@phdthesis{Rajab2021,
  author    = {Rajab, Suhaila},
  title     = {Untersuchung von Sub-Millisekunden Dynamiken und allosterischer Kommunikation in Ligandenbindedom{\"a}nen ionotroper Glutamatrezeptoren},
  doi       = {10.25972/OPUS-24494},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-244946},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Ionotrope Glutamatrezeptoren (iGluRs) sind ligandengesteuerte Ionenkan{\"a}le und vermitteln den Großteil der exzitatorischen Signalweiterleitung im gesamten zentralen Nervensystem. Dar{\"u}ber hinaus spielen iGluRs eine entscheidende Rolle bei der neuronalen Entwicklung und Funktion, einschließlich Lernprozessen und Ged{\"a}chtnisbildung. Da eine Fehlfunktion dieser Rezeptoren mit zahlreichen neurodegenerativen Erkrankungen verbunden ist, stellen iGluRs zudem wichtige Zielproteine f{\"u}r die pharmakologische Wirkstoffentwicklung dar. Im Allgemeinen wird zwischen drei Untergruppen ionotroper Glutamatrezeptoren unterschieden, welche aufgrund ihrer Selektivit{\"a}t f{\"u}r einen bestimmten Liganden benannt sind: AMPA-, Kainate-, und NMDA-Rezeptoren. Die iGluRs jeder dieser Untergruppen bestehen in der Regel aus vier Untereinheiten, welche wiederum aus vier semiautonomen Dom{\"a}nen aufgebaut sind: (i) die aminoterminale Dom{\"a}ne (ATD), (ii) die Ligandenbindedom{\"a}ne (LBD), (iii) die Transmembrandom{\"a}ne (TMD) und (iv) die carboxyterminale Dom{\"a}ne (CTD). Die Ligandenbindedom{\"a}ne, welche wiederum aus zwei Lobes (D1 und D2) besteht und in ihrer Struktur einer Muschelschale {\"a}hnelt, vollzieht bei Bindung eines Neurotransmitters eine Konformations{\"a}nderung, wobei sie sich um den gebundenen Agonisten herumschließt. Diese Konformations{\"a}nderung der LBD wird auf die Transmembrandom{\"a}ne, welche den membran{\"u}berspannenden Ionenkanal ausbildet, {\"u}bertragen, was in einer Umlagerung der Transmembranhelices und infolgedessen der {\"O}ffnung des Ionenkanals resultiert. Die Konformations{\"a}nderung der LBD ist demnach die treibende Kraft, welche dem {\"O}ffnen und Schließen des Ionenkanals zugrunde liegt. Aus diesem Grund stellt die isolierte Ligandenbindedom{\"a}ne, welche als l{\"o}sliches Protein hergestellt werden kann, ein etabliertes Modellsystem zur Untersuchung der strukturellen und funktionellen Zusammenh{\"a}nge innerhalb des Funktionsmechanismus ionotroper Glutamatrezeptoren dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Konformationsdynamiken der in Escherichia coli-Bakterien exprimierten isolierten Ligandenbindedom{\"a}nen der drei homologen Untergruppen - AMPA-, Kainate- und NMDA-Rezeptoren - sowohl als Monomer als auch als Dimer untersucht. Hierbei wurden im ungebundenen Apo-Zustand der Proteine signifikante Kinetiken im Bereich von Nanosekunden bis Mikrosekunden festgestellt, welche bei Bindung eines Agonisten sowie bei Dimerisierung erheblichen Ver{\"a}nderungen zeigen. Dar{\"u}ber hinaus wurde allosterische Kommunikation zwischen den LBDs der NMDA-Untergruppe untersucht, wobei in der Tat ein deutlicher allosterischer Effekt in Bezug auf die Konformationsdynamiken der Proteine gemessen werden konnte. Weiterhin wurde ein PET-FCS-basiertes Verfahren zur Messung der Dissoziationskonstante der Bindung eines Liganden an die LBD eines AMPA-Rezeptors entwickelt. Zuletzt wurde außerdem ermittelt, ob ein Unterschied zwischen vollen und partiellen Agonisten hinsichtlich ihres Einflusses auf die Konformationsdynamiken einer AMPA-Rezeptor LBD besteht, was nachgewiesenermaßen nicht der Fall ist. Alle Messungen wurden auf Einzelmolek{\"u}lebene auf Zeitskalen von Nanosekunden bis Millisekunden basierend auf Fluoreszenzfluktuationen unter Verwendung des photoinduzierten Elektronentransfers (PET) in Kombination mit Korrelationsspektroskopie (PET-FCS) durchgef{\"u}hrt. Zu diesem Zweck wurden PET-basierte Fluoreszenzsonden entwickelt, um Konformations{\"a}nderungen auf einer r{\"a}umlichen Skala von einem Nanometer zu detektieren. Durch die Experimente innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die PET-FCS-Methode eine vielversprechende Erg{\"a}nzung zu allen bisher bestehenden Methoden zur Untersuchung der Konformationsdynamiken der Ligandenbindedom{\"a}ne ionotroper Glutamatrezeptoren darstellt und daher eine aussichtsreiche M{\"o}glichkeit zur Erweiterung des zuk{\"u}nftigen Verst{\"a}ndnisses der Funktionsweise von iGluRs bietet.},
  subject      = {Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schubert2021,
  author    = {Schubert, Jonathan},
  title     = {Bildgebende Zweifarben-Einzelmolek{\"u}l-PET-Fluoreszenzspektroskopie am molekularen Chaperon Hsp90},
  doi       = {10.25972/OPUS-24493},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-244938},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Im Forschungsfeld der Proteindynamik h{\"a}ufen sich in den letzten Jahren Untersuchungen an einzelnen Molek{\"u}len. Damit k{\"o}nnen molekulare Ereignisse, die in konventioneller Spektroskopie durch stochastische Prozesse unentdeckt bleiben, durch direkte Beobachtung identifiziert und analysiert werden, was zu tieferem mechanistischem Verst{\"a}ndnis des untersuchten Systems beitragen kann. Die Implikation des molekularen Chaperons Hsp90 in die korrekte Faltung und Aktivierung einer Vielzahl davon abh{\"a}ngiger Klientenproteine machen es zu einem zentralen Knotenpunkt der zellul{\"a}ren Proteinhom{\"o}ostase, allerdings ist der Mechanismus seiner breiten Klientenerkennung und -prozessierung bisher nur l{\"u}ckenhaft untersucht. Mit der Erkenntnis, dass Hsp90 ATP abh{\"a}ngig große, ratenlimitierende Umstrukturierungen erf{\"a}hrt, wurden Reportersysteme entwickelt, die auf dem F{\"o}rster-Resonanzenergietransfer mit einer r{\"a}umlichen Aufl{\"o}sung von ca. 2-10 nm basieren. Diese dokumentieren einen Klammerschluss des Chaperons und prognostizieren einen intermediatbbasierten Konformations-Zyklus. Details {\"u}ber den Mechanismus der Umstrukturierungen wurden mit der Entwicklung von Reportersystemen ermittelt, die auf dem photoinduzierten Elektronentransfer zwischen der Aminos{\"a}ure Tryptophan und einem organischen Farbstoff basieren. Die Technik beruht auf kontaktinduzierter Fluoreszenzl{\"o}schung und damit verbundenen digitalen Intensit{\"a}ts{\"u}berg{\"a}ngen, dabei erm{\"o}glicht die r{\"a}umliche Sensitivit{\"a}t von < 1 nm die Beobachtung von lokalen Umstrukturierungen. In Hsp90 wurden damit mittels konventioneller Spektroskopie drei kritische lokale Umlagerungen untersucht und daraus ein Modell mit heterogenen apo-Konformationen sowie ein kooperativer Konformationszyklus abgeleitet, der dem intermediatbasierten Modell gegen{\"u}bersteht. Im Rahmen dieser Dissertation wurde anhand des Hsp90-Chaperons eine Methode entwickelt, die eine bildgebende PET Fluoreszenzspektroskopie von mehreren Umstrukturierungen gleichzeitig an einzelnen Molek{\"u}len erlaubt. Ein umfangreiches Farbstoffscreening f{\"u}hrte zur Identifizierung eines Farbstoffpaars, das die PET-basierte simultane Aufzeichnung zweier Konformations-Koordinaten erm{\"o}glicht. {\"U}ber verschiedene Modifikationen des Chaperons konnten einzelmolek{\"u}ltaugliche Oberfl{\"a}chen hergestellt werden, auf denen zweifach markierte Hsp90-Proteine immobilisiert sind. Fluoreszenzintensit{\"a}tszeitspuren einzelner Chaperone und entsprechende Kontrollkonstrukte best{\"a}tigen qualitativ den Erfolg der Methode, f{\"u}r die quantitative Analyse wurde eine Routine in der Programmiersprache Python entwickelt, mit welcher kinetische Informationen ermittelt werden konnten. Diese legen eine enge wechselseitige Abh{\"a}ngigkeit der drei lokalen Elemente nahe, wobei der Großteil der Konformations{\"u}berg{\"a}nge zweier simultan aufgezeichneter Umstrukturierungen Synchronit{\"a}t innerhalb von zwei Sekunden zeigt. Im Vergleich zur Hydrolyse von einem ATP in mehreren Minuten deutet das auf eine enge Kopplung hin. Weiter konnte eine Beschleunigung der Dynamiken durch aromatische Modifikation des N-Terminus von Hsp90 beobachtet werden, zudem erlaubt der Einzelmolek{\"u}lansatz die Verwendung des nativen Nukleotids ATP, wodurch auch die lokalen {\"O}ffnungsdynamiken zug{\"a}nglich werden. Die zur Bestimmung der Zeitkonstanten durchgef{\"u}hrte Analyse unterst{\"u}tzt die Ansicht heterogener apo-Zust{\"a}nde und einer einheitlich geschlossenen Konformation. Die bildgebende Zweifarben-Einzelmolek{\"u}l-PET-Spektroskopie konnte insgesamt zu einem Komplement der Einzelmolek{\"u}l-FRET-Spektroskopie entwickelt werden, um damit lokale Konformationsdynamiken zu untersuchen. Der bildgebende Ansatz erlaubt eine einfache Implementierung in einen experimentellen Einzelmolek{\"u}l-FRET Aufbau bei gleichzeitiger Erweiterung der beobachteten Koordinaten und wird so zu einem breit anwendbaren Werkzeug multidimensionaler Dynamikuntersuchungen einzelner Proteine.},
  subject      = {Fluoreszenzspektroskopie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schwarze2014,
  author    = {Schwarze, Simone},
  title     = {Untersuchung von Faltungs- und Funktionsdynamik isolierter Proteindom{\"a}nen mittels Fluoreszenzl{\"o}schung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-107080},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Proteine bestehen aus einer spezifischen Sequenz verschiedener Aminos{\"a}uren, die ihre charakteristische Funktion bestimmt. Die große Variabilit{\"a}t an Aminos{\"a}uresequenzen erm{\"o}glichte die Evolution einer nahezu unbegrenzten Anzahl an Proteinen. Meistens nehmen diese Schl{\"u}sselpositionen ein, von robusten Baustoffen bis hin zu molekularen Maschinen. Daher kann eine Fehlfunktion gravierende Auswirkungen auf das Leben haben, z.B. Krankheiten wie Alzheimer oder Epilepsi. Um die Funktionen und Fehlfunktionen zu verstehen, ist eine umfassende Kenntnis der Proteinfaltung, der Protein-Protein Assoziation, sowie den Dynamiken innerhalb von Proteinen erforderlich. Diese Vorg{\"a}nge wurden in dieser Arbeit an drei isolierten Proteindom{\"a}nen durch die Anwendung der Fluoreszenzl{\"o}schmechanismen der H-Dimerbildung und des photoinduzierten Elektronentransfers untersucht. Der entfaltete Zustand der Bindungsdom{\"a}ne BBL, das Teil des 2-oxo-acid Dehydrogenasekomplexes ist, wurde unter physiologischen Bedingungen mit Zirkulardichroismus (CD) und einer Kombination aus photoinduziertem Elektronentransfer und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie analysiert. Beide Methoden zeigten {\"u}bereinstimmend anhand von 20 in BBL einzeln eingef{\"u}gten konservativen Punktmutationen, dass Seitenketteninteraktionen keine Auswirkungen auf die Sekund{\"a}rstruktur des denaturierten Zustandes, den Ausgangspunkt der Faltung, haben. Mit Hilfe der Dekonvolation der CD-Spektren wurde zudem gezeigt, dass die Reststruktur im denaturierten Zustand der helikalen Proteindom{\"a}ne von β-Str{\"a}ngen und β-Kehren dominiert wird, die eine entscheidende Funktion bei der Faltung in den nativen Zustand haben k{\"o}nnten. Die N-terminale Dom{\"a}ne (NTD), der f{\"u}r die Materialforschung hochinteressanten Spinnen-seidenfaser, ist f{\"u}r die Polymerisation des Spinnenseidenfadens auf den pH-Wechsel von pH 7 auf pH 6 hin verantwortlich. Dieser f{\"u}r die Proteinfunktion wichtige Prozess wurde durch die Einbringung eines extrinsischen Fluoreszenzschalters, basierend auf der H-Dimerbildung, mit der Stopped-Flow-Technik untersucht. Es wurde gezeigt, dass die NTDs 104 mit einer Rate von 3 x 10^8 M-1 s-1 assoziieren und somit nahezu das Geschwindigkeitslimit der Protein-Protein Assoziation erreicht wird. Zwei geladenen Seitenketten, der D39 und D40, kommt eine entscheidende Funktion in dem Prozess zu, da eine Mutation dieser die Assoziation verhindert. Des Weiteren wurde gezeigt, dass sich die NTD auf eine Erh{\"o}hung der Ionenst{\"a}rke entgegengesetzt zu anderen Proteinen verh{\"a}lt: die Dissoziation wird beschleunigt, die Assoziation nicht beeinflusst. Gleiches Verhalten wurde auf den einzelnen Austausch der {\"u}brigen protonierbaren Aminos{\"a}ureseitenketten hin beobachtet, ausgenommen die Mutation der E119, welche die Dissoziation verlangsamt. Daher scheint der makromolekulare Dipol, der auf Grund der Ladungsverteilung in der NTD entsteht, die Assoziation maßgeblich zu beeinflussen. Glutamatrezeptoren sind an der schnellen synaptischen Signalweiterleitung im Nervensys-tem von Vertebraten beteiligt. Die Konformationen der Ligandenbindungsdom{\"a}ne (LBD) haben dabei entscheidende Auswirkungen auf die Funktion des Gesamtrezeptors. Diese wurden mit einer Kombination aus photoinduziertem Elektronentransfer und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie untersucht. Mit dieser Methode wurde ein dynamisches Bild der gebundenen sowie ungebundenen Form der AMPA-spezifischen Glutamatrezeptor 2-LBD gezeigt. Es wurde zudem gezeigt, dass sich die Dynamiken in Abh{\"a}ngigkeit der Bindung von den Agonisten Glutamat und AMPA, dem partiellen Agonisten Kainate oder Cyclothiazid (CTZ), welches eine Dimerisierung der LBDs bewirkt, unterschiedlich ver{\"a}ndern. Dies k{\"o}nnte eine Auswirkung auf die Funktion der Rezeptoren haben. Die Anwendung der Fluoreszenzl{\"o}schmechanismen der H-Dimerbildung und des photoinduzierten Elektronentransfers in dieser Arbeit hat gezeigt, dass diese die M{\"o}glichkeit bieten, unterschiedlichste Fragestellungen zu beantworten und so Einblicke in dynamische Funktionsweisen von Proteinen er{\"o}ffnen. Kombiniert mit etablierten Fluoreszenzmethoden ist es so m{\"o}glich quantitativ Kinetiken auf unterschiedlichen Zeitskalen zu untersuchen.},
  subject      = {Protein-Protein-Wechselwirkung},
  language  = {de}
}