@phdthesis{Schaefer2011, author = {Sch{\"a}fer, Ingo}, title = {Fremdgenexpression in humanen Mitochondrien}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85202}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Bei einer Vielzahl neuromuskul{\"a}rer und neurodegenerativer Erkrankungen spielen Fehlfunktionen der Mitochondrien eine wichtige Rolle. Da die Proteine der Atmungsketten-komplexe sowohl durch die mitochondriale DNA als auch durch das Kerngenom codiert werden, k{\"o}nnen Mutationen in beiden Genomen die Ausl{\"o}ser dieser Erkrankungen darstellen. Ver{\"a}nderungen der mitochondrialen DNA lassen sich - im Gegensatz zum Kerngenom - bisher nicht korrigieren, weshalb bei einem großen Teil der Erkrankungen nur die Symptome und nicht die Ausl{\"o}ser behandelt werden k{\"o}nnen. Das grundlegende Problem stellt dabei der Transport der DNA in die Mitochondrien dar. Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von physikalischen Transfektionsmethoden exogene DNA in die Mitochondrien menschlicher Kulturzellen einzubringen. Dazu wurden unterschiedliche Vektoren hergestellt, die in Mitochondrien das an die Mitochondrien angepasste gr{\"u}n fluoreszierende mtEGFP exprimieren sollen. Die Expressionsf{\"a}higkeit und Prozessierung dieser Konstrukte konnte in in-vitro-Assays mit einem Mitochondrienextrakt nachgewiesen werden. Bei Transfektionsversuchen mit der Gene Gun gelang es erstmals, exogene Plasmid-DNA in die Mitochondrien menschlicher Zellen einzubringen. Das durch die transfizierten Vektoren exprimierte mtEGFP konnte am Fluoreszenzmikroskop eindeutig in den Mitochondrien der Zellen lokalisiert werden. Eine Transfektion mit Hilfe magnetischer Partikel erwies sich jedoch nicht als zielf{\"u}hrend, da die die Partikel eine Eigenfluoreszenz aufwiesen, die eine Detektion der mtEGFP-Expression verhinderten. Eine wichtige Voraussetzung f{\"u}r die Transfektion von Mitochondrien durch mechanische Methoden wie die Mikroinjektion ist die reversible Induktion von Megamitochondrien, da sie erst in diesem Zustand penetriert werden k{\"o}nnen. Durch eine Ans{\"a}uerung des Kulturmediums mit Natriumacetat bzw. Essigs{\"a}ure konnten Mitochondrien erzeugt werden, die beinahe die Gr{\"o}ße des Zellkerns aufwiesen und somit ideale Bedingungen f{\"u}r die Mikroinjektion darstellen. Bei den anschließenden Mikroinjektionsversuchen mit den hergestellten mitochondrialen Expressionsvektoren wurden wiederum Zellen mit eindeutig gr{\"u}n fluoreszierenden Mitochondrien gefunden. Zusammenfassend wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmalig menschliche Mitochondrien mit exogener DNA transfiziert. Dies stellt einen grundlegenden Schritt f{\"u}r die Entwicklung neuer Therapieformen bei mitochondrialen Myopathien dar. Zuvor m{\"u}ssen die Transfektionsmethoden jedoch noch weiter optimiert werden, um eine h{\"o}here Transfektionseffizienz zu erreichen.}, subject = {Mitochondrium}, language = {de} } @phdthesis{Zirkel2011, author = {Zirkel, Janina}, title = {Malaria in Burkina Faso - Chancen f{\"u}r eine neue Strategie mit Hilfe von Methylenblau}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72583}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Trotz betr{\"a}chtlicher Anstrengung Malaria zu kontrollieren bzw. zu eradizieren, stellt die Krankheit weiterhin eines der gravierendsten Gesundheitsprobleme unseres Jahrtausends dar. Malaria fordert j{\"a}hrlich zwischen 0,7 und 2,7 Millionen Menschenleben, beeintr{\"a}chtigt schulische und soziale Entwicklung und hemmt erheblich das Wirtschaftswachstum der betroffenen L{\"a}nder. In Burkina Faso, einem der {\"a}rmsten L{\"a}nder der Welt, ist Malaria eines der gr{\"o}ßten Gesundheitsprobleme und ca. ein Drittel aller Todesf{\"a}lle werden hier Malaria angelastet. Die sich weiter ausbreiteten Resistenzen gegen die g{\"a}ngigen Malariamedikamente machen die Bek{\"a}mpfung der Malaria zunehmend schwierig. Artemisinin basierende Kombinationstherapien sind aktuell, trotz relativ hoher Therapiekosten und erster Resistenzen, die Erstlinien Behandlung. Effektive und billige neue Kombinationstherapien werden dringend ben{\"o}tigt. In dieser Doktorarbeit wurde das Resistenzpotential von Artemisinin modelliert. Die Homologiemodellierungen unterst{\"u}tzen die These von Krishna und Kollegen von SERCA als einzige Zielstruktur von Artemisinin. Des Weiteren wurde Methylenblau als neues altes Malariamittel evaluiert. Methylenblau ist das erste gegen Malaria eingesetzte Medikament, agiert als ein prooxidatives Agens und inhibiert selektiv und nicht-kompetitiv die P. falciparum Glutathion Reduktase. Die additiven und multiplen Zielprotein Effekte von Methylenblau wurden experimentell untersucht und hier in einem bioinformatischem Modell getestet. Unter dem Einfluss von Methylenblau werden einige Schl{\"u}sselenzyme des Redoxstoffwechsels in ihrer Aktivit{\"a}t beeintr{\"a}chtigt und der Parasit wird verst{\"a}rkt oxidativem Stress ausgesetzt. Des Weiteren konnte in dieser Dr. Arbeit eine starke Kooperationsbereitschaft der urbanen und l{\"a}ndlichen Bev{\"o}lkerung an zuk{\"u}nftigen Malaria Projekten gezeigt werden.}, subject = {Methylenblau}, language = {de} } @phdthesis{Donat2011, author = {Donat, Ulrike}, title = {Detektion und Therapie von Metastasen des humanen Prostatakarzinoms durch das onkolytische Vaccinia-Virus GLV-1h68}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-56421}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Zurzeit sterben j{\"a}hrlich ca. 11.000 M{\"a}nner in Deutschland am Prostatakarzinom. Damit stellt dies die zweith{\"a}ufigste Krebstodesursache von M{\"a}nnern dar. Da das Prostatakarzinom h{\"a}ufig asymptomatisch verl{\"a}uft, wird die Erkrankung oftmals erst so sp{\"a}t erkannt, dass zum Zeitpunkt der Diagnose bereits eine Metastasierung stattgefunden hat. Durch metastasierende Prostatakarzinomzellen werden Lymphknoten, Knochen und Lungen befallen. Es sind zwei unterschiedliche Verbreitungsarten von metastasierenden Tumorzellen beschrieben. Zum einen kann eine Migration {\"u}ber Lymphgef{\"a}ße erfolgen, ein Prozess der als lymphatische Metastasierung bezeichnet wird. Zum anderen k{\"o}nnen Tumorzellen {\"u}ber das Blutsystem im K{\"o}rper zirkulieren: die h{\"a}matogene Metastasierung. In dieser Arbeit wurde die lymphatische Metastasierung der humanen Prostatakarzinomzellline PC-3 im Detail analysiert und Teilaspekte der h{\"a}matogenen Verteilung untersucht. Ausgangspunkt der Untersuchungen bildete die Vergr{\"o}ßerung lumbaler und renaler Lymphknoten in PC-3-Tumor-tragenden M{\"a}usen 60 Tage nach der Implantation von PC-3-Zellen. Es wurde daraufhin der zeitliche Verlauf der Vergr{\"o}ßerung untersucht und festgestellt, dass sowohl das Volumen als auch die Anzahl vergr{\"o}ßerter Lymphknoten von Woche zu Woche nach Implantation der PC-3-Tumore zunehmen. Anschließend wurden alle vergr{\"o}ßerten Lymphknoten bez{\"u}glich des Vorhandenseins von metastasierenden humanen PC-3-Zellen in den M{\"a}usen untersucht. Dies geschah mit Hilfe einer RT-PCR unter Verwendung von Primern f{\"u}r humanes β-Aktin. Sechs Wochen nach Implantation konnten in 90 \% der vergr{\"o}ßerten Lymphknoten PC-3-Zellen nachgewiesen werden. Weiterhin wurde durch lentivirale Transduktion das Gen f{\"u}r das rot fluoreszierende Protein (RFP) in die PC-3-Zellen inseriert, wodurch eine Visualisierung dieser Zellen in der Maus erm{\"o}glicht wurde. Es konnten metastasierende PC-3-RFP-Zellen in lumbalen und renalen Lymphknoten PC-3-RFP-Tumor-tragender M{\"a}use nachgewiesen werden. Ebenso konnte mittels RFP gezeigt werden, dass die Lymphknotenmetastasierung in Abh{\"a}ngigkeit von der Lokalisation des PC-3-RFP-Tumors erfolgt. Es kam zur Metastasierung jener Lymphknoten, in deren Einzugsgebiet sich der PC-3-Tumor befand. Es wurde eine PC-3-RFP-Zellmigration zwischen lumbalen und renalen Lymphknotenmetastasen nachgewiesen und bei immunhistologischen Untersuchungen stellte sich heraus, dass PC-3-RFP-Zellen tats{\"a}chlich in lymphatischen Bahnen zwischen lumbalen und renalen Lymphknotenmetastasen migrieren. Außerdem wurde gezeigt, dass es von Woche zu Woche nach Implantation von PC-3-Zellen zu einer Zunahme der Anzahl von Lymphgef{\"a}ßen in PC-3-Tumoren kommt. Die Zunahme der Lymphgef{\"a}ßdichte korrelierte hierbei positiv mit der Bildung von Lymphknotenmetastasen. Es konnten weiterhin neben Lymphknotenmetastasen h{\"a}matogene Mikrometastasen in den Lungen PC-3-RFP-Tumor-tragender M{\"a}use beobachtet werden. Da die Haupttodesursache von Prostatakarzinompatienten in der Bildung von Metastasen liegt, ist es von herausragender Bedeutung eine effektive Therapie gegen lymphatische und h{\"a}matogene Metastasen zu entwickeln. Aus diesem Grund erlangt die onkolytische Virustherapie große Bedeutung. Deshalb wurde als zweiter Aspekt in dieser Arbeit der Einfluss des onkolytischen Vaccinia-Virus GLV-1h68 auf den Prozess der PC-3-Zellmetastasierung untersucht. Dabei konnte zun{\"a}chst gezeigt werden, dass GLV-1h68 in der Lage ist, erfolgreich sowohl migrierende PC-3-Zellen als auch metastasierende PC-3-Zellen in Lymphknoten zu kolonisieren. In der Folge wurde deshalb ein m{\"o}glicher Metastasen-inhibierender Effekt von GLV-1h68 untersucht. Hierbei stellte sich heraus, dass GLV-1h68 drei Wochen nach intraven{\"o}ser Injektion eine signifikante Reduktion der Anzahl der f{\"u}r PC-3-Zellen positiven Lymphknoten bewirkt. Des Weiteren konnte ein inhibierender Effekt von GLV-1h68 auf die im Blut zirkulierenden PC-3-Zellen und auf h{\"a}matogene Metastasen in den Lungen beobachtet werden. Durch intraven{\"o}se Injektion von GLV-1h68 in PC-3-RFP-Tumor-tragenden M{\"a}usen konnte gezeigt werden, dass es zu einer pr{\"a}ferentiellen Virus-Kolonisierung der Lymphknotenmetastasen im Vergleich zu den Tumoren kommt. Auch nach intraperitonealer und intratumoraler Injektion von GLV-1h68 konnte eine pr{\"a}ferentielle Virus-Kolonisierung der Lymphknotenmetastasen gezeigt werden. Dar{\"u}ber hinaus wurden die Lymph- und Blutgef{\"a}ße von PC-3-Tumoren und Lymphknotenmetastasen analysiert. Hierbei wurde gezeigt, dass es sieben Tage nach intraven{\"o}ser Injektion von GLV-1h68 zu einer signifikanten Abnahme von beiden Gef{\"a}ßarten kam. Es wurde in dieser Arbeit somit gezeigt, dass GLV-1h68 in der Lage ist, sowohl lymphatische als auch h{\"a}matogene Metastasen der Prostatakarzinomzelllinie PC-3 erfolgreich zu eliminieren. Folglich d{\"u}rften onkolytische Vaccinia-Viren ein vielversprechendes Therapeutikum f{\"u}r die Behandlung des fortgeschrittenen Prostatakarzinoms darstellen.}, subject = {Prostatakrebs}, language = {de} } @phdthesis{Hokema2011, author = {Hokema, Anna}, title = {Beeinflussung der Genexpression verschiedener Gene durch Xmrk in Pigmentzelltumoren bei Oryzias latipes}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-75616}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Ziel dieser Arbeit ist es ein besseres Verst{\"a}ndinis der molekularen Prozesse der Melanomentstehung und Tumorprogression zu gewinnen. Hierf{\"u}r wurde ein Tiermodell transgener Medakas (Oryzias latipes) verwendet, welche als stabiles Transgen das Konstrukt mitf::xmrk besitzen. Diese Fische entwickelten Pigmentzelltumore, welche f{\"u}r eine Microarrayanalyse herangezogen wurden. Aus diesem Microarraydatensatz wurden 11 Gene ausgew{\"a}hlt, welche in dieser Arbeit n{\"a}her untersucht wurden. Beobachtungen haben ergeben, dass sich bei transgenen Medakas, welche Xmrk exprimieren, verschiedene pigmentierte Hauttumore entwickeln. Diese Tumore wurden je nach ihrem verschiedenen Histiotyp klassifiziert und untersucht. Um einen Eindruck zu gewinnen, wie Xmrk die Transkription verschiedener Gene, welche in der Krebsentstehung und -progression eine wichtige Rolle spielen, beeinflusst, wurden pigmentierte Hauttumore transgener Medakas, so wie zu Vergleichszwecken hyperpigmentierte Haut transgener Medakas und Lymphome und gesunde Organe von Wildtyp-Medakas, untersucht. Mit Hilfe von Real-time-PCR's wurden die folgenden Gene untersucht: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 und ZFAND5. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Expression der Gene GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 von Xmrk beeinflusst wird, w{\"a}hrend dies f{\"u}r die Gene G6PC, GAMT, SPP1 und TACC2 nicht zutrifft. Im Vergleich zu gesunder Haut werden GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 in Tumoren h{\"o}her exprimiert. Die Gene G6PC, GAMT, NID1, SPP1 und TACC2 werden dagegen verglichen mit gesunder Haut unver{\"a}ndert oder niedriger exprimiert. Die Bedeutung der erh{\"o}hten Genexpression l{\"a}sst sich in vielen F{\"a}llen zurzeit nur theoretisch erfassen. Eine h{\"o}here Expression von SLC24A5 beispielsweise l{\"a}sst vermuten, dass ein Zusammenhang zwischen der Melaninproduktion und der Zellproliferation besteht. Die {\"U}berexpression von GM2A weist dagegen auf eine Rolle von GM2A als Tumormarker hin. Dahingegen scheint die erniedrigte Expression von GAMT und G6PC Auskunft {\"u}ber den ver{\"a}nderten Stoffwechsel in Tumoren zu geben. Um diese Ergebnisse zu best{\"a}tigen und zu entschl{\"u}sseln wie genau Xmrk die Expression der getesteten Gene beeinflusst, sind allerdings noch weitere funktionelle Studien n{\"o}tig. Generell kommt man zu dem Schluss, dass die Genexpression sich in jedem Tumor unterscheidet. Daher scheint jeder Tumor seinen eigenen Evolutionsweg zu beschreiten.}, subject = {Japank{\"a}rpfling}, language = {de} } @phdthesis{Vogel2011, author = {Vogel, Benjamin}, title = {Organisation von Chromatin durch HMGA1 Proteine}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65295}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {HMGA1 Proteine sind kleine, basische, Nicht-Histon Proteine, die in L{\"o}sung keine Struktur aufweisen, durch drei AT-Haken, als DNA-Bindungsmotive, gekennzeichnet sind und pr{\"a}ferentiell an die kleine Furche der DNA binden. Als differenziell exprimierte Architekturelemente des Chromatins erf{\"u}llen sie wichtige Funktionen bei der Regulation DNA abh{\"a}ngiger Prozesse in Zellen und w{\"a}hrend Entwicklungsprozessen. Aberrante Expressionen f{\"u}hren zu Entwicklungsdefekten und Krebs. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von HMGA1 Proteinen auf die Organisation des Chromatins untersucht. Als Modell diente dabei zun{\"a}chst die Differenzierung von C2C12 Muskelvorl{\"a}uferzellen. Wie in einer fr{\"u}heren Arbeit gezeigt wurde, ist die Herunterregulation von HMGA1a essentiell f{\"u}r den Eintritt von C2C12 Zellen in die Myogenese. Eine konstante {\"U}berexpression von HMGA1a-eGFP hingegen verhindert die Muskeldifferenzierung durch Beeinflussung der Expression myogenesespezifischer Gene und Etablierung einer stabilen Chromatinstruktur. Wie in der vorliegenden Arbeit herausgefunden wurde, nimmt die differenzielle HMGA1a Expression nicht nur Einfluss auf die Expression muskelspezifischer Gene, sondern auch auf die globale Zusammensetzung des Chromatins durch eine reduzierte Expression von H1 Histonen und einer aberranten Expression von HMGB1, HMGN1 und HP1 Proteinen. HMGA1a wurde zusammen mit ORC Proteinen eine Funktion bei der Definition von Replikationsurspr{\"u}ngen in eukaryotischen Zellen zugesprochen. ORC Proteine wurden auch als Komponenten des Heterochromatins und als Interaktionspartner von HP1α identifiziert. Hier konnte mit Hilfe von Co-Immunpr{\"a}zipitationen, Pull-down Assays und Verdr{\"a}ngungsexperimenten gezeigt werden, dass HMGA1 ein weiterer, direkter Interaktionspartner von ORC Proteinen im Heterochromatin ist und zusammen mit HP1α kooperiert. Pull-down-, Verdr{\"a}ngungs- und siRNA-Experimente zeigten zudem, dass HMGA1 zwar nicht direkt mit HP1α interagiert, die Kooperation der Proteine {\"u}ber ORC aber dennoch wichtig f{\"u}r die Aufrechterhaltung der Heterochromatinsstruktur ist. Damit erweisen sich HMGA1 Proteine als wichtige Stabilisierungsfaktoren des Heterochromatins. Bislang ging man davon aus, dass HMGA1 Molek{\"u}le linear, also eindimensional, an ein DNA Molek{\"u}l binden. Das Vorhandensein von drei DNA-Bindungsmotiven und die eher struktur- als sequenzabh{\"a}ngige Bindung an die DNA lassen vermuten, dass HMGA1 Proteine auch gleichzeitig an benachbarte DNA-Str{\"a}nge, also auch dreidimensional, binden k{\"o}nnten. Bekr{\"a}ftigt wurde diese Vermutung durch die Bildung von Chromatinaggregaten in Zellen die HMGA1a-eGFP {\"u}berexprimierten. Dies wurde mittels konfokaler und hochaufl{\"o}sender Mikroskopie (dSTORM) analysiert. Um das Potential einer DNA-Quervernetzung durch HMGA1 Proteine nachzuweisen, wurde eine neue Methode entwickelt. Mit Hilfe eines neuartigen DNA Cross-linking Assays wurde nachgewiesen, dass HMGA1 Proteine in der Lage sind, zwei individuelle DNA Str{\"a}nge zu vernetzen. Zudem wurde eine neue Dom{\"a}ne in HMGA1 entdeckt die maßgeblich zum Cross-linking beitr{\"a}gt. Elektronenmikroskopische Analysen best{\"a}tigten, dass HMGA1 Proteine in der Lage sind Kreuzungen und Schleifen in DNA Molek{\"u}len zu erzeugen. Diese Ergebnisse unterst{\"u}tzen die Vermutung, dass HMGA1 Proteine im Zellkern ein DNA Ger{\"u}st bilden k{\"o}nnen, das Einfluss auf die zelltypische Chromatinorganisation nimmt und dadurch DNA abh{\"a}ngige Prozesse beeinflusst. In wie weit eine HMGA1 induzierte DNA Quervernetzung in vivo zum Beispiel in Chromozentren von C2C12 Zellen oder in Krebszellen, in denen HMGA1 Proteine stark {\"u}berexprimiert sind, eine Rolle spielen, m{\"u}ssen k{\"u}nftige Untersuchungen zeigen. In dieser Arbeit konnte also gezeigt werden, dass HMGA1 Proteine die Chromatinstruktur auf drei Ebenen organisieren k{\"o}nnen: Durch Beeinflussung der Chromatinzusammensetzung durch Ver{\"a}nderung der Expression von Chromatinproteinen, durch Interaktion mit anderen Architekturelementen des Chromatins und durch Organisation eines potentiellen DNA Ger{\"u}sts.}, subject = {Chromatin}, language = {de} } @phdthesis{Philippi2011, author = {Philippi, Nicole}, title = {Modellierung von Signalwegen in verschiedenen biologischen Systemen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-57690}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Die Apoptose der Leberzellen ist abh{\"a}ngig von externen Signalen wie beispielsweise Komponenten der Extrazellul{\"a}ren Matrix sowie anderen Zell-Zell-Kontakten, welche von einer Vielfalt und Vielzahl an Knoten verarbeitet werden. Einige von ihnen wurden im Rahmen dieser Arbeit auf ihre Systemeffekte hin unter- sucht. Trotz verschiedener {\"a}ußerer Einfl{\"u}sse und nat{\"u}rlicher Selektion ist das System daraufhin optimiert, eine kleine Anzahl verschiedener und klar voneinander unterscheidbarer Systemzust{\"a}nde anzunehmen. Die verschiedenartigen Einfl{\"u}sse und Crosstalk-Mechanismen dienen der Optimierung der vorhandenen Systemzust{\"a}nde. Das in dieser Arbeit vorgestellte Modell zeigt zwei apoptotische sowie zwei nicht-apoptotische stabile Systemzust{\"a}nde, wobei der Grad der Aktivierung eines Knotens bis zu dem Moment stark variieren kann, in welchem der absolute Systemzustand selbst ver{\"a}ndert wird (Philippi et al., BMC Systems Biology,2009) [1]. Dieses Modell stellt zwar eine Vereinfachung des gesamten zellul{\"a}ren Netzwerkes und seiner verschiedenen Zust{\"a}nde dar, ist aber trotz allem in der Lage, unabh{\"a}ngig von detaillierten kinetischen Daten und Parametern der einzelnen Knoten zu agieren. Gleichwohl erlaubt das Modell mit guter qualitativer {\"U}bereinstimmung die Apoptose als Folge einer Stimulation mit FasL zu modellieren. Weiterhin umfasst das Modell sowohl Crosstalk-M{\"o}glichkeiten des Collagen-Integrin-Signalwegs, ebenso ber{\"u}cksichtigt es die Auswirkungen der genetischen Deletion von Bid sowie die Konsequenzen einer viralen Infektion. In einem zweiten Teil werden andere Anwendungsm{\"o}glichkeiten dargestellt. Hormonale Signale in Pflanzen, Virusinfektionen und intrazellul{\"a}re Kommunikation werden semi-quantitativ modelliert. Auch hier zeigte sich eine gute Ubereinstimmung der Modelle mit den experimentellen Daten.}, subject = {Systembiologie}, language = {de} } @phdthesis{Schuelein2011, author = {Sch{\"u}lein, Christina}, title = {Die Regulation von Fbw7 durch PI3K-abh{\"a}ngige Phosphorylierung und Charakterisierung eines konditionalen Usp28-Knockout-Mausmodells}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-70963}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Das Proto-Onkoprotein Myc ist an der Entstehung und Aufrechterhaltung einer Vielzahl humaner Tumore entscheidend beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurde Serin 227 in Fbw7 als Ziel f{\"u}r eine PI3K-abh{\"a}ngige Phosphorylierung identifiziert. Diese Phosphorylierung f{\"u}hrt zur Stabilisierung von Fbw7 und steigert die F{\"a}higkeit von Fbw7, Substratproteine zu ubiquitinieren und abzubauen. Um die Bedeutung von Usp28 in der Myc-induzierten Tumorentstehung und in der normalen Gewebehom{\"o}ostase zu untersuchen, wurde ein konditionales Knockout-Mausmodell f{\"u}r Usp28 charakterisiert. M{\"a}use mit einer Keimbahndeletion von Usp28 sind lebensf{\"a}hig, fertil und ph{\"a}notypisch unauff{\"a}llig. Weder in Organen der Usp28-negativen Tiere, noch in entsprechenden murinen embryonalen Fibroblasten kann eine Destabilisierung von Myc festgestellt werden. Allerdings zeigen Fibroblasten mit heterozygotem Usp28-Verlust einen Proliferationsdefekt und in Eμ-Myc-Lymphomen dieses Genotyps werden tendenziell niedrigere Myc-Proteinmengen gefunden. Das tumorfreie {\"U}berleben ist bei den Eμ-Myc; Usp28 +/- Tieren verl{\"a}ngert.}, subject = {Myc}, language = {de} } @phdthesis{Dippacher2011, author = {Dippacher, Sonja}, title = {Morphologische und molekularbiologische Untersuchungen zur Bedeutung der Serin-Threonin-Proteinkinase SRPK79D in Drosophila melanogaster}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-70937}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Die intakte Signal{\"u}bertragung im animalischen Nervensystem erfordert eine an richtiger Stelle ausgebildete funktionsf{\"a}hige Synapse zwischen zwei Nervenzellen bzw. zwischen Nerv und Muskel. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutante von Drosophila melanogaster untersucht, bei der es zu Ver{\"a}nderungen der Verteilung eines wichtigen Organisationsproteins der synaptischen aktiven Zone kommt. Ein wichtiges Ergebnis der Untersuchungen ist die Beobachtung, dass es in der Mutante zu einer ektopen Ausbildung von Elementen aktiver Zonen in Axonen kommt. In den Arbeitsgruppen von E. Buchner und S. Sigrist ist bereits das Protein Bruchpilot (BRP) charakterisiert worden, das Bestandteil der pr{\"a}synaptischen Ribbons, bei Drosophila als T-bars bezeichnet, ist. Bei der Suche nach Interaktionspartnern von BRP, ist eine Serin-Arginin-Protein spezifische Kinase SRPK79D entdeckt worden, die offenbar an der Regulation des Aufbaus der Tbars beteiligt ist (Nieratschker et al., 2009). Es gibt vier verschiedene Isoformen der Kinase. Werden nur zwei Isoformen der Kinase (SRPK79D-RB und -RE) exprimiert bzw. das Gen der Kinase komplett ausgeschaltet, findet man Ansammlungen von BRP als immunreaktive Aggregate in der Immunfluoreszenz- F{\"a}rbung von larvalen Motoneuron-Axonen (Nieratschker, 2008). Es ist unser {\"u}bergeordnetes Ziel, die Funktion und den molekularen Signalweg der Kinase SRPK79D zu entschl{\"u}sseln. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, PB-Protein in Reinform f{\"u}r eine Affinit{\"a}tsreinigung eines PB-Antik{\"o}rpers zu gewinnen, um in nachfolgenden Untersuchungen die Lokalisation dieser Kinase-Isoform zu untersuchen. Die Proteinreinigung war erfolgreich, aber es gelang nicht, eine f{\"u}r eine Affinit{\"a}tsreinigung ausreichende Menge des Proteins zu isolieren. Ein weiterer Versuch, Lokalisationsuntersuchungen zur Expression der Kinase in Drosophila- Embryonen durchzuf{\"u}hren, war ebenfalls nicht erfolgreich. Obwohl die Herstellung einer f{\"u}r die SRPK79D mRNA spezifischen RNA Sonde f{\"u}r die in-Situ-Hybridisierung gelang, war die Sensitivit{\"a}t dieser Sonde nicht hoch genug, um die Lokalisation vornehmen zu k{\"o}nnen. Eindeutige und aufschlussreiche Ergebnisse dagegen ergab die Untersuchung der Ultrastruktur der BRP-Ansammlungen in den larvalen Motornerven. Als deren Korrelat fanden sich elektronenmikroskopisch charakteristische Ansammlungen elektronendichter intraaxonaler Strukturen, deren Form {\"A}hnlichkeiten zu T-bars aufwies und die von Vesikeln umgeben waren. Die elektronendichten Strukturen zeigten zahlreiche Formvariationen, die wie Ansammlungen von T-bars nebeneinander bzw. „miteinander verklebte" T-bars oder wie zerst{\"o}rte T-bars aussahen. In einer nachfolgenden Studie wurde durch eine immun-elektronenmikroskopische Untersuchung gezeigt, dass diese Strukturen in der Tat BRP enthalten (Nieratschker et al., 2009). Ergebnis der Untersuchungen der vorliegenden Arbeit war der Nachweis, dass prinzipiell {\"a}hnliche Aggregate auch im Wildtyp gelegentlich gefunden werden, dass sie aber in Mutanten signifikant h{\"a}ufiger vorkommen und auch einen signifikant h{\"o}heren Durchmesser aufweisen. Doppelimmunreaktionen mit Antik{\"o}rpern, die den C- bzw. N-terminalen Bereich von BRP erkennen, belegten dar{\"u}ber hinaus, dass in den Aggregaten das vollst{\"a}ndige BRP-Protein vorliegt. Angeregt durch die Ultrastrukturbefunde von mit den elektronendichten Strukturen in den Aggregaten assoziierten Vesikeln wurde in weiteren Doppelimmunreaktionen untersucht, ob ein typisches Protein synaptischer Vesikel neuromuskul{\"a}rer Synapsen in Drosophila, der vesikul{\"a}re Glutamattransporter (DVGlut), in den BRP-Ansammlungen nachweisbar ist. W{\"a}hrend Kolokalisation von BRP und DVGlut in aktiven Zonen pr{\"a}synaptischer Boutons nachgewiesen werden konnte, war der Vesikelmarker in BRP-Aggregaten nicht kolokalisiert. Die Ergebnisse belegen, dass die Kinase SRPK79D f{\"u}r die Vermeidung einer ektopen Bildung von BRP-enthaltenden, elektronenmikroskopisch atypischen aktiven Zonen {\"a}hnelnden Strukturen in larvalen Motoneuronaxonen notwendig ist. Die in diesen Aggregaten regelm{\"a}ßig zu beobachtenden Vesikel {\"a}hneln morphologisch synaptischen Vesikeln, besitzen aber keine daf{\"u}r typischen Vesikelmarker.}, subject = {Bruchpilot}, language = {de} } @phdthesis{Schramm2011, author = {Schramm, Sabine}, title = {SYCE3, ein neues Synaptonemalkomplexprotein: Expression, funktionelle Analyse und Bindungspartner}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-70903}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Der Synaptonemalkomplex ist eine evolution{\"a}r hoch konservierte Struktur. Er wird spezifisch w{\"a}hrend der Prophase I der Meiose ausgebildet und ist essentiell f{\"u}r die Segregation der homologen Chromosomen w{\"a}hrend der Meiose und auch f{\"u}r die Entstehung genetischer Vielfalt. Der Synaptonemalkomplex ist eine protein{\"o}se Struktur, deren Aufbau dem einer Leiter {\"a}hnelt. Dabei werden die Leiterholme als Lateralelemente bezeichnet. Sie bestehen unter anderem aus den Proteinen SYCP2 und SYCP3 und assoziieren mit dem Chromatin der homologen Chromosomen. Die Stufen der Leiter bestehen hingegen aus Transversalfilamenten, deren Hauptkomponente parallele Homodimere des meiosespezifische Proteins SYCP1 sind. Dabei wird ein SYCP1 Dimer mit seinem C-Terminus in den Lateralelementen verankert und kann {\"u}ber seine N-terminale Dom{\"a}ne eine schwache Interaktion mit der N-terminalen Dom{\"a}ne eines gegen{\"u}berliegenden SYCP1 Dimers eingehen. Um diese Bindung zu stabilisieren werden Proteine des Zentralelements des Synaptonemalkomplexes ben{\"o}tigt: W{\"a}hrend SYCE1 durch seine Interaktion mit SYCP1 die N-terminale Assoziation zweier gegen{\"u}berliegender SYCP1 Dimere stabilisiert, verkn{\"u}pfen die zwei anderen zentralelementspezifischen Proteine SYCE2 und Tex12 lateral benachbarte SYCP1 Filamente und breiten so das SYCP1 Netzwerk entlang der chromosomalen Achsen aus. Dieser Prozess wird als Synapse bezeichnet und stellt eines der Schl{\"u}sselereignisse der Meiose dar. Fehler w{\"a}hrend dieses Prozesses f{\"u}hren meist zu Aneuploidie der entstehenden Gameten oder zum Abbruch der Meiose und somit zu Infertilit{\"a}t des betroffenen Organismus. In dieser Arbeit wurde mit SYCE3 ein neues Protein des murinen Synaptonemalkomplexes charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass SYCE3 meiosespezifisch in M{\"a}nnchen und Weibchen exprimiert wird und Bestandteil des Zentralelements des Synaptonemalkomplexes ist. Hierbei zeigt es dasselbe Verteilungsmuster wie SYCP1 und SYCE1 und kann mit beiden Proteinen interagieren. Eine zus{\"a}tzliche Interaktion konnte zwischen SYCE3 und SYCE2 nachgewiesen werden. Durch Untersuchungen an entsprechenden Knockout Mausmodellen konnte in dieser Arbeit außerdem gezeigt werden, dass SYCE3 in Abwesenheit von SYCP1 nicht an die chromosomalen Achsen rekrutiert werden kann. Die Ausbildung der Lateralelemente und auch die Anwesenheit der anderen zentralelementspezifischen Proteine SYCE1 und SYCE2 sind hingegen f{\"u}r die Anlagerung von SYCE3 an die chromosomalen Achsen nicht essentiell. Somit steht SYCE3 hinsichtlich seiner Bedeutung f{\"u}r die Paarung und die Synapse der homologen Chromosomen hierarchisch offenbar {\"u}ber den bisher beschriebenen Zentralelementproteinen SYCE1, SYCE2 und Tex12. Die funktionelle Bedeutung von SYCE3 f{\"u}r die Synapse der homologen Chromosomen und f{\"u}r den korrekten Ablauf der homologen Rekombination wurde im Rahmen dieser Arbeit durch die Herstellung und die Charakterisierung einer Syce3-/- Maus detailliert untersucht: Dabei f{\"u}hrte der Knockout von SYCE3 zur Infertilit{\"a}t in beiden Geschlechtern, die gleichzeitig mit einer signifikanten Reduktion der Gr{\"o}ße der entsprechenden Hoden und Ovarien im Vergleich zum Wildtyp einherging. Weitere Untersuchungen ergaben zudem, dass es in Syce3 defizienten Tieren zu einem Abbruch der Meiose kommt. Dabei hatte das Fehlen von SYCE3 keinen Einfluss auf die Ausbildung der Axialelemente. Die Initiation der Synapse hingegen war sowohl in Oocyten als auch in Spermatocyten in Abwesenheit von SYCE3 stark gest{\"o}rt. Dar{\"u}ber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden, dass das Fehlen von SYCE3 Einfluss auf die homologe Rekombination nimmt: Zwar k{\"o}nnen sich fr{\"u}he (DNA Doppelstrangbr{\"u}che) und intermedi{\"a}re (Transitionsknoten) Rekombinationsereignisse in der Abwesenheit von SYCE3 ausbilden, die Prozessierung zu sp{\"a}ten Rekombinationsstrukturen (Rekombinationsknoten) und die damit einhergehende Ausbildung von Crossing-over Strukturen fand jedoch nicht statt. Zusammengefasst wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass das neue Synaptonemalkomplexprotein SYCE3 essentiell f{\"u}r die Fertilit{\"a}t von M{\"a}usen ist. Durch den Knockout von Syce3 kann die Synapse zwischen den Homoligen nicht initiiert werden und es findet kein Crossing-over statt. Im Assembly Prozess des Synaptonemalkomplexes agiert SYCE3 oberhalb der anderen zentralelementspezifischen Proteine und unterhalb von SYCP1.}, subject = {Meiose}, language = {de} } @phdthesis{Wende2011, author = {Wende, Elisabeth Sophie}, title = {Untersuchungen zur Rolle der melanominduzierenden Rezeptortyrosinkinase Xmrk bei der Migration melanozyt{\"a}rer Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-70945}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Das maligne Melanom ist ein Hauttumor mit steigender Inzidenz und hohen Mortalit{\"a}tsraten. Da die molekularbiologischen Ereignisse, die der Melanomentwicklung zugrundeliegen, nur unzureichend bekannt sind, gibt es kaum spezifische Therapieans{\"a}tze. Zur Untersuchung der Melanomentwicklung eignet sich das Xiphophorus-Modell. In diesem System ist die Anwesenheit der RTK Xmrk ausreichend, um durch Aktivierung proliferativer und entdifferenzierender Signalwege und Apoptoseinhibition Melanome zu verursachen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Xmrk auch die Migration der Melanozytenzellinie Melan a-Hm induzieren kann. Die Migration der durch Xmrk transformierten Zellen ist am{\"o}boid und unabh{\"a}ngig von MAPK- und PI3K-Signalwegen. Eine Funktion bei der Migration haben jedoch die Kinasen FAK und Fyn. Sie bilden m{\"o}glicherweise einen Proteinkomplex, der f{\"u}r FAK und Src aus zahlreichen anderen Systemen bekannt ist und als Signalplattform f{\"u}r die Zellmigration fungiert. Diese Erkenntnisse k{\"o}nnen dazu beitragen, das Xiphophorus-Modell weiterzuentwickeln und die Grundlagen der Melanomgenese besser zu verstehen.}, subject = {Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor}, language = {de} }