@phdthesis{Boeck2018,
  author    = {B{\"o}ck, Julia},
  title     = {Differenzielle Methylierungsanalysen mittels verschiedener Next-Generation Sequencing-basierter Techniken: Die Bedeutung von differenziell methylierten Regionen in der menschlichen Hirnevolution und bei der Krebsentstehung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-164220},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {Die Evolution der Primaten zeigt eine Verbindung zwischen der zunehmenden Komplexit{\"a}t des sozialen Verhaltens und der Vergr{\"o}ßerung des humanen Gehirns, insbesondere des pr{\"a}frontalen Cortex. Deshalb stellt der pr{\"a}frontale Cortex bez{\"u}glich der Evolution des Menschen eine der interessantesten Strukturen im humanen Gehirn dar. Es wird angenommen, dass nicht allein die Gr{\"o}ße, sondern auch die Funktion, vor allem das Zusammenspiel von Neuronen und nicht-neuronalen Zellen, wie z.B. Gliazellen, zur Differenzierung des menschlichen Gehirns von dem rezenter Primaten gef{\"u}hrt hat. Daraus l{\"a}sst sich schließen, dass die Gehirnfunktionen {\"u}ber eine ausgeglichene und gut aufeinander abgestimmte transkriptionelle Landschaft kontrolliert werden, die durch ein zugrundeliegendes genetisches und epigentisches R{\"u}ckgrat organisiert ist. In dieser Studie wurden das Methylierungsprofil neuronaler und nicht-neuronaler Zellen des pr{\"a}frontalen Cortex (Brodmann-Areal 10) von drei Menschen und drei Schimpansen miteinander verglichen. Die intra- und interspezifischen differenziell methylierten Regionen (DMRs) waren in bestimmten genomischen Regionen angereichert. Intraspezifische Methylierungsunterschiede zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen konnten dreimal h{\"a}ufiger beobachtet werden als interspezifische Unterschiede in den einzelnen Zelltypen. Rund 90\% der humanen intraspezifischen DMRs wiesen eine Hypomethylierung in den neuronalen Zellen im Vergleich zu den nicht-neuronalen Zellen auf. In den intraspezifischen DMRs (Mensch und Schimpanse) waren Gene angereichert, die mit verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen assoziiert sind. Der Vergleich zwischen Menschen und Schimpanse in den neuronalen und nicht-neuronalen Zelltypen zeigte eine Anreicherung von Genen mit human-spezifischer Histonsignatur. In den nicht-neuronalen Zellen konnten mehr interspezifische DMRs (n=666) detektiert werden als in den neuronalen Zellen (n=96). Ungef{\"a}hr 95\% der nicht-neuronalen interspezifischen DMRs waren im Menschen, im Vergleich zum Schimpansen, hypermethyliert. Daraus ergibt sich der Eindruck, dass mehrere hundert der nicht-neuronalen Gene w{\"a}hrend der humanen Gehirnevolution einer Methylierungswelle unterlagen. Dies f{\"u}hrt zu der Annahme, dass der Einfluss dieser Ver{\"a}nderungen in den nicht-neuronalen Zellen auf die Verg{\"o}ßerung des menschlichen Gehirns bisher stark untersch{\"a}tzt wurde. Die bekannteste genetische Ursache f{\"u}r erblichen Brust- und Eierstockkrebs sind Mutationen in den Tumorsuppressorgenen (TSG) BRCA1 und BRCA2. Dennoch k{\"o}nnen nur rund 20-25\% der famili{\"a}ren Brustkrebserkrankungen {\"u}ber Keimbahnmutationen in BRCA1/BRCA2 erkl{\"a}rt werden, besonders bei Frauen, deren Erkrankung vor dem vierzigsten Lebensjahr auftritt. Epigenetische Ver{\"a}nderungen, die zu einer aberranten Genexpression f{\"u}hren, spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Karzinogenese und der Entwicklung einer Brustkrebserkrankung. Es ist bekannt, dass TSG nicht nur durch den Verlust der Heterozygotie (engl. loss of heterozygosity, LOH) oder homozygote Deletionen, sondern auch durch transkriptionelle Stilllegung via DNA-Methylierung inaktiviert werden k{\"o}nnen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde {\"u}berpr{\"u}ft, welchen Einfluss aberrante Methylierungsmuster im Promotorbereich von TSG auf die Brustkrebskarzinogenese und die Expression der Gene haben. F{\"u}r die Quantifizierung der Epimutationen wurden die Promotorbereiche von acht TSG (BRCA1, BRCA2, RAD51C, ATM, PTEN, TP53, MLH1, RB1) und des estrogene receptor (ESR1) Gens, welches eine Rolle in der Tumorprogression spielt, mittels Deep Bisulfite Amplicon Sequencing (DBAS) analysiert. Es wurden Blutproben von zwei unabh{\"a}ngigen BRCA1/BRCA2-mutationsnegativen Brustkrebs (BC)-Patientenkohorten, sowie von zwei unabh{\"a}ngigen alters-gematchten, gesunden Kontrollkohorten untersucht. BC-Kohorte 1 beinhaltet early-onset (EO) BC-Patientinnen. Kohorte 2 enth{\"a}lt BC-Patientinnen mit einem Risiko von >95\% eine heterozygote Mutation in BRCA1/BRCA2 (high-risk, HR) zu tragen. Allele mit >50\% methylierten CpGs werden als funktionell relevante Epimutationen erachtet, da bekannt ist, dass TSG {\"u}ber eine Methylierung im Promotorbereich transkriptionell stillgelegt werden. Im Vergleich zu ESR1 ({\O} Methylierung, 3\%), welches die Methylierungslevel eines durchschnittlichen Promotors wiederspiegelt, zeigten die TSG sehr geringe durchschnittliche Methylierungswerte von weniger als 1\%. Zudem waren die durchschnittlichen Epimutationsraten (EMR; <0,0001-0,1\%) der TSG sehr gering. Mit der Ausnahme von BRCA1, welches eine erh{\"o}hte EMR in der BC-Kohorte verglichen zu den Kontrollen (0,31\% gegen 0,06\%) zeigte, gab es keine signifikanten Gruppenunterschiede zwischen BC-Patientinnen und Kontrollen. Eine von 36 HR BC-Patientinnen zeigte im Vergleich zu den restlichen Proben eine stark erh{\"o}hte EMR von 14,7\% in BRCA1. Rund ein Drittel (15/44) der EO BC-Patientinnen wiesen eine erh{\"o}hte Rate an Einzel-CpG Fehlern in mehreren TSG auf. Die nachfolgenden Expressionsanalysen ergaben eine erniedrigte Expression vieler TSG je analysierter Patientin. Diese Ergebnisse f{\"u}hren zu der Annahme, dass epigenetische Ver{\"a}nderungen in normalen K{\"o}rperzellen als ein m{\"o}glicher Indikator f{\"u}r einen gest{\"o}rten Mechanismus, der f{\"u}r die Aufrechterhaltung des unmethylierten Status und der daraus resultierenden normalen Genexpression zust{\"a}ndig ist, angesehen werden k{\"o}nnen. Dies kann mit einem erh{\"o}hten BC-Risiko assoziiert werden.},
  subject      = {Epigenetik},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Geier2008,
  author    = {Geier, Katja},
  title     = {Durchflusszytometrische Diagnostik bei Verdacht auf Nijmegen Breakage Syndrom},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27695},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Das Nijmegen Breakage Syndrom ist eine seltene autosomal- rezessive Erkrankung, die durch ein typisches Erscheinungsbild mit Mikrozephalie, Wachstumsretardierung, Immundefizienz sowie durch eine erh{\"o}hte Empfindlichkeit gegen{\"u}ber ionisierender Strahlung und eine erh{\"o}hte Pr{\"a}disposition gegen{\"u}ber malignen Tumoren charakterisiert wird. Die Erkrankung wird durch Mutationen im NBS1-Gen verursacht, welches auf Chromosom 8q21 lokalisiert werden konnte. Das NBS1-Gen Produkt, Nibrin, ist Teil des MRE11-RAD50-Nibrin Proteinkomplexes, welcher eine zentrale Rolle bei der Erkennung und der Reparatur von DNA-Doppelstrangbr{\"u}chen spielt. Das Fehlen von Nibrin f{\"u}hrt zu einer fehlerhaften DNA-Reparatur und erkl{\"a}rt die verschiedenen klinischen und zellul{\"a}ren Symptome bei NBS-Patienten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Daten von 40 Patienten ausgewertet, die im Rahmen der Verdachtsdiagnose eines Nijmegen Breakage Syndroms mit der Durchflusszytometrie untersucht wurden. F{\"u}r die Unterscheidung zwischen NBS-positiven und NBS-negativen F{\"a}llen sind folgende Parameter von diagnostischer Relevanz: 1) der Anteil nichtproliferierender Zellen (G0/G1-Phase-Zelle), welcher bei NBS-Patienten meist deutlich h{\"o}her sind als bei gesunden Kontrollen. Sie spiegeln bei erh{\"o}hten Werten die herabgesetzte Mitogenantwort wider. 2) die G2/GF-Ratio als Maß f{\"u}r Strahlensensitivit{\"a}t, welche bei NBS-Patienten charakteristischerweise erh{\"o}ht ist. Die Auswertung der Daten erlaubte es in 22 F{\"a}llen die Verdachtsdiagnose NBS auszuschließen, da diese f{\"u}r beide Parameter Werte im Normalbereich zeigten. In 16 F{\"a}llen ergab sich ein positives Ergebnis mit erh{\"o}htem Anteil nichtproliferierender Zellen und erh{\"o}hter Strahlensensitivit{\"a}t. Unter den positiven F{\"a}llen konnte bei 9 Patienten die Diagnose des Nijmegen Breakage Syndroms mittels Mutationsanalyse best{\"a}tigt werden. Bei 7 Patienten konnte jedoch trotz erh{\"o}hter Strahlensensitivit{\"a}t keine Mutation im NBS1-Gen nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Durchflusszytometrie das Vorliegen einer erh{\"o}hten Strahlensensitivit{\"a}t eindeutig nachweisen kann. Eine erh{\"o}hte Strahlensensitivit{\"a}t ist wiederum ein charakteristisches Merkmal des Nijmegen Breakage Syndroms, da es in direkten Zusammenhang mit dem verursachenden Gendefekt steht. Die Durchflusszytometrie kann daher als ein sinnvolles diagnostisches Verfahren von hoher Sensitivit{\"a}t bei Patienten mit der Verdachtsdiagnose NBS angesehen und erfolgreich eingesetzt werden. Allerdings ist die Spezifit{\"a}t des Verfahrens sehr viel geringer. Die Methode der Wahl f{\"u}r die Prim{\"a}rdiagnostik des Nijmegen Breakage Syndroms wird in Zukunft daher die Mutationsanalyse sein.},
  subject      = {Durchflusscytometrie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schuetz2005,
  author    = {Sch{\"u}tz, Monika},
  title     = {Dynamik und Funktion der HMG-Proteine},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15627},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {HMG-Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und regulieren durch ihre Bindung an das Chromatin auf verschiedene Weise DNA-abh{\"a}ngige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. Um zu verstehen, wie HMG-Proteine ihre vielf{\"a}ltigen Funktionen erf{\"u}llen k{\"o}nnen, wurde mit Hilfe von EGFP- und DsRed2-Fusionsproteinen ihre Funktion in vivo untersucht. Im Wesentlichen wurde dabei mit Hilfe von Bleichtechniken ihr dynamisches Verhalten charakterisiert. Daneben wurde f{\"u}r die HMGN-Proteine ihr bislang unbekanntes Expressionsverhalten in Tumorzellen bestimmt. So konnte f{\"u}r die HMGN-Proteine gezeigt werden, dass bestimmte Tumorzelllinien (HT-29, FTC-133, MCF-7, RPMI 8226, 697, Ishikawa, LNCap) eine relativ erh{\"o}hte Expression von HMGN2 aufweisen, die mit der Tumordifferenzierung korreliert. Eine relativ verringerte Expression von HMGN1 steht dagegen in Mammakarzinomen und Non-Hodgkin-Lymphomen in direktem Zusammenhang mit der Aggressivit{\"a}t der Tumore. Somit kann die HMGN-Expression bei diesen Tumoren als diagnostischer Marker verwendet werden. FRAP-Analysen mit EGFP-Fusionsproteinen f{\"u}hrten zu der Erkenntnis, dass HMGN1, HMGN2, HMGA1a, HMGA1b und HMGB1 sich sehr schnell durch den Zellkern bewegen und nur transient an das Chromatin gebunden sind. Es konnte gezeigt werden, dass die spezifischen DNA/Chromatin-Bindungsmotive im Wesentlichen entscheiden, wo die Bindung der HMG-Proteine in vivo erfolgt, ihre Verweildauer im Euchromatin, Heterochromatin und zellzyklusabh{\"a}ngig dann aber durch Modifikationen (Phosphorylierungen, Acetylierungen) reguliert wird. Dies wurde beispielhaft durch punktmutierte und deletierte Fusionsproteine, sowie durch Inkubation der Zellen mit spezifischen Drogen f{\"u}r die HMGA1a-Proteine gezeigt. FRAP-Analysen haben außerdem gezeigt, dass die Spleißvarianten hHMGA1a und hHMGA1b unterschiedliche kinetische Parameter besitzen. Dies zeigt, dass beiden Varianten unterschiedliche Funktionen zugesprochen werden k{\"o}nnen. Die gefundenen spezifischen, transienten Verweildauern der einzelnen HMG-Proteine f{\"u}hren zu einem Modell eines dynamischen Chromatin-Netzwerkes, wobei alle HMG-Proteine in Wechselwirkungen innerhalb eines dynamischen Chromatinprotein-Cocktails DNA-abh{\"a}ngige Prozesse regulieren k{\"o}nnen. Die jeweiligen, wie hier gezeigt, durch Modifikationen regulierten Verweildauern der HMG-Proteine bestimmen dar{\"u}ber, welche anderen Chromatinproteine wie lange am Chromatin verbleiben und bestimmte Funktionen, wie beispielsweise die Modifikation der Core-Histone, {\"u}bernehmen k{\"o}nnen. Die dynamischen Parameter einzelner HMG-Proteine erkl{\"a}ren so, wie diese Proteine ihre vielf{\"a}ltigen Funktionen als Architekturelemente und bei der Regulation DNA-abh{\"a}ngiger Prozesse erf{\"u}llen k{\"o}nnen. Einige Vertreter, wie die HMGB1-Proteine, bewegen sich so schnell durch den Zellkern, dass ihre kinetischen Parameter durch das beschr{\"a}nkte zeitliche Aufl{\"o}sungsverm{\"o}gen konfokaler Mikroskope der {\"a}lteren Generation nicht erfassbar sind. Die Bestimmung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen von Drogen, welche die kinetischen Parameter von HMGB1-Proteinen beeinflussen k{\"o}nnen, ist inzwischen mit Mikroskopen der neuen Generation m{\"o}glich. Im Verlaufe der Arbeit zeigte sich, dass andere verwendete Fluorophore wie DsRed2 die kinetischen Eigenschaften von HMG-Fusionsproteinen beeinflussen k{\"o}nnen. Durch eine erh{\"o}hte Verweildauer k{\"o}nnen auch sehr transiente Interaktionen sichtbar gemacht werden. Wie gezeigt wurde, kann eine erh{\"o}hte Verweildauer aber auch zur Verdr{\"a}ngung anderer Proteine f{\"u}hren, die die gleichen Bindungsstellen benutzen und so eine Modulation des Chromatins bewirken. Die Nutzung von DsRed-Fluorophoren erm{\"o}glicht interessante neue Erkenntnisse. Diese m{\"u}ssen aber stets vor dem Hintergrund eines ver{\"a}nderten dynamischen Verhaltens der Fusionsproteine interpretiert werden. Zusammengenommen liefern die hier vorgestellten Ergebnisse zur Dynamik der HMG-Proteine grundlegende Informationen, die zur Kl{\"a}rung ihrer Funktion bei Chromatinmodulationen, etwa bei Differenzierungsprozessen oder der Entstehung von Tumorzellen entscheidend beitragen. Die Erkenntnis, dass diese Proteine lediglich transiente Interaktionen mit ihren Bindungspartnern eingehen k{\"o}nnen, sind im Hinblick auf die Behandlung von Tumoren, bei denen HMG-Proteine im Vergleich zu Normalgewebe h{\"a}ufig {\"u}berexprimiert sind, von großer Bedeutung.},
  subject      = {HMG-Proteine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Stoll2008,
  author    = {Stoll, Regina},
  title     = {Einfluss der Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferasesysteme auf die Aktivit{\"a}t des Virulenzgenregulators PrfA von Listeria monocytogenes},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-32072},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Die PrfA-Aktivit{\"a}t im L. monocytogenes Stamm EGD sowie dessen prfA Deletionsmutante mit dem prfA- bzw. prfA*-Gen unter Kontrolle des prfA-Promotors auf dem High-Copy Plasmid pERL3 wurde nach Wachstum in BHI, LB (Luria-Bertani Medium) und definiertem MM untersucht. Die Medien waren versetzt mit 50 mM der PTS-Kohlenstoffquellen Glucose, Mannose oder Cellobiose oder mit der Nicht-PTS-Kohlenstoffquelle Glycerin. Mit dem Wildtyp EGD konnte in BHI und LB mit allen genannten Kohlenstoffquellen nur eine geringe PrfA-Aktivit{\"a}t beobachtet werden. In MM dagegen war die PrfA-Aktivit{\"a}t in Anwesenheit von Glycerin stark erh{\"o}ht und mit Cellobiose als einziger Kohlenstoffquelle stark reprimiert. Mit dem PrfA*-{\"u}berexprimierenden Stamm wurden unter allen Bedingungen hohe PrfA-Aktivit{\"a}t gefunden. EGD\&\#916;prfApPrfA zeigte dagegen trotz gleicher PrfA-Menge wie EGD\&\#916;prfApPrfA* nur in BHI eine hohe PrfA-Aktivit{\"a}t. Die Zugabe des Amberlites XAD4 in LB erh{\"o}ht die reduzierte PrfA-Aktivit{\"a}t in EGD\&\#916;prfApPrfA und in MM verst{\"a}rkt XAD4-Zugabe die PrfA-Aktivit{\"a}t des Wildtyps. Eine ptsH-Mutante ist in LB und MM unabh{\"a}ngig von der Zugabe einer der vier Kohlenstoffquellen nicht in der Lage zu wachsen (Stoll et al., 2008), was darauf hin deutet, dass die Aufnahme der verwendeten Kohlenstoffquelle und auch der Glycerinstoffwechsel von einem intakten PTS-Weg abh{\"a}ngig sind. In BHI stehen dagegen offensichtlich noch PTS-unabh{\"a}ngige Kohlenstoffquellen zur Verf{\"u}gung, da die ptsH-Mutante in BHI noch wachsen kann. Dies unterst{\"u}tzt auch die Beobachtung, dass die Generationszeiten von L. monocytogenes in LB und vor allem MM im Vergleich zu BHI wesentlich l{\"a}nger sind. Expressionsdaten der PTS-Gene wurden von allen drei St{\"a}mmen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen erstellt. Die Daten deuten darauf hin, dass die PrfA-Aktivit{\"a}t mit der Expressionsst{\"a}rke und dem Phosphorylierungsstatus bestimmter PTS-Permeasen zusammenh{\"a}ngt. PTS-Permeasen bestehen immer aus mindestens drei Dom{\"a}nen, der Membran {\"u}berspannenden Zucker transportierenden Dom{\"a}ne EIIC (und EIID im Falle von Mannose spezifischen PTS) und den zwei im Zytosol l{\"o}slichen Komponenten EIIA und EIIB. EIIA wird direkt von HPr-His-P phosphoryliert, welches sein Phosphat von dem von PEP phosphorylierten EI empf{\"a}ngt. Das PTS spielt neben der Zuckeraufnahme eine Rolle in vielen regulatorischen Vorg{\"a}ngen in der Bakterienzelle, unter anderem in der Pathogenese (Barabote and Saier, 2005; Deutscher et al., 2006; Postma et al., 1993). Listerien codieren f{\"u}r alle sieben bekannten PTS-Familien, 86 Gene codieren f{\"u}r 29 komplette und einige unvollst{\"a}ndige PTS. Trotz der großen Anzahl an PTS-Genen besitzt L. monocytogenes kein vollst{\"a}ndiges PtsG, welches homolog zu E. coli oder B. subtilis ist, sondern nur ein EIIAGlc. Um die an der Glucoseaufnahme involvierten PTS-Permeasen zu identifizieren und einen m{\"o}glichen Zusammenhang zwischen diesen PTS-Permeasen und der PrfA-Aktivit{\"a}t zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit systematisch PTS-Permeasen deletiert, welche f{\"u}r putative Beta-Glucosid-PTS (PTSGlc), Mannose-PTS (PTSMan) und Cellobiose-PTS (PTSLac) codieren. Diese Deletionsmutanten wurden bez{\"u}glich ihres Wachstumes in Gegenwart der entsprechenden PTS-Zucker und die PrfA-Aktivit{\"a}t untersucht. Deletionen von in L. monocytogenes EGD-e nur schwach exprimierten PTSGlc haben keinen Einfluss auf das Wachstum in MM mit 10 mM Glucose oder Cellobiose. Von den vier exprimierten PTSMan sind zumindest zwei eindeutig in der Lage, Glucose zu transportieren, und die Deletion dieser PTS-Permeasen, codiert von lmo0096-0098 und lmo0781-0784, erh{\"o}ht sehr deutlich die Expression des im Wildtyp wenig exprimierten Gens f{\"u}r die PTS-Permease PTSGlc(lmo0027). F{\"u}r den Cellobiose-Transport scheint von den sechs vollst{\"a}ndigen PTSLac-Permeasen vor allem PTSLac(lmo2683-2685) und nach Deletion dieses Operons, ebenfalls die PTSGlc(lmo0027)-Permease wichtig zu sein. Obwohl die multiple Deletion dieser f{\"u}r die Glucose/Mannose- bzw. Cellobiose-Aufnahme in L. monocytogenes wichtigen PTS-Permeasen das Wachstum in definiertem MM drastisch reduziert, haben diese Deletionen offensichtlich keine Auswirkung auf das intrazellul{\"a}re Wachstum, da die Infektionsrate so effizient ist wie die des Wildtyps. Auf PrfA hat die schrittweise Deletion der Glucose/Mannose-spezifischen PTS-Permeasen nach Wachstum in MM mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle eine aktivierende Wirkung, jedoch keine Auswirkung nach Wachstum in Cellobiose-haltigem MM. Umgekehrt verh{\"a}lt es sich mit den PTSLac-Deletionsmutanten. In vitro Transkriptionsstudien mit (teilweise phosphoryliert) aufgereinigten Lmo0096 (EIIABMan) und Lmo1017 (EIIAGlc) -Proteinen deuten auf eine direkte Interaktion zwischen PrfA und bestimmten EII-Proteinen hin. Dies konnte f{\"u}r Lmo0096 auch in Immunpr{\"a}zipitationsassays gezeigt werden. Eine {\"U}berexpression von Lmo0096 f{\"u}hrte zudem zu einer sehr deutlichen Reduktion der PrfA-Aktivit{\"a}t nach Wachstum in MM mit Glucose.},
  subject      = {Listeria monocytogenes},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Mertins2008,
  author    = {Mertins, Sonja},
  title     = {Einfluss des Kohlenstoff-Metabolismus auf die Aktivit{\"a}t des Virulenzfaktors PrfA von Listeria monocytogenes},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29556},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Listeria monocytogenes geh{\"o}rt zu den Gram-positiven fakultativ intrazellul{\"a}ren Bakterien, ist aber auch zu einem saprophytischen Leben in freier Natur f{\"a}hig. Zahlreiche, umfassend charakterisierte Virulenzfaktoren sind f{\"u}r die verschiedenen Schritte im Infektionszyklus von L. monocytogenes erforderlich: InlA und InlB induzieren die Aufnahme von L. monocytogenes in nicht-phagozytische Zellen, LLO und PlcA sind f{\"u}r die Freisetzung aus dem prim{\"a}ren Phagosom, ActA f{\"u}r die Zell-zu-Zell-Ausbreitung und LLO zusammen mit PlcA und vor allem PlcB f{\"u}r die Freisetzung der Listerien aus dem sekund{\"a}ren Phagosom erforderlich. Der Hexose-Phosphat-Transporter UhpT ist teilweise f{\"u}r die Vermehrung von L. monocytogenes im Zytosol der infizierten Wirtszelle verantwortlich. Die Gene, die f{\"u}r diese Virulenzfaktoren kodieren, sind gr{\"o}ßtenteils in dem 9,6 kb-großen Virulenzgencluster LIPI-1 zusammengefasst oder liegen verteilt auf dem Chromosom. Alle diese Virulenzgene werden durch den positiven Regulationsfaktor PrfA (PrfA = positive regulatory factor A) in ihrer Transkription kontrolliert. Das prfA-Gen, kodierend f{\"u}r PrfA, ist benfalls Bestandteil des Virulenzgenclusters (LIPI-1). In bisherigen Studien konnte gezeigt werden, dass die Verwertung der Kohlenstoffquellen Glukose, Mannose und Cellobiose zur Hemmung der PrfA-Aktivit{\"a}t in L. monocytogenes f{\"u}hrt. Basierend auf Literaturdaten und eigenen Ergebnissen wurde die Hypothese aufgestellt, dass Komponenten der globalen Kohlenstoff-Katabolitrepression (KKR) oder des PTS (Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferase-System)-abh{\"a}ngigen Zuckertransports an der Modulation der PrfA-Aktivit{\"a}t beteiligt sind. Um zu {\"u}berpr{\"u}fen, ob {\"u}ber die KKR die Aktivit{\"a}t von PrfA gesteuert wird und dadurch auch die Regulation der PrfA-abh{\"a}ngigen Virulenzgenexpression, wurden in dieser Arbeit pLSV101-Insertionsmutanten f{\"u}r die Gene ccpA (kodierend f{\"u}r CcpA = catabolite control protein A), hprK (kodierend f{\"u}r die HPr-Kinase/Phosphorylase, die HPr am Ser46 phophoryliert) und ptsH (kodierend f{\"u}r das hitzestabile HPr) charakterisiert. Die Insertionsmutanten ::ccpA und ::hprK zeigten sowohl in BHI (undefiniertes n{\"a}hrstoffreiches Medium) als auch in definiertem Minimalmedium (MM) mit 50 mM Glukose ein verlangsamtes Wachstum und eine verringerte [14C]-Glukose-Aufnahme im Vergleich zum Wildtyp (WT). Die ::ptsH-Insertionsmutante war nur zu einem Wachstum in BHI f{\"a}hig und zeigte erwartungsgem{\"a}ß (fehlendes HPr) kein Wachstum in definiertem MM mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle. Die ::hprK- und (unter bestimmten Wachstumsbedingungen) auch die ::ptsH-Mutante wiesen sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene eine gesteigerte Expression PrfA-abh{\"a}ngiger Virulenzgene auf. Cellobiose-Verwertung f{\"u}hrte auch in der ::hprK-Insertionsmutante zu einer Hemmung der PrfA-Aktivit{\"a}t. Dagegen wurde in der ::ccpA-Insertionsmutante eine geringere Expression aller PrfA-abh{\"a}ngigen Virulenzgene im Vergleich zum WT festgestellt. Die Revertanten RccpA, RhprK und RptsH wiesen im Wachstumsverhalten und in der PrfA-abh{\"a}ngigen Virulenzgenexpression wieder einen wildtypischen Ph{\"a}notyp auf. Trotz der etwas gesteigerten Virulenzgenexpression zeigte die ::ptsH-Mutante eine deutlich verringerte Replikationsrate in J744 Makrophagen gegen{\"u}ber dem WT. Die Transkriptomprofile der ::ccpA- und ::hprK-Insertionsmutanten zeigten im Vergleich zum WT viele hochregulierte Gene. Diese umfassen Gene, die v.a. f{\"u}r den PTS-abh{\"a}ngigen Zuckertransport, ABC-Transporter und Enzyme des C- und N-Metabolismus kodieren und im WT wahrscheinlich unter den gegebenen Wachstumsbedingungen unter KKR-Kontrolle stehen. Die erh{\"o}hte PrfA-abh{\"a}ngige Virulenzgenexpression in der ::hprK-Mutante korreliert mit der Herunterregulation einiger Gene, die in ihrer Transkription durch einen aktiven PTSvermittelten Glukose-Transport kontrolliert werden. Die gesteigerte PrfA-Aktivit{\"a}t und die Abwesenheit von HPr-Ser46~P (neben CcpA eine wichtige Komponente der KKR) in den ::hprK- und ::ptsH-Insertionsmutanten f{\"u}hrten zu der Annahme, dass eine Korrelation zwischen der Menge an HPr-Ser46~P und der PrfA-Aktivit{\"a}t bestehen k{\"o}nnte. Die Untersuchung der PrfA-Aktivit{\"a}t und parallel dazu die Mengenbestimmung von HPr-Ser46~P in MM mit Glukose, Cellobiose und Glyzerin zeigte jedoch, dass weder HPr-Ser46~P noch HPr-His15~P direkte Modulatoren der PrfA-Aktivit{\"a}t sind. Eine direkte Interaktion zwischen HPr-Ser46~P und PrfA konnte mittels Biacor-Analyse ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Auch in vitro Transkriptions-Studien zeigten keinen inhibitorischen Effekt von HPr-Ser46~P auf die Initiation der Transkription bei PrfA-abh{\"a}ngigen Promotoren (S. M{\"u}ller-Altrock, pers{\"o}nliche Mitteilung). Interessanterweise war bei einem aktiven Glukose-Transport, bei Bedingungen also, wo die EIIA-Komponenten aller aktiven Glukose-spezifischen PTS im unphosphoryliertem Zustand vorliegen (EIIA-Komponenten {\"u}bertragen {\"u}ber EIIB das aktive Phosphat auf die {\"u}ber EIIC in die Bakterienzelle transportierte Glukose), die PrfA-Aktivit{\"a}t gering. Erst in der sp{\"a}tlogarithmischen bis station{\"a}ren Wachstumsphasen, wenn Glukose nur noch in geringem Umfang von der Bakterienzelle aufgenommen wird und die Glukose-spezifischen EIIA-Komponenten in phosphorylierter Form vorliegen, steigt die PrfA-Aktivit{\"a}t. Die Verwertung der PTS-unabh{\"a}ngigen Kohlenstoffquelle Glyzerin zeigte gegen{\"u}ber den PTS Zuckern Glukose und Cellobiose schon in der fr{\"u}hen Wachstumsphase eine erh{\"o}hte PrfA-Aktivit{\"a}t. Demnach scheint sich die Expression spezifischer PTS und der Phosphorylierungszustand von EIIA dieser PTS regulatorisch auf die PrfA-Aktivit{\"a}t auszuwirken. Die Glukose-Aufnahme in L. monocytogenes ist noch nicht vollst{\"a}ndig aufgekl{\"a}rt (R. Stoll, unver{\"o}ffentlichte Ergebnisse). Doch kann aufgrund des Wachstumsverlustes der ::ptsH-Insertionsmutante in Glukose-haltigem MM davon ausgegangen werden, dass die Glukose-Aufnahme in L. monocytogenes ausschließlich PTS-abh{\"a}ngig erfolgt. Ein Glukose-spezifisches PtsG, das in B. subtilis und anderen Bakterien als wichtiger Glukose-Transporter beschrieben wurde, existiert in L. monocytogenes nicht. Hier konnte nur eine PtsG-spezifische EIIA-Komponente (kodiert von lmo1017) identifiziert werden. Wachstumsuntersuchungen in definiertem MM mit den Kohlenstoffquellen Glukose, Mannose, Cellobiose und Glyzerin ergaben keinen Wachstumsunterschied zwischen der in dieser Komponente defekten \&\#916;eIIAGlc-Mutante und dem WT. Die PrfA-Aktivit{\"a}t dieser Mutante war leicht erh{\"o}ht, was sich in einer etwas gesteigerten ActA- bzw. PrfA-Expression und einer h{\"o}heren LLO-Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber dem WT auspr{\"a}gte. Es konnte jedoch keine eindeutige Interaktion zwischen dieser gereinigten EIIAGlc-Komponente und dem PrfA-Protein mittels Biacor-Analyse nachgewiesen werden (S. M{\"u}ller-Altrock und G. Seidel, pers{\"o}nliche Mitteilung). Welche EIIA-Komponenten spezifischer PTS an der Modulation der PrfA-Aktivit{\"a}t beteiligt sind, konnte in dieser Arbeit damit nicht abschließend gekl{\"a}rt werden. Der Transport von phosphorylierten Zuckern, wie Glukose-1-, Glukose-6- oder Mannose-6- Phosphat, erfolgt in L. monocytogenes {\"u}ber den Hexose-Phosphat-Transporter UhpT, der von dem strikt PrfA-abh{\"a}ngig uhpT-Gen kodiert wird. Durch die Zugabe von Amberlite XAD-4 zu LB-Medium oder durch vorherigen Anzucht in Glyzerin-haltigem MM, Bedingungen, die sich stimulierend auf die PrfA-Aktivit{\"a}t auswirken, konnte ein effizientes Wachstum von L. monocytogenes in Glukose-6-Phosphat-haltigem Medium erreicht werden. Obwohl die Kohlenstoff-Verbindungen (Glukose, Cellobiose und Glukose-6-Phosphat) in die Glykolyse eingeschleust werden, f{\"u}hrte die Verwertung von Glukose-6-Phosphat zur Aufhebung der KKR. Dies konnte durch vergleichende Gesamtgenom-Transkriptom-Analysen und an der Bestimmung der HPr-Ser46~P Meng gezeigt werden. Die PTS-unabh{\"a}ngige Glukose-6-Phosphat-Aufnahme f{\"u}hrt, {\"a}hnlich wie die von Glyzerin, zu einer erh{\"o}hten Aktivit{\"a}t von PrfA. Neben Glyzerin k{\"o}nnen auch Dihydroxyaceton (Dha) und Pyruvat (letztere allerdings mit niedriger Wachstumseffizienz), nicht aber Glyzerin-3-Phosphat in vitro als C3-Quellen dienen. Da die ::ptsH-Insertionsmutante kein Wachstum in Glyzerin- oder Dha-haltigem Medium zeigte, l{\"a}sst sich vermuten, dass die listeriellen Glyzerin-Kinase(n) (GlpK), {\"a}hnlich wie die von B. subtilis, durch HPr-His15~P aktiviert werden muss und die Dha-Kinase(n) (DhaK) von L. monocytogenes ebenfalls HPr-His15~P als Kofaktor f{\"u}r die Phosphorylierung von Dha verwendet. Der Glyzerin-Metabolismus in L. monocytogenes wurde vor allem {\"u}ber Gesamtgenom-Transkriptom-Analysen und Real-time RT-PCR Untersuchungen n{\"a}her charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes mehrere Gene besitzt, die in Glyzerin-haltigem Medium verst{\"a}rkt exprimiert werden und vermutlich am Glyzerin- bzw. Dha-Metabolismus beteiligt sind. L. monocytogenes besitzt zwei Dha-Kinasen (kodiert von lmo0347-48 und lmo2695-96), die beide eine hohe Homologie zur DhaK aus E. coli besitzen. Eine Deletion beider Dha-Kinasen (\&\#916;dhaK = \&\#916;lmo0347-48/lmo2695-96) f{\"u}hrte zu einer starken Wachstumshemmung in Glyzerin-haltigem MM und zur weitgehenden Inaktivierung von PrfA. Die \&\#916;dhaK- und die \&\#916;glpD/dhaK-Mutante wiesen in J744 Makrophagen eine verringerte Replikationsrate im Vergleich zum WT auf, was f{\"u}r eine Verwertung von Glyzerin und/oder Dha durch L. monocytogenes im Zytoplasma von Wirtszellen spricht. Da diese Mutanten aber noch -wenn auch mit verringerter Effizienz - in diesem Zellkompartiment der Makrophagen wachsen k{\"o}nnen, muss L. monocytogenes wohl auch in der Lage sein, weitere Kohlenstoffquellen dieser Wirtszelle verwerten zu k{\"o}nnen.},
  subject      = {Listeria monocytogenes},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Claes2003,
  author    = {Claes, Ellen},
  title     = {Einfluss funktionsloser Photorezeptoren auf die Anatomie der Retina - Eine licht- und elektronenmikroskopische Studie anhand der CNGA3-/-Rho-/- Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-8181},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Netzhauterkrankungen, wie Retinitis pigmentosa, sind in der Bev{\"o}lkerung weit verbreitet (1,5 Millionen weltweit). Gew{\"o}hnlich berichten die Betroffenen {\"u}ber Nachtblindheit und periphere Gesichtsfeldausf{\"a}lle. H{\"a}ufig f{\"u}hrt diese Erkrankung, die durch eine fortschreitende Degeneration von Photorezeptoren verursacht wird, zur vollst{\"a}ndigen Erblindung. Bisher beschrieb man den pathologischen Prozess vor allem an rd-M{\"a}usen. Allerdings setzt bei diesen die Degeneration sehr fr{\"u}h ein. Somit ist die {\"U}bertragbarkeit auf den Menschen erschwert, da abgesehen von wenigen Ausnahmen, der Verlust von Photorezeptoren hier erst im zweiten Lebensabschnitt beginnt. Deshalb war es interessant, im Rahmen dieser Arbeit anhand der CNGA3-/-Rho-/- Maus ein Modell zu untersuchen, das {\"a}hnlich dem menschlichen System, zun{\"a}chst eine intakte Morphologie zeigt. Dadurch war es m{\"o}glich eine genaue zeitliche Abfolge der Degeneration zu dokumentieren. Dies kann medizinisch zur Entwicklung eines Therapieansatzes genutzt werden, der bereits zu Beginn der Degeneration greift, und damit den fortlaufenden Prozess zum Stillstand bringen kann. Die CNGA3-/-Rho-/- Maus repr{\"a}sentiert ein System funktionsloser Photorezeptoren, bei dem der zyklische Nukleotid-Kanal (CNGA3) der Zapfenaußensegmente und das Rhodopsin (Rho) der St{\"a}bchenaußensegmente ausgeschaltet wurde. Best{\"a}tigt wurde dies durch ein Elektroretinogramm mit einer negativen Photoantwort bez{\"u}glich Zapfen und St{\"a}bchen. Die Degeneration f{\"u}hrt zu einem vollst{\"a}ndigen Verlust aller Photorezeptoren nach drei Monaten (Pm3). Zum Zeitpunkt Pw4 konnte, vergleichbar dem Wildtyp, eine intakte {\"a}ußere Retina nachgewiesen werden, bei der lediglich die {\"a}ußeren St{\"a}bchensegmente fehlen. Die synaptischen Kontakte zwischen den Terminalien der Photorezeptoren, der Horizontalzellen und Bipolarzelldendriten waren normal entwickelt und St{\"a}bchenendigungen als auch Zapfenendf{\"u}ßchen bildeten funktionelle Triaden aus. Bei den St{\"a}bchenendigungen konnte mit zunehmender Degeneration (Pw5, Pw6) eine Akkumulation synaptischer B{\"a}nder und postsynaptischer Elemente beobachtet werden. Im Zeitraum Pw4-7 zeigten sowohl die Zapfen, als auch die Horizontalzellen und St{\"a}bchen-Bipolarzellen, eine bemerkenswerte strukturelle Plastizit{\"a}t. Obwohl durch die Photorezeptoren kein Lichtsignal vermittelt wurde, konnten pr{\"a}synaptische Marker (bassoon) und postsynaptische Glutamatrezeptoren (GluR1, mGluR6) an den Photorezeptorterminalien nachgewiesen werden. Dies l{\"a}sst die Vermutung zu, dass eine Transmitterfreisetzung theoretisch m{\"o}glich w{\"a}re. Dar{\"u}ber hinaus konnte im Zeitraum von 12 Monaten keine nennenswerte Auswirkung auf die IPL beobachtet werden: Amakrin- und Zapfen-Bipolarzellen waren normal stratifiziert und die Expression der Transmitter-Rezeptoren zeigte ein charakteristisches Verteilungsmuster. Außerdem war die Ultrastruktur von konventionellen und Bandsynapsen der des Wildtyps vergleichbar. Dar{\"u}ber hinaus bildeten sowohl Amakrinzellen, als auch Bipolar- und Ganglienzellen, Forts{\"a}tze in die INL hinein. Allgemein zeigt die immunhistochemisch und ultrastrukturell untersuchte CNGA3-/-Rho-/- Maus, dass weder funktionell aktive Photorezeptoren noch Licht eine stimulierende Wirkung auf die Ausbildung synaptischer Strukturen und die Expression verschiedener Rezeptoren haben.},
  subject      = {Netzhaut},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gareiss2006,
  author    = {Gareiß, Barbara},
  title     = {Einfluss niedermolekularer Protein-Tyrosin-Phosphatasen von Listeria monocytogenes auf die listerielle Genexpression und Virulenz},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19853},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Im Genom von Listeria monocytogenes konnten zwei Gene identifiziert werden, die mutmaßlich f{\"u}r niedermolekulare Protein-Tyrosin Phosphatasen (LMW-PTPs) kodieren, Lmo0938/Ptp-1 und Lmo2540/Ptp-2, beide {\"a}hneln LMW-PTPs von B. subtilis. Einzel- und Doppeldeletionen der ptp-Gene beeinflussten die Transkription zahlreicher Gene, wie anhand von Gesamtgenom-DNA-Microarray-Analysen und quantitativer RT-PCR gezeigt werden konnten. Insbesondere waren die Gene f{\"u}r i) die Internaline A und B, ii) den Osmoprotektanten-Transporter OpuC, iii) MCP, notwendig zur Flagellen-Bewegung und iv) eine Anzahl von den Proteinen, die in die N{\"a}hrstoffaufnahme sowie den intrazellul{\"a}ren Metabolismus involviert sind, in vitro herunterreguliert. Die PrfA-regulierten Virulenzgene wurden in den Mutanten verst{\"a}rkt exprimiert. Im Wesentlichen konnte das gleiche Transkriptionsmuster in infizierten Caco-2-Enterocyten beobachtet werden. Die verringerte Invasivit{\"a}t (abh{\"a}ngig von InlA) und die Unbeweglichkeit der Mutanten passt zu den Transkriptionsergebnissen. Jedoch wurden weder die intrazellul{\"a}re Replikation innerhalb eukaryontischer Wirtszellen noch die Resistenz gegen Stressbedingungen durch die Deletion beeintr{\"a}chtigt. Die Proteome des Wildtyps und der ptp-Mutanten wurden durch 2-dimensionale Gelelektrophorese verglichen und es zeigte sich, dass die Transkriptionsergebnisse nicht vollst{\"a}ndig im Proteom reflektiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Ptps in die Regulationsnetzwerke des alternativen Stress-Sigmafaktor SigB und von PrfA eingreifen. Der {\"a}hnliche Effekt beider Ptps auf die Transkription oder auf den Proteinlevel deutet eine Interaktion oder Kooperation der beiden Enzyme an.},
  subject      = {Listeria monocytogenes},
  language  = {de}
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@phdthesis{Boegelein2021,
  author    = {B{\"o}gelein, Anna},
  title     = {Einfluss systemischer Therapeutika auf die CXCR4-Expression von Myelomzellen},
  doi       = {10.25972/OPUS-24174},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-241746},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Im Zuge der Bem{\"u}hungen um neue, tumorspezifische Therapieans{\"a}tze f{\"u}r die Myelomerkrankung hat sich der C-X-C-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4) aufgrund seiner zentralen Rolle in der Tumorgenese als vielversprechender Angriffspunkt hervorgetan. Im Sinne eines theranostischen Konzepts wird der Rezeptor mithilfe eines radioaktiv markierten Liganden quantifiziert und anschließend von rezeptorspezifischen Radiotherapeutika als Zielstruktur genutzt. Die CXCR4-Expression ist allerdings ein h{\"o}chst dynamischer Prozess mit großer inter- und intraindividueller Heterogenit{\"a}t, der u.a. durch eine begleitende Chemotherapie beeinflusst werden kann. Ob sich therapieinduzierte Ver{\"a}nderungen der Rezeptorexpression gezielt nutzen lassen, um die CXCR4-Expression zu optimieren und so die Effektivit{\"a}t der CXCR4-gerichteten Strategien zu steigern, wurde bislang nicht untersucht. Vor diesem Hintergrund wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene, in der Myelomtherapie etablierte Substanzen sowohl einzeln als auch in Kombination hinsichtlich ihres Einflusses auf die CXCR4-Expression von MM-Zelllinien und prim{\"a}ren MM-Zellen unter in vitro Bedingungen analysiert. In den durchgef{\"u}hrten Experimenten zeigte sich eine hohe Variabilit{\"a}t der CXCR4-Expression der MM-Zellen nach Therapieinduktion, die sich als substanz-, dosis- und zeitabh{\"a}ngig herausstellte. Die Ergebnisse best{\"a}tigten das große Potenzial der therapieinduzierten Modulation der CXCR4-Expression. Im weiteren Verlauf sind translationale Forschungsans{\"a}tze gerechtfertigt, die die {\"U}bertragbarkeit der in vitro gewonnenen Ergebnisse auf die komplexen Vorg{\"a}nge im lebenden Organismus {\"u}berpr{\"u}fen. Langfristiges Ziel ist der Entwurf eines patientenzentrierten, multimodalen Therapiekonzepts, welches das CXCR4-gerichtete theranostische Konzept mit einer individuell angepassten, medikament{\"o}sen MM-Therapie kombiniert.},
  subject      = {Plasmozytom},
  language  = {de}
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@phdthesis{Reiss2010,
  author    = {Reiß, Cora},
  title     = {Einfluss von Defekten des Mismatch Reparatur Proteins MLH1 (Mut L Homolog 1) auf Fertilit{\"a}t und Tumorgenese im Mausmodell},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-53626},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Mutationen im humanen DNA Mismatch-Reparatur (MMR) Gens Mlh1 sind mit dem erblichen, nicht-polyp{\"o}sen Kolonkarzinom (Lynch Syndrom, HNPCC) und einem signifikanten Anteil sporadischer kolorektaler Tumore assoziiert. Zudem konnten MMR Defekte in sporadischen und erblichen Lymphom Erkrankungen beschrieben werden. In Zellen resultiert die Inaktivierung des Mlh1 Gens in der Akkumulation von somatischen Mutationen im Genom und einer erh{\"o}hten Resistenz gegen{\"u}ber den genotoxischen Effekten einer Vielzahl von DNA sch{\"a}digenden Agenzien. M{\"a}use, die ein Null Allel f{\"u}r das MMR Gen Mlh1 tragen zeigen einen starken Tumorpr{\"a}dispositions Ph{\"a}notyp. Sie entwickeln vorrangig B- und T-Zell Lymphome und mit geringerer Haufigkeit gastrointestinale Tumore. Zus{\"a}tzlich sind Mlh1-/- M{\"a}use durch einen meiotischen Ph{\"a}notyp charakterisiert, der zu Sterilit{\"a}ten in beiden Geschlechtern f{\"u}hrt. Um die Effekte von Mlh1 missense Mutationen auf die Tumoranf{\"a}lligkeit zu untersuchen, erzeugten wir eine Mauslinie, die die h{\"a}ufig in HNPCC Patienten beschriebene MLH1G67R Mutation tragen, die in einer der ATP Bindungs-Dom{\"a}nen von MLH1 lokalisiert ist. Auch wenn die MLH1G67R Mutation in homozygot mutanten M{\"a}usen in einer DNA Reparatur Defizienz resultierte hatte sie keinen Effekt auf die MMR vermittelte zellul{\"a}re Antwort auf DNA Sch{\"a}den. Hierzu geh{\"o}rte die apoptotische Antwort von Epithelzellen der intestinalen Mucosa auf Cisplatin, die in Mlh1-/- M{\"a}usen defektiv jedoch in Mlh1G67R/G67R M{\"a}usen normal ausfiel. Mlh1G67R/G67R mutante M{\"a}use zeigten wie Mlh1-/- Tiere einen starken Tumorpr{\"a}dispositions Ph{\"a}notyp. Sie entwickelten jedoch im Vergleich zu Mlh1-/- Tieren signifikant weniger gastrointestinale Tumore, was darauf hinweist, dass Mlh1 missense Mutationen die Tumor supprimierende MMR Funktion in einer Gewebs-spezifischen Weise beeinflussen k{\"o}nnen. Dar{\"u}ber hinaus sind Mlh1G67R/G67R M{\"a}use, aufgrund der fehlenden Bindungsf{\"a}higkeit des MLH1G67R Proteins an die meiotischen Chromosomen im Pachyt{\"a}n Stadium, steril. Dies zeigt, dass die ATPase Aktivit{\"a}t von MLH1 f{\"u}r die Fertilit{\"a}t in S{\"a}ugern essentiell ist. Diese Untersuchungen belegen, dass die Mlh1G67R Mutation die biologischen MLH1 Funktionen differentiell mit einem eindeutigen Ph{\"a}notyp beeinflusst. Um die Rolle von MLH1 f{\"u}r die Lymphomagenese detaillierter untersuchen zu k{\"o}nnen, generierten wir ein neues Mausmodell mit einem konditionellen Mlh1 Allel (Mlh1flox/flox). Das Einkreuzen von transgenen EIIa-Cre Mausen in die Mlh1flox/flox Mauslinie f{\"u}hrte zur konstitutiven Inaktivierung von MLH1. Die resultierende Mlh1Δex4/Δex4 Mauslinie zeichnete sich durch MMR Defizienz und einen zu Mlh1-/- Tieren vergleichbaren Tumorpr{\"a}dispositions Ph{\"a}notyp aus. Zur T-Zell spezifischen MMR Inaktivierung kombinierten wir das Mlh1flox/flox Allel mit dem Lck-Cre Transgen. In den resultierenden Mlh1TΔex4/TΔex4 M{\"a}usen ist die MLH1 Inaktivierung auf doppelt positive und einzel positive Thymozyten und na{\"i}ve periphere TZellen beschr{\"a}nkt. Die Entwicklung von T-Zell Lymphomen in Mlh1TΔex4/TΔex4 M{\"a}usen ist im Vergleich zu Mlh1-/- M{\"a}usen signifikant reduziert, was eine wichtige, Lymphom supprimierende MMR Funktion in fr{\"u}hen Stadien der T-Zell Entwicklung oder in lymphoiden Vorl{\"a}uferzellen impliziert.},
  subject      = {Colonkrebs},
  language  = {de}
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@phdthesis{Brocher2007,
  author    = {Brocher, Jan},
  title     = {Einfluss von HMGA1-Proteinen auf die Myogenese und Heterochromatinorganisation w{\"a}hrend der Differenzierung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-24456},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {HMG-Proteine sind nach den Histonen die zweith{\"a}ufigste Superfamilie nukle{\"a}rer Proteine. Sie binden an DNA und Nukleosomen und induzieren strukturelle Ver{\"a}nderungen im Chromatin. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Dynamik des Chromatins und beeinflussen dadurch DNA-abh{\"a}ngige Prozesse, wie Transkription und Replikation. Proteine der HMGA-Familie sind charakterisiert durch konservierte DNA-Bindungsmotive, den AT-Hooks, welche eine Bindung an AT-reiche DNA-Sequenzen vermitteln und durch einen sauren C-Terminus. HMGA-Proteine sind verst{\"a}rkt im Heterochromatin konzentriert und stehen in Verbindung mit der Expressionsregulation spezifischer Gene aufgrund der Stabilisierung von Nukleoproteinkomplexen, so genannten Enhanceosomen. HMGA-Proteine spielen des Weiteren eine entscheidende Rolle in verschiedenen Entwicklungsprozessen und bei der Tumorprogression . Um den Einfluss von HMGA1 auf die zellul{\"a}re Differenzierung und die Chromatinmodulation zu untersuchen, wurden C2C12 Maus-Myoblastenzellen verwendet. Die Induktion der Myogenese in diesen Zellen geht mit der Herunterregulierung von HMGA1 einher. Durch die Etablierung einer C2C12-Zelllinie, welche ein EGFP-markiertes HMGA1a stabil exprimierte, konnte gezeigt werden, dass eine anhaltende HMGA1-Expression spezifisch die Myogeneseprozess inhibierte, w{\"a}hrend die Osteogenese davon unbeeinflusst zu bleiben schien. Dieser hemmende Effekt kann durch die HMGA1-abh{\"a}ngige Fehlexpression verschiedener Gene, welche f{\"u}r eine einwandfreie Muskeldifferenzierung n{\"o}tig sind und in die Zellzyklusregulation eingreifen, erkl{\"a}rt werden. Unter der Verwendung von RNAi konnte gezeigt werden, dass die Herunterregulierung von HMGA1-Proteinen f{\"u}r eine korrekte Genexpression und den Muskeldifferenzierungsprozess notwendig ist. W{\"a}hrend der terminalen Differenzierung wird die Umorganisation des Chromatins durch die Fusion der Chromozentren offensichtlich. Fotobleichtechniken, wie „fluorescence recovery after photobleaching" (FRAP) zeigten, dass HMGA1-Proteine mit dem Methyl-CpG-bindenden Protein 2 (MeCP2), welches eine wichtige Rolle in der Chromozentrenfusion spielt, um DNA-Bindungsstellen konkurriert und dieses vom Chromatin verdr{\"a}ngt. Diese dynamische Konkurrenz zwischen einem anhaltend exprimierten HMGA1 und MeCP2 tr{\"a}gt somit zur Inhibition der differenzierungsabh{\"a}ngigen Modulation des Chromatins w{\"a}hrend der sp{\"a}ten Myogenese bei. Die Untersuchungen in C2A1a-Zellen lieferten weitere Hinweise daf{\"u}r, dass der wesentlichste Umbau des Chromatins in einem Zeitfenster um den dritten Tag nach Induktion der Myogenese stattfindet, an welchem HMGA1 nat{\"u}rlicherweise nahezu vollst{\"a}ndig herunterreguliert sind. In diesem Zeitraum kommt es zur Dissoziation der Chromozentren, zu ver{\"a}nderten Expressionsmustern in bestimmten Genen, zu Modulationen in Histonmodifikationen (H3K4me2, H3K4me3, H3K27me3), zur Replikations-unabh{\"a}ngigen Akkumulation von Histon H3 in den Chromozentren {\"u}ber ungef{\"a}hr einen Zellzyklus hinweg und zu eine signifikanten Erh{\"o}hung der HP1-Dynamik. Durch den Einsatz von Bimolekularer Fluoreszenzkomplementierung (BiFC), die es erlaubt Protein-Protein-Interaktionen in vivo zu visualisieren, konnte gezeigt werden, dass der saure C-Terminus des HMGA mit der Chromodom{\"a}ne (CD) des HP1 interagiert. Zus{\"a}tzlich ist f{\"u}r diese Interaktion die korrekte DNA-Bindung des HMGA n{\"o}tig. FRAP-Messungen mit HP1-EGFP-Fusionsproteinen in Zellen die wildtypisches oder ein mutiertes HMGA koexprimierten, best{\"a}tigten diese Daten und wiesen darauf hin, dass die HP1-Verweildauer im Heterochromatin maßgeblich von der Gegenwart eines funktionellen HMGA1 abh{\"a}ngig ist. Des Weiteren zeigten C2C12-Myoblasten, die HMGA1 nat{\"u}rlicherweise exprimieren, eine hohe HP1-Verweildauer, die nach HMGA1-knock down drastisch verringert ist. Umgekehrt ist die HP1-Verweildauer nach einer Herunterregulierung von HMGA1 an Tag 3 der Myogenese gering und steigt durch die Koexpression von HMGA1 auf das in Myoblasten gemessene Niveau an. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die differenzielle Expression von HMGA1 und ihre F{\"a}higkeit mit HP1 zu interagieren, sowie ihre Konkurrenz mit MeCP2 um DNA-Bindungsstellen einen entscheidende Rolle in der Regulation der Aufrechterhaltung und Plastizit{\"a}t des Heterochromatins w{\"a}hrend der Differenzierung spielen. Daher ist eine zeitlich festgelegte Herunterregulierung von HMGA1 notwendig, um die Modulation des Chromatins und dadurch den Differenzierungsprozess zu erm{\"o}glichen},
  subject      = {HMG-Proteine},
  language  = {de}
}