@phdthesis{Derrer2010, author = {Derrer, Bianca}, title = {Charakterisierung der Vitamin B6 Synthese und des Shikimatsyntheseweges im Malariaerreger Plasmodium ssp.}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51456}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Malaria ist eine schwerwiegende Krankheit, die j{\"a}hrlich {\"u}ber eine Million Menschen t{\"o}tet. Die zunehmende Resistenzbildung gegen{\"u}ber den verwendeten Medikamenten macht die Entwicklung neuer Antimalariamittel dringend notwendig. Daher sind die Vitamin B6 Synthese und der Shikimatweg von besonderem Interesse, da diese beiden Synthesewege nur im Parasiten und nicht im Menschen vorkommen. Unter der Voraussetzung, dass diese essentiell f{\"u}r den Parasiten sind, b{\"o}ten sie ideale Ansatzpunkte zur Entwicklung neuer Antimalariamittel. Voraus gegangene Studien haben gezeigt, dass Plasmodium falciparum in der Lage ist, PLP de novo mittels eines bifunktionalen Enzymkomplex, bestehend aus den Proteinen Pdx1 und Pdx2, zu synthetisieren. Pdx1 stellt dabei die eigentliche Synthase dar, w{\"a}hrend Pdx2 als Glutaminase-Partner das ben{\"o}tigte Ammoniumion f{\"u}r den heterocyclen Ring bereitstellt. Zus{\"a}tzlich dazu verf{\"u}gt der Parasit auch {\"u}ber einen salvage pathway um PLP zu „recyclen", in dem der Pyridoxalkinase PdxK eine Schl{\"u}sselfunktion zuf{\"a}llt. Knockout Studien der pdx1 im Mausmalariasystem P. berghei haben gezeigt, dass PbPdx1 f{\"u}r eine optimale Entwicklung der Blutstadien ben{\"o}tigt wird, nicht jedoch f{\"u}r deren {\"U}berleben. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich die Effekte eines pbpdxK(-) Knockouts in demselben System untersucht. Es konnte eine monoklonale Knockoutlinie generiert werden, was zeigte, dass PbPdxK nicht essentiell f{\"u}r das {\"U}berleben des Parasiten in den Blutstadien ist. Die Entwicklung w{\"a}hrend des Blutstadiums war von dem pbpdxK(-) Knockout nicht betroffen. Allerdings zeigte sich im Moskitostadium eine drastische Reduktion der Sporozoitenzahl sowohl in den Mitteld{\"a}rmen als auch in den Speicheldr{\"u}sen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass PbPdxK essentiell f{\"u}r das {\"U}berleben der Sporozoiten ist. Daneben wurde versucht, die Gene pfpdx1, pfpdx2 sowie pfpdxK in P. falciparum 3D7 durch Verwendung der single cross over Strategie auszuschalten. Es konnte jedoch f{\"u}r keines der genannten Konstrukte eine Integration in die jeweiligen Genloci anhand von PCR-Analysen nachgewiesen werden. Ebenso scheiterte der Versuch, durch Rekombination eines komplement{\"a}ren Genabschnitts die Funktion des Gens zu rekonstituieren. Daher bleibt es unklar, ob pfpdx1, pfpdx2 und pfpdxK durch Knockout Strategien auszuschalten sind oder nur f{\"u}r Genmanipulationen nicht zug{\"a}nglich sind. Die Kultivierung von P. falciparum 3D7 Parasiten in Vitamin B6 depletiertem Medium hatte keinen Effekt auf deren Wachstum. Eine anschließende Analyse der Proteinextrakte zeigte eine erh{\"o}hte Expression der PfPdxK, w{\"a}hrend sich das Expressionslevel der PfPdx1 nicht ver{\"a}nderte. Es scheint, dass der Parasit in der Lage ist Vitamin B6 Mangel durch vermehrte Nutzung des salvage pathways vollst{\"a}ndig zu kompensieren. Fr{\"u}here Arbeiten zeigten, dass der C-Terminus der Pdx1 in die Aktivit{\"a}t des PLP Synthasekomplexes involviert ist. Aus diesem Grund wurden verschiedene C-terminale Deletionsmutanten der PfPdx1 konstruiert und dabei bis zu 30 Aminos{\"a}uren entfernt. Diese Analysen ergaben, dass der C-Terminus vier verschiedene Funktionen besitzt: das Assembly der Pdx1 Untereinheiten zum Dodekamer, die Bindung des Pentosesubstrats Ribose 5-Phosphat, die Bildung des Intermediats I320 und schließlich die PLP Synthese. Diese unterschiedlichen Funktionen wurden durch verschiedene Deletionsvarianten identifiziert. Dar{\"u}ber hinaus waren alle Deletionsvarianten in der Lage, die Glutaminase Pdx2 zu aktivieren, was zeigt, dass das Dodekamer nicht Vorraussetzung f{\"u}r die Glutaminaseaktivit{\"a}t ist. Aufgrund der geringen PLP Syntheseaktivit{\"a}t in vitro wurde vermutet, dass der PfPdx1/PfPdx2 Komplex durch einen zus{\"a}tzlichen Faktor aktiviert wird. Daher wurde versucht, mittels Yeast 2-Hybrid, basierend auf einer PCR-amplifizierten P. falciparum 3D7 cDNA-Bibliothek als bait und PfPdx1 als prey, einen Interaktionspartner zu identifizieren. Mehrere Klone wurden gewonnen, die alle einen Bereich des Mal13P1.540, einem putativen Hsp70 Proteins, enthielten. Jedoch scheiterten alle Versuche, die Protein-Protein-Interaktion mit rekombinant exprimierten Protein zu best{\"a}tigen. Ebenso war es nicht m{\"o}glich, das vollst{\"a}ndige Mal13P1.540 rekombinant zu exprimieren sowie dessen Lokalisation in vivo zu bestimmen. Daher bleibt die Interaktion von PfPdx1 und Mal13P1.540 ungekl{\"a}rt. Neben der Vitamin B6 Biosynthese konnten auch einige Gene des Shikimatweges in Plasmodium identifiziert werden. In P. berghei konnten der C-terminale Teil der 3-Dehydroquinatsynthase (2) sowie die Shikimatkinase (5) und die 5-Enoylpyruvylshikimat 3-Phosphatsynthase (6) in einem open reading frame (ORF) identifiziert werden, der dieselbe genetische Organisation aufweisen wie der Arom-Komplex der Hefen. Mit Hilfe eines Komplementationsassay wurde die Funktionalit{\"a}t dieses ORFs {\"u}berpr{\"u}ft. Dazu wurden S. cerevisiae BY4741Δaro1, ein Hefestamm ohne funktionalen Arom-Komplex, mit dem Pb2_6_5_ABC Fragment transformiert. Die so transformierten Hefen waren nicht in der Lage, auf Mangelplatten ohne aromatische Aminos{\"a}uren zu wachsen, was zeigte, dass das Pb2_6_5_ABC Konstrukt den BY4741Δaro1 Ph{\"a}notyp nicht komplementieren konnte. Der Versuch, mit Hilfe des Baculovirussytems rekombiant exprimiertes Protein zu erhalten, verlief erfolglos. Ebenso war es nicht m{\"o}glich, Teile des Proteins f{\"u}r Immunisierungen zu exprimieren. Daher bleibt die Funktionalit{\"a}t des Pb2_6_5_ABC Konstruktes ungekl{\"a}rt.}, subject = {Plasmodium falciparum}, language = {de} } @phdthesis{Hacker2010, author = {Hacker, Christian}, title = {Beteiligung des Major Vault Proteins an der Kernporenkomplexbildung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51279}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {In die Kernmembran von Eukaryoten sind Kernporenkomplexe eingelagert. Diese stellen die einzige Verbindung zwischen dem Nukleo- und Zytoplasma dar und vermitteln den gerichteten Transport von Proteinen und Ribonukleoproteinpartikeln {\"u}ber die Kernh{\"u}lle. Durch vorangehende Versuche unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass es experimentell m{\"o}glich ist, die Bildung einer kontinuierlichen Doppelmembran von der Insertion der Kernporenkomplexe zu trennen (Ewald et al., 1997). Dabei spielen verschiedene im Extrakt enthaltene Membranfraktionen eine Rolle. Erst k{\"u}rzlich wurden in unserer Arbeitsgruppe zwei unterschiedliche Membranfraktionen aus Xenopus Extrakt isoliert, die aufgrund ihrer Dichte als 40\% und 30\% Membranfraktion benannt wurden. Massenspektrometrische Untersuchungen zeigten, dass sich in der 30\% Membranfraktion, welche f{\"u}r die Kernporenkomplexbildung verantwortlich zu sein scheint, das Major Vault Protein (MVP) befindet. MVP ist Hauptbestandteil der Vault-Komplexe, großer tonnenf{\"o}rmiger Ribonukleoproteinpartikel, denen bislang eine Vielzahl von zellul{\"a}ren Funktionen zugeordnet wurden, die meisten davon jedoch noch stark debattiert. Vaults k{\"o}nnten wom{\"o}glich eine Rolle als Transporter {\"u}ber die Kernporenkomplexe spielen und wurden schon mehrfach mit dem Aufbau einer multiplen Arzneimittelresistenz in Verbindung gebracht. Die Beteiligung von MVP bei der Bildung der Kernporenkomplexe ist eine neue zellul{\"a}re Funktion und sollte deshalb in dieser Arbeit n{\"a}her untersucht werden. In dieser Arbeit wurden zun{\"a}chst die 40\% und 30\% Membranfraktionen auf ihr unterschiedliches Verhalten bei der Bildung der Kernh{\"u}lle separat und in Kombination genauer untersucht. Dabei zeigte sich, dass die 40\% Membranfraktion an Chromatin bindet und eine kontinuierliche Doppelmembran aufbaut. Die 30\% Membranfraktion konnte alleine nicht an Chromatin binden, induzierte aber in der durch die 40\% Membranfraktion gebildeten Doppelmembran den Aufbau von Kernporenkomplexen. Durch Immunfluoreszenzaufnahmen und ultrastrukturelle Untersuchungen wurde belegt, dass das an der 30\% Membranfraktion assoziierte MVP f{\"u}r die Bildung von Kernporenkomplexen verantwortlich war. Ferner konnten wir zeigen, dass sowohl MVP als auch Vault-Partikel die de novo Insertion von Kernporenkomplexen in kontinuierliche Doppelmembranen induzieren konnten. Die molekularen Mechanismen der Kernporenkomplexbildung durch MVP wurden mit Hilfe von artifiziellen Lipidmembranen analysiert. Anhand von unilamellaren Liposomen und elektronenmikroskopischen Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass MVP die Lipidstruktur beeinflussen und perforieren kann. Zudem l{\"o}ste MVP die Bildung von Poren in schwarzen Lipidmembranen aus und f{\"u}hrte zur Messung von Str{\"o}men durch Einzelkanalmessungen {\"u}ber die entstandenen Poren. Um die bei dem Prozess der Kernporenkomplexbildung beteiligten Bindungspartner von MVP zu identifizieren, wurden mehrere Protein-Protein-Bindungsstudien durchgef{\"u}hrt. Unter den ermittelten MVP-Bindungspartnern ließen sich keine Nukleoporine mit dem Sequenzmotiv FXFG identifizieren, es ist jedoch nicht auszuschließen, dass MVP bei der Bildung der Kernporenkomplexe mit anderen Nukleoporinen interagiert. Da eine fr{\"u}here Arbeit die Bedeutung von Mikrotubuli bei der Bildung der Kernporenkomplexe aufzeigte (Ewald et al., 2001), wurden in dieser Arbeit die Interaktionen der isolierten 40\% und 30\% Membranfraktionen und von MVP mit dem Mikrotubulinetzwerk n{\"a}her analysiert. Dabei zeigte sich, dass nur die 30\% Membranfraktion mit Mikrotubuli interagierte und eine Inhibition der Mikrotubulipolymerisation durch Colchizin den Einbau von Kernporenkomplexen verhinderte. Im Gegensatz dazu interagierten die 40\% Membranvesikel nicht mit Mikrotubuli und daher hat eine Colchizin-induzierte Inhibition der Mikrotubulipolymerisation keinen Effekt auf den Aufbau einer kontinuierlichen Doppelmembran. Durch immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen konnte zudem gezeigt werden, dass die Lokalisation von MVP an der Kernh{\"u}lle ebenfalls Abh{\"a}ngig von Mikrotubuli ist. Um zu demonstrieren, dass die MVP-induzierte Kernporenkomplexbildung im zellfreien System abh{\"a}ngig vom Transport von MVP zur Kernh{\"u}lle ist, wurde die Zugabe von MVP zu porenlosen Kernen nach einer Colchizin-Behandlung analysiert. Hierbei konnte belegt werden, dass MVP Mikrotubuli auch ben{\"o}tigt, um die Bildung von Kernporenkomplexen in der Kernmembran zu initiieren. Da Mikrotubulifilamente im zellfreien System mit ihren Plus-Enden gegen die Chromatinoberfl{\"a}che gerichtet sind, sollten f{\"u}r den gerichteten Transport zum Chromatin Motorproteine der Kinesin-Familie eine Rolle spielen. Durch die Inhibition von Mklp2, einem mitotischen Kinesin, konnte der Aufbau der Kernporenkomplexe durch MVP in porenlosen Kernen blockiert werden.}, subject = {Ribonucleoproteine}, language = {de} } @phdthesis{Breher2009, author = {Breher, Stephanie}, title = {Die kardiale Funktion von Popdc1 in der Maus: Vom Gen zum Ph{\"a}n}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37283}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Die Popeye domain containing (Popdc)-Gene bilden eine evolution{\"a}r stark konservierte Genfamilie mit pr{\"a}ferenzieller Expression im Herzen und in der Skelettmuskulatur. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Popdc1 in kardialen Myozyten in Glanzstreifen, lateralen Membranen und im T-Tubuli-System exprimiert wird und mit Ionenkan{\"a}len und anderen myozyt{\"a}ren Membranproteinen wie Cav1.2, Caveolin 3 und NCX1 kolokalisiert ist. Im ventrikul{\"a}ren Reizleitungssystem ist die Expression von Popdc1 gegen{\"u}ber dem ventrikul{\"a}ren Arbeitsmyokard erh{\"o}ht, w{\"a}hrend Atrium und Sinusknoten nahezu {\"a}quivalente Expressionsdom{\"a}nen aufweisen. Mithilfe von elektrophysiologischen Untersuchungen konnte bei den Popdc1-Nullmutanten eine stressinduzierte Sinusbradykardie festgestellt werden, die altersabh{\"a}ngig auftritt und auf Sinuspausen zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Histologische Untersuchungen, unter Zuhilfenahme des Sinusknotenmarkers HCN4, zeigten einen Zellverlust im inferioren Teil des Sinusknotens. Popdc1 ist ein Transmembranprotein, das eine 150 Aminos{\"a}ure umfassende, stark konservierte Popeye-Dom{\"a}ne aufweist. F{\"u}r diese Dom{\"a}ne konnte auf struktureller Ebene eine Homologie zu zyklischen Nukleotid-Bindungsdom{\"a}nen vorhergesagt und eine Bindung an cAMP und cGMP experimentell demonstriert werden. Es handelt sich bei den Popdc-Proteinen um einen neuen Zweig der Bindungsproteine f{\"u}r zyklische Nukleotidmonophosphate (cNMP). Die Bindungssequenz weist signifikante Unterschiede zu anderen bereits identifizierten cNMP-Bindungsproteinen auf. Weiterhin wurde die Interaktion von Popdc1 mit TREK1, einem Mitglied der Tandemporenkan{\"a}le untersucht. Es zeigte sich, dass Popdc1 nach Koexpression in Froschoozyten, den TREK1-Strom erh{\"o}ht und dass die \&\#946;-adrenerge Inhibition des TREK1 Kanals durch Popdc1 verst{\"a}rkt wird. Im Arbeitsmyokard, im kardialen Reizleitungssystem und in kotransfizierten Cos7-Zellen werden beide Proteine {\"u}berlappend exprimiert. Diese Daten zeigen, dass Popdc1 eine wichtige Funktion bei der Regulation der Schrittmacheraktivit{\"a}t, der Aufrechterhaltung der Sinusknotenmorphologie und der Modulation von Ionenkan{\"a}len aufweist. Interessanterweise wurden von unserer Arbeitsgruppe bereits die gleichen Ph{\"a}notypen f{\"u}r die Popdc2 Maus beschrieben, sodass die Popdc Genfamilie {\"u}berlappende und redundante Funktionen aufweist.}, subject = {Sinusknoten}, language = {de} } @phdthesis{Heinecke2010, author = {Heinecke, Kai}, title = {Die Dynamik der prim{\"a}ren Erkennungsschritte von BMP-Rezeptoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-49257}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden zusammen mit den Activinen, Growth and Differentiation Factors (GDFs) und Transforming Growth Factor \&\#946; (TGF-\&\#946;) die Transforming Growth Factor \&\#946;-Superfamilie von sekretierten Signalproteinen. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung, Erhaltung und Regeneration von Geweben und Organen. Die Signalvermittlung dieser Proteine erfolgt durch die Bindung von zwei verschiedenen Typen von Serin-/Threonin-Kinaserezeptoren, die als Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren bezeichnet werden. Im ersten Schritt erfolgt die Bindung an den hochaffinen Rezeptor (im Fall von BMP-2 der Typ-I-Rezeptor), im n{\"a}chsten Schritt wird der niederaffine Rezeptor in den Komplex rekrutiert. Bis heute sind lediglich sieben Typ-I- und f{\"u}nf Typ-II-Rezeptoren bekannt, was auf eine Promiskuit{\"a}t in der Liganden-Rezeptor-Interaktion schließen l{\"a}sst. Die Architektur beider Rezeptorsubtypen ist dabei relativ {\"a}hnlich. Beide bestehen aus einer ligandenbindenden extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne, einer Transmembrandom{\"a}ne sowie einer intrazellul{\"a}ren Kinasedom{\"a}ne. Eine nacheinander ablaufende Transphosphorylierung der intrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen f{\"u}hrt zu einer Phosphorylierung von SMAD-Proteinen, die dann als nachgeschaltete Vermittler fungieren und die Transkription regulierter Gene ausl{\"o}sen. Im Hauptteil dieser Arbeit wurden die initialen Schritte der Rezeptorkomplexformierung sowie die Mobilit{\"a}t der Rezeptoren mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass f{\"u}r die Bildung eines Signalkomplexes eine bestimmte Schwellenkonzentration des Liganden n{\"o}tig ist und dass der Mechanismus nach einem Alles-oder-Nichts-Prinzip wie ein Schalter funktioniert. Außerdem konnten Unterschiede in der Nutzung der gleichen Rezeptoren durch verschiedene Liganden festgestellt werden. Die anderen Teile der Arbeit befassen sich mit der Funktionalit{\"a}t der verschiedenen Rezeptordom{\"a}nen in der Signal{\"u}bermittlung, der Analyse von hoch- und niederaffinen Ligandenbindestellen auf ganzen Zellen sowie dem Einfluss des SMAD- und des MAPK-Signalwegs auf die Induktion der Alkalischen Phosphatase. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Art der SMAD-Phosphorylierung allein vom Typ der Kinasedom{\"a}ne abh{\"a}ngig ist, dass auf einer Zelle verschiedene Rezeptorpopulationen existieren, welche von unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen angesprochen werden, und dass die Induktion der Alkalischen Phosphatase stark vom zeitlichen Verlauf der SMAD- und MAPK-Aktivierung abh{\"a}ngig ist.}, subject = {Knochen-Morphogenese-Proteine}, language = {de} } @phdthesis{Gruber2010, author = {Gruber, Franz Andreas}, title = {Untersuchung zur Regulation der Expression des zuckerkonditionierten Verhaltens bei Drosophila melanogaster}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48802}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {In dieser Doktorarbeit habe ich die Regulation der Expression des zuckerbelohnten Verhaltens durch den F{\"u}tterungszustand bei Drosophila melanogaster untersucht. Die Fliegen k{\"o}nnen w{\"a}hrend einer Trainingsphase mit Hilfe einer Zuckerbelohnung auf einen bestimmten Duft konditioniert werden. Nach dem Training k{\"o}nnen die Fliegen dann auf das olfaktorische Ged{\"a}chtnis getestet werden. Die Bereitschaft das zuckerkonditionierte Ged{\"a}chtnis im Test zu zeigen wird vom F{\"u}tterungszustand kontrolliert, wie ich in {\"U}bereinstimmung mit den Ergebnissen fr{\"u}herer Arbeiten demonstrierte (Tempel et al. 1983; Gruber 2006; Krashes et al. 2008). Nur nicht gef{\"u}tterte Fliegen exprimieren das Ged{\"a}chtnis, w{\"a}hrend F{\"u}tterungen bis kurz vor dem Test eine reversibel supprimierende Wirkung haben. Einen {\"a}hnlichen regulatorischen Einfluss {\"u}bt der Futterentzug auch auf die Expression anderer futterbezogener Verhaltensweisen, wie z.B. die naive Zuckerpr{\"a}ferenz, aus. Nachdem ich den drastischen Einfluss des F{\"u}tterungszustands auf die Auspr{\"a}gung des zuckerkonditionierten Verhaltens gezeigt bzw. best{\"a}tigt hatte, habe ich nach verhaltensregulierenden Faktoren gesucht, die bei einer F{\"u}tterung die Ged{\"a}chtnisexpression unterdr{\"u}cken. Als m{\"o}gliche Kandidaten untersuchte ich Parameter, die zum Teil bereits bei verschiedenen futterbezogenen Verhaltensweisen unterschiedlicher Tierarten als „S{\"a}ttigungssignale" identifiziert worden waren (Marty et al. 2007; Powley and Phillips 2004; Havel 2001; Bernays and Chapman 1974; Simpson and Bernays 1983; Gelperin 1971a). Dabei stellte sich heraus, dass weder die „ern{\"a}hrende" Eigenschaft des Futters, noch ein durch Futteraufnahme bedingter Anstieg der internen Glukosekonzentration f{\"u}r die Suppression des zuckerkonditionierten Ged{\"a}chtnisses notwendig sind. Die Unterdr{\"u}ckung der Ged{\"a}chtnisexpression kann auch nicht durch Unterschiede in den aufgenommenen Futtermengen, die als verhaltensinhibitorische Dehnungssignale des Verdauungstrakts wirken k{\"o}nnten, oder mit der St{\"a}rke des s{\"u}ßen Geschmacks erkl{\"a}rt werden. Die Suppression des zuckerbelohnten Verhaltens folgte den Konzentrationen der gef{\"u}tterten Substanzen und war unabh{\"a}ngig von deren chemischen Spezifit{\"a}t. Deshalb wird die Osmolarit{\"a}t des aufgenommenen Futters als ein entscheidender Faktor f{\"u}r die Unterdr{\"u}ckung der zuckerkonditionierten Ged{\"a}chtnisexpression angenommen. Weil nur inkorporierte Substanzen einen Unterdr{\"u}ckungseffekt hatten, wird ein osmolarit{\"a}tsdetektierender Mechanismus im K{\"o}rper 67 postuliert, wahrscheinlich im Verdauungstrakt und/oder der H{\"a}molymphe. Die H{\"a}molymphosmolarit{\"a}t ist als „S{\"a}ttigungssignal" bei einigen wirbellosen Tieren bereits nachgewiesen worden (Bernays and Chapman 1974; Simpson and Raubenheimer 1993; Gelperin 1971a; Phifer and Prior 1985). Deshalb habe ich mit Hilfe genetischer Methoden und ohne die Fliegen zu f{\"u}ttern, versucht {\"u}ber einen k{\"u}nstlich induzierten Anstieg der Trehaloseund Lipidkonzentrationen die Osmolarit{\"a}t der H{\"a}molymphe in Drosophila zu erh{\"o}hen. Eine solche konzentrationserh{\"o}hende Wirkung f{\"u}r Lipide und die Trehalose, dem Hauptblutzucker der Insekten, ist bereits f{\"u}r das adipokinetische Hormon (AKH), das von Zellen der Corpora cardiaca exprimiert wird, nachgewiesen worden (Kim and Rulifson 2004; Lee and Park 2004; Isabel et al. 2005). Es stellte sich heraus, dass die k{\"u}nstliche Stimulierung AKH-produzierender Neurone das zuckerkonditionierten Verhalten tempor{\"a}r, reversible und selektiv unterdr{\"u}ckt. Gleiche Behandlungen hatten keinen Effekt auf ein aversiv konditioniertes olfaktorisches Ged{\"a}chtnis oder ein naives Zuckerpr{\"a}ferenzverhalten. Wie aus dieser Arbeit hervorgeht, stellt wahrscheinlich die Osmolarit{\"a}t des Verdauungstrakts und der H{\"a}molymphe oder nur der H{\"a}molymphe ein physiologisches Korrelat zum F{\"u}tterungszustand dar und wirkt als unterdr{\"u}ckendes Signal. Dass F{\"u}tterungen das zuckerkonditionierte Verhalten und die Zuckerpr{\"a}ferenz supprimieren, die k{\"u}nstliche Stimulation AKH-produzierender Zellen aber selektiv nur die zuckerbelohnte Ged{\"a}chtnisexpression unterdr{\"u}ckt, deutet auf mindestens zwei unterschiedliche „S{\"a}ttigungssignalwege" hin. Außerdem macht es deutlich wie uneinheitlich futterbezogene Verhaltensweisen, wie das zuckerbelohnte Verhalten und die naive Zuckerpr{\"a}ferenz, reguliert werden.}, subject = {Taufliege}, language = {de} } @phdthesis{Fischer2010, author = {Fischer, Matthias}, title = {Der Einfluß der Ribosomale S6 Kinase 2 (RSK2) auf das Neuriten- und Synapsenwachstum in vivo und in Zellkultur}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48341}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {In dieser Arbeit sollte die Funktion der Ribosomalen S6 Kinase 2 (RSK2) auf neuronaler Ebene untersucht werden. Dahingehend gab es, z.B. auf Grund der Ph{\"a}notypen von Fliegen und M{\"a}usen mit Mutationen im entsprechenden Gen oder von Patienten mit Coffin-Lowry-Syndrom (CLS) nur Vermutungen. Es bestand letztlich die Hoffnung, einen Beitrag zur Aufkl{\"a}rung der Pathophysiologie des CLS zu leisten. Es stellte sich auf Grund von Experimenten sowohl in vivo als auch in vitro in verschiedenen Modellsystemen in dieser Arbeit heraus, daß RSK2 einen negativen Einfluß auf das Neuriten- und Synapsenwachstum hat. In kultivierten Motoneuronen f{\"u}hrte der KO von RSK2 zu l{\"a}ngeren Axonen und die {\"U}berexpression eines konstitutiv aktiven RSK2-Konstrukts zu k{\"u}rzeren Axonen. In PC12-Zellen f{\"u}hrte die Expression von konstitutiv aktiven RSK2 Konstrukten zur Verk{\"u}rzung der Neuriten und die Expression eines Kinase-inaktiven RSK2 Konstrukts zu l{\"a}ngeren Neuriten. In vivo war die neuromuskul{\"a}re Synapse bei RSK2-KO M{\"a}usen vergr{\"o}ßert und hatte bei Drosophila rsk Mutanten mehr Boutons. Das RSK2-Protein ist in Motoneuronen der Maus und in {\"u}berexprimierter Form in den Boutons der neuromuskul{\"a}ren Synapse bei Drosophila nachweisbar. Damit wurde zum ersten Mal die Funktion von RSK2 auf neuronaler Ebene beschrieben. Bez{\"u}glich des Mechanismus, wie RSK2 das Nervenwachstum beeinflußt gab es deutliche Hinweise, die daf{\"u}r sprechen, daß RSK2 dies {\"u}ber eine in der Literatur schon h{\"a}ufiger beschriebene Hemmung der MAPK ERK1/2 erreicht. F{\"u}r diese Hypothese spricht die Tatsache, daß die ERK-Phosphorylierung in murinen Motoneuronen und im R{\"u}ckenmark embryonaler M{\"a}use der RSK2-Mutante erh{\"o}ht ist und der Axonwachstumsdefekt durch eine Hemmung von MEK/ERK behoben werden kann. Auch ist die ERK-Phosphorylierung an der murinen Muskel-Endplatte in der Mutante erh{\"o}ht. Zudem zeigen genetische Epistasis-Experimente in Drosophila, daß RSK die Bouton-Zahl {\"u}ber ERK/RL hemmt. RSK scheint also in Drosophila von der Funktion her der RSK2-Isoform in Wirbeltieren sehr {\"a}hnlich zu sein. Ein weiteres wichtiges Ergebnis ist die Beobachtung, daß RSK2 bei Motoneuronen keinen wesentlichen Einfluß auf das {\"U}berleben der Zellen in Gegenwart neurotropher Faktoren hat. M{\"o}glicherweise spielen hier redundante Funktionen der RSK Familienmitglieder eine Rolle. Ein bislang unerkl{\"a}rter Befund ist die reduzierte Frequenz spontaner Depolarisationen bzw. damit einhergehender Ca2+ Einstr{\"o}me bei RSK2-KO Motoneuronen in Zellkultur. Die H{\"a}ufigkeit und Dichte von Ca2+-Kan{\"a}len und aktive Zonen Proteinen war in Motoneuronen nicht von der Anwesenheit des RSK2-Proteins abh{\"a}ngig. Im Hippocampus konnte außerdem das RSK2-Protein pr{\"a}synaptisch in den Moosfaser-Boutons der CA3 Region nachgewiesen werden. Es befindet sich auch in den Pyramidenzellen, aber nicht in den Pyramidenzell-Dendriten in CA3. Bez{\"u}glich der Bedeutung dieser Befunde f{\"u}r die Aufkl{\"a}rung der Pathologie des CLS ist zu folgern, daß der neuro-psychologische Ph{\"a}notyp bei CLS Patienten wahrscheinlich nicht durch reduziertes {\"U}berleben von Neuronen, sondern eher durch disinhibiertes Axonwachstum oder Synapsenwachstum bedingt ist. Dies kann grob sowohl f{\"u}r die peripheren als auch die zentralen Defekte gelten, denn die Synapsen im ZNS und am Muskel sind in ihrer molekularen Ausstattung z.B. im Bereich der Vesikel, der aktiven Zonen oder der Transmitteraussch{\"u}ttung sehr {\"a}hnlich. Weiterhin k{\"o}nnte eine ver{\"a}nderte synaptische Plastizit{\"a}t u.a. an der Moosfaser-Pyramidenzell-Synapse in der CA3 Region des Hippocampus eine Rolle bei den kognitiven und mnestischen Einschr{\"a}nkungen der Patienten spielen. Die Entdeckung, daß aktiviertes ERK bei den beobachteten Effekten eine Rolle spielt kann f{\"u}r die Entwicklung von Therapiestrategien eine wertvolle Erkenntnis sein.}, subject = {Ribosom}, language = {de} } @phdthesis{Deuchert2010, author = {Deuchert, Thomas}, title = {Entwicklung eines experimentellen Systems zur Untersuchung der subzellul{\"a}ren Lokalisierung der Alpha-Methylacyl-CoA-Racemase}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-46495}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Entwicklung eines experimentellen Systems zur Untersuchung der subzellul{\"a}renLokalisierung der Alpha-Methylacyl-CoA-Racemase (AMACR) (Methode der retroviralen Transfektion von transformierten, embryonalen Mausfibroblasten)}, subject = {Alpha-Methylacyl-CoA-Racemase}, language = {de} } @phdthesis{Froehle2009, author = {Fr{\"o}hle, Kerstin}, title = {Mechanismen zur Regulierung der Nestgr{\"o}ße w{\"a}hrend des Koloniewachstums bei Blattschneiderameisen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-46311}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Die Strukturen der Ameisennester, so wird seit einiger Zeit vermutet, entstehen aufgrund eines selbstorganisierten Prozesses, bei dem die einzelne Ameise nur {\"u}ber lokale Informationen verf{\"u}gt, ohne eine {\"U}bersicht {\"u}ber das globale Muster zu haben. Die Gesamtstruktur resultiert demnach viel eher durch multiple Interaktionen, die entweder direkt zwischen den Individuen oder zwischen den Individuen und ihrer Umgebung stattfinden. Ziel dieser Arbeit war es, die Kriterien zu untersuchen, nach denen sich die Blattschneiderameisen w{\"a}hrend des Nestbaus richten, um so die Frage zu beantworten, ob es f{\"u}r die Entstehung der Strukturen nur der Interaktion mit der Umgebung bedarf oder ob direkte soziale Interaktionen auch einen Einfluss darauf haben. Betrachtet wurde dazu die Kontrolle der Nestgr{\"o}ße w{\"a}hrend verschiedener Stadien der Kolonieentwicklung: in der Gr{\"u}ndungsphase, in der die K{\"o}nigin die Entscheidungen alleine und ohne soziale Interaktionen f{\"a}llt; in der darauf folgenden Etablierungsphase, in der Arbeiterinnen entweder alleine oder in kleinen Gruppen die bereits existierenden Strukturen ver{\"a}ndern; sowie im adulten Stadium, in der die Baut{\"a}tigkeit von mehreren Tausend Arbeiterinnen ausgef{\"u}hrt werden kann. K{\"o}niginnen graben unverz{\"u}glich nach dem Hochzeitsflug ein Gr{\"u}ndungsnest, das aus einem vertikalen Tunnel und einer horizontalen Kammer besteht, in welcher die erste Brut und der Pilz gez{\"u}chtet werden. Um ein Gr{\"u}ndungsnest zu graben, muss die K{\"o}nigin zuerst mit ihren Mandibeln kopf{\"u}ber am Boden graben. Hierbei legt sie einen Tunnel an, der einen etwas gr{\"o}ßeren Durchmesser als sie selbst besitzt. Ist dann die gew{\"u}nschte Tunnell{\"a}nge erreicht, so wechselt sie vom vertikalen Tunnel zum horizontalen Kammergraben, worauf anschließend der Tunnel verschlossen wird. Die Frage, die sich nun stellt, ist, wie Atta vollenweideri K{\"o}niginnen die L{\"a}nge des Tunnels bewerten, um den Wechsel zum Kammergraben einzuleiten. Aufgrund der Ergebnisse wird angenommen, dass die K{\"o}niginnen sowohl die L{\"a}nge des Tunnels, wahrscheinlich {\"u}ber Propriozeption, als auch die Grabezeit absch{\"a}tzen und mit einer internen Referenz vergleichen. Wurde demnach weder die erwartete L{\"a}nge noch die maximal schon investierte Zeit erreicht, so fuhren die K{\"o}niginnen fort den Tunnel zu verl{\"a}ngern. Der Wechsel vom Tunnel zum Kammergraben wurde dann eingeleitet, wenn die K{\"o}niginnen, in Abh{\"a}ngigkeit von den jeweiligen Bodenbedingungen, entweder zuerst die erwartete L{\"a}nge oder die zu investierende Zeit erreicht hatten. Daraufhin fingen sie an die Kammer zu bauen, wobei sie die nun ausgegrabenen Lehmpartikel dazu benutzten, den Tunnel zu verschließen. Diese wurden von oben bis unten komplett verschlossen, womit die Kammergr{\"o}ßen von den Tunnell{\"a}ngen abh{\"a}ngig waren. Wurden die K{\"o}niginnen jedoch mit Tunneln konfrontiert, die experimentell {\"u}ber die erwartete L{\"a}nge hinaus verl{\"a}ngert wurden, so wurden diese nicht mehr {\"u}ber die komplette Strecke, sondern in mehreren Teilabschnitten verschlossen. Dies deutet darauf hin, dass bei der Regulierung der Kammergr{\"o}ße ein weiterer Mechanismus involviert ist. Nach 2-3 Monaten schl{\"u}pfen in der Regel die ersten Arbeiterinnen, womit die Kolonie in die Wachstumsphase eintritt. Mit dem Wachsen der Kolonie wird das Gr{\"u}ndungsnest ver{\"a}ndert, wobei die Arbeiterinnen die bereits existierende Pilzkammer vergr{\"o}ßern und neue Tunnel anlegen. Nach welchen Kriterien sie sich dabei richten, war allerdings nicht bekannt. Gezeigt werden konnte, dass Acromyrmex lundi Arbeiterinnen anfangen ein Nest zu vergr{\"o}ßern, wenn sich der frei f{\"u}r die Ameisen zur Verf{\"u}gung stehende Platz innerhalb des Nestes reduziert und dass sie aufh{\"o}ren, wenn wiederum gen{\"u}gend Platz vorhanden ist. Eine Zunahme in der Gruppengr{\"o}ße (1, 2, 6 und 12 Tiere) bewirkte somit, einen proportionalen Anstieg des ausgegrabenen Volumens und damit der Arbeitsleistung der Kolonie. Ob beim Graben aber eher die schon vorhandenen Pilzkammer vergr{\"o}ßert oder neue Tunnel angelegt werden, hing von der Stimuluskombination ab. So bewirkte ein Platzmangel, ausgel{\"o}st durch eine, relativ zur Nestgr{\"o}ße, große Zahl an Arbeiterinnen, das bereits existierende Tunnel verl{\"a}ngert oder neue angelegt wurden. Eine Kammervergr{\"o}ßerung konnte dagegen nur beobachtet werden wenn Pilz vorhanden und der Platz in der Kammer reduziert war. Die Arbeiterinnen reagierten dabei, auf dieselben Stimuli mit denselben Verhaltensmustern, unabh{\"a}ngig davon ob sie alleine oder in einer Gruppe gruben. Je mehr Ameisen sich aber in der Gruppe befanden desto mehr wurden die Kammern zun{\"a}chst vergr{\"o}ßert, wobei sich jedoch keine Korrelation mit der Gruppengr{\"o}ße zeigte. Dies l{\"a}sst darauf schließen, dass die Vergr{\"o}ßerung von den sich gleichzeitig am Graben beteiligenden Ameisen abh{\"a}ngt, die die Kammern so lange vergr{\"o}ßern bis gen{\"u}gend Platz vorhanden ist. Die Zahl der Ameisen die sich jedoch am Graben beteiligen nimmt mit steigender Gruppengr{\"o}ße zu, weswegen die Kammern bei großen Ameisenzahlen gr{\"o}ßer wurden. Gleichzeitig mit dem Vergr{\"o}ßern fingen die Ameisen jedoch an ausgegrabene Lehmpartikel in der Kammer zu deponieren. Dies bewirkte, dass vor allem gr{\"o}ßere Kammern im Nachhinein verkleinert wurden, bis ein bestimmter Abstand zum Pilz erreicht war, bei dem eventuell zwei Ameisen aneinander vorbeilaufen konnten. Somit hatte die Einlagerung der Lehmpartikel in der Kammer zur Folge, dass die Kammergr{\"o}ße im Nachhinein besser dem Pilzvolumen angepasst wurde. {\"A}hnlich wie bei der Kammervergr{\"o}ßerung verhielt es sich beim Anlegen der Tunnel. Auch diese wurden umso breiter je mehr Tiere sich gleichzeitig am Graben beteiligten und wurden dann im Nachhinein durch Einlagerung von Lehmpartikeln auf eine bestimmte Breite reduziert. Zus{\"a}tzlich wurden die Tunnel aber auch umso l{\"a}nger je mehr Ameisen sich in der Gruppe befanden, weshalb die Nestgr{\"o}ße {\"u}ber die Gr{\"o}ße der Gruppe reguliert wurde. Acromyrmex lundi Nester bestehen in der Regel aus einer großen zentralen Pilzkammer und aus mehreren Tunneln, die diese mit der Erdoberfl{\"a}che verbinden. Wie die Ameisen in dem adulten Stadium die Gr{\"o}ße der Pilzkammer regulieren, wurde bisher noch nicht untersucht. Als m{\"o}gliche Kriterien, nach denen sich die Ameisen richten k{\"o}nnten, wurde sowohl das vorhandene Pilzvolumen als auch die Anzahl an Arbeiterinnen in Betracht gezogen. Gezeigt werden konnte, dass die Kammern umso gr{\"o}ßer werden, je mehr Pilzvolumen vorhanden ist. Aufgrund dessen wird angenommen, dass der Pilz beim Bau der Pilzkammer als Vorlage dient und somit das Grabeverhalten r{\"a}umlich organisiert. Eine Erh{\"o}hung der Ameisenzahlen bewirkte dagegen eine Vergr{\"o}ßerung des Nestvolumens durch das Anlegen von Tunneln. Dadurch nahm das insgesamt ausgegrabene Volumen und damit die Grabeaktivit{\"a}t mit der Gr{\"o}ße der Kolonie zu. Allerdings stieg es nicht, wie bei den kleinen Gruppen beobachtet werden konnte, proportional zur Koloniegr{\"o}ße an. Vermutet wird, dass sowohl die Kammer- als auch die Nestvergr{\"o}ßerung {\"u}ber die Individuendichte reguliert wird. Demnach w{\"u}rden die Tiere anfangen zu graben, wenn die Individuendichte {\"u}ber einen Schwellenwert ansteigt und aufh{\"o}ren, wenn die Dichte wiederum unter diesen Schwellenwert f{\"a}llt. Allerdings gibt es Hinweise darauf, dass die Grabeaktivit{\"a}t nicht nur {\"u}ber die Individuendichte, sondern zus{\"a}tzlich noch durch ein rhythmisches Graben in der Nacht geregelt zu sein scheint. Zusammengenommen konnte also gezeigt werden, dass K{\"o}niginnen auf Stimuli in ihrer Umgebung reagieren, indem sie die Tiefe des Gr{\"u}ndungsnestes durch das Absch{\"a}tzen der schon gegrabenen Tunnell{\"a}nge bestimmen. Das Nestgraben erfolgt allerdings nicht nach einem einfachen Stimulus-Antwort-Mechanismus, sondern die K{\"o}niginnen richten sich zus{\"a}tzlich noch nach der Zeit, was einen internen Messfaktor darstellt. Ebenfalls scheint die Kammergr{\"o}ße durch mindestens zwei Mechanismen reguliert zu werden. Somit fließen sowohl bei der Bestimmung der Tunnell{\"a}nge als auch bei der Regulation der Kammergr{\"o}ße mehrere Kriterien in die Entscheidung mit ein. Ebenso wie die K{\"o}niginnen reagieren einzelne Individuen auf unterschiedliche Stimuli in ihrer Umgebung, wodurch unterschiedliche Neststrukturen entstehen k{\"o}nnen. So fangen Ameisen an ein Nest zu vergr{\"o}ßern, wenn sich der zur Verf{\"u}gung stehende Platz innerhalb des Nestes reduziert. W{\"a}chst der Pilz so reduziert sich der Abstand zwischen Pilz und Kammerwand, was f{\"u}r die Tiere ein Signal ist, die Kammer zu vergr{\"o}ßern. Dabei wird der Pilz als Vorlage verwendet, der das Graben r{\"a}umlich organisiert. Ist der Platz innerhalb des Nestes dagegen aufgrund des Koloniewachstums reduziert, so fangen die Arbeiterinnen an Tunnel auszugraben, so dass die Nestgr{\"o}ße der Koloniegr{\"o}ße angepasst wird. Allerdings, so wird vermutet, h{\"a}ngt die Anzahl der sich am Graben beteiligenden Ameisen sowie auch deren Arbeitsleistung von der Gr{\"o}ße der Gruppe ab. Demnach sind die Individuen nicht nur sensitiv auf die Stimuli, die aus ihrer Umgebung kommen, sondern {\"a}ndern ihr Verhalten auch in Abh{\"a}ngigkeit von dem sozialen Umfeld, in dem sie sich befinden.}, subject = {Nestgr{\"o}ße}, language = {de} } @phdthesis{Kukat2007, author = {Kukat, Alexandra}, title = {Mitochondriale Fusions- und Fissionsvorg{\"a}nge am Modellsystem von Mega-Mitochondrien einer rho0-Zelllinie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-26484}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Viele Funktionen der Mitochondrien basieren auf Prozessen, an denen sowohl mitochondriale wie auch kernkodierte Genprodukte beteiligt sind. Durch zahlreiche Interaktionen ist der Einfluss dieser Einzelkomponenten auf das zellul{\"a}re System oftmals nur schwierig erkennbar. Mit Hilfe von rho0 -Zellen, deren Mitochondrien {\"u}ber kein eigenes Genom mehr verf{\"u}gen, kann die mitochondriale Genkomponente ausgeschlossen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zun{\"a}chst die metabolischen, proliferativen und morphologischen Eigenschaften einer rho0-Zelllinie 143B.TK-K7 untersucht, welche durch die Expression einer mitochondrial zielgesteuerten Restriktionsendonuklease hergestellt wurde. W{\"a}hrend der Kultivierung bilden sich im Zytoplasma der 143B.TK-K7-Zellen mit fortlaufender Kultivierungszeit und zunehmenden Azidifizierung des Mediums Mega-Mitochondrien. Diese entstehen sowohl durch zahlreiche Fusionsereignisse als auch einem Schwellen durch vermehrten Wassereinfluss in die Mitochondrienmatrix. Alle Mitochondrien liegen dann als große kugelf{\"o}rmige Strukturen in der Zelle vor und nehmen somit die geringste Oberfl{\"a}che zu einem vorhandenen Volumen ein. Die Entstehung der Mega-Mitochondrien ist dabei abh{\"a}ngig von einer hohen Protonenkonzentration zus{\"a}tzlich zu einer ausreichend großen Menge an Laktat im Medium (Milchs{\"a}ure). Zudem zeigt sich, dass auch in Zellen, welche noch ein mitochondriales Genom besitzen, durch diese Bedingungen die Bildung von Mega-Mitochondrien induziert werden kann. Bei der Entstehung der Mega-Mitochondrien handelt es sich zun{\"a}chst nicht um apoptotische Vorg{\"a}nge, da durch den Austausch des aziden Mediums eine {\"a}ußerst schnelle R{\"u}ckbildung in ein, den rho0-Zellen {\"a}hnliches Mitochondriennetzwerk erfolgt. Metabolische Untersuchungen zeigen, dass f{\"u}r die R{\"u}ckbildung der Mega-Mitochondrien zu einem Netzwerk ausschließlich die im Medium vorhandene Protonenkonzentration ausreichend gering sein muss. Durch immunzytochemische Untersuchungen wurde deutlich, dass sowohl das mitochondriale Fusionsprotein MFN2 wie auch das Fissionsprotein DNM1L w{\"a}hrend der Entstehung und auch R{\"u}ckbildung der Mega-Mitochondrien in punktf{\"o}rmigen Bereichen an der {\"a}ußeren Mitochondrienmembran lokalisieren. Um zu {\"u}berpr{\"u}fen, ob die Bildung der Mega-Mitochondrien durch einer {\"U}berexpression von Proteinen der Fissionsmaschinerie verhindert wird, wurden PAGFP- bzw. EGFP-Fusionsproteine mit hFis1 und DNM1L hergestellt und in die 143B.TK-K7-Zellen transfiziert. Dabei f{\"u}hrt eine verst{\"a}rkte Expression von hFis1 zu aggregierten Mitochondrien, welche zwar anschwellen, nach einem Mediumwechsel jedoch trotzdem bestehen bleiben. Eine {\"U}berexpression von DNM1L hat keinen Einfluss auf die Entstehung und R{\"u}ckbildung der Mega-Mitochondrien. Durch Inhibierung des Tubulin- bzw. Aktin-Zytoskeletts, konnte gezeigt werden, dass eine Zerst{\"o}rung des Tubulin-Zytoskeletts auf die Entstehung und R{\"u}ckbildung der Mega-Mitochondrien keine Auswirkungen hat. Die Untersuchungen zu dem Einfluss des Aktin-Zytoskeletts zeigen, dass die Mega-Mitochondrien ringf{\"o}rmig von dem Aktin-Zytoskelett umgeben sind. Mit Hilfe von Fluoreszenzprotein-Markern f{\"u}r die {\"a}ußere und innere Mitochondrienmembran wurden die Mega-Mitochondrien als Modellsystem f{\"u}r mitochondriale Fusions- und Fissionsstudien verwendet. Somit konnte in der vorliegenden Arbeit mitochondriale Fusion und Fission zum ersten Mal an lebenden Zellen direkt beobachtet werden und f{\"u}hrte nachfolgend zu der Einteilung von Fusionsvorg{\"a}ngen der Mitochondrien in einen Modus 1, bei dem eine zeitlich gekoppelte vollst{\"a}ndige Fusion von sowohl {\"a}ußerer wie auch innerer Membran geschieht und einen Modus 2, bei dem die Fusion der {\"a}ußeren Membranen ohne die Fusion der inneren Membranen erfolgt. In {\"a}hnlicher Weise kann die Fission von Mitochondrien unterteilt werden. In einem als Modus 1 bezeichneten Mechanismus beginnt die R{\"u}ckbildung der Mega-Mitochondrien zun{\"a}chst mit einer Tubulierung der Mitochondrien hin zu langen Mitochondrienschl{\"a}uchen, die einen nur geringen Durchmesser besitzen. Erst dann treten vermehrt zeitlich sehr schnell ablaufende Fissionsvorg{\"a}nge auf. Zus{\"a}tzlich wurde ein Modus 2-Mechanismus der Fission beobachtet, welcher aus einer unvollst{\"a}ndigen Fusion resultiert, bei dem die inneren Membranen noch nicht miteinander verschmolzen sind. Auf elektronenmikroskopischer Ebene finden w{\"a}hrend der Mega-Mitochondrien-Bildung drastische Ver{\"a}nderung von zwiebelringartigen Cristae hin zu einer Abnahme von inneren Membranstrukturen und der elektronendichte im Matrixraum statt. Somit ist im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal eine optische Beobachtung sowohl dieser Bewegungen wie auch von Fusions- und Fissionsprozessen und deren zeitlich Aufl{\"o}sung in vivo mit Hilfe der Mega-Mitochondrien gelungen.}, subject = {Mitochondrium}, language = {de} } @phdthesis{Kukat2008, author = {Kukat, Christian}, title = {Fusion, Fission und Nucleoids in Megamitochondrien}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-30467}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {In rho0-Zellen, die {\"u}ber keine mitochondriale DNA (mtDNA) mehr verf{\"u}gen, entstehen w{\"a}hrend der Kultivierung Megamitochondrien durch endogene Milchs{\"a}ure-Azidifizierung des Kulturmediums. Diese Riesenorganellen bilden sich dabei durch mitochondriale Fusionsereignisse und/oder eine Hemmung der Fission. In Zellen mit mitochondrialem Genom ist es ebenso m{\"o}glich Megamitochondrien durch artifizielles Ans{\"a}uern des Kulturmediums zu induzieren. Diese Erkenntnisse wurden im Rahmen dieser Arbeit als Werkzeug verwendet, um Einblicke in mitochondriale Fusions- und Fissionsereignisse zu erlangen. Zun{\"a}chst wurde die Fusion mitochondrialer Matrixkompartimente mithilfe der photoaktivierbaren Variante des gr{\"u}nen fluoreszierenden Proteins (PA-GFP) untersucht. Hiermit konnte gezeigt werden, dass das Vermischen der Matrixkompartimente nach der Fusion ein sehr schneller Prozess ist. Die Analyse der Bildung und R{\"u}ckbildung der Megamitochondrien erfolgte sowohl konfokal- als auch elektronenmikroskopisch, wobei sich zeigte, dass die Matrix der Riesenorganellen kaum mehr Cristae beinhaltet. Die R{\"u}ckbildung der Megamitochondrien zum normalen Netzwerk ist ein sehr schneller Prozess, bei dem schon nach 15 min keine vergr{\"o}ßerten Organellen mehr sichtbar sind. Dies indiziert, dass der R{\"u}ckbildungsprozess wahrscheinlich durch Ver{\"a}nderungen von verf{\"u}gbaren Proteinen durchgef{\"u}hrt wird, ohne die Induzierung von Proteinneusynthese. Untersuchungen auf ultrastruktureller Ebene zeigten, dass es w{\"a}hrend der R{\"u}ckbildung zur Formation von drei unterschiedlichen Mitochondrientypen kam, die sich in ihrer Morphologie stark unterschieden. Weiterhin wurden vergleichende Studien zur Bildung der Megamitochondrien durchgef{\"u}hrt, bei denen der Einfluss von Atmungsketten-Inhibitoren auf die Bildung von Milchs{\"a}ure-induzierten Riesenorganellen untersucht wurde. Die Resultate deuten f{\"u}r die Megamitochondrieninduktion auf eine Abh{\"a}ngigkeit auf ein intaktes Membranpotential hin. Immunzytochemisch wurde die endogene Lokalisation der mitochondrialen Fusions- und Fissionsproteine Mitofusin 2, hFis1 und Drp1/DNM1L am Modellsystem der Megamitochondrieninduktion aufgekl{\"a}rt. Es zeigte sich, dass diese Proteine punktf{\"o}rmig an der {\"a}ußeren Membran der Riesenorganellen lokalisieren Um das Modellsystem an lebenden Zellen zu nutzen, wurden Vektoren konstruiert, die fluoreszenzmarkierte Proteine der mitochondrialen Fusions- und Fissionsmaschinerie exprimierten. Hiermit konnte einerseits die Lokalisation von Mitofusin 1, Mitofusin 2, hFis1 und Drp1/DNM1L in lebenden Zellen nach Induktion der Megamitochondrien analysiert werden und andererseits der Einfluss der {\"U}berexpression dieser Proteine auf die Bildung der Riesenorganellen dokumentiert werden. Die Ergebnisse machten deutlich, dass nur die {\"U}berepxression von hFis1 die Bildung der Megamitochondrien verhinderte. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Visualisierung und Dynamik mitochondrialer Nucleoids in lebenden Zellen. Nucleoids sind Protein-DNA-Komplexe, in denen mitochondriale Genome organisiert sind. Mit dem Farbstoff PicoGreen gelang es mtDNA in lebenden Zellen zu f{\"a}rben und Dynamikstudien der punktf{\"o}rmigen Strukturen mikroskopisch festzuhalten. W{\"a}hrend sich mtDNA im mitochondrialen Netzwerk nur marginal aufgrund stattfindender Fusions- und Fissionsereignisse bewegte kam es in den Milchs{\"a}ure-induzierten Megamitochondrien zu einer extensiven und extrem schnellen Bewegung von mitochondrialer DNA. In anschließenden Versuchen wurde der mitochondriale Transkriptions- und Verpackungsfaktor TFAM als fluoreszentes Fusionsprotein in Zellen transfiziert und Kolokalisationsstudien zeigten, dass das Fusionsprotein mit mtDNA kolokalisiert. In den Riesenorganellen pr{\"a}sentierten punktf{\"o}rmige TFAM-gef{\"a}rbte Nucleoids ein sehr dynamisches Verhalten mit schneller Bewegung. In rho0-Zellen ohne mitochondriale DNA war die TFAM-Fluoreszenz hingegen gleichm{\"a}ßig verteilt. Ein weiterer Nucleiodbestandteil ist das mitochondriale DNA-Einzelstrangbindeprotein SSBP1, welches in Megamitochondrien ebenso ein sehr dynamisches Verhalten aufwies. Eine mitochondrial-zielgesteuerte und EGFP-markierte Restriktionsendonuklease wies ebenfalls das typische, punktf{\"o}rmige Nucleoidmuster im mitochondrialen Netzwerk auf, was auf eine Interaktion mit der mtDNA schließen l{\"a}sst. In rho0-Zellen ohne mtDNA kam es jedoch zur gleichm{\"a}ßigen Verteilung des Konstruktes in den Mitochondrien. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit sowohl Einblicke in die Biologie der Megamitochondrien gewonnen, als auch Erkenntnisse {\"u}ber die Dynamik mitochondrialer Protein-DNA-Komplexe, wobei der Schwerpunkt hierbei auf einer Analyse mit Hilfe optischer Methoden lag.}, subject = {Mitochondrium}, language = {de} } @phdthesis{Schmitt2008, author = {Schmitt, Johannes}, title = {Proteine der Kernh{\"u}lle und deren Rolle bei der Umgestaltung des Zellkerns meiotischer und postmeiotischer Zellen von S{\"a}ugern}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-31203}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {W{\"a}hrend der Spermatogenese finden erstaunliche Differenzierungsprozessen statt. Reguliert wird die Spermatogenese sowohl hormonell als auch durch Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen und der extrazellul{\"a}rer Matrix. Unterteilt wird die Spermatogenese in drei funktionelle Einheiten. Die Proliferationsphase, die Meiose und die Spermiogenese. Im Laufe der Proliferationsphase gehen aus den Spermatogonien, Spermatocyten hervor, die die Meiose durchlaufen. W{\"a}hrend der Prophase I der Meiose kommt es zur Reduktion und Rekombination des genetischen Materials, was mit charakteristischen und h{\"o}chst dynamischen Bewegungsvorg{\"a}ngen der Telomere einhergeht. Auf die Meiose folgt die Spermiogenese, in der das genetische Material in seine „Transportform" {\"u}berf{\"u}hrt wird und aus einer station{\"a}ren, zellverbundenen Einheit ein mobiles autark funktionierendes Vehikel des genetischen Materials wird; das Spermium. Um das Verst{\"a}ndnis dieser Vorg{\"a}nge zu erweitern wurden in dieser Arbeit die Verteilungsmuster einiger Proteine in der Kernh{\"u}lle von Zellen der Spermatogenese, in Hinblick auf ihre dynamische Umverteilung untersucht. Bei diesen Proteinen handelte es sich um die SUN-Dom{\"a}nen Proteine und das meiosespezifische Lamin C2. Die SUN-Dom{\"a}nen Proteine sind Teil des membrandurchspannenden LINC-Komplexes, der Komponenten des Nukleoplasma mit denen des Cytoplasma verbindet. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die SUN-Dom{\"a}nen Proteine, Sun1 und Sun2 w{\"a}hrend der Meiose exprimiert werden, und an den Anheftungsplatten meiotischer Chromosomen lokalisieren und deren dynamisches Verteilungsmuster dem Verteilungsmuster der Telomere w{\"a}hrend der Prophase I der Meiose entsprechen. Dies deutet darauf hin, dass Sun1 und Sun2 eine tragende Rolle, w{\"a}hrend der koordinierten Bewegungsprozessen der Prophase I der Meiose spielen. In der Spermiogenese sind die SUN-Dom{\"a}nen Proteine, Sun1 und Sun3 vertreten. Dabei weist deren unterschiedliche Lokalisation an entgegengesetzten Zellpolen darauf hin, dass Sun1 und Sun3 m{\"o}glicherweise unterschiedliche Funktionen bei der Umgestaltung des Spermienkopfes w{\"a}hrend der Spermiogenese erf{\"u}llen. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung einer Mauslinie um die Rolle von Lamin C2 in der Meiose untersuchen zu k{\"o}nnen. Hierzu wurde eine Lamin C2 Knock-out Studie begonnen. In ersten Untersuchungen der knock-out Tiere konnte eine Gr{\"o}ßenreduktion der Hoden beobachtet werden. Ebenso konnte ein Abbruch der Meiose vermerkt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass sowohl die SUN-Dom{\"a}nen Proteine, als auch Lamin C2, wichtige Rollen in dem komplexen Arrangement der Spermatogenese {\"u}bernehmen.}, subject = {Meiose}, language = {de} } @phdthesis{Klaeckta2009, author = {Kl{\"a}ckta, Christian}, title = {Biochemische und -physikalische Charakterisierung von rekombinanten Porinen aus den beiden pathogenen Bakterien Nocardia farcinica und Vibrio cholerae sowie von nativen Porinen aus drei Streptomyces Arten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-38910}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Die vorliegende Dissertation beschreibt detaillierte biochemische und biophysikalische Untersuchungen von rekombinanten Porinen aus den beiden pathogenen Bakterien Nocardia farcinica und Vibrio cholerae sowie von nativen Porinen aus drei Streptomyces Arten. F{\"u}r die beiden pathogenen Vertreter sind bereits impermebable Zellwandstrukturen beschrieben worden (Daffe et al., 1993; Rodriguez-Torres et al., 1993). F{\"u}r Streptomyces Arten ist keine vergeichbare, definierte {\"a}ußere Zellwandbarriere bekannt. Im Fall von S. griseus konnten dennoch undefinierte, kovalente Lipidverkn{\"u}pfungen mit der Peptidoglykanschicht nachgewiesen werden (Kim et al., 2001). Daher besteht die Notwendigkeit des Transports von N{\"a}hrstoffen und anderer Molek{\"u}le auch bei Streptomyces Arten durch porenformende Proteine, so genannte Porine. Unter Porinen versteht man wassergef{\"u}llte Kan{\"a}le, die in zwei Klassen unterteilt werden k{\"o}nnen: allgemeine Diffusionsporen und substratspezifische Porine. Allgemeine Diffusionsporen filtern entsprechend der molekularen Masse der gel{\"o}sten Substrate und weisen ein lineares Verh{\"a}ltnis zwischen Translokationsrate und Substratkonzentrationsgradient auf. Dagegen kann der Transport bestimmter Substanzen durch spezifische Porine mit einer Substrat-Bindestelle im Kanal durch die Michaelis-Menten-{\"a}hnliche Kinetik beschrieben werden. Diese Kan{\"a}le erm{\"o}glichen den schnellen Influx bestimmter Klassen von Substraten.}, subject = {Porine}, language = {de} } @phdthesis{Hoehn2009, author = {H{\"o}hn, Katharina}, title = {Genotyp-Ph{\"a}notyp Korrelation bei Fanconi An{\"a}mie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37542}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Die Fanconi An{\"a}mie (FA) stellt eine sowohl genetisch als auch ph{\"a}notypisch {\"a}ußerst heterogene, autosomal rezessiv und X-chromosomal vererbte Erkrankung dar. Sie ist gekennzeichnet durch chromosomale Instabilit{\"a}t, ein chronisch progredientes Knochenmarkversagen, multiple kongenitale Fehlbildungen und eine Pr{\"a}disposition zu diversen Neoplasien. Auf zellul{\"a}rer Ebene ist die FA durch eine erh{\"o}hte spontane Chromosomenbr{\"u}chigkeit sowie einer Hypersensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber DNA-sch{\"a}digenden Agenzien charakterisiert. Bislang konnten 13 Komplementations-gruppen (FA-A bis FA-N) und ihre jeweiligen Gene identifiziert werden. Die FA-Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der Reparatur von DNA-Doppelstrang-br{\"u}chen. Die breite genetische Heterogenit{\"a}t der Fanconi An{\"a}mie und die große Anzahl privater Mutationen, aufgrund derer kaum interindividuelle Vergleiche m{\"o}glich sind, erschweren eine Genotyp-Ph{\"a}notyp Korrelation ebenso wie der compound-heterozygote Mutationsstatus vieler FA-Patienten. Bisherige Untersuchungen weisen darauf hin, dass die Art der jeweiligen Mutation einen gr{\"o}ßeren Einfluß auf die ph{\"a}notypische Auspr{\"a}gung der Erkrankung hat als die Art des betroffenen Gens. Zus{\"a}tzlich zeichnet die Fanconi An{\"a}mie eine große ph{\"a}notypische Variabilit{\"a}t aus, die sich in h{\"o}chst unterschiedlichen Krankheitsauspr{\"a}gungen und -verl{\"a}ufen {\"a}ußert. Um aussagekr{\"a}ftige Genotyp-Ph{\"a}notyp Korrelationen etablieren zu k{\"o}nnen, bedarf es einer ausreichenden Anzahl von FA-Patienten, bei denen sowohl die Komplementationsgruppe als auch die zugrunde liegende Mutation eindeutig definiert wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden exemplarisch die Krankheitsverl{\"a}ufe einiger Patienten (4 x FA-A, 1 x FA-B, 3 x FA-C, 1 x FA-D2 und 2 x FA-G) analysiert und mit den jeweiligen molekulargenetischen Befunden korreliert. Im Anschluss daran wurden in der Literatur beschriebene Genotyp-Ph{\"a}notyp Korrelationen erl{\"a}utert, verschiedene Mechanismen der ph{\"a}notypischen Variabilit{\"a}t dargestellt und abschließend pr{\"a}gnante Kasuistiken nochmals hervorgehoben.}, subject = {Fanconi-An{\"a}mie}, language = {de} } @phdthesis{Glaser2008, author = {Glaser, Stefanie}, title = {Untersuchung des RNA-Kernexportes im Modellsystem Xenopus laevis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37474}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Der eukaryotische Initiationsfaktor 5A (eIF5A) ist evolution{\"a}r hoch konserviert und besitzt als einzig bislang bekanntes Protein die Aminos{\"a}uremodifikation Hypusin. Obwohl eIF5A ubiquit{\"a}r exprimiert wird, sind die zellul{\"a}ren Funktionen von eIF5A noch weitgehend unklar. Hypusininhibitoren konnten die Oberfl{\"a}chenexpression von CD83 die CD83 mRNA im Zellkern dendritischer Zellen anreichern und folglich die Oberfl{\"a}chenexpression von CD83 verhindern konnten, wurde eine Beteiligung von eIF5A beim nukleozytoplasmatischen Export der CD83 mRNA vermutet. Weiterhin ist bekannt, dass HuR, ein Protein der ELAV-Familie, an ein cis-aktives RNA-Element mit einer ausgepr{\"a}gten Sekund{\"a}rstruktur innerhalb der kodierenden Sequenz der CD83 mRNA bindet. W{\"a}hrend die Bindung von HuR an AU-reiche Elemente in der 3UTR bestimmter Transkripte zu deren Stabilisierung f{\"u}hrt, wird die Stabilit{\"a}t von CD83-Transkripten durch die Interaktion mit HuR jedoch nicht beeinflusst. In dieser Arbeit wurden Mikroinjektionsstudien in Xenopus laevis-Oozyten zum nukleozytoplasmatischen Export von CD83 mRNA durchgef{\"u}hrt. Es konnte gezeigt werden, dass die charakteristische Sekund{\"a}rstruktur des HuR-Response-Elements essentiell f{\"u}r den Kernexport von CD83-Transkripten ist. HuR wurde zudem als Bindungspartner von eIF5a identifiziert. Inhibitorische Antik{\"o}rper sowohl gegen HuR als auch eIF5A waren in der Lage, den Export von CD83-Transkripten zu inhibieren. W{\"a}hrend die meisten mRNAs durch den TAP/NXT1-vermittelten Exportweg in das Zytoplasma transportiert werden, transloziert CD83 mRNA CRM1-vermittelt, da der Export durch den CRM1-Inhibitor Leptomycin B gehemmt werden konnte. Oozytentypischer TFIIIA, ebenfalls ein Interaktionspartner von eIF5A, ist in jungen Xenopus-Oozyten sowohl bei der RNA-Polymerase III-abh{\"a}ngigen Transkription von 5S rRNA als auch am nukleozytoplasmatischem Export und der Lagerung von 5S rRNA im Zytoplasma beteiligt. Aufgrund der Parallele zwischen dem HIV-1-Rev vermittelten HIV-1-mRNA-Export und dem TFIIIA-vermittelten 5S rRNA-Export, wurde der Export von TFIIIA im Hinblick auf eine Beteiligung von eIF5A als Kofaktor analysiert. In Xenopus-Oozyten wurde TFIIIA an den nukleoplasmatischen Filamenten der Kernporenkomplexe detektiert. Weiterhin konnte durch den Einsatz des spezifischen CRM1-Inhibitors Leptomycin B best{\"a}tigt werden, dass TFIIIA, welches ein leucinreiches Kernexportsignal enth{\"a}lt, mittels CRM1 exportiert wird. Im Overlay-Blot-Assay konnte gezeigt werden, dass eIF5A mit TFIIIA interagiert. Außerdem deuten Mikroinjektionsexperimente darauf hin, dass eIF5A, wie beim HIV-1-Rev-vermittelten Export, auch beim TFIIIA-Export als essentieller Kofaktor involviert ist. Ein weiterer bekannter Bindungspartner von eIF5A ist Aktin, das im Zellkern an verschiedenen Exportprozessen sowie der RNA-Polymerase I-, II- und III-abh{\"a}ngigen Transkription beteiligt ist. Im Gegensatz zu Aktin wurde die Existenz des Aktinpartners Myosin im Zellkern erst vor kurzem realisiert. In dieser Arbeit konnten durch bioinformatische Analysen gezeigt werden, dass Kernmyosin IC bei Vertebraten weit verbreitet ist. Es wurde auch bei Xenopus laevis identifiziert. Im Vergleich zu Myosin IC fand sich ein zus{\"a}tzlicher Aminoterminus aus 16 Aminos{\"a}uren, welcher als Kernlokalisationssignal fungiert. In Oozyten von Xenopus laevis konnte Kernmyosin IC, {\"a}hnlich wie RNA-Polymerase II, an den lateralen Schleifen der Lampenb{\"u}rstenchromosomen dargestellt werden. Inhibierende Kernmyosinantik{\"o}rper f{\"u}hrten nach Mikroinjektion in den Zellkern von Xenopus-Oozyten zu einer kompletten Retraktion der meisten lateralen transkriptionsaktiven Schleifen sowie zu einer Verk{\"u}rzung der Chromosomenachsen. konnte Kernmyosin IC vor allem im Nukleoluskern detektiert werden, wo es partiell mit RNA-Polymerase I und Fibrillarin kolokalisierte. In amplifizierten Nukleolen f{\"u}hrte eine Transkriptionsinhibition mit Aktinomycin D zu einer Umverteilung des Kernmyosin IC zusammen mit der RNA-Polymerase I und der rDNA. Nach Injektion inhibierender Kernmyosinantik{\"o}rper kam es zu einem massiven architektonischen Umbau der Nukleolen. Im Gegensatz zu den Nukleolen von somatischen Xenopus-Zellen war ein BrUTP-Einbau in amplifizierte Nukleolen jedoch noch m{\"o}glich. Wie f{\"u}r Kernaktin bereits beschrieben, konnte auch Kernmyosin IC an den nukleoplasmatischen Filamenten der Kernporenkomplexe von Xenopus laevis-Ooyzten dargestellt werden. Da Aktin als essentieller Kofaktor an Exportprozessen beteiligt ist, sollte in Mikroinjektionsexperimenten auch eine Beteiligung von Kernmyosin IC beim Kernexport {\"u}berpr{\"u}ft werden. Antik{\"o}rper gegen ein Epitop in der Myosinkopfdom{\"a}ne des Kernmyosin IC (XNMIC \#42) waren im Gegensatz zu Antik{\"o}rpern, die den charakteristischen Aminoterminus aus 16 Aminos{\"a}uren erkennen (XNMIC \#54), in der Lage, einen CRM1-vermittelten Proteinexport zu inhibieren.}, subject = {RNS}, language = {de} } @phdthesis{Herrmann2009, author = {Herrmann, Petra}, title = {Entwicklung und Evaluierung neuer Methoden zur Analyse des Proteoms von Listeria monocytogenes in infizierten Wirtszellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37500}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {In dieser Arbeit wurden neue Methoden zur Analyse des Proteoms von Listeria monocytogenes in infizierten Wirtszellen entwickelt und evaluiert. Proteomische Analysen k{\"o}nnen im Vergleich zu transkriptomischen Analysen durch Erfassung von Proteinmengen und eventuell auch posttranslationalen Modifikationen, sowie von Abbauprozessen ein genaueres Abbild des Funktionszustands einer Zelle unter unterschiedlichen Umweltbedingungen darstellen. Das Hauptproblem bei proteomischen Untersuchungen an in eukaryontischen Wirtszellen gewachsenen Bakterien, n{\"a}mlich die {\"U}berlagerung des bakteriellen Proteinmusters durch die im {\"U}berschuss vorhandenen Wirtszellproteine, musste in dieser Arbeit {\"u}berwunden werden. Es wurde eine Methode etabliert, intrazellul{\"a}r gewachsene Bakterien {\"u}ber Bindung an paramagnetische Partikel („Beads") und anschließende Magnetseparation selektiv von Wirtszellkomponenten abzutrennen. Dabei wurden drei Beads-Varianten mit unterschiedlicher Beschichtung gew{\"a}hlt: Dynabeads anti Listeria (Dynal, Oslo), Kieselgel \&\#61483; Magnetit Beads (MERCK in Entwicklung), Dynabeads M-270 Epoxy - CBD Beads (Beschichtung mit Phagenlysin Ply 118). Hierbei konnte nur f{\"u}r die Kieselgel + Magnetit Beads eine hinreichende Isolierungsrate f{\"u}r die Methode der 2-D-Gelelektrophorese von 6-7* 10**7 Listerien/ Zellkulturflasche erreicht werden. Im 2-D-Proteingel zeigte sich jedoch eine starke Streifenbildung, wodurch sich dieser Ansatz als nicht auswertbar erwies. In einem alternativen Ansatz gelang es, aus Infektionen an J774-Makrophagen, die Listerien mittels konsekutiver Waschschritte von Wirtszellproteinen aufzureinigen. Es konnten aus den Infektionen 30-50 µg listerielles Protein isoliert und zweidimensional aufgetrennt werden, wobei das Proteinpattern qualitativ eindeutig dem von in vitro gewachsenen Listeria monocytogenes entsprach. Auf diese Weise konnten 38 Proteine von Listeria monocytogenes, welche von Listerien w{\"a}hrend der Infektion in Makrophagen induziert oder reprimiert werden anhand der Deta-2-D Software identifiziert, quantifiziert und statistisch ausgewertet werden. F{\"u}r einige der hier mittels der neu entwickelten Methode identifizierten Proteine konnte anhand der der vorliegenden Literatur (zu Transkriptom, Sekretom, Virulenz von Listeria) bereits eine Beteiligung am Virulenzgeschehen nachgewiesen werden. Zum jetzigen Zeitpunkt unterliegt die proteomische Analyse einigen Limitierungen, z.B. beim Nachweis von schwach exprimierten, stark alkalischen, stark hydrophoben, hochmolekularen und niedermolekularen Proteinen, so dass die derzeitige Methodik noch nicht das gesamte Proteom abdecken kann. Dass die „klassischen" Virulenzfaktoren pathogener Listerien, Listeriolysin O (LLO), die Phospholipasen PlcA und PlcB, sowie ActA hier nicht erfasst wurden, ist darin begr{\"u}ndet, dass es sich um sekretierte Proteine handelt. Besondere Bedeutung kommt der Beobachtung zu, dass nur in ganz wenigen F{\"a}llen (z.B. Pgm, ClpP, Pgi, TrxB, MurC) die nachgewiesenen intrazellul{\"a}ren Ver{\"a}nderungen der Proteinmenge mit den von anderen publizierten Transkriptionsdaten {\"u}bereinstimmen. Diese Diskrepanzen stellen keine Artefakte dar, sondern sind durch intrazellul{\"a}re posttranskriptionelle Mechanismen begr{\"u}ndet. Insgesamt zeigte auch diese Proteinanalyse , dass bei Replikation von Listeria monocytogenes im Cytosol eukaryontischer Wirtszellen zahlreiche komplexe Anpassungen von teils zentralen aber auch peripheren Stoffwechselwegen und Biosynthesen der Bakterien an dieses spezielle Milieu ablaufen.}, subject = {Listeria monocytogenes}, language = {de} } @phdthesis{Busch2009, author = {Busch, Sebastian}, title = {Morphologie und Organisation individueller oktopaminerger Neurone im Gehirn von Drosophila m.}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-36203}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Das biogene Amin Oktopamin moduliert verschiedene Verhaltensweisen in Invertebraten. In verschiedenen Insektenspezies, wie Heuschrecken, Grillen oder Schaben, ist die Funktion und die Architektur des peripheren oktopaminergen Systems auf Einzelzellebene bekannt. Um die zellul{\"a}re Grundlage f{\"u}r die verschiedenen Funktionen von Oktopamin im Zentralnervensystem zu verstehen, ist eine detaillierte Analyse der Architektur des zentralen oktopaminergen Systems notwendig. Innerhalb meiner Doktorarbeit fertigte eine anatomische Karte individueller oktopaminerger Neurone des adulten Hirns von Drosophila an. Ich nutzte die Flp-out Technik, um einzelne oktopaminerge Neurone anzuf{\"a}rben. Anhand ihrer Projektionsmuster konnte ich 28 verschiedene Zelltypen in vier Oktopamin-immunoreaktiven Zellclustern identifizieren. Ihre Morphologie sowie die Verteilung genetischer Marker zeigte, dass die meisten Zelltypen mehrere Neuropile innervieren und dabei eine klare Trennung von Pr{\"a}- und Postsynaptischen Regionen aufweisen. Die Mehrheit der Zelltypen bildet dendritische Verzweigungen in einer bestimmten Region, der posterioren Slope. Jedoch innerviert jeder Zelltyp stereotyp eine bestimmte Kombination von Zielregionen im Gehirn. Das deutet stark darauf hin, dass oktopaminerge Neurone kombinatorisch organisiert sind: Jedes individuelle Neuron scheint Komponente eines spezifischen neuronalen Schaltkreises zu sein. Dabei k{\"o}nnte jeder Zelltyp eine Art "Modul" darstellen, das selektiv bestimmte Funktionen in den jeweiligen Zielregionen moduliert. Das oktopaminerge Mittelliniencluster des Sub{\"o}sophagealen Ganglions zeigt eine besondere zellul{\"a}re Organisation. Es besteht aus gepaarten und ungepaarten Neuronen, die des Zentralgehirn mit extensiven Verzweigungen versorgen. Um die Ordnung hinter dieser komplexen Organisation zu verstehen, wurden die segmentale Organistion der Mittellinienneurone auf Einzelzellebene analysiert und ihre embryonalen Anlagen verglichen. Letzteres erm{\"o}glichte die morphologische Analyse von einzelnen oktopaminergen Mittellinienklonen. OA-VPM und OA-VUM Neurone bilden zusammen drei Subcluster im Sub{\"o}sophagealen Ganglion, die wahrscheinlich die drei gnathalen Neuromere repr{\"a}sentieren. Alle OA-VUM Neurone stammen von der embryonalen Mittellinie ab. In den mandibularen und maxillaren Neuromeren formen sie morphologisch identische Zelltypen, mit stereotypen Innervationsmustern. OA-VPM Neurone gehen nicht aus der embryonalen Mittellinie hervor und sind nicht segmental dupliziert. Diese Arbeit vermittelt nicht nur einen Eindruck {\"u}ber die Architektur individueller oktopaminerger Neurone, sondern auch {\"u}ber die Organisation des oktopaminergen Systems auf Einzelzellebene.}, subject = {Drosophila}, language = {de} } @phdthesis{Stoll2009, author = {Stoll, Sascha}, title = {Funktionelle Analyse von Blochmannia floridanus, dem prim{\"a}ren Endosymbionten der Rossameise Camponotus floridanus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37238}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Ameisen der Gattung Camponotus beherbergen bakterielle Symbionten der Gattung Blochmannia in spezialisierten Zellen des Mitteldarms (Blochmann, 1882; Buchner, 1965; Sauer, 2000; Schr{\"o}der et al., 1996). Die Genomsequenzierung dieser Symbionten zeigte, dass Blochmannia, {\"a}hnlich den Symbionten von Blattl{\"a}usen, haupts{\"a}chlich Gene der Aminos{\"a}urebiosynthese beibehalten hat (Degnan et al., 2005; Gil et al., 2003). Die Relevanz dieser nahrungsaufwertenden Funktion konnte experimentell best{\"a}tigt werden (Feldhaar et al., 2007). Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Aufkl{\"a}rung der dynamischen Interaktion der beiden Partner w{\"a}hrend des komplexen Lebenszyklus des holometabolen Wirtes. Fr{\"u}here Studien deuteten darauf hin, dass die Symbiose vor allem w{\"a}hrend der Larven- und Puppenphasen von Bedeutung sein k{\"o}nnte (Feldhaar et al., 2007; Wolschin et al., 2004; Zientz et al., 2006). Mit fluoreszenter in situ Hybridisierung (FISH) und konfokaler Laserscanning Mikroskopie konnte in der vorliegenden Arbeit die Lokalisierung von B. floridanus w{\"a}hrend der wichtigsten Entwicklungsstadien aufgekl{\"a}rt werden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Symbionten schon im ersten Larvenstadium in spezialisierten Zellen um den Darm angeordnet sind, aber in sp{\"a}teren Stadien nicht, wie bisher angenommen, auf diese Bakteriozyten beschr{\"a}nkt sind, sondern bis zum Schlupf der jungen Arbeiterinnen massiv andere Darmzellen infizieren. {\"U}bereinstimmend mit Bestimmungen der Zellzahl in den verschiedenen Wirtsstadien ist die Anzahl der Symbionten gegen Ende der Metamorphose am h{\"o}chsten. Die Symbiose degeneriert in sehr alten Arbeiterinnen, gut gef{\"u}llte Bakteriozyten werden jedoch noch monatelang beibehalten. Mit Macroarray- und qRT- PCR- basierten Transkriptomanalysen wurde die Expression der bakteriellen Gene in charakteristischen Entwicklungsstadien des Wirtes untersucht. Allgemein zeigen vor allem Gene f{\"u}r molekulare Chaperons und bestimmte bakterielle Grundfunktionen eine hohe Expression. Aber auch viele Gene, die m{\"o}glicherweise wichtige Funktionen in der Symbiose besitzen, wie die Biosynthese essentieller Aminos{\"a}uren und das Recycling von Stickstoffverbindungen, zeigen ein hohes absolutes Transkriptlevel. Zudem besteht eine positive Korrelation zwischen dem Expressionsniveau und dem GC- Gehalt der Gene, die in dem h{\"o}heren Selektionsdruck und damit einer geringeren Mutationsrate der essentiellen Gene begr{\"u}ndet liegt (Schaber et al., 2005). Durch Proteinanalysen konnte best{\"a}tigt werden, dass die Faktoren mit der h{\"o}chsten absoluten Transkription die dominanten Proteine der Symbionten darstellen. In den unterschiedlichen Entwicklungsstadien zeigen viele Gene eine deutliche Dynamik, deren Ausmaß aber, verglichen mit freilebenden Bakterien, gering ist. Aus den Expressionsprofilen aufeinanderfolgender Gene lassen sich m{\"o}gliche Transkriptionseinheiten ableiten, die teilweise auch experimentell best{\"a}tigt wurden. Oftmals zeigen auch Gene, die nicht in Transkriptionseinheiten angeordnet sind, aber verwandten Stoffwechselwegen angeh{\"o}ren, {\"a}hnliche Muster. Dies deutet auf das Vorhandensein grundlegender Genregulations-mechanismen hin, obwohl im Genom von B. floridanus nur noch sehr wenige Transkriptionsfaktoren codiert sind (Gil et al., 2003). Auf {\"u}bergeordneter Ebene zeigt sich, dass bei Symbionten aus sp{\"a}ten Puppenstadien viele symbioserelevante Gene im Vergleich zu Genen des Grundmetabolismus eine erh{\"o}hte Expression zeigen. Dies betrifft besonders die Biosynthese aromatischer und verzweigter Aminos{\"a}uren, die in diesen Stadien vom Wirt in hoher Menge ben{\"o}tigt werden, w{\"a}hrend die internen Reserven gleichzeitig zur Neige gehen. Dies {\"a}ußert sich auch im deutlichen Abfallen der Speicherproteinmenge des Wirts gegen Ende der Puppenphase. Die festgestellte Ver{\"a}nderung der Symbiontenzahl {\"u}bertrifft das geringe Ausmaß der Genregulation um ein Vielfaches. Die Bakterien liegen in jedem Stadium polyploid mit bis zu 100 Genomkopien vor, dieser Polyploidiegrad bleibt jedoch w{\"a}hrend der gesamten Wirtsentwicklung weitestgehend konstant. Somit scheint die Kontrolle des Wirts {\"u}ber die bakterielle Vermehrung der entscheidende Faktor dieser Symbiose zu sein. Die verbleibenden regulatorischen F{\"a}higkeiten der Bakterien stellen m{\"o}glicherweise eine Feinjustierung von optimierten Produktionseinheiten dar, deren Anzahl nach den Bed{\"u}rfnissen des Wirtes ver{\"a}ndert wird. Insgesamt konnten in der vorliegenden Arbeit neue Einblicke in das komplexe Zusammenleben von Blochmannia und Camponotus gewonnen werden, die zu einem besseren Verst{\"a}ndnis der biologischen Funktion und der grundlegenden Mechanismen dieser Symbiose f{\"u}hren. Eine der wichtigsten Fragestellungen nach dem Sinn einer nahrungsaufwertenden Symbiose f{\"u}r einen Nahrungsgeneralisten konnte mit starken Hinweisen auf eine stadienabh{\"a}ngige Relevanz der Symbiose beantwortet werden, die den enormen evolution{\"a}ren Erfolg dieser Ameisengattung erkl{\"a}ren k{\"o}nnte.\&\#8195;}, subject = {Intrazellul{\"a}re Symbiose}, language = {de} } @phdthesis{Mueller2009, author = {M{\"u}ller, Nicole}, title = {Entwicklung antigenabh{\"a}ngig aktivierbarer TNF-Ligand-Fusionsproteine}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-36489}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Von TRAIL, FasL und APRIL, drei Mitgliedern der TNF-Liganden-Familie, ist bekannt, dass Trimerstabilit{\"a}t und Oligomerisierungsstatus maßgeblich das Rezeptoraktivierungspotential dieser Liganden beeinflussen. F{\"u}r die immunstimulatorischen TNF-Liganden CD27L, CD40L, OX40L, 41BBL und GITRL war hingegen vor der Durchf{\"u}hrung dieser Arbeit praktisch nicht bekannt, inwieweit Trimerbildung, Stabilisierung und Oligomerisierung wichtig f{\"u}r deren Aktitvit{\"a}t sind. Dies wurde in dieser Arbeit systematisch untersucht. CD40L besaß bereits als trimeres Molek{\"u}l eine hohe Aktivit{\"a}t, die durch sekund{\"a}re Oligomerisierung nur wenig gesteigert wurde. Die spezifische Aktivit{\"a}t konnte durch Stabilisierung mit Hilfe der Tenascin-C (TNC)-Trimerisierungsdom{\"a}ne nur geringf{\"u}gig gesteigert werden. CD27L war als l{\"o}sliches Flag-markiertes sowie als hexameres Fc-Protein selbst nach Quervernetzen nicht in der Lage, seinen Rezeptor CD27 zu binden und zu aktivieren. Die TNC-stabilisierte trimere Form des CD27L hingegen induzierte nach Oligomerisierung mit einem anti-Flag-Antik{\"o}rper ein starkes Signal. Trimerer OX40L und trimerer 41BBL konnten nur in oligomerisierter Form ihre Rezeptoren aktivieren, wobei die Aktivit{\"a}t der TNC-stabilisierten Form signifikant st{\"a}rker ausgepr{\"a}gt war. GITRL aktivierte seinen Rezeptor bereits als stabilisiertes Trimer und Hexamer, die Aktivit{\"a}t konnte durch Quervernetzen nur gering gesteigert werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass CD27L, OX40L und 41BBL zu der Untergruppe der TNF-Ligandenfamilie geh{\"o}rt, f{\"u}r die eine Stabilisierung des trimeren Molek{\"u}ls und dessen Oligomerisierung n{\"o}tig sind, um eine starke Rezeptoraktivierung zu erm{\"o}glichen. Im Gegensatz dazu zeigten CD40L und GITRL bereits oligomerisierungsunabh{\"a}ngig eine hohe Aktivit{\"a}t. GITRL ben{\"o}tigte allerdings die Stabilisierung des trimeren Molek{\"u}ls durch die TNC-Dom{\"a}ne, um gute Aktivit{\"a}t zu zeigen. Im Weiteren wurden Antik{\"o}rperfragment (scFv-)-TNF-Ligand-Fusionsproteine konstruiert und untersucht, die ein Zelloberfl{\"a}chenantigen binden. Eine starke Zelloberfl{\"a}chenantigen-spezifische Aktivierung des jeweiligen Rezeptors konnte f{\"u}r scFv-41BBL und f{\"u}r scFv-OX40L gezeigt werden, wohingegen scFv-CD40L und scFv-GITRL bereits auf antigennegativen Zellen stark aktiv waren. scFv-CD27L war selbst auf antigenpositiven Zellen inaktiv. Verwendet man an Stelle des Antik{\"o}rperfragments eine extrazellul{\"a}re Proteinbindedom{\"a}ne, z.B. die eines TNF-Rezeptors, erh{\"a}lt man Fusionsproteine, die zum einen eine selektive Aktivierung der TNF-Ligandendom{\"a}ne und somit die Aktivierung des korrespondierenden Rezeptors auf der Zielzelle erm{\"o}glichen, zum anderen aber durch die Bindung an den membranst{\"a}ndigen Liganden dessen Aktitv{\"a}t neutralisieren k{\"o}nnen. F{\"u}r CD40-, RANK- und B7-2-FasL konnte der immobilisationabh{\"a}ngige Aktivierungseffekt auf entsprechenden Zelloberfl{\"a}chenmolek{\"u}l-exprimierenden Zellen gezeigt werden. Anhand von T47D-Zellen, die durch eine autokrine CD40L-CD40-Signalschleife vor Apoptose gesch{\"u}tzt sind, konnte gezeigt werden, dass durch die Bindung von CD40-FasL an membranst{\"a}ndigen CD40L die CD40L-CD40-Interaktion gest{\"o}rt und gleichzeitig Apoptose verst{\"a}rkt induziert werden kann. Das Prinzip der antigenabh{\"a}ngigen Aktivierung von TNF-Liganden k{\"o}nnte Anwendung in der Tumortherapie finden, da bei Verwendung entsprechender selektiv exprimierter Marker eine lokale Rezeptoraktivierung erreicht und so Nebenwirkungen minimiert werden k{\"o}nnen.}, subject = {Rekombinantes Protein}, language = {de} } @phdthesis{Porps2008, author = {Porps, Patrick}, title = {Erh{\"o}hte Lebenserwartung und Resistenz gegen{\"u}ber oxidativem Stress in Maus-Prion-Protein (PrP)-exprimierenden Drosophila melanogaster}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-36171}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {{\"U}bertragbare spongiforme Enzephalopathien (TSE) wie Scrapie beim Schaf, die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) beim Rind oder die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen sind fortschreitende neurodegenerative Erkrankungen, die nach langer Inkubationszeit zum Tod f{\"u}hren. Die protein only-Hypothese besagt, dass das infekti{\"o}se Agens „Prion" teilweise oder vollst{\"a}ndig aus dem zellul{\"a}ren Prion-Protein (PrPC) besteht und nach Infektion des Organismus die Konversion von PrPC in die pathogene Isoform (PrPSc) verursacht. Die der Krankheit zugrunde liegenden neuropathologischen Mechanismen und die physiologische Funktion von PrPC sind bisher unbekannt. Es wurden jedoch eine neuroprotektive Funktion oder eine m{\"o}gliche Rolle im Zusammenhang mit der oxidativen Stress Hom{\"o}ostase postuliert. In dieser Arbeit wurden transgene Drosophila melanogaster-Linien als Modell zur Untersuchung der Funktion von PrPC etabliert. Unter Verwendung des Expressionssystems UAS/GAL4 exprimierten die Fliegen entweder wildtypisches PrP (wt-PrP) oder eine trunkierte, krankheits-assoziierte Mutante PrP\&\#916;32-134 (tr-PrP), der die potentielle neuroprotektive Octarepeat-Dom{\"a}ne entfernt wurde. Wt-PrP transgene Fliegen zeigten nach Vergleich mit Kontrolllinien eine signifikante, um 20\% erh{\"o}hte allgemeine Lebenserwartung. Obwohl die Expression von tr-PrP in Drosophila zu keinen nachweisbaren neuropathologischen Ver{\"a}nderungen f{\"u}hrte, wurde die Lebensspanne um 8\% reduziert. Ko-Expression von wt-PrP und tr-PrP konnte diesen Effekt nicht komplementieren, was eine chronische Toxizit{\"a}t der trunkierten Form nahelegt, die in diesem Zusammenhang der Neuroprotektion {\"u}bergeordnet ist. Da Lebenserwartung und Stressresistenz eng miteinander korrelieren, wurden die Fliegen den reaktiven Sauerstoffspezies Wasserstoffperoxid, Sauerstoff und Paraquat ausgesetzt, um auf drei unabh{\"a}ngigen Wegen oxidativen Stress zu induzieren. In der Tat vermittelt wt-PrP eine signifikante Stressresistenz, wohingegen tr-PrP-exprimierende Tiere eine normale Anf{\"a}lligkeit offenbarten, die jedoch teilweise durch Ko-Expression beider PrP-Formen komplementiert werden konnte. Hier erscheint die protektive Funktion von wt-PrP der Toxizit{\"a}t der Deletionsmutante {\"u}bergeordnet zu sein. Diese Daten belegen eine wichtige Funktion des Prion-Proteins bez{\"u}glich der Abwehr von oxidativem Stress. Essentiell ist dabei die Kupfer-bindende Octarepeat-Dom{\"a}ne, durch die m{\"o}glicherweise Fenton-{\"a}hnliche Reaktionen, die bei der Sauerstoff-Radikalsynthese eine wichtige Rolle spielen, inhibiert werden k{\"o}nnten. Konsistent damit ist die Beobachtung des Verlusts der erworbenen Stressresistenz nach Expression der Octarepeat-losen Mutante tr-PrP und die signifikante Reduktion der Lebenserwartung {\"u}ber einen bislang unaufgekl{\"a}rten Mechanismus. Das Drosophila PrP-Modell bietet die M{\"o}glichkeit, die physiologische Funktion von PrP detailliert zu untersuchen. Außerdem ist die Identifizierung unbekannter PrP-Interaktionspartner erm{\"o}glicht, um Signaltransduktionswege des PrP und die zugrunde liegenden neurodegenerativen Mechanismen aufzukl{\"a}ren.}, subject = {Prion}, language = {de} } @phdthesis{Mueller2009, author = {M{\"u}ller, Stefanie}, title = {Funktionale und molekulare Charakterisierung des ArsRS Zweikomponenten-Systems sowie der Response-Regulatoren HP1021 und HP1043 von Helicobacter pylori}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-36263}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Bakterien sind in der Lage, sich schnell an wechselnde Umweltbedingungen anzupassen. Eine wichtige Rolle bei der Wahrnehmung von verschiedensten Umweltreizen und der zellul{\"a}ren Antwort spielt die Genregulation durch Zweikomponenten-Systeme. Gut charakterisiert ist das ArsRS Zweikomomponenten-System in H. pylori, welches an der Ausbildung der S{\"a}ureresistenz beteiligt ist und dem Bakterium so die Kolonisierung der Magenschleimhaut erm{\"o}glicht. Die Histidin-Kinase ArsS wird in Gegenwart von S{\"a}ure aktiviert und phosphoryliert den Response-Regulator ArsR, der die Transkription von Target-Genen reguliert. In der periplasmatischen Sensordom{\"a}ne der Histidin-Kinase ArsS sind sieben Histidinreste vorhanden, die aufgrund ihres pKa-Wertes von 6,0 bei Absenken des pH Wertes von pH 7 auf pH 5, was eine Aktivierung der Histidin-Kinase zur Folge hat, protoniert werden k{\"o}nnten. Es konnte gezeigt werden, dass der Histidinrest H94 der periplasmatischen Sensordom{\"a}ne einen wesentliche Rolle bei der S{\"a}urewahrnehmung durch die Histidin-Kinase ArsS spielt. Die Einf{\"u}hrung einer positiv geladenen AS an dieser Position allein reicht jedoch nicht aus, um die Kinase zu aktivieren, weshalb unklar bleibt, ob eine Protonierung des Histidinrestes H94 in vivo die S{\"a}urewahrnehmung vermittelt. Weiterhin konnten Indizien darauf erhalten werden, dass neben dem Histidinrest H94 noch weitere Aminos{\"a}uren an der S{\"a}urewahrnehmung durch die Histidin-Kinase beteiligt sind. Der Aspartatrest D124 leistet unter den negativ geladenen AS vermutlich den gr{\"o}ßten Beitrag zur S{\"a}urewahrnehmung. In den mit H. pylori nahe verwandten Arten Helicobacter hepaticus, Wolinella succinogenes und Campylobacter jejuni sind Orthologe zu dem ArsRS Zweikomponenten-System vorhanden. Um zu untersuchen, ob es sich bei der S{\"a}urewahrnehmung durch die Histidin-Kinase ArsS um eine spezifische Anpassung von H. pylori an sein Habitat handelt oder ob S{\"a}ure einen allgemeinen Stimulus der ArsS-orthologen Kinasen darstellt, wurden Mutanten im genetischen Hintergrund von H. pylori G27 konstruiert, in welchen die Histidin-Kinase ArsS durch die orthologen Kinasen HH1608, CJ1262 und WS1818 substituiert wurde. Durch Transkriptionsstudien konnte gezeigt werden, dass die Kinase WS1818 eine gesteigerte Aktivit{\"a}t bei saurem pH-Wert aufweist. Auch die Kinase HH1607 kann S{\"a}ure als einen Umweltreiz wahrnehmen, jedoch deutlich weniger effektiv als die Kinasen ArsS und WS1818. Ob die Zweikomponenten-Systeme HH1608/HH1607 und WS1817/WS1818 in vivo in H. hepaticus und W. succinogenes an der Wahrnehmung von S{\"a}ure und evtl. an der Ausbildung einer S{\"a}ureresistenz beteiligt sind, ist unklar, da {\"u}ber die Funktion dieser Zweikomponenten-Systeme bisher nichts bekannt ist. Die Kinase CJ1262 ist nicht in der Lage, S{\"a}ure als einen Umweltreiz wahrzunehmen. Die beiden Response-Regulatoren HP1043 und HP1021 spielen vermutlich eine Rolle bei der Regulation von Genen, deren Produkte eine wichtige Funktion f{\"u}r das vegetative Zellwachstum haben. Die Aktivit{\"a}t der beiden RR wird entgegen dem g{\"a}ngigen Zweikomponenten-System-Paradigma nicht {\"u}ber eine Phosphorylierung moduliert. In der vorliegenden Arbeit wurde analysiert, ob eine strikte Expressionskontrolle f{\"u}r die wachstumsassoziierten Funktion dieser Response-Regulatoren von Bedeutung ist. Zu diesem Zweck wurden verschieden Mutanten konstruiert, in welchen die Transkription der Gene hp1021 und hp1043 unter der Kontrolle von unterschiedlich regulierten Promotoren stattfindet. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression des Gens hp1043 sowohl transkriptionell als auch posttranskriptionell und/oder posttranslational strikt reguliert wird. Es kann deshalb postuliert werden, dass die Aktivit{\"a}t des RR HP1043 {\"u}ber die vorhandene Konzentration an Regulator in der Bakterienzelle beeinflusst wird. Die Expression des Gens hp1021 wird nicht strikt reguliert. Auf welche Weise die Aktivit{\"a}t des RR HP1021 moduliert wird, bleibt unklar.}, subject = {Helicobacter pylori}, language = {de} }