@phdthesis{Philippi2011, author = {Philippi, Nicole}, title = {Modellierung von Signalwegen in verschiedenen biologischen Systemen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-57690}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Die Apoptose der Leberzellen ist abh{\"a}ngig von externen Signalen wie beispielsweise Komponenten der Extrazellul{\"a}ren Matrix sowie anderen Zell-Zell-Kontakten, welche von einer Vielfalt und Vielzahl an Knoten verarbeitet werden. Einige von ihnen wurden im Rahmen dieser Arbeit auf ihre Systemeffekte hin unter- sucht. Trotz verschiedener {\"a}ußerer Einfl{\"u}sse und nat{\"u}rlicher Selektion ist das System daraufhin optimiert, eine kleine Anzahl verschiedener und klar voneinander unterscheidbarer Systemzust{\"a}nde anzunehmen. Die verschiedenartigen Einfl{\"u}sse und Crosstalk-Mechanismen dienen der Optimierung der vorhandenen Systemzust{\"a}nde. Das in dieser Arbeit vorgestellte Modell zeigt zwei apoptotische sowie zwei nicht-apoptotische stabile Systemzust{\"a}nde, wobei der Grad der Aktivierung eines Knotens bis zu dem Moment stark variieren kann, in welchem der absolute Systemzustand selbst ver{\"a}ndert wird (Philippi et al., BMC Systems Biology,2009) [1]. Dieses Modell stellt zwar eine Vereinfachung des gesamten zellul{\"a}ren Netzwerkes und seiner verschiedenen Zust{\"a}nde dar, ist aber trotz allem in der Lage, unabh{\"a}ngig von detaillierten kinetischen Daten und Parametern der einzelnen Knoten zu agieren. Gleichwohl erlaubt das Modell mit guter qualitativer {\"U}bereinstimmung die Apoptose als Folge einer Stimulation mit FasL zu modellieren. Weiterhin umfasst das Modell sowohl Crosstalk-M{\"o}glichkeiten des Collagen-Integrin-Signalwegs, ebenso ber{\"u}cksichtigt es die Auswirkungen der genetischen Deletion von Bid sowie die Konsequenzen einer viralen Infektion. In einem zweiten Teil werden andere Anwendungsm{\"o}glichkeiten dargestellt. Hormonale Signale in Pflanzen, Virusinfektionen und intrazellul{\"a}re Kommunikation werden semi-quantitativ modelliert. Auch hier zeigte sich eine gute Ubereinstimmung der Modelle mit den experimentellen Daten.}, subject = {Systembiologie}, language = {de} } @phdthesis{Torlopp2010, author = {Torlopp, Angela}, title = {Die Rolle von FGF in der fr{\"u}hen Kardiogenese und Proepikardiogenese im H{\"u}hnerembryo}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-47695}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {In dieser Arbeit sollte die Funktion von FGF-Signalen im Herzfeld und in der Entwicklung des Proepikards im H{\"u}hnerembryo untersucht werden. Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF) sind eine große Gruppe von Signalmolek{\"u}len und in eine Vielzahl von Entwicklungsprozessen involviert. Das Proepikard (PE), welches sich asymmetrisch auf dem rechten Sinushorn des Sinus venosus entwickelt, bildet die Grundlage des Koronargef{\"a}ßsystems des Herzens. FGF-Liganden (FGF2, FGF10, FGF12) werden insbesondere in den epithelialen Zellen des Proepikards exprimiert, sowie an der sinomyokardialen Basis dieser embryonalen Progenitorpopulation. Die FGF-Rezeptoren (FGFR1, FGFR2, FGFR4) weisen ein {\"a}hnliches Expressionsmuster auf und deren Inhibition, durch spezifische Antagonisten, war der Ausgangspunkt f{\"u}r die funktionelle Analyse der proepikardialen FGF-Signalaktivit{\"a}t. Die Inhibition von FGF-Signalen in vitro f{\"u}hrt zu einem verringerten Wachstum sowie einer erh{\"o}hten Apoptoserate in proepikardialen Explantaten, die unter serumfreien Bedingungen kultiviert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl der Ras/MAPK- als auch der PI3-Kinase-Signalweg, beides Bestandteile der FGF-Signaltransduktion, f{\"u}r das Wachstum und {\"U}berleben proepikardialer Zellen verantwortlich sind. Dagegen sind FGF-Signale nicht in die Etablierung proepikardialer Identit{\"a}t involviert, wie die Analyse der Expression etablierter proepikardialer Markergene wie TBX18, WT1 und TBX5 nach FGF-Inhibition zeigte. Dies konnte gleichfalls durch in vivo-Experimente gezeigt werden, in denen die rechtsseitige Inhibition von FGF zu einem retardierten Proepikardwachstum f{\"u}hrte. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die asymmetrische Apoptose in der sich transient entwickelnden linksseitigen Proepikardanlage auf eine fr{\"u}he differentielle Expression von Apoptosegenen wie Caspase 2 zur{\"u}ckgeht. Diese asymmetrische Expression wird von FGF8 reguliert, wahrscheinlich als Teil eines fr{\"u}hen rechtsseitigen Signalweges, der Apoptose im rechten Sinushorn des kardialen Einflusstraktes verhindert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Expression der Hyaluronansynthase 2 (HAS2) in Abh{\"a}ngigkeit von FGF in der Herzfeldregion analysiert. Hyaluronansynthasen produzieren Hyalurons{\"a}ure, welches eine essentielle Komponente der extrazellul{\"a}ren Matrix ist. Es wurde in vivo gezeigt, dass die Expression von HAS2 im prim{\"a}ren Herzfeld in gleicher Weise von FGF reguliert wird wie die des kardialen Transkriptionsfaktors NKX2.5. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass FGF w{\"a}hrend der fr{\"u}hen Entwicklung des Herzens und der Entstehung des Proepikards diverse Funktionen besitzt.}, subject = {Huhn}, language = {de} } @phdthesis{Berg2008, author = {Berg, Daniela}, title = {Entwicklung von TRAIL-Fusionsproteinen und ihre Wirkung auf Myelomzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27430}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {1. Zusammenfassung L{\"o}sliche humane TRAIL-Varianten (hTRAIL), die nur die "TNF homology domain" (THD) beinhalten, binden sowohl den TRAILR1 aus auch den TRAILR2, stimulieren jedoch nur den TRAILR1. Nach sekund{\"a}rem Quervernetzen des Liganden wird dann aber auch der TRAILR2 effektiv aktiviert. Entsprechende murine TRAIL-Varianten (mTRAIL) dagegen zeigen nur eine schwache Rezeptorbindung und sind selbst nach sekund{\"a}rem Quervernetzen nur wenig aktiv. Interessanterweise kann ein Fusionsprotein aus der THD von mTRAIL und der Trimerisierungsdom{\"a}ne von Tenascin-C (TNC), das wie mTRAIL selbst auch als Trimer vorligt, effizient an TRAIL-Rezeptoren binden und nach sekund{\"a}rem Quervernetzen den TRAILR2 gut stimulieren. Weiterhin kann eine mTRAIL-Variante, die neben der THD auch die Stammregion des Molek{\"u}ls enth{\"a}lt, die die THD von der Transmembrandom{\"a}ne trennt, nach sekund{\"a}rem Quervernetzen Apoptose induzieren, jedoch nicht so effektiv wie das TNC-mTRAILFusionsprotein. Die spezifische Bioaktivit{\"a}t der humanen TRAIL-Varianten wird gleichfalls, wenn auch weniger stark, durch Fusion mit der Tenascin-C-Trimerisierungsdom{\"a}ne gesteigert. Die Fixierung des N-Terminus der THD, die hier durch die TNCDom{\"a}ne sonst jedoch durch die Stamm- oder Transmembrandom{\"a}ne gew{\"a}hrleistet wird, k{\"o}nnte demnach f{\"u}r mTRAIL f{\"u}r eine gute Rezeptorbindung und effektive Apoptoseinduktion n{\"o}tig sein. Dies deutet auf eine bisher nicht erkannte Rolle der Stammregion f{\"u}r die Aktivit{\"a}t dieser Liganden hin und bietet die M{\"o}glichkeit, rekombinante l{\"o}sliche Liganden der TNF-Familie mit erh{\"o}hter Aktivit{\"a}t zu generieren. Die TRAIL-induzierte Apoptose kann f{\"u}r die Behandlung von Tumorzellen n{\"u}tzlich sein. Es wurde jedoch k{\"u}rzlich gezeigt, dass TRAIL neben Apoptose auch proinflammatorische, d. h. potentiell tumorf{\"o}rdernde Signalwege, insbesondere in apoptoseresistenten Zellen induzieren kann. Im Folgenden sollte untersucht werden, inwiefern TRAIL solche Signalwege in Myelomzellen stimuliert. Oligomerisiertes TRAIL kann bei allen analysierten Zelllinien Caspasen aktivieren und Apoptose induzieren. Werden die Zelllinien mit dem pan-Caspaseinhibitor ZVAD behandelt, kann die Caspase- Aktivierung bei allen Zellen blockiert werden, die Apoptoseinduktion jedoch nur bei zwei Zelllinien. Im Gegensatz dazu sch{\"u}tzt ZVAD drei andere Myelomzelllinien nur partiell vor der TRAIL-induzierten Apoptose. Dies zeigt, dass TRAIL in Myelomzellen auch caspaseunabh{\"a}ngigen Zelltod induzieren kann. TRAIL induziert in den Myelomzellen auch proinflammatorische Signalwege wie den NF\&\#1082;B-, den JNK-, den p38- und den p42/44-Signalweg. Die Stimulation des JNK- und des p38-Signalwegs erwies sich hierbei in zelltypspezifischer Weise caspaseabh{\"a}ngig, die Aktivierung des NF\&\#1082;B- und p42/44-Signalwegs immer als caspaseunabh{\"a}ngig. Zusammenfassend geht aus diesen Ergebnissen hervor, dass zur Behandlung des multiplen Myeloms, TRAIL in Kombination mit anti-inflammatorisch wirkenden Mitteln eingesetzt werden sollte, insbesondere um m{\"o}gliche proinflammatorische Nebenwirkungen durch TRAIL zu minimieren.}, subject = {TRAIL}, language = {de} } @phdthesis{Wicovsky2007, author = {Wicovsky, Andreas}, title = {Die Rolle von TRAF1 und JNK bei der TNF-vermittelten Apoptose}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23689}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {TNF (Tumor Nekrose Faktor) vermittelt seine biologischen Funktionen durch Interaktionen mit TNFR1 (TNFRezeptor 1) und TNFR2 (TNFRezeptor 2). In fr{\"u}heren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass der TNFR2 sowohl durch die Induktion von membrangebundenem TNF als auch durch die proteasomale Degradation von TRAF2 (TNFRezeptor-assozierter Faktor 2) die TNFR1-vermittelte Apoptose verst{\"a}rken kann. Des Weiteren war bekannt, dass TRAF1 (TNFRezeptor-assozierter Faktor 1), ein anderes Mitglied der TRAF-Familie, mit TRAF2 Heterotrimere bilden kann und zudem nach TNF-induzierter NFkappaB- (nuclear factor kappaB) Aktivierung verst{\"a}rkt exprimiert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte nun erstmals gezeigt werden, dass TRAF1 in beide TNFR-Signalkomplexe rekrutiert wird und darin in einem TRAF2/TRAF1-Heterotrimer TRAF2 funktionell ersetzen kann. Dar{\"u}ber hinaus verhindert TRAF1 die Rekrutierung von TRAF2 in lipid rafts sowie dessen anschließende proteasomale Degradation. Auf diese Weise kann TRAF1 die TNFR2-abh{\"a}ngige Verst{\"a}rkung der TNFR1-induzierten Apoptose verhindern. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die TNF-vermittelte Aktivierung der JNK (c-Jun N-terminale Kinase), dessen Regulation durch ROS (reactive oxygen species), Caspasen (Cysteinyl-Aspartat-spezifische Proteasen) sowie NFkappaB-induzierte Faktoren untersucht. TNF induziert in den meisten Zellen zun{\"a}chst nach zehn bis 30 Minuten eine transiente JNK-Aktivierung, woraufhin bei NFkB-inhibierten Zellen eine zweite andauernde JNK-Aktivierung folgt. Die meisten in der Literatur beschriebenen Studien gehen dabei von einem ROS-abh{\"a}ngigen, Caspase-unabh{\"a}ngigen Mechanismus der persistierenden JNK-Aktivierung aus. Des Weiteren wurde in den vor allem bei embryonale Mausfibroblasten durchgef{\"u}hrten Untersuchungen davon ausgegangen, dass bestimmte NFkappaB-induzierte Radikalf{\"a}nger die andauernde Aktivierung der JNK verhindern. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in den humanen Zelllinien KB, Jurkat und HaCaT die andauernde Aktivierung der JNK, im Gegensatz zur transienten JNK-Aktivierung, Caspase-abh{\"a}ngig verl{\"a}uft. Es ergab sich {\"u}berdies, dass die inhibierende Wirkung des NFkB-Signalweges auf die persistierende JNK-Aktivierung in diesen Zelllinien in erster Linie auf die indirekte Verhinderung der Apoptose durch die Induktion von antiapoptotischen Proteinen wie Flip-L (FLICE-inhibitory protein long) und IAPs (inhibitor of apoptosis) zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist, als auf die direkte Expression von Radikalf{\"a}ngern. Zudem wurde in den untersuchten Zelllinien die Caspase-vermittelte Spaltung von MEKK-1 (MAP/ERK kinase kinase-1) und p21WAF/Cip 1 nachgewiesen, von denen bekannt ist, dass die Spaltprodukte eine JNK-stimulierende Wirkung haben. Dennoch m{\"u}ssen k{\"u}nftige Studien zeigen, ob die Spaltung von p21WAF/Cip 1 und MEKK-1 in Fragmente mit JNK-stimulierender Aktivit{\"a}t oder andere Caspasesubstrate f{\"u}r die Caspase-vermittelte andauernde Aktivierung der JNK verantwortlich sind.}, language = {de} } @phdthesis{Hassel2003, author = {Hassel, Jessica C.}, title = {Untersuchungen zur Apoptoseregulation durch die Melanom induzierende Rezeptortyrosinkinase Xmrk}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11319}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {{\"U}berexpression der konstitutiv aktiven Rezeptortyrosinkinase Xmrk im Zahnkarpfen Xiphophorus f{\"u}hrt zur Ausbildung maligner Melanome. Expressionsstudien in transgenen Medaka-Fischen haben gezeigt, daß Xmrk allerdings nur in bestimmten Geweben wie Hirn, Epithelien, Auge und Pigmentzellen zur Tumorbildung f{\"u}hrt. Zellen, die durch Xmrk transformiert werden k{\"o}nnen, scheinen somit {\"u}ber entsprechende Komponenten der durch Xmrk induzierten intrazellul{\"a}ren Signaltransduktion verf{\"u}gen zu m{\"u}ssen. Bisher wurde eine Reihe von Signalproteinen identifiziert, die von Xmrk rekrutiert und aktiviert werden. Dazu geh{\"o}ren die PLC-g, die Adapterproteine Shc und Grb2, die PI3K, die Fyn-Kinase aus der Familie der Src-Kinasen und der Transkriptionsfaktor STAT5. Um die Signaltransduktion von Xmrk in induzierbarer Form untersuchen zu k{\"o}nnen, wurde eine mit EGF stimulierbare Rezeptorchim{\"a}re HER-mrk, deren extrazellul{\"a}rer Anteil vom humanen EGF-R und deren intrazellul{\"a}rer Anteil von Xmrk stammt, in der IL-3 abh{\"a}ngigen murinen pro-B-Zellinie Ba/F3 exprimiert. EGF-Stimulation dieser als BaF Hm bezeichneten Zellen f{\"u}hrt zu IL-3 unabh{\"a}ngigem Wachstum und zu Langzeit{\"u}berleben. Stimulation des aus der gleichen Genfamilie stammenden EGF-Rezeptors hingegen, wird er in Ba/F3 Zellen exprimiert, kann kein Langzeit{\"u}berleben vermitteln. Erste Untersuchungen zeigten, daß das durch HER-mrk vermittelte Langzeit{\"u}berleben in Ba/F3 Zellen nicht auf einer h{\"o}heren Rezeptorexpression verglichen mit den EGF-R exprimierenden Zellen beruht. Allerdings korreliert die Rezeptordichte mit der DNA-Syntheseleistung der Ba/F3 Zellen. Durch verschiedene carboxyterminal verk{\"u}rzte HER-mrk Rezeptormutanten wurde eine unterschiedliche Anzahl von Substratbindungsstellen von Xmrk deletiert. Expression dieser HER-mrk Rezeptormutanten in Ba/F3 Zellen zeigte, daß f{\"u}r die Ausl{\"o}sung der Replikation der DNA keine C-terminale Substratbindungsstelle notwendig ist, w{\"a}hrend f{\"u}r eine Vollendung der Zellteilung mit Zellvermehrung und f{\"u}r Langzeit{\"u}berleben zwei membrannahe Substratbindungsstellen ausreichend sind. Der Vergleich der durch die verschiedenen Rezeptoren induzierten Signalwege bzw. der Substratinteraktionen von HER-mrk, seinen Mutanten und dem EGF-R gab Hinweise auf f{\"u}r die Antiapoptose entscheidende Signalwege. Untersuchungen zur Aktivierung von STAT1, 3 und 5 zeigten, daß HER-mrk zu einer Aktivierung aller drei STAT-Proteine f{\"u}hrt, w{\"a}hrend der EGF-R in Ba/F3 Zellen nur STAT1 und 3, nicht aber STAT5 aktivieren kann. Die HER-mrk Rezeptormutanten zeigten, daß f{\"u}r die Aktivierung von STAT5 durch HER-mrk keine carboxyterminale Substratbindungsstelle notwendig ist, diese aber m{\"o}glicherweise durch Stabilisierung der Rezeptorbindung seine Aktivierung verst{\"a}rken. F{\"u}r die Aktivierung von STAT1 und 3 hingegen sind carboxyterminale Substratbindungsstellen entscheidend. Das f{\"u}r ein antiapoptotisches Protein kodierende STAT5-Zielgen bcl-X wurde als HER-mrk Zielgen identifiziert. Auch die schw{\"a}chere STAT5 Aktivierung durch die trunkierte HER-mrk Rezeptormutante Hm delta1006 hatte eine bcl-X Transkription zur Folge, w{\"a}hrend der EGF-R bcl-X nicht induzierte. Untersuchungen weiterer antiapoptotischer Signalwege zeigten, daß die mrk-Kinase sowie ihre Rezeptormutante Hm delta1006 im Gegensatz zum EGF-R auch zu einer Induktion von bcl-2 f{\"u}hren. Da diese Mutante kein Langzeit{\"u}berleben vermittelt, ist somit die Induktion der Genexpression antiapoptotischer Proteine wie Bcl-XL und Bcl-2 nicht ausreichend f{\"u}r Antiapoptose. Es bedarf somit der Kombination mehrerer antiapoptotischer Signalwege, um Langzeit{\"u}berleben zu sichern. Expression der Rezeptorchim{\"a}re HER-mrk in murinen Melanozyten f{\"u}hrt bei Stimulation der mrk-Kinase zur Transformation der Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine starke Induktion von bcl-X nach HER-mrk Stimulation in den Melanozyten nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung humaner Melanomzellinien, die in der Expression verschiedener Rezeptortyrosinkinasen oft ein sehr unterschiedliches Muster zeigen, konnte eine konstitutive Aktivit{\"a}t von STAT5 in allen untersuchten Zellinien nachgewiesen werden, w{\"a}hrend STAT1 und 3 nur eine schwache und inhomogene Basalaktivit{\"a}t aufwiesen. Es zeigt sich folglich ein {\"a}hnliches Bild wie im Xiphophorus-Melanom, in dem ausschließlich STAT5 konstitutiv aktiv ist. Die untersuchten humanen Melanomzellinien zeigten durchweg eine Expression von Bcl-XL. Andere Signalwege wie z.B. die Aktivierung der MAPK hingegen zeigten ein heterogenes Muster bei den verschiedenen Zellinien. Erste Experimente in A375 Zellen deuten darauf hin, daß die Expression von dominant negativem STAT5 zur Reduktion der bcl-X Transkription und zur Apoptose der Zellen f{\"u}hrt (Wellbrock, unver{\"o}ffentlicht). Der STAT5/Bcl-XL Signalweg scheint folglich ganz entscheidend f{\"u}r die Antiapoptose von Melanomen zu sein.}, language = {de} } @phdthesis{SchulzeLuehrmann2002, author = {Schulze-L{\"u}hrmann, Jan}, title = {Die H{\"a}matopoetische Progenitor Kinase (HPK) 1 und NFAT-Transkriptionsfaktoren unterst{\"u}tzen die Apoptose von T-Lymphozyten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3074}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Die Expression der H{\"a}matopoetischen Progenitor Kinase 1 (HPK1), einem Mitglied der Familie der „Germinal Centre" Kinasen, ist im adulten Organismus auf die Zellen des h{\"a}matopoetischen Systems beschr{\"a}nkt. Die HPK1 wurde urspr{\"u}nglich als ein Aktivator des JNK-Signal{\"u}bertragungsweges beschrieben [Hu et al., 1996; Kiefer et al., 1996], und k{\"u}rzlich wurde eine transiente Aktivierung der HPK1 nach TZR-Stimulation nachgewiesen. Auch wurde eine Assoziation der HPK1 mit dem Linker aktivierter T-Zellen (LAT) und den Adaptorproteinen Nck, Crk, Gads, Grb2, Grap, CrkL sowie SLP-76 gezeigt. F{\"u}r die Aktivierung der nach TZR-Stimulation in den Lipid-Rafts lokalisierten HPK1 sind sowohl Lck als auch ZAP-70 notwendig [Liou et al., 2000; Liu et al., 2000a; Ling et al., 2001]. Diese Daten legen eine m{\"o}gliche Funktion von HPK1 bei der TZR-vermittelten Signal{\"u}bertragung nahe. Trotzdem konnte bisher eine physiologische Rolle der HPK1 im Rahmen der Immunrezeptor-Signal{\"u}bertragung nicht nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wird dargestellt, dass eine wichtige Funktion der HPK1 in T-Zellen nach TZR-Stimulation, die durch die F{\"o}rderung des Aktivierungs-induzierten Zelltodes (AICD) vermittelt wird, in der Kontrolle der Termination der Immunantwort und damit Hom{\"o}ostase des Immunsystems besteht. Dies wurde durch retrovirale {\"U}berexpression der wildtypischen (wt) HPK1 in murinen CD4+ T-Zellen nachgewiesen, in denen die HPK1 zu einem Anstieg der spontanen und antiCD3-vermittelten Apoptose sowie zu einer gesteigerten Expression des Fas-Liganden (FasL oder auch CD95L) f{\"u}hrte. Die Expression einer HPK1-„antisense" (AS)-RNA in CD4+ T-Zellen bewirkte dagegen eine schwache, jedoch signifikant nachweisbare Hemmung der Apoptose und FasL-Expression. Die Apoptose-Hemmung durch die HPK1-AS-RNA war besonders stark in H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen ausgepr{\"a}gt, in denen die {\"U}berexpression der wt HPK1 den durch reaktive Sauerstoffmetabolite (ROS) induzierten Zelltod verst{\"a}rkte. Aus diesen Daten folgt, dass die HPK1 die T-Zell-Apoptose reguliert. In H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen f{\"u}hrt die HPK1-Expression zu einer verst{\"a}rkten und anhaltenden Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK), die wahrscheinlich an der HPK1-vermittelten Apoptoseinduktion beteiligt ist. Unter den gleichen Bedingungen konnte eine schnelle Spaltung der HPK1 beobachtet werden. Die {\"U}berexpression der N- oder C-terminalen Spaltprodukte in CD4+ T-Zellen f{\"u}hrte - wie die der Gesamt-HPK1 - zu einem Anstieg des AICD. In {\"U}bereinstimmung mit publizierten Daten konnten wir eine Hemmung der NFkB-Aktivit{\"a}t durch das C-terminale HPK1-Peptid nachweisen, das die IkBalpha-Degradation inhibiert. Die erzielten Ergebnisse f{\"u}hrten uns in ihrer Gesamtheit zu folgendem Modell: w{\"a}hrend der Initiationsphase der T-Zell-Stimulierung werden nach schneller, transienter HPK1-Aktivierung pro- und anti-apoptotische Signale durch den JNK- und NFkB-Signal{\"u}bertragungsweg vermittelt. Durch die Akkumulation der C-terminalen HPK1-Spaltprodukte kommt es sp{\"a}ter zur Inhibierung der NFkB-Aktivit{\"a}t und damit zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen den {\"U}berlebens- und Apoptose-stimulierenden Signalen zugunsten des AICD. Allerdings gibt es sicherlich weitere Faktoren und Signalwege, die an der HPK1-vermittelten Kontrolle der T-Zell-Apoptose beteiligt sind und von deren Untersuchung ein detaillierteres Verst{\"a}ndnis der HPK1-Physiologie erwartet wird. Die Nukle{\"a}ren Faktoren aktivierter T-Zellen (NFAT´s) geh{\"o}ren zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren, denen eine konservierte, ca. 300 Aminos{\"a}uren (aa) große DNA-Bindedom{\"a}ne und eine Calcineurin-Bindedom{\"a}ne gemeinsam ist. NFATc (auch NFATc1 oder NFAT2 genannt) und NFATp (NFATc2 oder NFAT1) werden in peripheren T-Zellen stark exprimiert und kontrollieren deren Effektorfunktionen u.a. {\"u}ber die Expression von IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IFNgamma und weiterer Lymphokine. Weitere von den NFAT´s kontrollierte Gene sind p21WAF1, der CD40L und der CD95L. Somit scheinen die NFAT´s bei der Zellzyklus-Kontrolle und beim AICD von T-Lymphozyten eine wichtige Rolle zu spielen. Daten unseres Labors zeigten, dass die T-Zell-Aktivierung zu einer massiven Induktion der kurzen Isoform A von NFATc innerhalb von 3-4 h f{\"u}hrt [Chuvpilo et al., 1999b], noch vor dem Start des AICD. Dies ließ vermuten, dass sich die biologische Funktion von NFATc/A durch das Fehlen des C-terminalen Peptids von ca. 245 aa, das in allen anderen NFAT-Proteinen einschließlich der l{\"a}ngeren Isoform NFATc/C vorhanden ist, unterscheidet. Deshalb sollte in der vorliegenden Arbeit die Induktion und Funktion von NFATc/A in murinen T-Lymphozyten untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion prim{\"a}rer CD4+ T-Lymphozyten mit NFATc/A-exprimierenden rekombinanten Retroviren, im Gegensatz zu der mit NFATc/C- oder NFATp-exprimierenden Retroviren, den AICD unbeeinflusst l{\"a}sst. Dies deutet darauf hin, dass es durch die massive NFATc/A-Synthese nach Effektor-T-Zell-Aktivierung zur Induktion von Effektor-Funktionen kommt, ohne dass dabei die T-Zell-Apoptose beschleunigt wird. Im Gegensatz dazu {\"u}ben die langen NFAT-Faktoren wie NFATc/C und NFATp eine pro-apoptotische Wirkung aus.}, subject = {T-Lymphozyt}, language = {de} } @phdthesis{Seeberger2000, author = {Seeberger, Harald Bruno Gustav}, title = {Fr{\"u}he Entwicklungsschritte in der Pathogenese der B-Zell-Lymphome vom mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT)-Typ}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-2286}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2000}, abstract = {B-Zell-Lymphome vom mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT)-Typ sind die gr{\"o}ßte Gruppe der extranodalen Lymphome. Sie enstehen vor dem Hintergrund einer chronischen Entz{\"u}ndung, wie etwa einer Helicobacter pylori-assoziierten Gastritis im Magen. Die Mechanismen der Lymphomgenese sind weitgehend unverstanden. Der Befund, dass die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome autoreaktiv sind und durch Antigen oder T-Zell-vermittelte Signale stimuliert werden, weist auf ein m{\"o}gliches Ver-sagen der T-Zell-Kontrolle hin. Zur Pr{\"u}fung dieser Hypothese wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl tumor-infiltrierende T-Zellen als auch maligne B-Zellen aus MALT-Typ Lymphomen untersucht. Mit Hilfe von Expressionsanalysen der Vb -Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) wurden antigen-induzierte klonale Expansionen in den tumor-infiltrierenden T-Zellen nachgewiesen. Weiterhin wurden {\"a}hnliche antigen-erkennende Regionen (CDR3) des TCR in tumor-infiltrierenden T-Zellen aus zwei verschiedenen MALT-Typ Lymphomen gefunden. Diese Ergebnisse charakterisieren die T-Zellen als funktionell und auch als potenziell tumor-reaktiv. Um m{\"o}gliche Defekte bei malignen B-Zellen zu untersuchen, wurde eine in vitro T/B-Zell-Kokultur entwickelt. Damit war es m{\"o}glich, die Interaktion des apoptose-induzierenden Oberfl{\"a}chenmolek{\"u}ls FasL auf aktivierten T-Zellen mit dem entsprechenden Todesrezeptor Fas auf malignen B-Zellen zu untersuchen. Drei von sieben MALT-Typ Lymphomen und vier von f{\"u}nf DLBL erwiesen sich als resistent gegen FasL-vermittelte Apoptose. Meine Untersuchungen deuten darauf hin, dass hierf{\"u}r eine mutationsbedingte funktionelle Inaktivierung des Fas-Rezeptors verantwortlich ist. In Fas-Transkripten aller untersuchten malignen B-Zellen wurden insgesamt 14 verschiedene Punktmutationen gefunden, die zu Aminos{\"a}ureaustauschen bei der Translation f{\"u}hren. Zehn dieser Mutationen waren mit der Apoptose-Resistenz maligner B-Zellen assoziiert. Durch erg{\"a}nzende Untersuchungen konnten alternative Mechanismen der Apoptose-Resistenz wie etwa reduzierte Fas-Expression, Produktion von l{\"o}slichem Fas (sFas) oder St{\"o}rungen in der Fas-Signalkaskade weitgehend ausgeschlossen werden. Aus diesen Ergebnissen l{\"a}sst sich folgender Schluss ziehen: Resistenz gegen FasL/Fas-vermittelte Apoptose ist ein Mechanismus der fr{\"u}hen MALT-Typ Lymphomgenese und m{\"o}glicherweise auf bestimmte Fas-Mutationen zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Durch Apoptose-Resistenz entkommen die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome der vorhandenen T-Zell-Kontrolle. Gleichzeitig nehmen sie die parakrin angebotene T-Zell-Hilfe solange in Anspruch, bis sie v{\"o}llige Autonomie erreicht haben. Durch das abnorm verl{\"a}ngerte {\"U}berleben der B-Zellen steigt dann die Wahrscheinlichkeit, weitere Aberrationen wie etwa die in 50 Prozent aller F{\"a}lle auftretende Chromosomentranslokation t(11;18)(q21;q21) zu erwerben.}, subject = {MALT}, language = {de} } @phdthesis{Schaefer2000, author = {Sch{\"a}fer, Rolf}, title = {Aktivierung von Caspasen in AKR-2B Mausfibroblasten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1950}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2000}, abstract = {In der vorliegenden Arbeit konnte die essentielle Beteiligung von Caspasen im Zelltodmodell der AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen und ihre Aktivit{\"a}ten charakterisiert werden. AKR 2B-Mausfibroblasten stellen eine subklonierte und gut charakterisierte Zellinie dar, in der durch Entzug des Serums der Zelltod induziert wird. W{\"a}hrend des Zelltods sterben innerhalb von 6h etwa 50 Prozent einer dichtearretierten Kultur. Die {\"u}berlebenden Zellen bleiben von diesem Mangelzustand f{\"u}r mindestens weitere 48h unbeeinflußt, ben{\"o}tigen aber zum {\"U}berleben eine Proteinneusynthese. Der Zelltod zeigt f{\"u}r eine Apoptose typische morphologische Ver{\"a}nderungen der Zelle, obwohl apoptotische Charakteristika, wie die oligonukleosomale Fragmentierung der DNA oder die Aufnahme der zerfallenen Zelle durch benachbarte Zellen, ausbleiben. Mittels unterschiedlicher Methoden konnte die Expression von mRNA aller f{\"u}r den apoptotischen Prozeß bekannten relevanten Caspasen in den AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen werden. Die Caspasen-1, -2, -3, -6 und -9 liegen in ihrer zymogenen Form konstitutiv in den Zellen vor. Mit Ausnahme der Caspase-9 konnte die durch Serumentzug induzierte Spaltung dieser Caspasen in Untereinheiten und somit ihre Aktivierung nicht detektiert werden. Die wesentliche Beteiligung dieser Cystein-Proteasen wurde jedoch durch den protektiven Effekt spezifischer Inhibitoren und den Nachweis ihrer spezifischen Aktivit{\"a}t bestimmt. Die Charakterisierung dieser enzymatischen Aktivit{\"a}ten lieferte Hinweise zur Identit{\"a}t der aktivierten Caspasen. Neben einer konstitutiven VEIDase- und IETDase-Aktivit{\"a}t wird 3h nach Entzug des Serums eine DEVDase maximal aktiviert. Das Gemisch an Caspase-Aktivit{\"a}ten wird durch eine DEVDase dominiert. Diese Aktivit{\"a}t wird zum gr{\"o}ßten Teil durch nur ein Enzym gestellt, wie durch eine Affinit{\"a}tsmarkierung und 2D-Gelelektrophorese gezeigt wurde. KM- und Ki-Wert-Bestimmungen der DEVDase deuten darauf hin, daß dieses Enzym typische Effektoreigenschaften, wie die der Caspase-3, besitzt. Daneben werden Lamine w{\"a}hrend des Zelltods in AKR 2B-Mausfibroblasten abgebaut, was auf eine aktivierte Caspase-6 hinweist. Die enzymatischen Charakteristika dieser Protease weichen aber von den in AKR 2B-Mausfibroblasten festgestellten Werten deutlich ab, so daß man ihr nur eine untergeordnete Rolle im Caspasen-Gemisch zuordnen kann. Eine mehrfach chromatographische Reinigung der Aktivit{\"a}t bietet die beste Grundlage f{\"u}r eine anschließende Sequenzierung der Caspase mit dem Ziel ihrer Identifizierung. Durch die Expression des viralen Caspase-Inhibitors CrmA konnte eine tragende Rolle der Caspase-8 und damit des Rezeptor-vermittelten Weges in der Initiierung des apoptotischen Programms in AKR 2B-Mausfibroblasten ausgeschlossen werden. Gleiches gilt f{\"u}r den mitochondrial-vermittelten Weg, f{\"u}r dessen Beteiligung, bis auf die Spaltung der Caspase-9, keine Hinweise vorliegen. Der Weg, der zur Aktivierung der DEVDase f{\"u}hrt, ist Ziel gegenw{\"a}rtiger Untersuchungen. Substanzen, die Signalwege aktivieren PDGF-BB, TPA, Forskolin und 8Br-cAMP) oder auch Substanzen, deren Verbindung zu Signalwegen noch weitgehend offen ist, sch{\"u}tzen die Zellen vor dem Zelltod. Der protektive Effekt dieser Signalwege konzentriert sich in einem Konvergenzpunkt, der auf noch unbekannte Weise die Aktivierung der Effektor-Caspasen blockiert. Die Identit{\"a}t dieses Konvergenzpunktes und von ihm ausgehenden protektiven Weges ist Ziel weiterer Untersuchungen. So ist es m{\"o}glicherweise dieser Weg, der zum {\"U}berleben von 50 Prozent der AKR 2B-Mausfibroblasten w{\"a}hrend des Serumentzugs wesentlich beitr{\"a}gt.}, subject = {Maus}, language = {de} } @phdthesis{Loske2000, author = {Loske, Claudia}, title = {Metabolische Ver{\"a}nderungen und Zelltod in neuralen Zellen durch "Advanced Glycation Endproducts"}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1707}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2000}, abstract = {Advanced Glycation Endproducts (AGEs) entstehen aus nicht-enzymatisch glykierten Proteinen. In einer Folge von Dehydratations-, Kondensations- und Oxidationsschritten entsteht ein heterogenes Gemisch aus farbigen, fluoreszierenden Verbindungen. AGE-modifizierte Proteine sind unl{\"o}slich und proteaseresistent, bei ihrer Bildung entstehen freie Radikale und andere reaktive Intermediate. Von der AGE-Bildung betroffen sind vor allem langlebige Proteine mit geringem Umsatz wie Kollagen und Kristallin aber auch pathologische Proteinablagerungen, z.B. in der Alzheimer´schen Demenz (AD). Die Akkumulation von AGEs spielt in der Pathogenese von Komplikationen des Diabetes und der H{\"a}modialyse eine Rolle, f{\"u}r die AD wird eine Beteiligung von AGEs am Krankheitsverlauf diskutiert. Die Alzheimer´sche Demenz ist gekennzeichnet durch den histologischen Nachweis seniler Plaques und neurofibrill{\"a}rer B{\"u}ndel in Hirngewebe der Patienten. Auf Ebene des Stoffwechsels kommt es zu einer Verringerung des zerebralen Glukoseumsatzes, es finden sich Marker sowohl f{\"u}r eine Akutphasenreaktion als auch f{\"u}r oxidativen Stress. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die AGE-Bildung in vitro die Aggregation von ßA4, dem Hauptbestandteil der senilen Plaques in der AD, beschleunigt. Der geschwindigkeits-bestimmende Schritt ist dabei die Glykierung des ßA4-Monomers. Durch Zugabe von {\"U}bergangsmetall-ionen kann die Vernetzung weiter beschleunigt werden. Dies deutet darauf hin, dass AGEs zur Plaquebildung in der AD beitragen, redox-aktive Eisenionen sind in der AD mit den Plaques assoziiert. Mit Hilfe von Metallchelatoren, Antioxidantien oder mit Substanzen, welche die zur Vernetzung notwendigen Aminogruppen abblocken, l{\"a}sst sich die Aggregation von ßA4 verlangsamen oder verhindern. AGEs wirken zytotoxisch auf BHK 21 Fibroblasten und humane SH-SY5Y Neuroblastoma Zellen. Die Toxizit{\"a}t unterschiedlicher Modell-AGEs ist abh{\"a}ngig von verschiedenen Faktoren, u.a. von dem zur Herstellung verwendeten Protein und vom Zucker. Die LD50 der Modell-AGEs korreliert mit dem AGE-Gehalt und der Radikalproduktion der Pr{\"a}parationen in vitro. Die AGE-Toxizit{\"a}t ist haupts{\"a}chlich radikalvermittelt. Oxidativer Stress l{\"a}sst sich in AGE-behandelten Zellen durch die Bildung intrazellul{\"a}rer Lipidperoxidationsprodukte nachweisen. Auf Ebene der Signaltransduktion konnte die Aktivierung des Transkriptions-faktors NfkB als Zeichen der Stressabwehr nachgewiesen werden. Die Gabe von Antioxidantien vor oder gleichzeitig mit den AGEs verringerte den Zelltod. Auch durch das Blockieren des Rezeptors f{\"u}r AGEs (RAGE) mit spezifischen Antik{\"o}rpern konnte die Zahl {\"u}berlebender Zellen gesteigert werden. Durch AGEs ausgel{\"o}ster Stress f{\"u}hrt in Neuroblastoma Zellen bereits in Konzentrationen unterhalb der LD50 zu St{\"o}rungen im Redoxstatus, es kommt zur Depletion von GSH und zu Verschiebungen im Verh{\"a}ltnis GSH/GSSG. Damit einher gehen Ver{\"a}nderungen im Energiestoffwechsel der Zelle, nach anf{\"a}nglich erh{\"o}hter Glukoseaufnahme kommt es im weiteren Verlauf der Inkubation zu einer Verringerung der Aufnahme von Glukose aus dem Medium, gefolgt von einer Zunahme der Laktataussch{\"u}ttung. Ausserdem wurde eine Depletion von ATP um bis zu 50 Prozent nachgewiesen. Antioxidantien k{\"o}nnen die St{\"o}rungen im Metabolismus der Zellen verhindern oder abschw{\"a}chen, die meisten der getesteten Substanzen konnten Redoxstatus und ATP-Gehalt der Zellen zu normalisieren. Obwohl sich in AGE-gestressten Zellkulturen durch Annexin-Fluorescein-Markierung ein geringf{\"u}gig erh{\"o}hter Prozentsatz apoptotischer Zellen nachweisen ließ und AGEs auch die Freisetzung von Cytochrom c ins Zytoplasma induzieren, verl{\"a}uft der durch AGEs ausgel{\"o}ste Zelltod verl{\"a}uft offenbar insgesamt nekrotisch. Sowohl durch Radikalproduktion als auch {\"u}ber rezeptorvermittelte Signalwege verursachen AGEs oxidativen Stress und induzieren Ver{\"a}nderungen im Metabolismus der Zelle. Dies f{\"u}hrt u. a. dazu, dass f{\"u}r die antioxidativen Schutzmechanismen der Zelle nicht mehr gen{\"u}gend Energie zur Verf{\"u}gung steht. AGE-Stress tr{\"a}gt damit in einer selbstverst{\"a}rkenden Reaktionskaskade zur Neurodegeneration bei und kann so an der Pathogenese der AD beteiligt sein. Antioxidantien und auch AGE-Inhibitoren k{\"o}nnten einen interessanten Ansatz zur Entwicklung alternativer Therapien in der AD darstellen.}, subject = {Alzheimer-Krankheit}, language = {de} } @phdthesis{KolbMaeurer2001, author = {Kolb-M{\"a}urer, Annette}, title = {Interaktion humaner dendritischer Zellen mit Listeria monocytogenes}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1638}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Dendritische Zellen (DZ) aktivieren naive CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten und spielen daher die entscheidende Rolle bei der Ausl{\"o}sung einer Immunantwort gegen{\"u}ber pathogenen Mikroorganismen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von DZ mit Listeria monocytogenes untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes effizient in unreife, humane DZ aufgenommen wird. Die Phagozytoserate von L. monocytogenes unter Zugabe von humanem Plasma war wesentlich h{\"o}her als im Plasma-freien Medium oder Medium mit f{\"o}talem K{\"a}lberserum (FCS). Die Zugabe von Immunglobulinen f{\"u}hrte zu einem konzentrationsabh{\"a}ngigen Anstieg der Phagozytose von L. monocytogenes in humane DZ, der mit der Phagozytoserate bei Zugabe von humanem Plasma vergleichbar war. Plasma von gesunden Spendern enthielt Antik{\"o}rper gegen das listerielle Oberfl{\"a}chenprotein p60. Durch die Verwendung einer p60 Deletionsmutante konnte gezeigt werden, dass der p60 Antik{\"o}rper das Haupt-Opsonin f{\"u}r die Aufnahme von L. monocytogenes in Mo-DZ darstellt. Die Aufnahmerate dieser Mutante zeigte nur geringe Differenzen bei An- oder Abwesenheit von humanem Plasma w{\"a}hrend der Inkubationszeit, was den Schluss zul{\"a}sst, dass Immunglobuline gegen das Oberfl{\"a}chenprotein p60 von L. monocytogenes und anderen apathogenen Listerien, f{\"u}r die effiziente Phagozytose verantwortlich sind. Nach Aufnahme der Listerien befanden sich die meisten (> 95 Prozent) DZ in Membran-umgrenzten Phagosomen und sehr selten frei im Zytosol. Die Mehrzahl der Listerien wurde im Phagosom der humanen DZ effizient lysiert. L. monocytogenes-infizierte DZ entwickelten sich ph{\"a}notypisch zu reifen DZ. Die durch Listerien ausgel{\"o}ste Maturation der DZ ließen sich durch die Zugabe von listerieller Lipoteichons{\"a}ure (LTA) nachahmen. Obwohl bekannt ist, dass eine Listerieninfektion in anderen Zellkulturen Zelltod induziert, f{\"u}hrte die Infektion humaner DZ lediglich in weniger als 20 Prozent der infizierten DZ zur Nekrose. Apoptotischer Zelltod konnte nicht nachgewiesen werden. Die Interaktion humaner DZ mit L. monocytogenes k{\"o}nnte somit eine Verbreitung der Bakterien im Organismus verhindern. Langfristig gesehen ergeben die in dieser Arbeit gewonnenen Daten zur Interaktion DZ mit L. monocytogenes Erkenntnisse zur Entwicklung neuer DNA-Vakzinierungsstrategien mit L. monocytogenes als DNA-Tr{\"a}ger.}, subject = {Mensch}, language = {de} }