@phdthesis{Pitsch2024,
  author    = {Pitsch, Maximilian Jonathan},
  title     = {Zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) als {\"A}quivalent akkumulierter neuronaler Evidenz},
  doi       = {10.25972/OPUS-35129},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-351292},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2024},
  abstract  = {Die vier Crz-Neurone des ventralen Nervensystems von Drosophila melanogaster sammeln Evidenz, wann im Rahmen eines Paarungsakts zirka 6 Minuten vergangen sind. Diese Entscheidung ist f{\"u}r die m{\"a}nnliche Fliege von Bedeutung, da das M{\"a}nnchen vor Ablauf dieser ~6 Minuten, welche den Zeitpunkt der Ejakulation darstellen, eher das eigene Leben opfern w{\"u}rde, als dass es die Paarung beenden w{\"u}rde. Nach Ablauf der ~6 Minuten f{\"a}llt die Motivation des M{\"a}nnchens dagegen dramatisch ab. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zun{\"a}chst mittels optogenetischer neuronaler Inhibitionsprotokolle sowie Verhaltensanalysen das Ph{\"a}nomen der Evidenz-akkumulation in den Crz-Neuronen genauer charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass die akkumulierte Evidenz auch w{\"a}hrend einer elektrischen Inhibition der Crz-Neurone persistierte. Dieses Ergebnis warf die Hypothese auf, dass das {\"A}quivalent der akkumulierten Evidenz in den Crz-Neuronen biochemischer Natur sein k{\"o}nnte. Es wurde daraufhin ein Hochdurchsatzscreening-Verfahren entwickelt, mittels dessen 1388 genetische Manipulationen der Crz-Neurone durchgef{\"u}hrt und auf eine {\"A}nderung der Evidenzakkumulation getestet wurden. Nur ~30 genetische Manipulationen zeigten eine ver{\"a}nderte Evidenzakkumulation, wobei die meisten dieser Manipulationen den cAMP-Signalweg betrafen. Mittels der optogenetischen Photoadenylatzyklase bPAC, einer Reihe weiterer genetischer Manipulationen des cAMP-Signalwegs sowie der ex vivo Kalzium-Bildgebung und Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie konnte best{\"a}tigt werden, dass cAMP das {\"A}quivalent der in den Crz-Neuronen spannungsabh{\"a}ngig akkumulierten Evidenz darstellt, wobei die Kombination dieser Methoden nahelegte, dass der Schwellenwert der Evidenzakkumulation durch die cAMP-Bindungsaffinit{\"a}t der regulatorischen PKA-Untereinheiten festgelegt sein k{\"o}nnte. Mittels genetischer Mosaikexperimente sowie bildgebenden Verfahren konnte dar{\"u}ber hinaus gezeigt werden, dass innerhalb des Crz-Netzwerks eine positive R{\"u}ckkopplungsschleife aus rekurrenter Aktivit{\"a}t sowie der cAMP-Akkumulation besteht, welche, sobald die cAMP-Spiegel den Schwellenwert erreichen, zu einem netzwerkweit synchronisierten massiven Kalziumeinstrom f{\"u}hrt, was die Abgabe des Crz-Signals an nachgeschaltete Netzwerke triggert. Dieses Ph{\"a}nomen k{\"o}nnte ein Analogon des Aktionspotenzials auf Netzwerkebene sowie auf Intervallzeitskalen darstellen und wurde als „Eruption" bezeichnet. Genetische, optogenetische sowie Bildgebungsexperimente konnten zeigen, dass die CaMKII derartige Eruptionen durch Niedrighalten der cAMP-Spiegel unterdr{\"u}ckt, was den Zeitmessmechanismus des ersten beschriebenen Intervallzeitmessers CaMKII offenlegt.},
  subject      = {Evidenz},
  language  = {de}
}
@article{BeckYuStrzelczykPaulsetal.2018,
  author    = {Beck, Sebastian and Yu-Strzelczyk, Jing and Pauls, Dennis and Constantin, Oana M. and Gee, Christine E. and Ehmann, Nadine and Kittel, Robert J. and Nagel, Georg and Gao, Shiqiang},
  title     = {Synthetic light-activated ion channels for optogenetic activation and inhibition},
  series = {Frontiers in Neuroscience},
  volume    = {12},
  journal   = {Frontiers in Neuroscience},
  number    = {643},
  doi       = {10.3389/fnins.2018.00643},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-177520},
  year      = {2018},
  abstract  = {Optogenetic manipulation of cells or living organisms became widely used in neuroscience following the introduction of the light-gated ion channel channelrhodopsin-2 (ChR2). ChR2 is a non-selective cation channel, ideally suited to depolarize and evoke action potentials in neurons. However, its calcium (Ca2\(^{2+}\)) permeability and single channel conductance are low and for some applications longer-lasting increases in intracellular Ca\(^{2+}\) might be desirable. Moreover, there is need for an efficient light-gated potassium (K\(^{+}\)) channel that can rapidly inhibit spiking in targeted neurons. Considering the importance of Ca\(^{2+}\) and K\(^{+}\) in cell physiology, light-activated Ca\(^{2+}\)-permeant and K\(^{+}\)-specific channels would be welcome additions to the optogenetic toolbox. Here we describe the engineering of novel light-gated Ca\(^{2+}\)-permeant and K\(^{+}\)-specific channels by fusing a bacterial photoactivated adenylyl cyclase to cyclic nucleotide-gated channels with high permeability for Ca\(^{2+}\) or for K\(^{+}\), respectively. Optimized fusion constructs showed strong light-gated conductance in Xenopus laevis oocytes and in rat hippocampal neurons. These constructs could also be used to control the motility of Drosophila melanogaster larvae, when expressed in motoneurons. Illumination led to body contraction when motoneurons expressed the light-sensitive Ca\(^{2+}\)-permeant channel, and to body extension when expressing the light-sensitive K\(^{+}\) channel, both effectively and reversibly paralyzing the larvae. Further optimization of these constructs will be required for application in adult flies since both constructs led to eclosion failure when expressed in motoneurons.},
  language  = {en}
}