@phdthesis{Zeitz2009, author = {Zeitz, Jonas}, title = {Analyse der Funktion und Lokalisation des anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds A1}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37071}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {In multizellul{\"a}ren Organismen ist die Apoptose, eine Art des programmierten Zelltods, ein hoch spezifischer, nat{\"u}rlicher Prozess um unerw{\"u}nschte, {\"u}bersch{\"u}ssige oder besch{\"a}digte Zellen auf einem geordneten, nicht entz{\"u}ndlichen, Weg zu beseitigen. Auch im menschlichen K{\"o}rper werden t{\"a}glich Milliarden an Zellen durch Apoptose abgebaut. Dadurch kann der Organismus die Zellzahl und Gewebegr{\"o}ße regulieren. Eine Fehlregulation der Apoptose kann weitreichende Konsequenzen haben. W{\"a}hrend es bei einer unzureichenden Apoptose zu Autoimmunit{\"a}t und Tumoren kommen kann, f{\"u}hrt ein gesteigerter Zelltod zu Immunschw{\"a}che oder akuten und chronischen degenerativen Erkrankungen. Aus diesem Grund ist die Erforschung der genauen Regulation des programmierten Zelltods von großer Bedeutung. Die Mitochondrien spielen eine Schl{\"u}sselrolle bei der Regulation des programmierten Zelltods. W{\"a}hrend des Ablaufs der Apoptose kommt es zur Freisetzung von Mediatoren der Apoptose aus diesen Organellen. Diese Molek{\"u}le sind dann an der Aktivierung von Caspasen beteiligt, welche die Degradation von Proteinen und als Folge davon der DNA bewerkstelligen. Die Proteine der Bcl-2 Familie, zu der pro- und anti-apoptotische Mitglieder geh{\"o}ren, kontrollieren die Integrit{\"a}t der Mitochondrien haupts{\"a}chlich durch Protein-Protein und Protein-Membran Interaktionen. Viele anti-apoptotische Mitglieder der Bcl-2 Familie sind mittels einer C-terminalen Transmembrandom{\"a}ne in der Lage an die {\"a}ußere Mitochondrienmembran zu binden. A1, ein anti-apoptotisches Mitglied dieser Proteinfamilie, besitzt allerdings keine typische Transmembrandom{\"a}ne. Die Funktion und Lokalisation des Proteins werden sehr kontrovers diskutiert. Daher ist das Ziel dieser Arbeit, die Lokalisation und Funktion von A1 zu analysieren. Um ein umfassendes Bild zu bekommen, wandten wir gentechnische Methoden zur Modifizierung des A1 C-Terminus an. Die intrazellul{\"a}re Lokalisation des Proteins wurde mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Die Bedeutung des proteasomalen Abbaus von A1 wurde schließlich durch Inhibitionsexperimente charakterisiert. Durch eine Fusion des C-terminalen Endes von A1 mit dem „enhanced green fluorescent protein" haben wir die Funktion und Lokalisierungseigenschaften des A1 C-terminus mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie untersucht. Wir konnten zeigen, dass das C-terminale Ende das so entstandene chim{\"a}re Protein deutlich destabilisieren konnte. Eine Blockade des proteasomalen Abbaus f{\"u}hrte zu einer Stabilisierung des Fusionsproteins. Des Weiteren konnte in der konfokalen Mikroskopie eine diffuse Verteilung des chim{\"a}ren Proteins in 293T Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das C-terminale Ende von A1 keine Lokalisation an spezifische intrazellul{\"a}re Organellen vermitteln kann, jedoch f{\"u}r die Instabilit{\"a}t und den proteasomalen Abbau des Proteins verantwortlich ist. Eine Analyse der Lokalisation des Gesamtproteins A1 in 293T Zellen mittels konfokaler Mikroskopie konnte eine Verteilung von A1 zugunsten des Zytoplasmas mit Anreicherung an den Mitochondrien nachweisen. Obwohl das C-terminale Ende von A1 f{\"u}r sich keine spezifische intrazellul{\"a}re Lokalisation vermittelt, zeigte das Protein eine Kolokalisation an den Mitochondrien. Somit scheinen noch andere N-terminale Bereiche des Proteins an der Lokalisation von A1 beteiligt zu sein. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass der C-Terminus von A1 eine wichtige Rolle f{\"u}r die Stabilit{\"a}t des anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds spielt.}, subject = {Apoptosis}, language = {de} } @phdthesis{Langer2009, author = {Langer, Manuel}, title = {Analyse der Instabilit{\"a}t und Funktionalit{\"a}t des Anti-Apoptose-Proteins A1}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-50119}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Apoptose ist eine bestimmte Art des programmierten Zelltods. Dieser Prozess erf{\"u}llt zahlreiche wichtige physiologische Funktionen. Eine pathologische Dysregulation der Apoptose ist an der Entstehung etlicher Krankheiten beteiligt. Bei der Regulation der Apoptose nehmen die Bcl-2-Familienmitglieder und damit auch das anti-apoptotisches Familienmitglied A1 eine wichtige Stellung ein. Die Stabilit{\"a}t und anti-apoptotische Funktion von A1 wird {\"u}ber den Ubiquitin-Proteasomen-Weg reguliert. Hierbei ist das C-terminale Ende von A1 essentiell. Ausgangspunkt f{\"u}r diese Arbeit war die Hypothese, dass an den C-Terminus von A1 eine bisher unbekannte Ubiquitin-E3-Ligase bindet, verzweigte Ubiquitinketten an Lysinreste des A1-Proteins konjugiert und das Protein dadurch f{\"u}r den proteasomalen Abbau markiert. Durch Mutationen einzelner Lysinreste von A1 sollte untersucht werden, welche dieser Aminos{\"a}uren ubiquitinyliert werden. Damit sollte der molekulare Mechanismus, der hinter der Instabilit{\"a}t und der anti-apoptotischen Funktion steckt, weiter charakterisiert werden. In dieser Arbeit wurden insgesamt 11 Mutanten des A1-Proteins hergestellt, bei denen die 11 Lysinreste von A1 gruppenweise zu Argininresten (K-A1-Mutanten) ausge-tauscht wurden. Der Austausch von Lysin zu Arginin wurde gew{\"a}hlt, weil hierdurch die Ladung an der entsprechenden Position des Proteins gleich bleibt, w{\"a}hrend eine Konjugation von Ubiquitin an Arginin nicht m{\"o}glich ist. Im Ergebnis zeigte sich, dass das A1-Protein nicht nur an einzelnen, ganz spezifischen Lysinen, sondern an allen oder doch zumindest den meisten seiner 11 Lysine ubiquitinyliert werden kann, denn es ergaben sich bei den K-A1-Mutanten keine signifikanten Unterschiede in St{\"a}rke oder Muster ihrer Ubiquitinylierung. Es m{\"u}ssen also nicht einige wenige Lysine notwendigerweise ubiquitinyliert werden, um A1 zu destabilisieren, sondern die Ubiquitinylierung ganz unterschiedlicher Lysine markiert das Protein f{\"u}r den proteasomalen Abbau. Auch hat der Verlust bestimmter Lysingruppen und damit potentieller Ubiquitinylierungsstellen keinen signifikanten Einfluss auf die anti-apoptotische Funktion des A1-Proteins. Zusammengefasst unterst{\"u}tzen die Ergebnisse die Hypothese, dass eine bisher nicht bekannte Ubiquitin-E3-Ligase sowohl die Stabilit{\"a}t als auch die anti-apoptotische Funktion von A1 reguliert, indem sie verzweigte Ubiquitinketten an (fast) alle Lysine des Protein anh{\"a}ngt und das Protein damit f{\"u}r den proteasomalen Abbau markiert.}, subject = {Apoptosis}, language = {de} } @phdthesis{Heinze2010, author = {Heinze, Britta}, title = {Charakterisierung der angeborenen Immunantwort gegen Pneumoviren in einem in vivo Modell}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-56454}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {In dieser Arbeit wurde das PVM-Mausmodell verwendet, um die Bedeutung der Typ I und Typ III Interferonantwort f{\"u}r die Pathogenese einer pneumoviralen Infektion zu analysieren. Hierzu wurden zun{\"a}chst mit Hilfe der reversen Genetik rekombinante PVM-Mutanten hergestellt, bei denen die Gene f{\"u}r die NS-Proteine, welche vermutlich als Interferonantagonisten fungieren, deletiert sind. Die Charakterisierung der Replikationsf{\"a}higkeit der rPVM dNS-Mutanten erfolgte in vitro in Interferon-kompetenten und Interferon-inkompetenten Zelllinien. Ein zentraler Schritt innerhalb dieser Charakterisierung war die Untersuchung der Induktion von Interferonen in vivo und in vitro nach Infektion mit den rPVM dNSMutanten, wobei nachgewiesen wurde, dass die NS-Proteine von PVM als Interferonantagonisten fungieren. In allen Interferon-kompetenten Zellkulturen wurde eine Attenuierung von rPVM dNS1, rPVM dNS2 und rPVM dNS1dNS2 bezogen auf rPVM beobachtet. In allen Interferon-inkompetenten Zellkulturen konnte die Attenuierung der rPVM dNS-Mutanten nahezu vollst{\"a}ndig revertiert werden. Nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten wurde in verschiedenen Zelllinien eine Induktion von Typ I und Typ III Interferonen betrachtet, wobei Unterschiede in der St{\"a}rke der Interferon-Induktion nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten vorhanden waren. Zusammenfassend war es m{\"o}glich, die NS1- und NS2-Proteine von PVM in Analogie zu RSV eindeutig als Antagonisten der Interferonantwort zu identifizieren. Die Untersuchung der protektiven Rolle von Typ I und Typ III Interferonen f{\"u}r die Replikation und Pathogenit{\"a}t von PVM bildete den zweiten Teil dieser Arbeit. Hierzu wurde die Replikationsf{\"a}higkeit und Pathogenit{\"a}t der rPVM dNS-Mutanten in verschiedenen Interferon-defizienten Mausst{\"a}mmen getestet. Die Untersuchungen ergaben eine protektive Rolle von Typ I und Typ III Interferonen bei einer Infektion mit PVM, wobei den Typ I Interferonen ein effektiverer Einfluss zugeordnet werden konnte. Ein Vergleich von Replikation und Virulenz zwischen den verschiedenen Typ I oder Typ III oder Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mausst{\"a}mmen belegte eine erh{\"o}hte Suszeptibilit{\"a}t der Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten M{\"a}use gegen{\"u}ber einer Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten. Eine vollst{\"a}ndige Aufhebung der Attenuierung wurde auch in den Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten M{\"a}usen nicht erlangt. Eine anti-apoptotische Funktion der NS-Proteine zus{\"a}tzlich zu ihrer Wirkungsweise als Interferonantagonisten wurde aufgrund der unvollst{\"a}ndigen Revertierung der Pathogenit{\"a}t der rPVM dNS-Mutanten in Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten M{\"a}usen vermutet. Der abschließende Teil dieser Dissertation befasste sich mit der Frage, welche Zellen bei einer nat{\"u}rlichen pulmonalen Infektion Interferone in vivo produzieren. In vitro wurde beobachtet, dass {\"u}berraschenderweise nur sehr wenige virusinfizierte oder uninfizierte Zellen Typ I Interferone bilden. Der Nachweis dar{\"u}ber, welche Zellen w{\"a}hrend einer pulmonalen Infektion haupts{\"a}chlich Interferone in vivo produzieren, war aufgrund der fehlenden Eignung der kommerziell erh{\"a}ltlichen Interferon-Antik{\"o}rper f{\"u}r intrazellul{\"a}re Gewebef{\"a}rbungen nicht m{\"o}glich. Dennoch gelang es abschließend durch eine neue Nachweismethode erstmals Zellen mit rezeptorgebundenen Interferon zu identifizieren, wobei es sich um ziliierte Epithelzellen, Alveolarmakrophagen und vermutlich Clarazellen sowie Typ I und Typ II Pneumozyten handelte.}, subject = {Interferon}, language = {de} } @phdthesis{Herold2005, author = {Herold, Marco}, title = {Der C-Terminus des antiapoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedes A1 reguliert Stabilit{\"a}t und Funktionalit{\"a}t des Proteins}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14459}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Die Stimulation von Lymphozyten durch alleinige Quervernetzung ihrer Antigenrezeptoren f{\"u}hrt in Abh{\"a}ngigkeit von der Signalst{\"a}rke zur Induktion von Apoptose. Dieser Prozess spielt im Rahmen der negativen Selektion von B-Zellen eine wichtige Rolle und kann am Beispiel von WEHI 231 Zellen, einer murinen Lymphomzelllinie modellhaft nachempfunden werden. Die Quervernetzung des B-Zellrezeptors (BZR) in WEHI 231 Zellen f{\"u}hrt in Abh{\"a}ngigkeit von der Prozessierung der mitochondrialen Caspase 9 zu Apoptose. Dies kann durch {\"U}berexpression des antiapoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds A1 verhindert werden. Interessanterweise besitzt A1 im Gegensatz zu Fast allen anderen Bcl-2 Proteinen keinen C-terminalen Bereich, der das Protein in intrazellul{\"a}re Membranen wie Mitochondrien und Endoplasmatisches Retikulum verankert. Ob und gegebenenfalls welche Bedeutung das C-terminale Ende f{\"u}r das Protein und dessen Funktion hat wurde in dieser Arbeit untersucht. Eine C-terminale Deletionsmutante wies im Vergleich zum Wildtyp eine h{\"o}here Proteinstabilit{\"a}t auf. Die Fusion der letzten 35 Aminos{\"a}uren von A1 an eine enzymatisch inaktive Form von Caspase 3 f{\"u}hrte zu einem sehr instabilen chim{\"a}ren Protein. Somit scheint der C-Terminus von A1 sowohl notwendig als auch hinreichend f{\"u}r die kurze Halbwertszeit des Proteins zu sein. Die meisten kurzlebigen Proteine werden {\"u}ber den proteasomalen Signalweg degradiert. Dies scheint auch f{\"u}r A1 zu gelten, da seine Halbwertszeit durch den Einsatz eines Proteasomeninhibitors verl{\"a}ngert wurde. In Koexpressionsstudien konnte zudem eine Ubiquitylierung von A1 beobachtet werden, welche bei der stabileren A1 Mutante stark reduziert war. A1 ist jedoch nicht immer instabil. In Anwesenheit des „BH3-only" Proteins Bim, das A1 direkt binden kann, wird die Halbwertszeit von A1 enorm erh{\"o}ht. Die antiapoptotische Funktion von A1 scheint sich jedoch nicht nur auf die Neutralisation durch bloße Bindung zu beschr{\"a}nken, da die Deletionsmutante trotz vergleichbarer Interaktion mit Bim einen sehr viel geringeren Schutz gegen Etoposid vermittelter Apoptose verlieh. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass das antiapoptotische Bcl-2 Familienmitglied A1 eine sehr kurze Halbwertszeit besitzt und das der C-Terminus nicht nur die Stabilit{\"a}t sondern auch die antiapoptotische Schutzfunktion f{\"u}r das Protein vermittelt.}, subject = {Apoptosis}, language = {de} } @phdthesis{Heck2009, author = {Heck, Tobias Johannes}, title = {Die Rolle des 1A-Promotors in der glukokortikoidinduzierten T-Zell-Apoptose}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-40417}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Glukokortikoide (GCs) geh{\"o}ren zur Familie der Steroidhormone. Unter physiologischen Bedingungen haben GCs eine bedeutende Funktion als Stresshormone in der Aktivierung kataboler Stoffwechselvorg{\"a}nge. In hohen, therapeutischen Konzentrationen spielen zus{\"a}tzlich antientz{\"u}ndliche und immunsuppressive Wirkungen eine bedeutende Rolle. Diese Modulation des Immunsystems geschieht unter anderem durch Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) in T-Lymphozyten. Die Erforschung der Mechanismen dieses glukokortikoidinduzierten Zelltodes (GICD) tr{\"a}gt zu einem besseren Verst{\"a}ndnis der Wirkungsweise von Glukokortikoiden innerhalb des Immunsystems bei. Timothy J. Cole et. al. konnten belegen, dass die Aktivit{\"a}t des Glukokortikoidrezeptor-Promotor 1A (GR-1A) mit einem Ansprechen von T-Lymphozyten auf GICD korreliert. Es ist das Ziel dieser Arbeit, den Zusammenhang von GR-1A-Promotor-Expression und GICD im Detail zu untersuchen. S{\"a}mtliche Zellexperimente wurden an WEHI 7.1 Zellen durchgef{\"u}hrt, einer murinen, unreifen T-Zell-Lymphomlinie. In ersten Untersuchungen der WEHI 7.1-Zellen zeigte sich, dass nur bestimmte Zellklone nach Glukokortikoid¬behandlung in Apoptose gingen, w{\"a}hrend andere vollst{\"a}ndig resistent gegen{\"u}ber GCs erschienen. In weiterf{\"u}hrenden Experimenten wurden ausschließlich die GICD-sensible Zellen eingesetzt. F{\"u}r diesen Typ der WEHI 7.1 Zellen wurde sowohl das Vorhandensein des GR-1A-Transkripts, als auch ein deutliches Ansprechen auf GICD nachgewiesen. In den folgenden Experimenten WEHI 7.1-5A Zellen mit WEHI 7.1-5A Zellen supprimierter GR-1A-Ausstattung verglichen. Die erw{\"u}nschte Reduktion des GR-1A-Transkripts wurde {\"u}ber RNA-Interferenz (RNAi) mittels small interfering RNA (siRNA) erzielt. RNAi ist eine Technik, die durch kleine siRNA-Ketten selektiv den Abbau bestimmter mRNA bewirkt und dadurch zu einer Verringerung der Proteinbiosynthese eines bestimmten Gens f{\"u}hrt. Der Zusammenhang von GR-1A und glukokortioidinduzierter Apoptose sollte an WEHI 7.1-Zellen mit einer reduzierten GR-1A-Expression untersucht werden. Durch das Einschleusen siRNA-tragender lentiviraler Vektoren gegen das GR-1A-Transkript sollten Zellen generiert werden, die eine erh{\"o}hte Resistenz gegen die glukokortikoidinduzierte Apoptose aufweisen. Diejenigen Zellen, die siRNA-Information in das Genom integriert hatten, konnten durch Detektion eines gr{\"u}n fluoreszierenden Markergens (eGFP) isoliert werden. Anschließend wurden die Zellen auf eine {\"A}nderung der GR-Proteinmenge analysiert. Western Blot Analysen zur Quantifizierung des GR ergaben keine signifikanten Unterschiede in der Expression des GR-Proteins in den erfolgreich GR-1A-defizienten WEHI 7.1-Zellen im Vergleich zur Negativkontrolle. Es wurden Dexamethason-Dose-Response-Assays durchgef{\"u}hrt, um den Anteil von GICD an den transfizierten Zellen zu erfassen. Nach Behandlung mit dem hochpotenten Glukokortikoid Dexamethason ergaben sich keine signifikanten {\"U}berlebensvorteile f{\"u}r Zellen, die aufgrund von RNAi einen Mangel an GR-1A-Transkript besitzen. Die in dieser Arbeit durchgef{\"u}hrten Studien konnten den von Cole et al. postulierten Zusammenhang zwischen GR-1A-Expression und GICD nicht beweisen. Es bleibt ungekl{\"a}rt, ob es nach erfolgreicher Transfektion der WEHI 7.1-Zellen tats{\"a}chlich zu einer signifikanten Abnahme der GR-1A-Transkription gekommen ist, beziehungsweise ob tats{\"a}chlich eine korrekte Synthese von siRNA in den Zellen stattgefunden hat. Weitere Untersuchungen erscheinen daher n{\"o}tig, um die Rolle des 1A-Promotor besser zu verstehen.}, subject = {Apoptosis}, language = {de} } @phdthesis{Bahlo2008, author = {Bahlo, Angela}, title = {Immunisierungsstrategien gegen Prionenerkrankungen und Untersuchungen zur Prionen-induzierten Neurodegeneration}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28443}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Prionenerkrankungen oder Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSEs) sind {\"u}bertragbare Krankheiten, zu denen die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen, Scrapie bei Schafen und die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) bei Rindern geh{\"o}ren. Der infekti{\"o}se Erreger (PrPSc) besteht dabei aus einer abnormalen Form des zellul{\"a}ren Prion-Proteins (PrPC) und unterscheidet sich von dieser nur in der Proteinstruktur. Ein Hauptproblem bei der Entwicklung von aktiven Immunisierungsstrategien gegen Prionenerkrankungen besteht in der fehlenden Reaktion des Immunsystems auf das ubiquit{\"a}r exprimierte Selbst-Antigen PrPC, welche auf einer Immuntoleranz gegen das k{\"o}rpereigene Protein beruht. In dieser Arbeit wurde ein transgenes Mausmodell f{\"u}r aktive Immunisierungsexperimente verwendet. Diese transgenen Tiere exprimieren Hamster-PrPC (HaPrP) unter der Kontrolle des Neuronen-spezifischen Enolase-Promotors (NSE) ausschließlich im Nervensystem auf einem Prnpo/o-Hintergrund. Durch die Verwendung eines „artfremden" Proteins (rekombinantes Maus-PrP) gegen endogenes Hamster-PrP als Vakzine sollte die Immunogenit{\"a}t des Proteins verst{\"a}rkt werden. Zus{\"a}tzlich wurde f{\"u}r die Immunisierungen ein Fusionsprotein aus Maus-PrP und einem T-Helferepitop des Tetanustoxins (P30) eingesetzt. Als Adjuvanz diente das bakterielle DNA-Motiv CpG-1826, welches die F{\"a}higkeit besitzt T-und B-Lymphozyten direkt zu stimulieren und die Sekretion von Interleukinen zu induzieren. Die Immunisierungen erfolgten subkutan und wurden monatlich durchgef{\"u}hrt. Nach jedem Boost wurden die Blutseren auf Antik{\"o}rper sowohl gegen Maus-PrP als auch gegen Hamster-PrP untersucht. Neben der Analyse der humoralen Immunantwort mittels ELISA, Westernblot und FACS, wurden die Seren der immunisierten M{\"a}use auf ihre F{\"a}higkeit getestet, die Prionenreplikation in vitro zu inhibieren. Mit der gew{\"a}hlten Immunisierungsstrategie war es mit beiden Proteinen m{\"o}glich, hohe Antik{\"o}rperantworten sowohl gegen Maus- als auch gegen Hamster-Prion-Protein zu induzieren. In Zellkultur waren die Seren in der Lage, signifikant den PrPSc-Gehalt zu reduzieren. Die immunisierten M{\"a}use wurden mit Hamsterprionen infiziert, um den Einfluss der induzierten Antik{\"o}rper auf den Verlauf der Krankheit zu untersuchen. Nach Immunisierung mit PrP-P30 zeigten die M{\"a}use gegen{\"u}ber mit Ovalbumin-behandelten Kontrolltiere eine signifikant verl{\"a}ngerte Inkubationszeit von ca. 30\%. Im Gegensatz dazu konnte nach Immunisierung mit PrP ohne das zus{\"a}tzliche T-Helferepitop keine Verl{\"a}ngerung in den Inkubationszeiten beobachtet werden. Abschließend wurde die Immunantwort in den immunisierten Tieren auf zellul{\"a}rer Ebene mittels Proliferationsanalyse von T-und B-Lymphozyten untersucht. Daf{\"u}r wurden Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten der immunisierten NSEHa-Prnpo/o_M{\"a}usen isoliert, ex vivo mit Maus-PrP bzw. Hamster-PrP stimuliert und auf die Proliferation von CD4-positiven oder CD8-positiven T-Lymphozyten untersucht. Durch die Analyse wurde gezeigt, dass es nach Immunisierung mit rek.PrP oder PrP-P30 zu keiner spezifischen Proliferation von T-Lymphozyten kam. Die beobachtete humorale Immunantwort scheint also unabh{\"a}ngig von einer spezifischen T-Zell-Immunantwort zu wirken. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass es m{\"o}glich ist, durch die Wahl von geeigneten Immunisierungsstrategien, die Toleranz gegen das Selbstprotein PrP zu brechen. Sie stellen eine Grundlage f{\"u}r weitere Forschungsans{\"a}tze dar, um prophylaktische Immunisierungen gegen Prionenerkrankungen in Zukunft zu realisieren. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Funktion der apoptotischen Faktoren BAX und BCL-2 in der Prionen-induzierten Neurodegeneration in vivo untersucht. Dazu wurde neuroektodermales Gewebe aus BAX-/- und BCL-2-/- -Embryonen in das Gehirn von PrP-Knockout-M{\"a}usen (Prnpo/o) transplantiert. Diese PrPC-defizienten Tiere sind nicht mit Prionen infizierbar und k{\"o}nnen PrPSc nicht propagieren. Nach Langzeitinfektion mit Mausprionen wurden die Transplantate histochemisch auf Prionenpathologie untersucht. Die typischen neuropathologischen Ver{\"a}nderungen waren dabei strikt auf das PrPC-positive Transplantat begrenzt. Zus{\"a}tzlich wurden die Transplantate auf apoptotische Ver{\"a}nderungen untersucht und dabei TUNEL-F{\"a}rbungen und aktivierte-Caspase-3 F{\"a}rbungen durchgef{\"u}hrt. Es zeigten sich hierbei hinsichtlich Auspr{\"a}gung und St{\"a}rke der Pathologie keine Unterschiede zwischen den BAX-bzw. BCL-2-Knockout Transplantaten und wildtypischen Transplantaten. Daraus konnte gefolgert werden, dass in diesem Modell weder BAX noch BCL-2 eine signifikante Rolle bei der Prionenpathogenese spielen. Die Ergebnisse aus diesem Teil der Arbeit leisten einen wichtigen Beitrag f{\"u}r das bessere Verst{\"a}ndnis der durch Prionen-induzierten Neurodegeneration und sind f{\"u}r die Entwicklung von potentiellen therapeutischen Strategien hilfreich.}, subject = {Impfung}, language = {de} } @article{WalterCollenburgJaptoketal.2016, author = {Walter, T. and Collenburg, L. and Japtok, L. and Kleuser, B. and Schneider-Schaulies, S. and M{\"u}ller, N. and Becam, J. and Schubert-Unkmeir, A. and Kong, J. N. and Bieberich, E. and Seibel, J.}, title = {Incorporation and visualization of azido-functionalized N-oleoyl serinol in Jurkat cells, mouse brain astrocytes, 3T3 fibroblasts and human brain microvascular endothelial cells}, series = {Chemical Communications}, volume = {52}, journal = {Chemical Communications}, number = {55}, doi = {10.1039/c6cc02879a}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-191263}, pages = {8612-8614}, year = {2016}, abstract = {The synthesis and biological evaluation of azido-N-oleoyl serinol is reported. It mimicks biofunctional lipid ceramides and has shown to be capable of click reactions for cell membrane imaging in Jurkat and human brain microvascular endothelial cells.}, language = {en} } @phdthesis{Thorwarth2001, author = {Thorwarth, Wolf Michael}, title = {Kombinierte Leber- D{\"u}nndarmtransplantation}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-2897}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Nach Transplantation moduliert die Leber nicht nur die Immunantwort des Empf{\"a}ngers gegen{\"u}ber ihr selbst, sondern {\"u}bt auch auf mittransplantierte Organe einen protektiven Effekt aus. Dieses Ph{\"a}nomen wurde in der vorliegenden Arbeit an dem hoch immunogenen D{\"u}nndarm untersucht. Diese Studie war dabei nicht nur unter immunologischen Gesichtspunkten von Bedeutung. So stellt die simultane Leber- / D{\"u}nndarmtransplantation f{\"u}r Patienten, die an einer Leberzirrhose infolge eines Kurzdarmsyndrom leiden, eine erfolgversprechende Therapieoption dar. Zur experimentellen Analyse dieser speziellen Transplantationsform existierte aber in der Ratte bisher kein vergleichbares Modell. In der vorliegenden Arbeit wird daher erstmalig ein Modell etabliert, in dem - orientiert an den Verh{\"a}ltnissen beim Menschen - Leber (arterialisiert) und D{\"u}nndarm simultan und orthotop transplantiert werden. Mittels kurzfristiger Immunsuppression wurde bei allogener Transplantation hier nicht nur Akzeptanz sondern Toleranz erreicht und mittels Indikator-Herz- und Hauttransplantation {\"u}berpr{\"u}ft. Die dazu ben{\"o}tigte immunsuppressive Dosis unterschritt dabei die f{\"u}r eine erfolgreiche isolierte D{\"u}nndarmtransplantation notwendige Immunsuppression erheblich. Dieser Toleranzentwicklung geht eine zeitlich begrenzte Abstoßungsreaktion voraus. Die daran beteiligten zellul{\"a}ren Mechanismen wurden durch sequentielle Immunhistologie dargestellt. W{\"a}hrend dieser Abstoßung sammeln sich {\"u}berdurchschnittlich viele apoptotische T-Lymphozyten, haupts{\"a}chlich CD8+ Zellen, im Lebertransplantat, nicht aber im transplantierten D{\"u}nndarm an. Dieses Ph{\"a}nomen konnte mittels einer neu etablierten Doppelf{\"a}rbung dargestellt werden. Apoptoseinduktion in alloreaktiven T-Zellen k{\"o}nnte einer der Mechanismen sein, die den immunsuppressiven Effekt des Lebertransplantates erkl{\"a}ren und den gleichzeitig transplantierten D{\"u}nndarm vor seiner Abstoßung bewahren.}, language = {de} } @phdthesis{Blank2009, author = {Blank, Marc}, title = {Mechanismen der Glukokortikoid-induzierten Apoptose in T-Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-41332}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Glukokortikoide induzieren Apoptose in vielen verschiedenen Zelltypen. Wenngleich die Glukokortikoid-induzierte Apoptose eine der zuerst entdeckten Formen des Programmierten Zelltodes war, ist sie dennoch kaum verstanden und daher heute noch Teil vieler Forschungen. Eine Bcl-2 {\"U}berexpression resultiert in einer Resistenz gegen{\"u}ber GC- induzierter Apoptose in einer Reihe von Zellen wie einigen Lymphomzell-linien, aber auch normalen Thymozyten, sowie reifen T- und B-Zellen. Glukokortikoide k{\"o}nnen die Transkription der BH3-only Gene Bim (BCL-2-interacting mediator of cell death) und Puma (p53-upregulated modulator of apoptosis), einer proapoptotischen Untergruppe der Bcl-2 Familie, induzieren. Dies legt nahe, dass Bim und Puma am Weg der GC-induzierten Apoptose beteiligt sind. Ceramid ist in der Lage {\"u}ber die Aktivierung der proapoptotischen Bcl-2 Mitglieder Bax und Bak die {\"a}ußere Mitochondrienmembran zu sch{\"a}digen und damit zur Aktivierung von Caspasen zu f{\"u}hren. Verschiedene apoptotische Stimuli, wie z.B. Glukokortikoide, f{\"u}hren so {\"u}ber eine Erh{\"o}hung des endogenen Ceramid Levels zur Apoptose. Ceramid kann auf zwei verschiedenen Wegen gebildet werden: zum einen durch Hydrolyse von Sphingomyelin (katalysiert durch saure (a), oder neutrale (n) Sphingomyelinase (SMase)), zum anderen durch de novo Biosynthese. Studien an Thymozyten zeigen, dass von den beiden M{\"o}glichkeiten der Ceramidsynthese, lediglich die Inhibition der aSMase zu einer Resistenz gegen{\"u}ber GC-induzierter Apoptose f{\"u}hrt. Um nun die Rolle von Bim und der aSMase bei der Glukokortikoid-induzierten Apoptose zu untersuchen, wurde die murine T-Zelllymphomlinie WEHI7.15a zu Hilfe genommen. W{\"a}hrend die {\"U}berexpression retroviral eingebrachter shRNAs gegen Bim und aSMase keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose zeigten, f{\"u}hrte der knockdown des Glukokortikoid-Rezeptors selbst zu einer Resistenz gegen{\"u}ber Dexamethason. Auch der pharmakologische Inhibitor der Sphingomyelin-Hydrolyse, Imipramin, zeigte sowohl in vitro, als auch in vivo keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose. Dar{\"u}ber hinaus waren sowohl Thymozyten, als auch periphere T-Zellen von aSMase knockout M{\"a}usen genauso sensitiv auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose wie Wildtyp-Zellen. Die in vitro knockdown Ergebnisse von Bim und vom Glukokortikoid-Rezeptor selbst, konnten weiterhin ex vivo, durch das Einbringen der shRNAs in h{\"a}matopoetische Stammzellen, welche zur Rekonstitution bestrahlter M{\"a}use genutzt wurden, best{\"a}tigt werden. W{\"a}hrend der Bim knockdown keinerlei Einfluss auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose ex vivo zeigte, konnte die verminderte Expression des Glukokortikoid-Rezeptors den Zelltod verhindern. Im Gegensatz hierzu zeigten sowohl der GR knockdown, als auch der Bim knockdown im h{\"a}matopoetischen System einen Einfluss auf die Thymozytenentwicklung in vivo.}, subject = {Glucocorticosteroidrezeptor}, language = {de} } @phdthesis{Meisenzahl2001, author = {Meisenzahl, Christina}, title = {Regulation der Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase durch Interferon in retinalen Pigmentepithelzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1180452}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Ophtalmologische Krankheitsbilder, die mit Degeneration oder erblichen Dystrophien der Retina einhergehen, f{\"u}hren in vielen F{\"a}llen zur Erblindung und stellen daher ein großes Problem in der Augenheilkunde dar. Als Korrelat des Zellverlustes wurde der apoptotische Zelltod identifiziert. Die Schritte, die zwischen der Genmutation und dem funktionellen Defizit in der Zelle liegen sowie die Signalketten, die letztlich zur Entscheidung zum Zelltod f{\"u}hren, sind noch relativ unklar. Im Zusammenhang mit der Frage, welche Gene die molekulargenetische Grundlage f{\"u}r den Vorgang der Apoptose in Zellen der menschlichen Netzhaut bilden, wurde in dieser Arbeit die Frage untersucht, ob in der humanen Pigmentepithelzellinie ARPE-19 die Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase produziert werden und ob die Genexpression dieser Metalloproteinasen durch eine Behandlung der Zellen mit humanen Interferonen stimuliert werden kann. Der Nachweis sollte auf der mRNA-Ebene erfolgen. Als Nachweismethoden dienten die Northern-blot-Analyse, wobei f{\"u}r die Hybridisierung Digoxigenin-markierte antisense-RNA verwendet wurde, die durch in vitro-Transkription gewonnen wurde, sowie die RT-PCR. Als Modell diente die ARPE-19-Zelle, die sich durch ihre epitheliale Morphologie und rasche Proliferationsrate von anderen prim{\"a}ren RPE-Kulturen unterscheidet . Als Kontrolle wurden humane Fibroblasten sowie Gliomazellen verwendet. Mit der Northern-blot-Analyse konnte in der ARPE-19-Zelle die mRNA der Metalloproteinase Collagenase nicht nachgewiesen werden. Der Versuch, eine eventuell sehr geringe mRNA-Menge durch Behandlung mit Interferon alpha und gamma {\"u}ber die Nachweisgrenze zu erh{\"o}hen, erbrachte ebenfalls ein negatives Ergebnis. F{\"u}r die Untersuchung von Stromelysin 1 wurde auf die sensiblere Methode der RT-PCR {\"u}bergegangen. W{\"a}hrend Stromelysin 1 in den Kontrollzellen nachgewiesen werden konnte, konnte auch mit der RT-PCR-Methode in der ARPE-19-Zelle Stromelysin 1 nicht nachgewiesen werden. Daher muss davon ausgegangen werden, dass die ARPE-19-Zelle durch die Anzahl der Passagen, der sie w{\"a}hrend der Zellkultur unterzogen wurde, zwar nicht immortalisierte, jedoch eine gewisse Zahl von Genen abschaltete, zu denen auch die Gene der hier untersuchten Metalloproteinasen Collagenase und Stromelysin geh{\"o}ren, oder dass die Zellinie nicht den komplett identischen Chromosomensatz einer origin{\"a}ren retinalen Pigmentepithelzelle besitzt. Die Tatsache, daß hochspezialisierte Zellen bei oftmaligem Passagieren ihre spezialisierten Eigenschaften verlieren, kann in der Forschung h{\"a}ufig beobachtet werden. Offenbar ist die in Kultur gehaltene ARPE-19-Zelle eine in ihrer transkriptionellen Aktivit{\"a}t extrem reduzierte Zelle, bei der auch die Transkription der Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase abgeschaltet ist.}, subject = {Maus}, language = {de} }