@phdthesis{FernandezMora2005,
  author    = {Fern{\´a}ndez-Mora, Eugenia},
  title     = {Analysis of the maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles in macrophages},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14049},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Rhodococcus equi is a Gram-positive intracellular pathogen which can cause severe bronchopneumonia in foals. In recent years, the role of this bacterium as human pathogen has been noted, as R.equi infections in humans have increase in frequency. This increase is associated with the rise in immunosupressed individuals, specially AIDS patients, where infection leads to symptoms and pathology similar to those seen in foals with a high mortality rate. Due to its capability to survive and multiply in murine and equine macrophages, R.equi has been classified as a facultative intracellular bacterium. R.equi is found frequently in macrophages in alveolar infiltrate from infected animals. The pathogenicity of R.equi depends on its ability to exist and multiply inside macrophages and has been associated with the presence of virulence plasmids. It has been observed that, inside foal alveolar macrophages, R.equi-containing vacuoles (RCVs) do not mature into phagolysosomes. However, most of the intracellular events during R.equi infection have not been investigated in detail. The aim of this study was to elucidate the intracellular compartmentation of R.equi and the mechanism by which the bacteria avoid destruction in host macrophages. The importance of the virulence-associated plasmids of R.equi for the establishment of RCVs was also evaluated. Furthermore, the intracellular fate of viable and non-viable R.equi was compared in order to study whether viability of R.equi influeciantes the establishment of RCVs. In this study, the RCV was characterized by using a variety of endocytic markers to follow the path of the bacteria trhough murine macropages. Transmission electron microscopy-base analysis showed that R.equi was found equally frequently in phagosomes with loosely or thightly apposed membranes, and RCV often contains numerous membranous vesicles. Laser scanning microscopy of infected macrophages showed that the majority of phagosomes containing R.equi acquired transiently the early endosomal markers Rab5, Ptlns3P, and EEA-1, suggesting initially undisturbed phagosome maturation. Although the RCV acquired some late endosomal markers, such as Rab7, LAMP-1, and Lamp-2, they did not acquired vATPase, did not interact with pre-labeled lysosomes, and failed to acidify. These data clearly suggest that the RCV is a compartment which has left vacuoles that resemble multivesicular body compartments (MVB), which are transport intermediates between early and late endosomes and display internal vesicles very similar to the ones observed within RCVs. Analyisis of several R.equi strains containing either VapA- or VapB-expressing plasmids or neither demonstrated that the possession of the virulence-associated plasmids does not affect phagosome trafficking over a two hour period of infection. The finding that non-viable R.equi was still able to inhibit phagosome maturation (although not to the same extent as viable R.equi did) suggests that heat-insensitive factors, such as cell periphery lipids, may play a major role in inhibition of phagosome maturation, although heat-sensitive factors may also be involved.},
  subject      = {Rhodococcus equi},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Luehrmann2002,
  author    = {L{\"u}hrmann, Anja},
  title     = {Analyse der Reifung von Afipien- und Rhodokokken-enthaltenden Phagosomen in Makrophagen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1619},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {Die Isolierung von Phagosomen erm{\"o}glicht die biochemische Analyse der Phagosomen-Zusammensetzung sowie der an der Phagosomenreifung beteiligten Molek{\"u}le. Deshalb wurde im Rahmen dieser Promotionsarbeit eine Methode entwickelt, die es erm{\"o}glicht, Bakterien-enthaltende Phagosomen zu isolieren. Diese Methode erzielt im Vergleich zu anderen in der Literatur beschriebenen Methoden eine gute Ausbeute (fast 40 Prozent) und vor allem eine h{\"o}here Reinheit an Bakterien-enthaltenden Phagosomen. So besteht keine Kontamination mit Teilen des Golgi-Apparates und nur eine sehr geringe Kontamination mit endosomalen und lysosomalen Proteinen sowie Plasmamembranbestandteilen. Allerdings wurde eine Kontamination mit Mitochondrien und ER detektiert. Letzteres muss nicht unbedingt eine Kontamination darstellen, sondern k{\"o}nnte ein wichtiger Bestandteil von Phagosomen sein. Afipia felis ist ein Gram-negatives Bakterium, das f{\"u}r einige F{\"a}lle der Katzen-Kratz Krankheit verantwortlich ist. Es kann innerhalb von Makrophagen {\"u}berleben und sich vermehren. Die genaue Kompartimentierung der Afipia felis-enthaltenden Phagosomen in Makrophagen war allerdings unbekannt und sollte deshalb in der vorliegenden Promotionsarbeit analysiert werden. Ovalbumin Texas Red, mit dem Lysosomen vor der Infektion markiert wurden, gelangt nicht in die Afipien-enthaltenden Phagosomen, und die Afipien-enthaltenden Phagosomen sind auch nicht zug{\"a}nglich f{\"u}r Ovalbumin Texas Red, mit dem das gesamte endozytische System nach der etablierten Infektion markiert wurde. Außerdem sind etablierte, isolierte Afipia felis-enthaltende Phagosomen nur in geringem Umfang positiv f{\"u}r sp{\"a}t endosomale/lysosomale Markerproteine und negativ f{\"u}r fr{\"u}h endosomale Markerproteine. Die Afipien, die ein nicht endozytisches Kompartiment etablieren, werden vom Makrophagen in ein EEA1-negatives Kompartiment aufgenommen, das auch zu sp{\"a}teren Zeitpunkten negativ f{\"u}r LAMP-1 ist. Nur die circa 30 Prozent der Afipien, die sich in einem Kompartiment befinden, das zum endozytischen System geh{\"o}rt, gelangen nach der Aufnahme durch den Makrophagen in ein EEA1-positives Kompartiment, das zu einem sp{\"a}teren Zeitpunkt positiv f{\"u}r LAMP-1 wird. T{\"o}tung der Afipien oder Opsonisierung mit Antik{\"o}rpern vor der Infektion normalisiert die Reifung der Afipia felis-enthaltenden Phagosomen in den J774E-Makrophagen. Somit konnte nachgewiesen werden, dass die Mehrzahl der Phagosomen (70 Prozent), die Afipia felis enthalten, nicht zum endozytischen System geh{\"o}ren. Diese ungew{\"o}hnliche Kompartimentierung besteht bereits bei der Aufnahme und kann nur von lebenden Afipien etabliert werden. Rhodococcus equi ist ein Gram-positives Bakterium, das unter anderem Bronchopneumonien beim Fohlen verursacht. Aber auch Menschen und andere S{\"a}ugetiere sind von Infektionen mit R. equi betroffen. Die F{\"a}higkeit der Rhodokokken, innerhalb der Makrophagen zu {\"u}berleben und sich zu vermehren, ist mit dem Vorhandensein eines 85 kbp Plasmids assoziiert. Da {\"u}ber die genaue Kompartimentierung von R. equi im Mausmakrophagen wenig bekannt war, und der Frage, ob es einen Unterschied zwischen der Kompartimentierung von R. equi(+)- und R. equi(-)-enthaltenden Phagosomen gibt, noch nicht nachgegangen wurde, war beides Thema dieser Promotionsarbeit. Dabei zeigt sich, dass R. equi(-)-enthaltende Phagosomen wesentlich st{\"a}rker mit den sp{\"a}t endosomalen/lysosomalen Markerproteinen vATPase und LAMP-1 assoziiert sind sowie eine h{\"o}here ß-Galaktosidase-Aktivit{\"a}t aufweisen als die R. equi(+)-enthaltenden Phagosomen. Da sowohl die isolierten R. equi(-)- als auch die R. equi(+)-enthaltenden Phagosomen mit dem fr{\"u}h endosomalen Markerprotein rab5 assoziiert sind, ist anzunehmen, dass Rhodokokken unabh{\"a}ngig vom Vorhandensein des 85 kbp Plasmids in der Lage sind, die Phagosomenreifung zu verz{\"o}gern. Aber R. equi(-) kann die Reifung zwar verz{\"o}gern, aber letztendlich nicht verhindern. Wahrscheinlich reifen die Phagosomen, die R. equi(-) enthalten, zu einem sp{\"a}teren Zeitpunkt zu Phagolysosomen, wohingegen R. equi(+) ein ungew{\"o}hnliches Kompartiment etabliert und dadurch die Phagosomenreifung endg{\"u}ltig zu verhindern scheint. Somit ist anzunehmen, dass mindestens ein vom 85 kbp Plasmid kodiertes Molek{\"u}l f{\"u}r die Etablierung dieses ungew{\"o}hnlichen, R. equi(+)-enthaltenden Kompartimentes, verantwortlich ist. Da eine Infektion mit Rhodococcus equi zytotoxisch f{\"u}r die infizierte Zelle sein kann, wurde die von den Rhodokokken vermittelte Zytotoxizit{\"a}t n{\"a}her analysiert. Die in dieser vorliegenden Promotionsarbeit dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich, dass nur die Plasmid-enthaltenden Rhodokokken zur Nekrose, aber nicht zur Apoptose ihrer Wirtszellen f{\"u}hren, w{\"a}hrend R. equi(-) keinen Einfluss auf die Vitalit{\"a}t ihrer Wirtszellen haben. Dieses Ph{\"a}nomen ist allerdings abh{\"a}ngig vom Wirtszelltyp. So sind R. equi(-) als auch R. equi(+) f{\"u}r humane Monozyten nur geringf{\"u}gig zytotoxisch.},
  subject      = {Afipia},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Wenzel2014,
  author    = {Wenzel, Jens},
  title     = {Regulation of TLR-induced macrophage responses by cytoskeleton-associated phosphoproteins},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-98843},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Toll-like receptors (TLR) are pattern recognition receptors (PRR) by which macrophages (M{\O}) sense pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). The recognition of lipopolysaccharide (LPS), the PAMP of gram negative bacteria, by TLR4 triggers signaling cascades and leads to the pro-inflammatory activation of the cells. A recent quantitative and kinetic analysis of the phosphoproteome of LPS-activated primary macrophages highlighted the cytoskeleton as a cell compartment with an enriched protein phosphorylation. In total 44 cytoskeleton-associated proteins were regulated by this post-translational modification and thus might be involved in the control and regulation of key macrophage functions like spreading, motility and phagocytosis. To investigate the control of cytoskeleton-associated cell functions by TLR4 activation, we first developed a method to quantitatively measure the spreading response of bone marrow M{\O} after stimulation with LPS. Fluorescence microscopy was used for cell imaging and visualisation of the M{\O} contact area. In collaboration with the Fraunhofer Institute Erlangen, we developed and validated a software tool for the semi-automated segmentation and quantitation of M{\O} fluorescence microscopy data, which allowed fast, robust and objective image analysis. Using this method, we observed that LPS caused time-dependent spreading, which was detectable after 1-2 h and maximal after 24 h. Next, the impact of genetic or pharmacological inhibition of known TLR signaling components was investigated. Deficiency in the adapter protein MYD88 strongly reduced spreading activity at the late time points, but had no impact early after LPS-stimulation. A similar effect was observed upon pharmacological inhibition of ERK1/2 signaling, indicating that ERK1/2 mediates MYD88-dependent M{\O} spreading. In contrast, M{\O} lacking the MAPK p38 were impaired in the initial spreading response but responded normally 8-24 h after stimulation. The genetic deletion of the MAPK phosphatases DUSP1 and DUSP16 resulted in impaired late spreading, corroborating the essential role for functional MAPK signaling in TLR4-driven M{\O} spreading. To identify the contribution of other cytoskeletal phosphoproteins to M{\O} spreading, siRNA knockdown of selected candidate genes in primary murine M{\O} was employed and combined with automated quantitative image analysis. These experiments revealed a functional role for the Myosins MYO1e and MYO1f in M{\O} spreading. These motor proteins are strongly phosphorylated in LPS-activated M{\O}. Because of their ability to simultaneously bind to actin filaments and cell membrane or other proteins, we investigated their role in phagocytosis, cytokine production and antigen presentation. Phagocytosis and killing of bacteria were not affected in Myo1e-/- macrophages. However, MYO1e plays a role in chemokine secretion and antigen presentation processes. MCP1 (CCL2) release was selectively increased in Myo1e-deficient M{\O} and dendritic cells (DC), while cytokine secretion was unaffected. Furthermore, macrophages and DCs lacking MYO1e showed lower levels of MHC-II on the cell surface. However, mRNA levels of CCL2 and of MHC-II were unaltered. These data suggest a role for MYO1e in the transport of selected chemokines and of MHC-II molecules to the cell surface. MHC-II-restricted antigen presentation assays revealed an impaired capacity of macrophages and DC lacking MYO1e to stimulate antigen-specific T cells, suggesting that the reduced MHC-II expression is functionally relevant. Taken together, in this study first a quantitative image analysis method was developed which allows the unbiased, robust and efficient investigation of the macrophage spreading response. Combination of this method with siRNA knockdown of selected cytoskeleton-associated phosphoproteins led to the identification of MYO1e and MYO1f as regulators of macrophage spreading. Furthermore, we identified MYO1e in M{\O} and DC to be essential for the intracellular transport of CCL2 and MHC-II to the cell surface and for optimal stimulation of antigen-specific CD4 T cells.},
  subject      = {Toll-like-Rezeptoren},
  language  = {en}
}