@phdthesis{Hayen2001, author = {Hayen, Wiebke}, title = {Determinanten der Tumorzellmigration}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1180784}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Hyalurons{\"a}ure (HS) ist ein weit verbreitetes Glykosaminoglykan in der Extrazellul{\"a}rmatrix vieler Gewebe und tritt in erh{\"o}hten Konzentrationen in der Umgebung solider Tumore auf. Es ist bekannt, daß HS die Zellmigration vieler Zellarten stimuliert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der HS in der Tumorzellmigration auf der Basis eines dreidimensionalen Fibringel-Systems, in welches Tumorzell-bedeckte Microcarrier eingebettet wurden, untersucht. Ein Vergleich zwischen zwei- und dreidimensionaler Migration unterverschiedenen Bedingungen ergab, daß die dreidimensionale Migration nicht von HS-spezifischen Oberfl{\"a}chenrezeptoren abh{\"a}ngt, sondern haupts{\"a}chlich von der Porosit{\"a}t der Matrix. In zweidimensionalen Systemen war die Migration durch Antik{\"o}rper gegen den HS-Rezeptor CD44 inhibierbar, unter dreidimensionalen Bedingungen jedoch nicht. Zur Bestimmung der strukturellen Eigenschaften der Fibringele wurden spektrometrische Messungen, konfokale Mikroskopie, Kompaktionsmessungen und Fl{\"u}ssigkeitspermeation herangezogen. Eine weitere Lokalisation ergab ein intrazellul{\"a}res Auftreten von HS vorwiegend perinukle{\"a}r mit dem Zytoskelett assoziiert. Ein direkter Einfluß auf die Aktinpolymerisation konnte ausgeschlossen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die direktionale Migration von Tumorzellen auf Endothelzellen sowohl in dreidimensionalen Fibringelsystemen als auch unter zweidimensionalen Bedingungen untersucht. Endothelzell-konditioniertes Medium wurde weiter aufgereinigt und es konnten massenspektrometrisch mehrere potentiell chemotaktisch aktive Molek{\"u}le im Medium bestimmt werden.}, subject = {Tumorzelle}, language = {de} } @phdthesis{AppeltMenzel2016, author = {Appelt-Menzel, Antje}, title = {Etablierung und Qualifizierung eines humanen Blut-Hirn-Schranken-Modells unter Verwendung von induziert pluripotenten und multipotenten Stammzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-134646}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2016}, abstract = {Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine der dichtesten und wichtigsten Barrieren zwischen Blutzirkulation und Zentralnervensystem (ZNS) dar. Sie besteht aus spezialisierten Endothelzellen, welche die zerebralen Kapillaren auskleiden und durch sehr dichte Tight Junctions (TJs) miteinander verbunden sind. Weitere Komponenten der dynamischen Blut-Hirn-Schrankenbarriere stellen Perizyten, Astrozyten, Neurone und Mikrogliazellen dar, welche zusammen mit der extrazellul{\"a}ren Matrix der Basalmembran der Gehirnkapillaren und den zuvor genannten Endothelzellen ein komplexes regulatorisches System, die so genannte neurovaskul{\"a}re Einheit bilden (Hawkins und Davis 2005). Die Hauptfunktionen der BHS lassen sich in drei Untergruppen untergliedern, die physikalische, metabolische und Transport-Barriere (Neuhaus und Noe 2010). Haupts{\"a}chlich dient die BHS der Aufrechterhaltung der Hom{\"o}ostase des ZNS und dem Schutz vor neurotoxischen Substanzen sowie Pathogenen, wie Bakterien und Viren. Zudem ist sie auch f{\"u}r die Versorgung der Neuronen mit N{\"a}hrstoffen und regulierenden Substanzen sowie den Efflux von Stoffwechselendprodukten des ZNS zur{\"u}ck ins Blut verantwortlich. F{\"u}r die Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Multiple Sklerose oder Gehirntumoren, stellt die Dichtigkeit der BHS gegen{\"u}ber Substanzen und die hohe metabolische Aktivit{\"a}t der Endothelzellen aber ein großes Problem dar. Viele Medikamente sind nicht in der Lage in ausreichender Konzentration die BHS zu {\"u}berwinden, um an ihren Wirkort zu gelangen oder werden vor dem Transport metabolisiert und die Wirksamkeit dadurch eingeschr{\"a}nkt. Weiterhin spielen auch Defekte der BHS eine entscheidende Rolle in der Beeinflussung der Pathogenese vieler ZNS-Erkrankungen. Aufgrund des hohen Bedarfs an geeigneten Testsystemen in der Grundlagen- sowie pr{\"a}klinischen Forschung f{\"u}r Medikamentenentwicklung und Infektionsstudien wurden eine Vielzahl unterschiedlicher BHS-Modelle entwickelt. Neben in silico-, azellul{\"a}ren in vitro- und in vivo-Modellen sind auch zahlreiche zellbasierte Modelle der BHS entwickelt worden. Standardisierte Modelle auf Basis immortalisierter Zelllinien jedoch weisen nur eine inhomogene TJ-Expression auf und verf{\"u}gen meist {\"u}ber eine geringe Barriereintegrit{\"a}t, erfasst {\"u}ber transendotheliale elektrische Widerst{\"a}nde (TEER) unter 150 · cm2 (Deli et al. 2005). Im Vergleich dazu wurden in Tierexperimenten TEER-Werte von mehr als 1500 · cm2 an der BHS gemessen (Butt et al. 1990; Crone und Olesen 1982). Die Verf{\"u}gbarkeit humaner prim{\"a}rer BHS-Zellen ist sehr limitiert und ihr Einsatz nicht nur im Hinblick auf ethische Aspekte bedenklich. Humane Gehirnzellen k{\"o}nnen z. B. aus Biopsie- oder Autopsiematerial von Patienten mit Epilepsie oder Gehirntumoren isoliert werden. Allerdings besteht hier das Risiko, dass die isolierten Zellen krankheitsbedingt ver{\"a}ndert sind, was die Eigenschaften der BHS-Modelle erheblich beeinflussen kann. Eine Alternative, die diese Probleme umgeht, ist die Verwendung von humanen induziert pluripotenten Stammzellen (hiPSCs), um standardisierte humane BHS-Modelle unter reproduzierbaren Bedingungen bereitzustellen. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, hiPSCs in vitro nach etablierten und standardisierten Methoden in Endothelzellen der BHS, neurale Stammzellen (hiPS-NSCs) sowie Astrozyten (hiPS-A) zu differenzieren (Lippmann et al. 2012; Lippmann et al. 2014; Wilson et al. 2015; Yan et al. 2013;Reinhardt et al. 2013) und zum Aufbau der Modelle einzusetzen. Die Endothelzellen wurden mit Hilfe protein- und genbasierter Nachweismethoden auf das Vorhandensein von endothelzellspezifischen TJ-Markern sowie spezifischen Transportern untersucht und funktionell charakterisiert. Die Kryokonservierung der hiPS-EC-Progenitoren, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelt wurde, erm{\"o}glicht eine gr{\"o}ßere r{\"a}umliche und zeitliche Flexibilit{\"a}t beim Arbeiten mit den stammzellbasierten Modellen sowie das Anlegen standardisierter Zellbanken. Weiterhin wurden multipotente NSCs aus fetalen Gehirnbiopsien isoliert (fNSCs) und als Kontrollkulturen zu den hiPS-NSCs f{\"u}r den Aufbau von BHS-Modellen eingesetzt. Mit dem Ziel die in vivo-BHS bestm{\"o}glich zu imitieren und die Modelleigenschaften zu optimieren, wurde ein Set aus zehn unterschiedlichen BHS-Modellen basierend auf prim{\"a}ren Zellen, hiPSCs und fNSCs analysiert. Der Aufbau der BHS-Modelle erfolgte unter Verwendung von Transwellsystemen. Durch die systematische Untersuchung des Einflusses der unterschiedlichen Zelltypen der neurovaskul{\"a}ren Einheit auf die Barriereintegrit{\"a}t und Genexpression des BHS-Endothels, konnten die Quadrupel-Kulturen mit Perizyten, Astrozyten und hiPS-NSCs als die Kultur mit den physiologischsten Eigenschaften identifiziert werden. Auf Grund der signifikant erh{\"o}hten TEER-Werte von bis zu 2500 · cm2 und einer um mindestens 1,5-fachen Steigerung der Genexpression BHSrelevanter Transporter und TJ-Molek{\"u}le gegen{\"u}ber den Monokulturen, wurden diese Modelle f{\"u}r weiterf{\"u}hrende Studien ausgew{\"a}hlt. Das Vorhandensein eines komplexen, in vivo-{\"a}hnlichen TJ-Netzwerkes, bestehend aus Occludin, Claudin 1, 3, 4 und 5, konnte mittels quantitativer Realtime-PCR, Western Blot sowie ultrastruktureller Analyse in der Gefrierbruch- und Raster-Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden. Neben der Begrenzung der parazellul{\"a}ren Permeabilit{\"a}t, welche {\"u}ber die geringe Permeation von FITC-Dextran (4 kDa und 40 kDa), Fluoreszein und Lucifer Yellow nachgewiesen wurde, stellt die BHS ebenfalls eine Barriere f{\"u}r den transzellul{\"a}ren Transport von Substanzen dar. Eine Beurteilung der Modelle hinsichtlich der Qualifikation f{\"u}r die Nutzung im Wirkstoffscreening wurde mit Hilfe von Transportversuchen unter dem Einsatz von BHS-relevanten Referenzsubstanzen durchgef{\"u}hrt. Die Klassifikation der Testsubstanzen erfolgte analog ihrer Permeationsgeschwindigkeiten: Diazepam und Koffein gelten als schnell transportierte Wirkstoffe, Ibuprofen, Celecoxib und Diclofenac werden mit einer mittleren Geschwindigkeit {\"u}ber die BHS transportiert und Loratadin sowie Rhodamin 123 sind langsam permeierende Substanzen. Innerhalb der Versuche mit den Quadrupelkulturen wurde diese Reihenfolge best{\"a}tigt, lediglich f{\"u}r Koffein wurde ein signifikant niedrigerer Permeationskoeffizient verglichen mit der Monokultur erzielt. Der Einsatz der hiPSC-Technologie erm{\"o}glicht es zudem, aus einer Stammzelllinie große Mengen an humanen somatischen Zelltypen zu generieren und f{\"u}r gezielte Anwendungen bereitzustellen. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass mit Hilfe eines eigens f{\"u}r diese Zwecke konstruierten R{\"u}hrreaktorsystems eine reproduzierbare Expansion der hiPSCs unter definierten Bedingungen erm{\"o}glicht wurde. Basierend auf dieser Grundlage ist nun ein Hochdurchsatz-Screening von Medikamenten denkbar. Die in dieser Arbeit pr{\"a}sentierten Daten belegen die Etablierung eines stammzellbasierten in vitro- Quadrupelmodels der humanen BHS, welches {\"u}ber in vivo-{\"a}hnliche Eigenschaften verf{\"u}gt. Die Anforderungen, die an humane BHS-Modelle gestellt werden, wie die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, eine angemessene Charakterisierung, welche die Untersuchung der Permeabilit{\"a}t von Referenzsubstanzen einschließt, die Analyse der Expression von BHS-relevanten Transportermolek{\"u}len sowie die solide und physiologische Morphologie der Zellen, wurden erf{\"u}llt. Das etablierte BHS-Modell kann in der Pharmaindustrie f{\"u}r die Entwicklung von Medikamenten eingesetzt werden. Ausreichend qualifizierte Modelle k{\"o}nnen hier in der pr{\"a}klinischen Forschung genutzt werden, um Toxizit{\"a}ts- und Transportstudien an neu entwickelten Substanzen durchzuf{\"u}hren und eine bessere in vitro-in vivo-Korrelation der Ergebnisse zu erm{\"o}glichen oder Mechanismen zu entwickeln, um die BHS-Barriere gezielt zu {\"u}berwinden.}, subject = {Blut-Hirn-Schranke}, language = {de} } @phdthesis{Tulke2020, author = {Tulke, Moritz}, title = {Grundlegende Arbeiten zum bio-artifiziellen renalen Tubulus aus ko-kultivierten adipozyt{\"a}ren mesenchymalen Stammzellen und Endothelzellen auf einer synthetischen Kapillarmembran}, doi = {10.25972/OPUS-21689}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-216896}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2020}, abstract = {Mit fortschreitender chronischer Niereninsuffizienz kommt es zur Akkumulation von Ur{\"a}mietoxinen und im Endstadium unbehandelt zum Tod im sogenannten Ur{\"a}mischen Syndrom. Die Blutreinigung erfolgt bei der am h{\"a}ufigsten verwendeten Form der Nierenersatztherapie, der H{\"a}modialyse, nur unzureichend. Die Folge ist eine erh{\"o}hte Morbidit{\"a}t und Mortalit{\"a}t der betroffenen Patienten. Bei der H{\"a}modialyse werden nur Ur{\"a}mietoxine bis zu einer Gr{\"o}ße von 20 kDa {\"u}ber die im Dialysator eingesetzten Hohlfaserdialysemembranen diffusiv und konvektiv semiselektiv nach Gr{\"o}ßenausschluss entfernt. Proteingebundene Ur{\"a}mietoxine, deren effektive Gr{\"o}ße durch die Bindung an Transportproteine wie beispielsweise Albumin die Trennsch{\"a}rfe der Dialysemembranen {\"u}bersteigt, werden retiniert. In-vivo werden proteingebundene Ur{\"a}mietoxine im proximalen Tubulus, einem Teil des tubul{\"a}ren Systems des Nephrons, sekretorisch eliminiert. Im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit wurden die ersten Entwicklungsschritte auf dem Weg zu einem sogenannten bio-artifiziellen Tubulus evaluiert. Der angedachte biohybride Filter sollte aus einer Ko-Kultur funktionaler humaner proximaler Tubuluszellen und humaner Endothelzellen (HUVEC) auf synthetischen Hohlfasermembranen bestehen und k{\"o}nnte w{\"a}hrend der H{\"a}modialyse als zus{\"a}tzlicher Reinigungsschritt angewendet werden, um unter anderem proteingebundene Ur{\"a}mietoxine effektiv durch aktiven Transport aus dem Blut der Patienten zu entfernen. Die Differenzierung der proximalen Tubuluszellen erfolgte dabei aus adulten adipozyt{\"a}ren mesenchymalen Stammzellen (ASC), deren Herkunft eine sp{\"a}tere autologe Behandlung erm{\"o}glicht. Die Ko-Kultur mit Endothelzellen wurde zur potentiellen Steigerung der Sekretion proteingebundener Ur{\"a}mietoxine verwendet. In der vorliegenden Arbeit konnten ASCs durch eine Kombination der l{\"o}slichen Differenzierungsfaktoren All-Trans-Retinoins{\"a}ure (ATRA), Aktivin A und BMP-7 erfolgreich in Zytokeratin 18-exprimierende Zellen differenziert werden, wodurch die erw{\"u}nschte epitheliale Differenzierung best{\"a}tigt wurde. Die Expression funktionaler Proteine, wie das f{\"u}r den Wassertransport relevante Aquaporin 1 oder auch der Na+-/K+-ATPase, konnte in dieser Arbeit bereits vor der Differenzierung nachgewiesen werden. Im n{\"a}chsten Schritt wurde erfolgreich gezeigt, dass eine simultane, qualitativ hochwertige Ko-Kultur von ASCs und HUVECs auf der mit dem extrazellul{\"a}ren Matrixprotein Fibronektin modifizierten Innen- bzw. Außenseite von synthetischen Hohlfasermembranen aus Polypropylen bzw. Polyethersulfon m{\"o}glich ist. Die Viabilit{\"a}t beider Zelltypen wurde dabei durch die Verwendung eines f{\"u}r die Ko-Kultur entwickelten N{\"a}hrmediums erreicht, in welchem die Proliferation von ASCs bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer Stammzelleigenschaften deutlich erh{\"o}ht war. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse stellen eine aussichtsreiche Basis f{\"u}r einen bio-artifiziellen renalen Tubulus dar. Weitere Entwicklungsschritte, wie die Differenzierung der ASCs zu proximalen Tubuluszellen im 3D-Bioreaktor einschließlich ihrer funktionalen Charakterisierung anhand Tubulusepithel-spezifischer Transporter, sind erforderlich, be-vor erste funktionale Experimente vor dem „Upscaling" auf klinisch verwendbare Module m{\"o}glich sind.}, subject = {Hohlfaserreaktor}, language = {de} } @phdthesis{Krones2022, author = {Krones, David}, title = {The Role of Acid Sphingomyelinase in \(Staphylococcus\) \(aureus\) Infection of Endothelial Cells}, doi = {10.25972/OPUS-29049}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-290492}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2022}, abstract = {Staphylococcus aureus is a human bacterial pathogen responsible for a variety of diseases including bacterial pneumonia and sepsis. Recent studies provided an explanation, how S. aureus and its exotoxins contribute to the degradation of endothelial junction proteins and damage lung tissue [4]. Previous findings were indicating an involvement of acid sphingomyelinase (ASM) activity in cell barrier degradation [5]. In the presented study the impact of singular virulence factors, such as staphylococcal α-toxin, on in vitro cell barrier integrity as well as their ability to elicit an activation of ASM were investigated. Experiments with bacterial supernatants performed on human endothelial cells demonstrated a rapid dissociation after treatment, whereas murine endothelial cells were rather resistant against cell barrier degradation. Furthermore, amongst all tested staphylococcal toxins it was found that only α-toxin had a significant impact on endothelial junction proteins and ASM activity. Ablation of this single toxin was sufficient to protect endothelial cells from cell barrier degradation and activation of ASM was absent. In this process it was verified, that α-toxin induces a recruitment of intracellular ASM, which is accompanied by rapid and oscillating changes in cytoplasmic Ca2+ concentration and an increased exposure of Lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP1) on the cell surface. Recruitment of lysosomal ASM is associated, among other aspects, to plasma membrane repair and was previously described to be involved with distinct pathogens as well as other pore forming toxins (PFT). However, with these findings a novel feature for α-toxin has been revealed, indicating that the staphylococcal PFT is able to elicit a similar process to previously described plasma membrane repair mechanisms. Increased exposure and intake of surface membrane markers questioned the involvement of ASM activity in S. aureus internalization by non-professional phagocytes such as endothelial cells. By modifying ASM expression pattern as well as application of inhibitors it was possible to reduce the intracellular bacterial count. Thus, a direct connection between ASM activity and S. aureus infection mechanisms was observed, therefore this study exemplifies how S. aureus is able to exploit the host cell sphingolipid metabolism as well as benefit of it for invasion into non-professional phagocytic cells}, subject = {Staphylococcus aureus}, language = {en} }