@article{ElKeredySchleyerKoenigetal.2012, author = {El-Keredy, Amira and Schleyer, Michael and K{\"o}nig, Christian and Ekim, Aslihan and Gerber, Bertram}, title = {Behavioural Analyses of Quinine Processing in Choice, Feeding and Learning of Larval Drosophila}, series = {PLoS One}, volume = {7}, journal = {PLoS One}, number = {7}, doi = {10.1371/journal.pone.0040525}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-130811}, pages = {e40525}, year = {2012}, abstract = {Gustatory stimuli can support both immediate reflexive behaviour, such as choice and feeding, and can drive internal reinforcement in associative learning. For larval Drosophila, we here provide a first systematic behavioural analysis of these functions with respect to quinine as a study case of a substance which humans report as "tasting bitter". We describe the dose-effect functions for these different kinds of behaviour and find that a half-maximal effect of quinine to suppress feeding needs substantially higher quinine concentrations (2.0 mM) than is the case for internal reinforcement (0.6 mM). Interestingly, in previous studies (Niewalda et al. 2008, Schipanski et al 2008) we had found the reverse for sodium chloride and fructose/sucrose, such that dose-effect functions for those tastants were shifted towards lower concentrations for feeding as compared to reinforcement, arguing that the differences in dose-effect function between these behaviours do not reflect artefacts of the types of assay used. The current results regarding quinine thus provide a starting point to investigate how the gustatory system is organized on the cellular and/or molecular level to result in different behavioural tuning curves towards a bitter tastant.}, language = {en} } @article{BugaScholzKumaretal.2012, author = {Buga, Ana-Maria and Scholz, Claus J{\"u}rgen and Kumar, Senthil and Herndon, James G. and Alexandru, Dragos and Cojocaru, Gabriel Radu and Dandekar, Thomas and Popa-Wagner, Aurel}, title = {Identification of New Therapeutic Targets by Genome-Wide Analysis of Gene Expression in the Ipsilateral Cortex of Aged Rats after Stroke}, series = {PLoS One}, volume = {7}, journal = {PLoS One}, number = {12}, doi = {10.1371/journal.pone.0050985}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-130657}, pages = {e50985}, year = {2012}, abstract = {Background: Because most human stroke victims are elderly, studies of experimental stroke in the aged rather than the young rat model may be optimal for identifying clinically relevant cellular responses, as well for pinpointing beneficial interventions. Methodology/Principal Findings: We employed the Affymetrix platform to analyze the whole-gene transcriptome following temporary ligation of the middle cerebral artery in aged and young rats. The correspondence, heat map, and dendrogram analyses independently suggest a differential, age-group-specific behaviour of major gene clusters after stroke. Overall, the pattern of gene expression strongly suggests that the response of the aged rat brain is qualitatively rather than quantitatively different from the young, i.e. the total number of regulated genes is comparable in the two age groups, but the aged rats had great difficulty in mounting a timely response to stroke. Our study indicates that four genes related to neuropathic syndrome, stress, anxiety disorders and depression (Acvr1c, Cort, Htr2b and Pnoc) may have impaired response to stroke in aged rats. New therapeutic options in aged rats may also include Calcrl, Cyp11b1, Prcp, Cebpa, Cfd, Gpnmb, Fcgr2b, Fcgr3a, Tnfrsf26, Adam 17 and Mmp14. An unexpected target is the enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A synthase 1 in aged rats, a key enzyme in the cholesterol synthesis pathway. Post-stroke axonal growth was compromised in both age groups. Conclusion/Significance: We suggest that a multi-stage, multimodal treatment in aged animals may be more likely to produce positive results. Such a therapeutic approach should be focused on tissue restoration but should also address other aspects of patient post-stroke therapy such as neuropathic syndrome, stress, anxiety disorders, depression, neurotransmission and blood pressure.}, language = {en} } @phdthesis{Kotzsch2008, author = {Kotzsch, Alexander}, title = {BMP Ligand-Rezeptor-Komplexe: Molekulare Erkennung am Beispiel der Spezifischen Interaktion zwischen GDF-5 und BMPR-IB}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-31040}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Knochenwachstumsfaktoren (Bone Morphogenetic Proteins, BMPs) sind ubiquit{\"a}re, sekretierte Proteine mit vielf{\"a}ltigen biologischen Funktionen. Die Vielfalt an zellul{\"a}ren Prozessen, die durch BMPs reguliert werden, von der Knochenentwicklung und Organhom{\"o}ostase bis hin zur Neurogenese, erstaunt - und wirft angesichts von teils redundanten, teils spezifischen Funktionen der BMPs Fragen zu den Mechanismen ihrer Signal{\"u}bermittlung auf. Die Signaltransduktion von BMPs erfolgt wie bei den strukturell verwandten TGF-\&\#946;s und Activinen durch die ligandeninduzierte Oligomerisierung von transmembranen Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, von denen zwei Typen - Typ I und Typ II - existieren. Einer Vielzahl von mehr als 18 BMP-Liganden stehen nach derzeitigem Erkenntnisstand nur vier Typ I und drei Typ II Rezeptorsubtypen f{\"u}r die Bildung von heteromeren Rezeptorkomplexen zur Verf{\"u}gung. Ein BMP-Ligand kann hochspezifisch nur einen bestimmten Rezeptorsubtyp oder in einer promisken Art und Weise mehrere Rezeptorsubtypen binden. Trotz dieser Bindungspromiskuit{\"a}t {\"u}ben BMPs ihre biologische Funktion {\"u}berwiegend hochspezifisch aus, d.h. abh{\"a}ngig vom Liganden werden spezifische zellul{\"a}re Prozesse reguliert. Somit stellt sich die Frage, wie die Bildung von heteromeren Ligand-Rezeptor-Komplexen und die Aktivierung definierter intrazellul{\"a}rer Signalkaskaden zusammenh{\"a}ngen und wie letztlich ein bestimmtes BMP-Signal durch einen „Flaschenhals", repr{\"a}sentiert durch die begrenzte Anzahl an Rezeptorsubtypen, in das Zellinnere {\"u}bermittelt wird. Die Interaktionen zwischen BMP-2 / GDF-5 und den Typ I Rezeptoren BMPR-IA / BMPR-IB sind ein Paradebeispiel f{\"u}r Bindungspromiskuit{\"a}t und -spezifit{\"a}t. W{\"a}hrend BMP-2 beide Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB mit gleicher Bindungsaffinit{\"a}t bindet („promiske Interaktion"), zeigt GDF-5 eine 15-20fach h{\"o}here Bindungsaffinit{\"a}t zu BMPR-IB („spezifische" Interaktion). Dieser Unterschied ist scheinbar gering, aber physiologisch {\"u}beraus relevant. Um Einblick in die Mechanismen der molekularen Erkennung zwischen den Bindungspartnern zu gewinnen, wurden bin{\"a}re und tern{\"a}re Komplexe aus den Liganden BMP-2 oder GDF-5, den extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA oder BMPR-IB sowie der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne des Typ II Rezeptors ActR-IIB untersucht. Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die strukturelle und funktionelle Analyse dieser Ligand-Rezeptor-Komplexe. Um den Einfluss struktureller Flexibilit{\"a}t auf die BMP Typ I Rezeptor Erkennung n{\"a}her zu analysieren, wurde zudem die Struktur von BMPRIA in freiem Zustand mittels NMR-Spektroskopie aufgekl{\"a}rt. Aus Mutagenesedaten und der Kristallstruktur des GDF-5•BMPR-IB-Komplexes lassen sich im Vergleich zu bekannten Kristallstrukturen Merkmale ableiten, mit denen die Ligand-Rezeptor-Bindung und -Erkennung charakterisiert werden kann: (1) Die Hauptbindungsdeterminanten in Komplexen von BMPR-IA und BMPR-IB mit ihren Liganden sind unterschiedlich. W{\"a}hrend in Komplexen mit BMPR-IB ein hydrophobes Motiv die Bindungsaffinit{\"a}t bestimmt, tr{\"a}gt in Komplexen mit BMPR-IA eine polare Interaktion signifikant zur Bindungsenergie bei. Ein Vergleich der Strukturen von freien und gebundenen Liganden und Typ I Rezeptoren zeigt, dass interessanterweise diese Hauptbindemotive erst bei der Ligand-Rezeptor-Interaktion entstehen, sodass ein „induced fit" vorliegt und die Molek{\"u}le entsprechend „aufeinander falten". (2) Die Bindungsspezifit{\"a}t wird durch periphere Schleifen in den Typ I Rezeptoren bestimmt. Wie Untersuchungen von Punktmutationen in BMPR-IA zeigen, die einer krebsartigen Darmerkrankung (Juvenile Polyposis) zugrunde liegen, f{\"u}hrt erst die „richtige" Kombination aus Flexibilit{\"a}t in den Schleifen und Rigidit{\"a}t des Rezeptorgrundger{\"u}sts zu signalaktiven Typ I Rezeptoren mit einer potentiell den Liganden komplement{\"a}ren Oberfl{\"a}che. Die mangelnde sterische Komplementarit{\"a}t von Ligand- und Rezeptoroberfl{\"a}chen f{\"u}hrt zu der niedrigeren Bindungsaffinit{\"a}t von GDF-5 zu BMPR-IA im Vergleich zu BMPR-IB. Interessanterweise zeigen die hier vorgestellten, hochaufgel{\"o}sten Strukturdaten, dass die Orientierungen/Positionen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB in den Bindeepitopen der Liganden BMP-2 und GDF-5 variieren. Unter der Voraussetzung, dass die extrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne, das Transmembransegment und die intrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne der Typ I Rezeptoren ein starres Element bilden, sollte sich die unterschiedliche Orientierung der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen der Typ I Rezeptoren in der Anordnung der Kinasedom{\"a}nen widerspiegeln und sich auf die Signaltransduktion auswirken. M{\"o}glicherweise ist eine bestimmte Anordnung der Kinasedom{\"a}nen der Typ I und Typ II Rezeptoren f{\"u}r eine effiziente Phosphorylierung bzw. Signaltransduktion erforderlich. Der Vergleich mehrerer Ligand-Typ I Rezeptor-Komplexe zeigt, dass die unterschiedliche Orientierung dieser Rezeptoren m{\"o}glicherweise vom Liganden abh{\"a}ngt. Angesichts der Bindungspromiskuit{\"a}t unter BMP-Liganden und -Rezeptoren k{\"o}nnten so spezifische Signale {\"u}bermittelt und spezifische biologische Funktionen reguliert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Erkenntnisse tragen wesentlich zur strukturellen Charakterisierung der Ligand-Rezeptor-Erkennung in der BMP-Familie bei. Die Frage, warum trotz strukturell hoch homologer Liganden und Rezeptoren und weitgehend konservierten Bindeepitopen eine teils promiske und teils spezifische Interaktion m{\"o}glich ist, kann nun f{\"u}r die Liganden BMP-2 und GDF-5 sowie den beiden Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB beantwortet werden.}, subject = {Cytokine}, language = {de} } @phdthesis{Noskov2003, author = {Noskov, Andrey}, title = {Structural and functional studies of the Interleukin-5 receptor system}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-8195}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {The aim of current work was contribution to the long-term ongoing project on developing human IL-5 agonists/antagonists that intervene with or inhibit IL-5 numerous functions in cell culture and/or in animal disease models. To facilitate design of an IL-5 antagonist variant or low-molecular weight mimetics only capable of binding to the specific receptor alpha chain, but would lack the ability to attract the receptor common \&\#946;-chain and thus initiate receptor complex activation it is necessary to gain the information on minimal structural and functional epitopes. Such a strategy was successfully adopted in our group on example of Interleukin 4. To precisely localize minimal structural epitope it is essential to have structure of the ligand in its bound form and especially informative would be structure of complex of the ligand and its specific receptor alpha chain. For this purpose large quantities (tens of milligrams), retaining full biological activity IL-5 and extracellular domain of IL-5 specific receptor \&\#945;-chain were expressed in a bacterial expression system (E.coli). After successful refolding proteins were purified to 95-99\% Stable and soluble receptor:ligand complex was prepared. Each established purification and refolding procedures were subjected to optimization targeting maximal yields and purity. Produced receptor:ligand complex was applied to crystallization experiments. Microcrystals were initially obtained with a flexible sparse matrix screening methodology. Crystal quality was subsequently improved by fine-tuning of the crystallization conditions. At this stage crystals of about 800x150x30µm in size can be obtained. They possess desirable visible characteristics of crystals including optical clarity, smooth facecs and sharp edges. Crystals rotate plane polarized light reflecting their well internal organization. Unfortunately relative slimness and sometimes cluster nature of the produced crystals complicates acquisition of high-resolution dataset and resolution of the structure. With some of obtained crystals diffraction to a resolution up to 4{\AA} was observed.}, subject = {Interleukin 5}, language = {en} } @phdthesis{Kumar2002, author = {Kumar, Andreas}, title = {Expression und Aufreinigung von intrazellul{\"a}ren Anteilen des Interleukin-4-Rezeptors als GST-Fusionsproteine und Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5338}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {In dieser Doktorarbeit wurden zwei intrazellul{\"a}re Anteile des IL-4 Rezeptors als GST-Fusionsproteine exprimiert. GST-E1, in dem das cytoplasmatische membranproximale 1/3 von IL-4Ralpha (173 AS) einschließlich des Box 1 Motivs an GST fusioniert ist, konnte nach differenzierter De- und Renaturierung und Bindung an Glutathion-Sepharose Matrix in elektrophoretisch reiner Form aufgereinigt werden. GST-gammainP5D4, in dem die intrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne von gamma c an GST gebunden vorliegt, konnte nur als heterogenes Gemisch mit 4 C-terminal verk{\"u}rzten Fraktionen erhalten werden. Mit diesen rekombinanten Fusionsproteinen wurden Immunpr{\"a}zipitationsversuche in Lysaten IL-4R-transfizierter Ba/F3 Zellen vor und nach Stimulation mit IL-4 durchgef{\"u}hrt. F{\"u}r GST-E1 wurde eine Wechselwirkung mit Jak1 nachgewiesen, die dem bisherigen Kenntnisstand entspricht; f{\"u}r GST-ginP5D4 hingegen konnte eine Wechselwirkung mit Jak3 nicht gezeigt werden. Beide Proteine sind in der Lage, STAT5 zu pr{\"a}zipitieren; diese Bindung erscheint unabh{\"a}ngig von der IL-4 Stimulation der Zellen und l{\"a}ßt neue Spekulationen {\"u}ber den Mechanismus der Signaltransduktion durch STAT5 zu. Danach k{\"o}nnten nach den hier gewonnenen Informationen beide IL-4-Rezeptorketten jeweils ein STAT5 Molek{\"u}l zur STAT5-Dimerisirerung nach Rezeptoraktivierung beitragen. Es ist somit gelungen, ein in-vitro-Modell zur Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen am IL-4 Rezeptor zu etablieren, welches f{\"u}r weitere Untersuchungen eingesetzt werden kann.}, language = {de} } @phdthesis{GrosseWilde2001, author = {Große-Wilde, Anne}, title = {Klonierung, molekulare Charakterisierung und konditionale Inaktivierung eines murinen Todesrezeptors f{\"u}r TRAIL (mTRAIL-R)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-559}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) ist ein Apoptose-induzierendes Mitglied der TNF-Superfamilie (TNF-SF). Bislang sind zwei humane TRAIL-Todesrezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, bekannt, die zur TNF-Rezeptor-Superfamilie geh{\"o}ren. TRAIL induziert Apoptose in einer Vielzahl von Tumorzelllinien, wohingegen die meisten prim{\"a}ren Zellen resistent gegen{\"u}ber TRAIL sind. In pr{\"a}klinischen Studien mit M{\"a}usen und nichthumanen Primaten wurde keine systemische Toxizit{\"a}t von TRAIL nachgewiesen. Diese Beobachtungen haben betr{\"a}chtliches Interesse an dem Einsatz von TRAIL zur Tumortherapie geweckt. {\"U}ber die physiologische Rolle von TRAIL ist jedoch noch wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war, Werkzeuge zum Studium des Apoptose-induzierenden TRAIL-Systems in M{\"a}usen zu etablieren. Zun{\"a}chst mussten das oder die murinen Homologe der beiden Apoptose-induzierenden TRAIL-Rezeptoren identifiziert werden. Dazu wurden murine TRAIL-bindende Proteine biochemisch {\"u}ber 2D-Gelanalysen identifiziert. Anhand einer Sequenzinformation aus einer Datenbank wurde ein muriner TRAIL-Rezeptor kloniert, der aufgrund seines biochemisch bestimmten Molekulargewichts p54_mTRAIL-R genannt wurde. Der Sequenzvergleich sowie die Funktionsanalyse von p54_mTRAIL-R ergab, dass dieser Rezeptor das funktionelle murine Homolog zu den humanen TRAIL-Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 ist. So war p54_mTRAIL-R ebenfalls in der Lage, nach {\"U}berexpression Caspase-abh{\"a}ngig Apoptose zu induzieren. Wie die Transkripte der humanen TRAIL-Todesrezeptoren wurden die Transkripte von p54_mTRAIL-R in allen untersuchten Geweben detektiert. Es wurde ein l{\"o}sliches p54_mTRAIL-R:Fc-Fusionsprotein hergestellt, welches zur TRAIL-Inaktivierung in vivo und in vitro verwendet werden kann. Um die physiologische Rolle des p54_mTRAIL-Rs in vivo studieren zu k{\"o}nnen, sollten mTRAIL-R-defiziente M{\"a}use generiert werden. Zur Modifikation des f{\"u}r p54_mTRAIL-R kodierenden tar-Locus wurde das Gen kloniert und charakterisiert. Um eine durch die Gendefizienz hervorgerufene eventuelle Letalit{\"a}t oder sekund{\"a}re kompensierende Effekte zu vermeiden, wurden mit Hilfe des Cre/loxP-Systems und des Flp/FRT-Systems konditionale p54_mTRAIL-R defiziente M{\"a}use hergestellt. Die Werkzeuge, die in dieser Arbeit generiert wurden, wie l{\"o}sliches p54_mTRAIL-R:Fc Fusionsprotein und konditionale p54_mTRAIL-R defiziente M{\"a}use, k{\"o}nnen nun in vivo f{\"u}r die Erforschung der physiologischen Rolle des TRAIL-Systems sowie seines Potentials und dessen Grenzen bei der Tumortherapie benutzt werden.}, subject = {Maus}, language = {de} }