@phdthesis{Schmitt2010,
  author    = {Schmitt, Karin},
  title     = {Charakterisierung des BvgAS1,2-Regulons von Bordetella petrii},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-53603},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Die Gattung Bordetella, die phylogenetisch in die Gruppe der β-Proteobakterien eingeordnet und zur Familie der Alcaligenaceae gez{\"a}hlt wird, umfasst nach heutigem Wissenstand neun Gram-negative Arten. Die klassischen Bordetella-Arten B. pertussis, B. parapertussis und B. bronchiseptica werden im sogenannten B. bronchiseptica-Cluster zusammengefasst. Der strikt humanpathogene Erreger B. pertussis stellt als Verursacher des Keuchhustens das wohl bedeutendste Mitglied der Gattung dar. B. parapertussis ist der Verursacher von respiratorischen Erkrankungen in Menschen und Schafen, w{\"a}hrend B. bronchiseptica f{\"u}r Atemwegserkrankungen in verschiedenen S{\"a}ugetieren verantwortlich gemacht wird. Zudem kann B. bronchiseptica f{\"u}r einen l{\"a}ngeren Zeitraum in der Umwelt {\"u}berleben. Die in den letzte Jahren identifizierten „neuen" Bordetella-Arten, B. avium, B. hinzii, B. holmesii, B. trematum und B. ansorpii, wurden alle human- oder tierassoziiert isoliert und besitzen unterschiedliches pathogenes Potential, das zum Teil noch n{\"a}her untersucht werden muss. Eine Ausnahme stellt der aus einer anaeroben dechlorinierten Flusssediment-Anreicherungskultur isolierte Keim B. petrii dar. Dieser ist bis zum heutigen Zeitpunkt der einzige Umweltkeim der Gattung Bordetella (von Wintzingerode, Schattke et al. 2001). In evolution{\"a}rer Hinsicht ist B. petrii besonders interessant, da er sowohl f{\"u}r orthologe Gene einiger Virulenzfaktoren der pathogenen Bordetellen kodiert, als auch die typischen Eigenschaften eines Umweltkeims aufweist und somit als Bindeglied zu fungieren scheint. Ein solcher Virulenzfaktor ist das BvgAS-System, das in den pathogenen Bordetellen den Hauptregulator der Virulenzgenexpression darstellt, aber in B. petrii strukturell komplexer aufgebaut ist. Neben dem auf Aminos{\"a}ureebene hoch konservierten Response Regulator bvgA, finden sich in B. petrii Gene f{\"u}r zwei Histidinkinasen, bvgS1 und bvgS2, sowie eine unabh{\"a}ngige hpt-Dom{\"a}ne. Eine periplasmatische Sensordom{\"a}ne fehlt in beiden Kinasen, und nur in BvgS1 konnte eine PAS-Dom{\"a}ne identifiziert werden. In den letzten Jahren wurden zunehmend B. petrii-Isolate aus den verschiedensten Habitaten isoliert, wie z.B. das Schwammisolate R521 (Sfanos, Harmody et al. 2005) und das klinisches Isolat aus einem Patienten mit mandibul{\"a}rer Osteomyelitis (Fry, Duncan et al. 2005). Im Rahmen dieser Arbeit wurde {\"u}ber einen PCR-Ansatz versucht, mit aus der Wildtypsequenz abgeleiteten Oligonukleotiden das BvgAS1,2-System der Isolate zu sequenzieren, aber nur im klinischen Isolat konnte ein orthologes Genfragment zum Response Regulator bvgA identifiziert werden. Ein Nachweis der Histidinkinasen sowie der hpt-Dom{\"a}ne schlug in allen untersuchten Isolaten fehl. Die vergleichenden Genomanalysen mittels DNA-Microarrays konnten aufgrund fehlender Hybridisierungen keine weiteren Gemeinsamkeiten und Unterschiede auf DNA-Ebene zwischen den Isolaten und B. petrii DSM 12804 aufzeigen. B. petrii ist ein hoch variabler Umweltkeim, der sich an verschiedene Lebensbedingungen anpassen kann. Dies konnte auch durch die Isolation dreier ph{\"a}notypisch unterscheidbare Varianten w{\"a}hrend eines Langzeitwachstumsversuches gezeigt werden (Lechner 2008). Durch die Genomsequenzierung von B. petrii DSM 12804 konnten wenigsten sieben genomischen Inseln beschrieben werden (Gross, Guzman et al. 2008), die durch unterschiedliche Exzision f{\"u}r die Entstehung der Varianten und daraus resultierend f{\"u}r die Variabilit{\"a}t in B. petrii verantwortlich sind. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Gr{\"o}ße der einzelnen genomischen Inseln im Genom von B. petrii durch vergleichende Genomanalysen mittels DNA-Microarrays, mit Ausnahme von GI1, GI5 und GI6, im Vergleich zu den bioinformatischen Vorhersagen best{\"a}tigt werden. Diese Inseln zeigten in den Microarray-Analysen eine Vergr{\"o}ßerung bzw. Verkleinerung im Vergleich zu den zuvor beschrieben putativen Grenzen. Die große Instabilit{\"a}t des Genoms von B. petrii DSM 12804 konnte in dieser Arbeit auch durch Microarray-Analysen einzelner Klone aufgezeigt werden, die unterschiedliche Variationen im Bereich der genomischen Inseln aufwiesen. In den Analysen von B. petrii 12804 ΔbvgA bzw. ΔbvgAS konnten zus{\"a}tzlich zu den gezielten Manipulation im BvgAS1,2-Lokus weitere Deletionen im Bereich von bpet0196-0200, bpet4219-4235 und bpet4176 detektiert werden. Die Re-Integration dieser Genbereiche nach Klonierung einer BvgA-Komplementationsmutante deutet auf eine extrachromosomale plasmid-{\"a}hnliche Struktur dieser Bereiche hin. Dies konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend best{\"a}tigt werden und bleibt weiter zu untersuchen. Im Verlauf der evolution{\"a}ren Entwicklung der Bordetellen wurde das BvgAS-System, das urspr{\"u}nglich f{\"u}r die Adaption an Umweltbedingungen mit verschiedenen Sauerstoff-konzentrationen und/oder Temperaturen zust{\"a}ndig war, mit der Regulation der Expression der Virulenzgene verkn{\"u}pft (von Wintzingerode, Gerlach et al. 2002). In den Transkriptomanalysen zur Untersuchung der Funktionalit{\"a}t des BvgAS1,2-Systems in B. petrii konnte aufgezeigt werden, dass die Temperatur ein wichtiger Signalgeber f{\"u}r die Expression des Flagellen- und Chemotaxisoperons ist. In B. bronchiseptica wird die Motilit{\"a}t, bei Temperaturen unter 25°C, negativ durch das BvgAS-System reguliert. Auch in B. petrii konnte in den Untersuchungen eine negative Regulation der Flagellen- und Chemotaxisgene durch das BvgAS1,2-System unter diesen Bedingungen detektiert werden. Ob aber in B. petrii die gleiche hierarchische Struktur zur Regulation der Motilit{\"a}t besteht wie in B. bronchiseptica, bleibt zu untersuchen. Im Verlauf der Untersuchungen konnte dem BvgAS-Zwei-Komponentensystem in B. petrii auch eine Funktion im Energiestoffwechsel einger{\"a}umt werden, um auf wechselnde Sauerstoffbedingungen reagieren zu k{\"o}nnen. Die Messung des Sauerstoffgehaltes der Umgebung und damit eine Regulation der aeroben bzw. anaeroben Atmung erfolgt in B. petrii wahrscheinlich ebenfalls {\"u}ber das BvgAS1,2-System. Die in der Histidinkinase BvgS1 vorhergesagte PAS-Dom{\"a}ne scheint laut den Analysen f{\"u}r diesen Vorgang von großer Bedeutung zu sein. Desweiteren scheint das System auch die Zusammensetzung der Cytochromoxidase zur optimalen Anpassung an aerobe, mikroaerophile und anaerobe Bedingungen zu regulieren.},
  subject      = {Bordetella},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Lechner2008,
  author    = {Lechner, Melanie},
  title     = {Charakterisierung des Umweltkeims Bordetella petrii. Untersuchungen zur genomischen Variabilit{\"a}t und zum Bvg Regulon},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-34391},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Die 2001 beschriebene Art B. petrii stellt den ersten Umweltkeim der Gattung Bordetella dar, welcher aus einer anaeroben, dechlorinierenden Anreicherungskultur aus Flusssediment isoliert wurde. Phylogenetisch wird B. petrii an die Basis der Gattung Bordetella eingeordnet und ist in evolution{\"a}rer Hinsicht deshalb interessant, weil er sowohl f{\"u}r orthologe Gene bestimmter Virulenzfaktoren der pathogenen Bordetellen kodiert als auch typische Eigenschaften von Umweltkeimen aufweist und somit eine Art Bindeglied darstellt. Da B. petrii ein orthologes BvgAS-System besitzt (der Hauptregulator der Virulenzgenexpression in den pathogenen Bordetellen), wurde dessen Struktur im Rahmen dieser Arbeit mittels in silico Analysen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine Konservierung nur auf Aminos{\"a}ureebene deutlich zu erkennen ist und der Response Regulator BvgA von B. petrii die st{\"a}rkste Konservierung aufweist. Desweiteren besitzt B. petrii Gene f{\"u}r zwei Histidinkinasen, BvgS1 und BvgS2, sowie ein separates Gen, welches f{\"u}r eine Hpt-Dom{\"a}ne kodiert. Weitere putative Virulenzfaktoren von B. petrii geh{\"o}ren in die Gruppe der Adh{\"a}sionsfaktoren. Diese Faktoren spielen bei den „klassischen" Bordetellen im Infektionszyklus eine wichtige Rolle f{\"u}r die Anheftung z.B. an die Epithelzellen des Respirationstraktes. Um ein m{\"o}gliches pathogenes Potential von B. petrii absch{\"a}tzen zu k{\"o}nnen, wurden vergleichende Zellkulturstudien mit B. bronchiseptica durchgef{\"u}hrt. Dabei konnte gezeigt werden, dass B. petrii um den Faktor 7,5 weniger in Makrophagen aufgenommen wird. Hinweise auf die Funktionalit{\"a}t des BvgAS-Systems in B. petrii wurden durch Proteomstudien mit einer BvgA-Mutante erhalten, und deuten darauf hin, dass das BvgAS-System in B. petrii m{\"o}glicherweise eine Funktion in der Respirationskontrolle haben k{\"o}nnte. Im Rahmen der Genomsequenzierung wurden acht genomische Inseln beschrieben, die in dieser Arbeit hinsichtlich ihrer Struktur und ihrem Excisionsverhalten untersucht wurden. Es konnte gezeigt werden, dass die genomischen Inseln, mit Ausnahme der Insel GI0, in verschiedenen Kombinationen, als ringf{\"o}rmige Intermediate aus dem B. petrii Genom ausgeschnitten werden k{\"o}nnen. Vier der genomischen Inseln (GI1-GI3 und GI6) weisen strukturelle {\"A}hnlichkeiten zu einer Familie syntenischer genomischer Inseln auf, zu denen auch das clc-Element von Pseudomonas sp. Strain B13 z{\"a}hlt. Die gr{\"o}ßte {\"A}hnlichkeit zum clc-Element weist die Insel GI3 von B. petrii auf. Diese beiden Inseln haben ann{\"a}hernd die gleiche Gr{\"o}ße und besitzen Gene zu Abbau von 3-Chlorobenzoat (3-CBA). Die Untersuchung der Stabilit{\"a}t von GI3 ergab, dass nach 125-150 Generationen nur noch 1,5 \% der Bakterien die Insel GI3 enthielten. Desweiteren konnte die {\"U}bertragung der Insel GI3 von B. petrii auf B. bronchiseptica PS2 gezeigt und der Integrationsbereich bestimmt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch ein neuer Stammbaum der Gattung Bordetella erstellt, in welchen eine Reihe k{\"u}rzlich neu beschriebener B. petrii Isolate mit aufgenommen wurden wodurch ein zu den pathogenen Bordetellen abgegrenztes Cluster gebildet wird.},
  subject      = {Mikrobiologie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Link2007,
  author    = {Link, Stefanie},
  title     = {Molekulare Charakterisierung des Filament{\"o}sen H{\"a}magglutinins von Bordetella holmesii},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23049},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Zur Gattung Bordetella z{\"a}hlen derzeit neun verschiedene Arten Gram-negativer Bakterien. Der strikt humanpathogene Keim B. pertussis ist der Erreger des Keuchhustens und stellt das wohl wichtigste Mitglied der Gattung dar. B. holmesii geh{\"o}rt zu den sogenannten neuen Bordetella-Arten und wurde 1995 erstmals von Weyant et al. beschrieben. In den letzten Jahren gewann B. holmesii als humanpathogener Keim, der Keuchhusten-{\"a}hnliche Erkrankungen verursacht, zunehmend an Bedeutung. Mit Ausnahme des BvgAS-Systems (Gerlach et al., 2004) konnten in B. holmesii bislang keine f{\"u}r die „klassischen" Bordetella-Arten bekannten Virulenzfakoren nachgewiesen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein zum Filament{\"o}sen H{\"a}magglutinin homologer Faktor in B. holmesii identifiziert. Der fhaB-Locus aus B. holmesii unterscheidet sich deutlich von dem der anderen Bordetella-Arten, da die fhaB-Sequenz in B. holmesii (fhaBBH) stromaufw{\"a}rts von einem putativen Membranprotein und stromabw{\"a}rts von einem IS1001-{\"a}hnlichen IS-Element flankiert wird. Sowohl auf DNA- als auch auf Proteinebene weist das fhaBBH-Gen die gr{\"o}ßte {\"A}hnlichkeit zu dem fhaB-Homolog aus B. avium auf, was die Vermutung best{\"a}rkt, dass B. holmesii phylogenetisch im Umfeld von B. avium anzusiedeln ist. Durch in silico-Analysen der FhaBBH-Aminos{\"a}uresequenz konnte eine N-terminale Signalpeptiddom{\"a}ne sowie eine TPS-Dom{\"a}ne identifiziert werden. Dies l{\"a}sst vermuten, dass FHABH an die bakterielle Oberfl{\"a}che transportiert und m{\"o}glicherweise sekretiert wird. Anhand von in silico-Analysen wurde zudem ein KGD-Motiv, nicht jedoch eine Heparinsulfat- und eine Kohlenhydratbindedom{\"a}ne im FhaBBH identifiziert. Das KGD-Motiv k{\"o}nnte das RGD-Motiv im FHA der „klassischen" Bordetella-Arten bei der Erkennung von Rezeptoren ersetzen. In Zellkultur-Experimenten konnte die Ad{\"a}sionsf{\"a}higkeit von B. holmesii G7702 an A549-Zellen nachgewiesen werden. Eine fhaB-Deletionsmutante des entsprechenden Stammes zeigte dagegen eine signifikant niedrigere Adh{\"a}sionsrate an die menschlichen Lungenepithelzellen. Somit konnte gezeigt werden, dass FHA in B. holmesii eine Rolle als Adh{\"a}sionsfaktor spielt. Die im Vergleich zum Wildtyp stark verringerte Adh{\"a}sionsrate der bvgA-Mutante von B. holmesii G7702 l{\"a}sst zudem auf die Beteiligung weiterer Adh{\"a}sionsfaktoren an der Wirtszelladh{\"a}sion in B. holmesii und deren Regulation durch das BvgAS-Systems schließen. Die Regulationsstudien haben gezeigt, dass die fhaB-Transkription in B. holmesii {\"u}ber zwei konstitutiv aktive Promotoren und einen bvg-abh{\"a}ngigen Promotor erfolgt. In vitro ist phosphoryliertes BvgABH in der Lage, spezifisch an die fhaB-upstream-Region aus B. holmesii zu binden. Innerhalb der fhaBBH-upstream-Region wurden drei putative BvgA-Bindestellen BS2-4 identifiziert, die {\"A}hnlichkeiten zu inverted repeat-Anordnungen der BvgA-Konsensussequenz 5'- T/A T T C C/T T A -3' aufweisen. Basierend auf den Ergebnissen der in vitro-Binde- und in vivo-Expressionsstudien zur Charakterisierung der einzelnen putativen BvgABH-Bindestellen wird ein Modell f{\"u}r die BvgABH-Bindung innerhalb des fhaB-Promotors in B. holmesii vorgeschlagen. Demnach wird zun{\"a}chst die prim{\"a}re BvgABH-Bindestelle BS2 mit der h{\"o}chsten Affinit{\"a}t von BvgABH-P gebunden, wobei f{\"u}r BvgABH-P eine Dimerisierung angenommen wird. Anschließend bindet ein zweites BvgABH-P-Dimer an die als sekund{\"a}re Bindestelle bezeichnete BS3-Region, die sich stromabw{\"a}rts von BS2 befindet. Eine m{\"o}glicherweise darauf folgende unspezifische Anlagerung von zwei weiteren BvgABH-P-Dimeren an den 37 bp großen DNA-Abschnitt zwischen BS2 und BS3 ist, ebenso wie die Besetzung der niedrigaffinen Bindestelle BS4 durch ein weiteres BvgABH-P-Dimer, haupts{\"a}chlich auf kooperative Protein-Protein-Wechselwirkungen zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Das an BS4 gebundene BvgABH-P-Dimer befindet sich am weitesten stromabw{\"a}rts und k{\"o}nnte zusammen mit der RNA-Polymerase die Initiation der Transkription gew{\"a}hrleisten. Ergebnisse aus den in vitro-Bindestudien sowie die unterschiedliche Zusammensetzung und Anordnung der putativen BvgA-Bindestellen der fhaB-Promotoren aus B. holmesii und B. pertussis deuten auf eine unterschiedliche Regulation dieser beiden Promotoren hin. So scheint der fhaB-Promotor aus B. holmesii, im Vergleich zum fhaB-Promotor aus B. pertussis, erst bei h{\"o}heren Konzentrationen an phosphoryliertem BvgA gebunden und somit aktiviert zu werden. In B. holmesii wird vermutlich die konstitutive FHA-Synthese nach BvgAS-Stimulation durch die bvg-abh{\"a}ngige fhaBBH-Expression unterst{\"u}tzt, um eine erfolgreiche Infektion des Wirtes zu gew{\"a}hrleisten.},
  subject      = {Bordetella},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Horvat2007,
  author    = {Horvat, Aleksandra},
  title     = {Untersuchungen zur Signalwahrnehmung der Sensorkinase BvgS des BvgAS-Zwei-Komponentensystems aus Bordetella bronchiseptica und Struktur-Funktionsanalyse des Response Regulator-Proteins BvgA aus Bordetella holmesii},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21991},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Die Histidin-Kinase BvgS des BvgAS-Zwei-Komponentensystems geh{\"o}rt zu den unorthodoxen Histidin-Kinasen, die im Gegensatz zu den klassischen Sensorkinasen durch eine komplexere Dom{\"a}nen-Struktur gekennzeichnet ist. Schon seit l{\"a}ngerem ist bekannt, dass BvgS durch niedrige Temperaturen oder die Anwesenheit von chemischen Substanzen, wie Sulfationen oder Nikotins{\"a}ure inaktiviert wird. Zudem konnte in vitro gezeigt werden, dass die Autophosphorylierungs-Aktivit{\"a}t der BvgS Histidin-Kinase nach Inkubation mit oxidiertem Ubichinon inhibiert wird (Bock \& Gross, 2002). Bislang ist weitgehend unklar, welche Bedeutung die zus{\"a}tzlichen Dom{\"a}nen, wie die periplasmatische-, PAS- bzw. HPt-Dom{\"a}ne f{\"u}r die Signalwahrnehmung besitzen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb nach Erstellung einer B. bronchiseptica spezifischen Genbank mit Hilfe des GAL4-Yeast Two-Hybrid (YTH) Systems nach Interaktionspartnern der einzelnen BvgS-Dom{\"a}nen gesucht. Nach dem Ausschluss von falsch-positiven Klonen und dem Durchlauf entsprechender Kontrollen konnten im YTH-System f{\"u}r die periplasmatische und die PAS-Dom{\"a}ne von BvgS insgesamt vier Interaktionspartner identifiziert werden. F{\"u}r die HPt-Dom{\"a}ne konnte mit Hilfe des YTH-Systems kein m{\"o}glicher Interaktionspartner gefunden werden. Als ein putativer Interaktionspartner der BvgS-PAS-Dom{\"a}ne wurde das BB0602-Protein identifiziert, das ein ATP-Bindeprotein darstellt, welches als Bestandteil eines ABC-Transport-System f{\"u}r den Transport von verzweigten Aminos{\"a}uren verantwortlich gemacht wird. Diese Interaktion konnte mittels eines GST-Pulldownassays best{\"a}tigt werden. Der biochemische Nachweis der {\"u}brigen identifizierten Protein-Interaktionen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erbracht werden. Die Ergebnisse des YTH-Screenings deuten darauf hin, dass die Aktivit{\"a}t der BvgS Histidin-Kinase und damit die Virulenzgenexpression durch die An- bzw. Abwesenheit von verzweigten Aminos{\"a}uren beeinflusst werden k{\"o}nnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Relevanz der Interaktion zwischen der PAS-Dom{\"a}ne und dem ATP-Bindeprotein BB0602 nicht n{\"a}her charakterisiert werden, so dass in Zukunft unter anderem die Konstruktion einer B. bronschiseptica bb0602-Deletionsmutante geplant ist, um somit m{\"o}gliche Auswirkungen auf die Expression von bvg-abh{\"a}ngigen Genen zu beobachten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit lag in der Struktur-Funktionsanalyse des Response Regulators BvgA aus B. holmesii (BvgABH). K{\"u}rzlich konnte gezeigt werden, dass trotz der umfangreichen Sequenzkonservierung der BvgA-Proteine aus B. holmesii und B. pertussis, eine B. pertussis bvgA-Mutante nicht durch den bvgA-Lokus aus B. holmesii komplementiert werden konnte (Gerlach et al., 2004). Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein hybrider Response Regulator BvgAfus konstruiert, der aus der Receiver- und Linker-Dom{\"a}ne des BvgABH-Proteins und der Output-Dom{\"a}ne von BvgABP zusammengesetzt ist. Voraussetzung hierf{\"u}r war die Kenntnis der einzelnen Dom{\"a}nengrenzen und die Sequenz des Linker-Bereiches des Response Regulators BvgA aus B. pertussis (BvgABP), welche durch limitierte Proteolyse und massenspektrometrische Methoden identifiziert wurden (Bantscheff et al., 2000). Im Falle des hybriden Proteins konnte im Gegensatz zu BvgABH eine Bindung an BvgABP-abh{\"a}ngige Promotorsequenzen beobachtet werden. Zudem war BvgAfus in der Lage, die Expression BvgABP-abh{\"a}ngiger Gene in vivo zu induzieren. Allerdings war es in seiner Phosphorylierungseffizienz im Vergleich zum wildtypischen Response Regulator-Protein aus B. holmesii eingeschr{\"a}nkt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die wenigen Abweichungen zwischen den Aminos{\"a}uresequenzen der Output-Dom{\"a}nen daf{\"u}r verantwortlich sind, dass das BvgABH-Protein die Funktion von BvgABP in vivo und in vitro nicht {\"u}bernehmen kann. So unterscheiden sich die Output-Dom{\"a}nen der Response Regulatoren aus B. pertussis und B. holmesii in zehn Aminos{\"a}ureaustauschen, wobei davon vier Aminos{\"a}uren innerhalb des Helix-Turn-Helix-Motives ver{\"a}ndert sind. Um zu untersuchen, ob die unterschiedlichen DNA-Binde- und transkriptionsaktivierenden Eigenschaften von BvgABH im Besonderen auf diese Aminos{\"a}ureunterschiede zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind, wurden mittels ortspezifischer Mutagenese die Aminos{\"a}uresequenz innerhalb des Helix-Turn-Helix-Motives an die Sequenz aus B. pertussis angeglichen. Das resultierende Protein BvgABH* zeigte eine dem wildtypischen BvgABH-Protein {\"a}hnliche Phosphorylierungseffizienz, war aber nicht in der Lage, BvgABP-abh{\"a}ngige Zielsequenzen spezifisch zu erkennen bzw. die Funktion des BvgABP-Proteins in vivo zu ersetzen. Dieses Ergebnis l{\"a}sst vermuten, dass die wenigen Aminos{\"a}ureunterschiede der Output-Dom{\"a}ne außerhalb der DNA-Binderegion zwar nicht im Zusammenhang mit der Phosphorylierungseffizienz stehen, jedoch die DNA-Bindeeigenschaften beeinflussen.},
  subject      = {Bordetella},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Stuebs2004,
  author    = {St{\"u}bs, Dorothee},
  title     = {Identifizierung und Regulation von k{\"a}lteinduzierbaren Faktoren aus B. bronchiseptica},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12704},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {K{\"a}lteschockproteine werden in Bakterien, gleichermaßen wie die gut charakterisierten Hitzeschockproteine, bei hohen Temperaturschwankungen stark induziert und erm{\"o}glichen der Zelle durch unterschiedliche Funktionen ein Wachstum in der K{\"a}lte. In dieser Promotionsarbeit wurde begonnen, die K{\"a}lteschock-Antwort von Bakterien des Genus Bordetella zu charakterisieren. Sowohl B. bronchiseptica als auch B. pertussis codieren f{\"u}r f{\"u}nf K{\"a}lteschockproteine, die als CspA, CspB, CspC, CspD und CspE bezeichnet werden. Die f{\"u}nf Proteine weisen eine signifikante Homologie zum Haupt-K{\"a}lteschockprotein CspA aus E. coli auf. W{\"a}hrend in den Modellorganismen E. coli und B. subtilis mindestens vier (E. coli) bzw. alle drei (B. subtilis) csp-Gene deletiert sein m{\"u}ssen, um einen Wachstumsdefizit zu erkennen, gen{\"u}gt im Falle von B. bronchiseptica eine einzige Insertionsmutation im Gen cspB, um einen temperaturunabh{\"a}ngigen Wachstumsdefekt zu beobachten. Nach einem K{\"a}lteschock werden in B. bronchiseptica drei der f{\"u}nf csp-Gene, cspA, cspB und cspC, deutlich induziert. Betrachtet man das Expressionsmuster der f{\"u}nf csp-Gene unter verschiedenen Stressbedingungen, wie Zugabe von translationshemmenden Antibiotika, Hitzeschock oder osmotischer Stress, so l{\"a}sst sich ein komplexes Expressionsmuster aufzeichnen. Außerdem besitzen die drei k{\"a}lteinduzierbaren Gene cspA, cspB und cspC mehrere Transkriptionsstartpunkte, deren Transkriptmengen unter den verschiedenen Schockbedingungen stark variieren. Es stellte sich heraus, dass eine {\"U}berexpression von CspB aus B. bronchiseptica f{\"u}r die E. coli - Zelle toxisch ist, daher wurde das CspB-Protein als GST-Fusionsprotein exprimiert und {\"u}ber Glutathion-Sepharose aufgereinigt. Um eine potentielle Funktion von CspB in der Zelle zu untersuchen, wurden Filterbindeassays mit CspB::GST durchgef{\"u}hrt. Es wurde eine hochaffine, aber unspezifische Bindung an ssDNA festgestellt, was auf eine m{\"o}gliche Funktion von CspB als Chaperon hindeutet. Nach Synthese eines CspB-spezifischen Antik{\"o}rpers wurde die K{\"a}lteinduktion von CspB auch auf Proteinebene nachgewiesen. Durch 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrische Charakterisierung konnten 17 weitere k{\"a}lteinduzierbare Proteine aus B. bronchiseptica identifiziert werden. Darunter waren u. a. ein Chaperon mit {\"A}hnlichkeit zu GroES, ein Translationsinhibitor BB2940 und das CspB. Diese k{\"a}lteinduzierbaren Proteine {\"a}hneln den CIPs aus E. coli. Weiterhin konnten noch das UspA und mehrere am Metabolismus beteiligte Proteine als CIPs aus B. bronchiseptica identifiziert werden, was signifikante Unterschiede in Bezug auf die K{\"a}lteadaptation zwischen den beiden Organismen aufzeigt. Betrachtet man die Promotorbereiche aller identifizierten csp-Gene, so f{\"a}llt eine f{\"u}r diese Gene typische sehr lange 5'UTR auf. Innerhalb dieser upstream Region findet man in vier der f{\"u}nf csp-Gene einen 9 bp langen Consensus mit der Sequenz TCCTTGATT, der in nahezu gleichem Abstand vom postulierten Startcodon vorkommt. Diese identifizierte 9bp-box ist f{\"u}r eine effiziente Transkription in der K{\"a}lte jedoch nicht von Bedeutung. Auf posttranskriptioneller Ebene wird die lange 5'UTR f{\"u}r die Stabilisierung der cold-shock mRNA in der K{\"a}lte verantwortlich gemacht. Außerdem ist das Vorhandensein der kompletten 5'UTR essentiell f{\"u}r eine effiziente Translation bei niedriger Temperatur, wobei eine Mutation der 9bp-box einen geringen, aber signifikanten negativen Effekt auf die Translation aus{\"u}bt. Sechs Gene, der neu identifizierten CIPs, beinhalten ebenfalls eine 9bp-box in ihrer upstream Region. Interessanterweise werden zwei der f{\"u}nf csp-Gene, cspC und cspD, vom BvgAS Zweikomponentensystem, dem Haupttranskriptionsregulator der Virulenzgene im Genus Bordetella, reguliert. Die beiden Gene geh{\"o}ren zu den Bvg-negativ regulierten Genen, die in der Bvg-minus-Phase exprimiert werden. Weiterhin beeinflusst eine leichte {\"U}berexpression von CspB aus B. pertussis die Expression der Adenylatzyklase sowohl in B. pertussis, als auch in B. bronchiseptica negativ. Dieser f{\"u}r das CspB spezifische Effekt erinnert an das strukturell verwandte Tex-Protein (Fuchs et al, 1996; K{\"o}nig et al, 2002). Beide Proteine beeinflussen die Expression der Virulenzfaktoren negativ, wobei f{\"u}r CspB gezeigt werden konnte, dass es einen direkten Einfluss auf die verminderte cyaA-Expression auf Transkriptionsebene besitzt. Dies zeigt eine Verbindung der K{\"a}lteschockantwort mit dem Virulenz-Regulon der Bordetellen, deren Rolle im Infektionszyklus bislang ungekl{\"a}rt ist.},
  subject      = {Bordetella bronchiseptica},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gerlach2004,
  author    = {Gerlach, Gabriele},
  title     = {Funktionelle Charakterisierung des BvgAS BH-Zwei-Komponentensystems von Bordetella holmesii},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-10419},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Zur Gattung Bordetella geh{\"o}ren mehrere zum Teil sehr eng miteinander verwandte Keime, die bislang, mit Ausnahme des Umweltisolats B. petrii, ausschließlich in Assoziation mit einem Wirtsorganismus nachgewiesen werden konnten. Hierzu geh{\"o}ren zum einen die „klassischen" Arten, deren pathogenes Potential vom obligat humanpathogenen Erreger des Keuchhustens, B. pertussis, dem ebenfalls humanpathogenen Keim B. parapertussis bis hin zu B. bronchiseptica, dem Erreger von Atemwegserkrankungen in verschiedenen S{\"a}ugetieren, reicht. Zum anderen wurde dieser Gattung mit B. avium, B. hinzii, B. trematum, B. holmesii und B. petrii in den letzten Jahren „neue" Arten zugeordnet, die zum Teil humanpathogenes, zum Teil tierpathogenes Potential besitzen. Da die evolution{\"a}ren Beziehungen der „neuen" Bordetella-Arten innerhalb der Gattung Bordetella bislang noch wenig untersucht wurden, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Verbreitung und Konservierung von bekannten Bordetella-Genen und IS-Elementen bei den „neuen" Bordetella-Arten untersucht. Aufgrund der vermehrten Hinweise auf ein humanpathogenes Potential von B. holmesii und seiner Assoziation mit einem dem Keuchhusten {\"a}hnlichen Krankheitsbild wurde der Schwerpunkt dieser Untersuchungen auf die Analyse der phylogenetischen Beziehungen zwischen B. holmesii und dem B. bronchiseptica-Cluster gelegt. W{\"a}hrend durch den Nachweis der bei dem B. bronchiseptica-Cluster vorkommenden IS-Elemente IS481 und IS1001 die durch die 16S rDNA-Sequenz ermittelte Position von B. holmesii innerhalb des B. bronchiseptica-Clusters best{\"a}tigt werden konnte, ergab eine vergleichende Sequenzanalyse der in der Gattung Bordetella hoch konservierten Proteine OmpA, BvgA und BvgS die interessante Beobachtung, dass dieser Organismus in dieser Hinsicht viel mehr {\"A}hnlichkeiten zu den „neuen" Bordetella-Arten besitzt und in diesem Zusammenhang phylogenetisch eher im Umfeld von B. avium anzusiedeln ist. Bei der Charakterisierung von vier unterschiedlichen B. holmesii-Blutisolaten wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei variante B. holmesii-St{\"a}mme identifiziert, die sich hinsichtlich der fehlenden Expression des intakten Response-Regulators BvgABH von wildtypischen B. holmesii-Isolaten unterscheiden. Im weiteren konnte gezeigt werden, dass bei diesen phasenvarianten St{\"a}mmen die fehlende Expression auf eine Punktmutation innerhalb der bvgABH-Nukleotidsequenz zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Diese wird in beiden F{\"a}llen an der selben Nukleotidposition durch die Insertion eines Adenosinrestes hervorgerufen. Obwohl dieser Sequenzabschnitt nicht durch eine repetitive Nukleotidfolge gekennzeichnet ist und somit keinerlei {\"A}hnlichkeiten mit einer f{\"u}r Frameshift-Mutationen anf{\"a}lligen Stelle besitzt, k{\"o}nnte es sich bei der identifizierten DNA-Region dennoch um einen „hot spot" f{\"u}r eine Punktmutation handeln, da die zwei varianten B. holmesii-St{\"a}mmen unabh{\"a}ngig voneinander aus unterschiedlichen Blutkulturen isoliert wurden. Von besonderer Bedeutung war zudem die Beobachtung, dass sich unter diesen varianten St{\"a}mmen auch der bei den Stammsammlungen als Referenzstamm abgelegte B. holmesii-Stamm ATCC51541 befindet. Da im Rahmen dieser Arbeit keinerlei offensichtliche ph{\"a}notypische Unterschiede zwischen den varianten und den wildtypischen B. holmesii-St{\"a}mmen festgestellt werden konnten, bleibt die Bedeutung der Phasenvariation bei B. holmesii bislang noch ungekl{\"a}rt. Im weiteren wurde mit Hilfe eines „Genome Walks" die an den bvgABH-Leserahmen angrenzenden DNA-Bereiche f{\"u}r B. holmesii ermittelt. Dabei konnte 5 bp nach dem bvgABH-Stoppcodon ein weiterer Leserahmen (bvgSBH) identifiziert werden, welcher Homologien zu der Histidinkinase BvgS aus B. pertussis besitzt. Interessanterweise stellte sich bei der Sequenzanalyse heraus, dass der Konservierungsgrad des bvgASBH-Locus aus B. holmesii und des bvgAS-Locus aus B. pertussis auf DNA-Ebene sehr gering ist. Diese Beobachtung erkl{\"a}rt wiederum, warum der bvgASBH-Genlocus aus B. holmesii fr{\"u}her nicht durch DNA/DNA- Hybridisierungs-Experimente mit einer B. pertussis spezifischen DNA-Sonde nachgewiesen werden konnte und sein Vorhandensein erst nach dem Einsatz von degenerierten Primern {\"u}ber PCR-Analysen detektiert werden konnte. Im weiteren konnte {\"u}ber den „Genome Walk" gezeigt werden, dass die an dem bvgAS-Locus angrenzenden DNA-Bereiche innerhalb der Gattung Bordetella nicht konserviert sind. Zum einen ist der bvgASBH-Locus aus B. holmesii nicht wie bei dem B. bronchiseptica-Cluster in 5´-Richtung von dem fhaB-orthologen Genlocus benachbart, da sich an dieser Stelle ein weiterer, potentieller Response-Regulator befindet. Ebenso konnten stromaufw{\"a}rts von bvgASBH keinerlei Hinweise auf das Vorhandensein eines, dem bvgR-Gen der „klassischen" Arten orthologen Leserahmens erzielt werden. {\"U}ber weitere Sequenzanalysen konnte dar{\"u}ber hinaus gezeigt werden, dass der Promotorbereich des bvgASBH-Genlocus {\"u}berraschenderweise keinerlei offensichtliche Sequenzhomologien zu dem entsprechenden Promotorbereich der bvgAup-Region der „klassischen" Arten zeigt. Dennoch konnten {\"u}ber in silico-Analysen mehrere Sequenzmotive innerhalb der bvgABHup-Region identifiziert werden, die als „inverted repeat"-Strukturen angeordnet sind und die zum Teil eine hohe {\"U}bereinstimmung zu der f{\"u}r die „klassischen" Bordetella-Arten beschriebene BvgA-Konsensussequenz 5´-T/A T T C C/T T A-3 besitzen. W{\"a}hrend sich diese Wiederholungssequenzen hinsichtlich ihrer Symmetrie und ihrer Anordnung von denen innerhalb der f{\"u}r das B. bronchiseptica-Cluster beschriebenen bvgAup-Region unterscheiden, konnten auff{\"a}llige Parallelen zu der Promotorregion des vag- (virulence activated gene) Gens bvgR festgestellt werden. Obwohl sowohl der Response-Regulator BvgABH aus B. holmesii als auch das BvgA-Protein aus B. pertussis in vitro an die „inverted repeat" Strukturen der bvgABHup-Region binden kann, f{\"u}hrte eine Analyse der GFP-Expression der Reportergenfusion bvgABHup-gfp zu der erstaunlichen Beobachtung, dass die Reportergenfusion in B. pertussis durch die Bindung des BvgA-Proteins reprimiert wird, w{\"a}hrend sie im Gegensatz dazu in B. holmesii durch die Bindung des BvgABH-Proteins aktiviert wird. Die molekulare Grundlage f{\"u}r diese unterschiedlichen Regulationsmechanismen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht ermittelt werden. Trotz einer umfangreichen Sequenzkonservierung zwischen dem Response-Regulator BvgABH aus B. holmesii und BvgA aus B. pertussis ist das BvgABH-Protein nicht in Lage, die Funktion des BvgA-Proteins aus B. pertussis in vitro bzw. in vivo zu ersetzen. Im Gegensatz dazu konnte mit Hilfe von Komplementationsexperimenten gezeigt werden, dass die Histidinkinase BvgSBH aus B. holmesii in der Lage ist, die Funktion des in dem B. pertussis Stamm 347 mutierten BvgS-Proteins zu {\"u}bernehmen. {\"U}berraschenderweise unterschiedet sich jedoch das BvgSBH-Protein hinsichtlich der Wahrnehmung der Umweltstimuli von BvgS, da die Aktivit{\"a}t der Histidinkinase BvgSBH in dem hybriden B. pertussis Stamm BP 347 (pRK415-bvgASBH ATCC51541) nicht vollst{\"a}ndig durch Sulfationen moduliert werden kann. Dies ist m{\"o}glicherweise darauf zur{\"u}ckzuf{\"u}hren, dass im Gegensatz zu den cytoplasmatischen Regionen die BvgSBH- und BvgS- Sensorproteine vor allem in ihren sensorischen Bereichen einen sehr geringen Konservierungsgrad aufweisen.},
  subject      = {Bordetella},
  language  = {de}
}