@phdthesis{Bausenwein2000,
  author    = {Bausenwein, Burkhard},
  title     = {Funktionelle Charakterisierung von Daughter of Sevenless},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-814},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Ein Weg, der von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen benutzt wird um Signale auf "downstream" gelegene Effektormolek{\"u}le zu {\"u}bertragen, erfolgt {\"u}ber Adaptorproteine, die Bindungsstellen f{\"u}r verschiedene Proteine zur Verf{\"u}gung stellen. Das daughter of sevenless (dos) Gen wurde in einem Screen nach Downstream-Komponenten der Sevenless (Sev) Rezeptor-Tyrosin-Kinase gefunden. Dos besitzt eine N-terminale PH-Dom{\"a}ne und mehrere Tyrosinreste in Konsensussequenzen f{\"u}r SH2-Dom{\"a}nen Bindungsstellen von verschiedenen Proteinen. Die strukturellen Merkmale von Dos und Experimente, die zeigten, daß Tyrosine im Dos Protein nach der Aktivierung von Sev phosphoryliert werden, legen den Schluß nahe, daß Dos zur Familie der Multi-Adaptor-Proteine geh{\"o}rt. Zu dieser Familie werden die Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS) Proteine, Gab1 und Gab2 gerechnet. In dieser Arbeit wurde ein monoklonaler Maus anti-Dos Antik{\"o}rper etabliert. Das Epitop dieses Antik{\"o}rpers liegt im Bereich der C-terminalen 416 Aminos{\"a}uren des Dos Proteins. Mittels Westernblot Analysen wurde f{\"u}r Dos ein Molekulargewicht von 115 kD ermittelt. Antik{\"o}rperf{\"a}rbungen von wildtypischen Augenimaginalscheiben dritter Larven zeigten, daß das Dos Protein in Zellen in und posterior der morphogenetischen Furche exprimiert wird und in diesen Zellen apikal lokalisiert ist. Zur Charakterisierung des homozygot letalen dosR31 Allels, wurde der genomische Bereich sequenziert und die erhaltenen Daten mit der cDNA Sequenz verglichen. Die so etablierte Aminos{\"a}uresequenz f{\"u}r das DosR31 Protein hat sechs Aminos{\"a}uresubstitutionen, die m{\"o}glicherweise die Terti{\"a}rstruktur beeinflussen. Zus{\"a}tzlich wurde ein Stopcodon in Position 463 der Aminos{\"a}uresequenz gefunden. Bei dosR31 handelt es sich um ein "loss of function" Allel, das nicht in der Lage ist, die normale Dos Funktion zu erf{\"u}llen. Um die funktionelle Rolle der potentiellen SH2-Dom{\"a}nen Bindungsstellen f{\"u}r die Dos Funktion in der Rezeptor-Tyrosin-Kinasen vermittelten Signaltransduktion zu untersuchen, wurden mutierte dos Transgene in Fliegen exprimiert. Die potentiellen Bindungsstellen f{\"u}r die SH2-Dom{\"a}nen des SH2/SH3 Adaptorproteins Shc, der PhospholipaseC-g (PLCg), der regulatorische Untereinheit der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3Kinase) und der Corkscrew (Csw) Tyrosin Phosphatase wurden durch den Austausch des f{\"u}r die Bindung wichtigen Tyrosins gegen ein Phenylalanin mutiert. Die ektopische Expression der mutierten Konstrukte ohne Bindungsstellen f{\"u}r die Shc, PLCg und PI3Kinasen SH2-Dom{\"a}nen konnte in Abwesenheit von endogenem Dos die fehlende Dos Funktion w{\"a}hrend der Entwicklung vollst{\"a}ndig ersetzen. Im Gegensatz dazu ist das Tyrosin 801 als nachgewiesene Bindungsstelle f{\"u}r Csw SH2-Dom{\"a}nen essentiell f{\"u}r die Funktion von Dos. Ektopische Expression von Transgene durch Hitzeschock kann zu ph{\"a}notypischen Effekten f{\"u}hren, die nicht auf das Transgen zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind. Um dieses Problem zu umgehen wurde das endogene dos Enhancer/Promotor Element kloniert, damit die Funktion von mutierten Transgenen auch im endogenen Expressionsmuster untersucht werden konnte. Das klonierte genE-dos Minigen war in der Lage, den Verlust von endogenem Dos in dosR31 und dosP115 Tieren vollst{\"a}ndig zu ersetzen und zeigte eine v{\"o}llig wildtypische Expression in Augenimaginalscheiben. Zur Untersuchung, welche Rolle die mutierten SH2-Dom{\"a}nen Bindungsstellen bei der Dos Funktion in der Augenentwicklung spielen, wurde ein neues in vivo Testsystem basierend auf der Flp/FRT Flipase Rekombinase Technik etabliert. Dieses klonale Testsystem erlaubt die Expression mutierter Transgene unter der Kontrolle der dos Enhancer/Promotor Sequenzen in Klonen von Zellen, denen die endogene Dos Funktion fehlt. Die klonale Analyse der mutierten Konstrukte konnte zeigen, daß das Tyrosin 801, als Bindungsstelle f{\"u}r eine Csw SH2-Dom{\"a}ne, eine essentielle Rolle f{\"u}r die Dos Funktion spielt. Die Tyrosinreste in den potentiellen SH2-Dom{\"a}nen Bindungsstellen f{\"u}r Shc, PLCg und PI3Kinase spielen hingegen keine essentielle Rolle f{\"u}r die Dos Funktion bei der Augenentwicklung. Das etablierte klonale Testsystem kann allgemein zur Untersuchung der in vivo Funktion von potentiellen Protein-Protein Interaktionsregionen im Dos Protein bei der Augenentwicklung eingesetzt werden unabh{\"a}ngig von deren Erfordernis f{\"u}r andere Entwicklungsprozesse.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Stolzenberger2000,
  author    = {Stolzenberger, Sascha},
  title     = {Spezifische Hemmung der allergieassoziierten Interleukin-4 Signaltransduktion},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-2375},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Das Cytokin Interleukin-4 (IL-4) ist ein essentieller Faktor bei der Entstehung von Sofort-Typ Allergien. Die Bindung von IL-4 an seinen Rezeptor und die anschließende Phosphorylierung des IL-4 aktivierten Transkriptionsfaktors Stat6 ist ein Schl{\"u}sselereignis bei der allergischen Immunantwort. In der vorliegenden Arbeit werden Ergebnisse zur Hemmung der Stat6 vermittelten Signaltransduktion des IL-4 Rezeptors vorgestellt. Dazu wurde ein Vektorsystem etabliert, bei dem ein von dem Drosophila-Transkriptionsfaktor Antennapedia abgeleitetes 16 AS langes Peptid benutzt wird. Dieses Antennapediapeptid kann Plasmamembranen lebender Zellen energie- und rezeptorunabh{\"a}ngig durchqueren und dabei andere hydrophile Molek{\"u}le mittransportieren. Stat6 bindet {\"u}ber eine SH2 Dom{\"a}ne an phosphorylierte Reste von IL4Ra und bildet, nachdem es selbst phosphoryliert ist, mit anderen Stat6-Molek{\"u}len aktive Dimere. Ein aus der Stat6-Bindestelle des IL-4Ra abgeleitetes phosphoryliertes Peptid (Stat6BP) wurde mit Hilfe des Antennapediapeptids in verschiedene humane und murine Zellinien transportiert. F{\"u}r Stat6BP konnte mit Hilfe von spezifischer Immunpr{\"a}zipitation und Western-Blot gezeigt werden, dass es IL-4 induzierte Phosphorylierung und Aktivierung von Stat6 transient hemmen kann. Durch zus{\"a}tzliche Applikation des Tyrosinphosphataseinhibitors Natriumpervanadat gelang es, die hemmende Wirkung von Stat6BP zu verl{\"a}ngern. Unter gleichen Bedingungen konnte auch gezeigt werden, dass Stat6BP spezifisch die Aktivierung von Stat6 hemmt, da die durch IL-4 oder IL-3 induzierte Phosphorylierung des eng verwandten Stat5 v{\"o}llig unbeeintr{\"a}chtigt bleibt. Ferner wurde durch das Peptid die Expression eines Stat6 kontrollierten Reportergens gehemmt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde außerdem die Rolle der Src-Typ Kinasen p56lck und p59fyn in der IL-4 Signaltransduktion in unterschiedlichen T-Zellinien untersucht. Es zeigte sich, dass die Aktivierung der beide Kinasen stark von der getesteten Zellinie abh{\"a}ngt. In einigen T-Zellinien aktiviert IL-4 eher p56lck, in anderen eher p59fyn.},
  subject      = {Interleukin 4},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Pei2000,
  author    = {Pei, Geng},
  title     = {The Role of Raf-mediated Signalling Pathways for Motoneuron},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1846},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {The transmission of proliferative and developmental signals from activated cell-surface receptors to initiation of cellular responses in the nucleus is synergically controlled by the coordinated action of a diverse set of intracellular signalling proteins. The Ras/Raf/MEK/MAPK signalling pathway has been shown to control the expression of genes which are crucial for the physiological regulation of cell proliferation, differentiation and apoptosis. Within this signalling cascade, the Raf protein family of serine/threonine kinases serves as a central intermediate which connects to many of other signal transduction pathways. To elucidate the signalling functions of the different Raf kinases in motoneurons during development, the expression, distribution and subcellular localization of Rafs in the spinal cord and the facial nucleus in brainstem of mice at various embryonic and postnatal stages were investigated. Moreover, we have investigated the intracellular redistribution of Raf molecules in isolated motoneurons from 13 or 14 day old mouse embryos, after addition or withdrawal of neurotrophic factors to induce Raf kinases activation in vitro. Furthermore, in order to investigate the potential anti-apoptotic function of Raf kinases on motoneurons, we isolated motoneurons from B-raf-/- and c-raf-1-/- mouse embryos and analysed the survival and differentiation effects of neurotrophic factors in motoneurons lacking B-Raf and c-Raf-1. We provide evidence here that all three Raf kinases are expressed in mouse spinal motoneurons. Their expression increases during the period of naturally occurring cell death of motoneurons. In sections of embryonic and postnatal spinal cord, motoneurons express exclusively B-Raf and c-Raf-1, but not A-Raf, and subcellularly Raf kinases are obviously colocalized with mitochondria. In isolated motoneurons, most of the B-Raf or c-Raf-1 immunoreactivity is located in the perinuclear space but also in the nucleus, especially after activation by addition of CNTF and BDNF in vitro. We found that c-Raf-1 translocation from the cytosol into the nucleus of motoneurons after its activation by neurotrophic factors is a distinct event. As a central finding of our study, we observed that the viability of isolated motoneurons from B-raf but not c-raf-1 knockout mice is lost even in the presence of CNTF and other neurotrophic factors. This indicates that B-Raf but not c-Raf-1, which is still present in B-raf deficient motoneurons, plays a crucial role in mediating the survival effect of neurotrophic factors during development. In order to prove that B-Raf is an essential player in this scenario, we have re-expressed B-Raf in mutant sensory and motor neurons by transfection. The motoneurons and the sensory neurons from B-raf knockout mouse which were transfected with exogenous B-raf gene revealed the same viability in the presence of neurotrophic factors as primary neurons from wild-type mice. Our results suggest that Raf kinases have important signalling functions in motoneurons in mouse CNS. In vitro, activation causes redistribution of Raf protein kinases, particularly for c-Raf-1, from motoneuronal cytoplasm into the nucleus. This redistribution of c-Raf-1, however, is not necessary for the survival effect of neurotrophic factors, given that B-raf-/- motor and sensory neurons can not survive despite the presence of c-Raf-1. We hypothesize that c-Raf-1 nuclear translocation may play a direct role in transcriptional regulation as a consequence of neurotrophic factor induced phosphorylation and activation of c-Raf-1 in motoneurons. Moreover, the identification of target genes for nuclear translocated c-Raf-1 and of specific cellular functions initiated by this mechanism awaits its characterization.},
  subject      = {Maus},
  language  = {en}
}