@phdthesis{Bauchart2010,
  author    = {Bauchart, Philippe Michel Paul},
  title     = {Evaluation of the Zoonotic Risk of Escherichia coli Strains involved in Extraintestinal Infections of Humans and Animals. Characterization of New Virulences Factors in ExPEC},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48848},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) represent a subset of the so-called extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) pathotype that can cause various extraintestinal infections in humans and animals. APEC are the causative agent of localized colibacillosis or systemic infection in poultry. In this latter case, the syndrome starts as an infection of the upper respiratory tract and develops into a systemic infection. Generally, ExPEC are characterized by a broad variety of virulence-associated factors that may contribute to pathogenesis. Major virulence factors, however, that clearly define this pathotype, have not been identified. Instead, virulence-associated genes of ExPEC and thus also of APEC could be used in a mix-and-match-fashion. Both pathotypes could not be clearly distinguished by molecular epidemiology, and this suggested a hypothetical zoonotic risk caused by APEC. Accordingly, the main scientific question of this study was to characterize common traits as well as differences of APEC and human ExPEC variants that could either support the possible zoonotic risk posed by these pathogenic E. coli strains or indicate factors involved in host specificity. Comparative genomic analysis of selected APEC and human ExPEC isolates of the same serotype indicated that these variants could not be clearly distinguished on the basis of (i) general phenotypes, (ii) phylogeny, (iii) the presence of typical ExPEC virulence genes, and (iv) the presence of pathoadaptive mutations. Allelic variations in genes coding for adhesins such as MatB and CsgA or their regulators MatA and CsgD have been observed, but further studies are required to analyze their impact on pathogenicity. On this background, the second part of this thesis focused on the analysis of differences between human ExPEC and APEC isolates at the gene expression level. The analysis of gene expression of APEC and human ExPEC under growth conditions that mimick their hosts should answer the question whether these bacterial variants may express factors required for their host-specificity. The transcriptomes of APEC strain BEN374 and human ExPEC isolate IHE3034 were compared to decipher whether there was a specific or common behavior of APEC and human ExPEC, in response to the different body temperatures of man (37°C) or poultry (41°C). Only a few genes were induced at 41 °C in each strain relative to growth at 37 °C. The group of down-regulated genes in both strains was markedly bigger and mainly included motility and chemotaxis genes. The results obtained from the transcriptome, genomic as well as phenotypic comparison of human ExPEC and APEC, supports the idea of a potential zoonotic risk of APEC and certain human ExPEC variants. In the third part of the thesis, the focus was set on the characterization of Mat fimbriae, and their potential role during ExPEC infection. Comparison of the mat gene cluster in K-12 strain MG1655 and O18:K1 isolate IHE3034 led to the discovery of differences in (i) DNA sequence, (ii) the presence of transcriptional start and transcription factor binding sites as well as (iii) the structure of the matA upstream region that account for the different regulation of Mat fimbriae expression in these strains. A negative role of the H-NS protein on Mat fimbriae expression was also proven at 20 °C and 37 °C by real-time PCR. A major role of this fimbrial adhesin was demonstrated for biofilm formation, but a significant role of Mat fimbriae for APEC in vivo virulence could not yet be determined. Interestingly, the absence of either a functional matA gene or that of the structural genes matBCDEF independently resulted in upregulation of motility in E. coli strains MG1655 and IHE3034 by a so far unknown mechanism. In conclusion, the results of this thesis indicate a considerable overlap between human and animal ExPEC strains in terms of genome content and phenotypes. It becomes more and more apparent that the presence of a common set of virulence-associated genes among ExPEC strains as well as similar virulence gene expression patterns and phylogenetic backgrounds indicate a significant zoonotic risk of avian-derived E. coli isolates. In addition, new virulence factors identified in human ExPEC may also play a role in the pathogenesis of avian ExPEC.},
  subject      = {Escherichia coli},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Konradt2010,
  author    = {Konradt, Christoph},
  title     = {Cross-talk between Shigella and cells of the adaptive immunity: The TTS effector IpgD inhibits T cell migration},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55397},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Shigellosis, or bacillary dysentery, is a rectocolitis caused by the gram-negative, enteroinvasive bacteria of the genus Shigella. Shigellosis still remains a major public health burden with an estimated 80 million cases of bloody diarrhoea and 700.000 deaths per year, primarily in children under the age of 5. Shigella disrupts, invades, and causes inflammatory destruction of the colonic epithelium in humans through virulence effectors secreted by the type III secretion apparatus (TTSA). In contrast to the Shigella-induced manipulation of the host innate immune response, the impact of Shigella on the adaptive immunity has been poorly studied thus far. In order to understand why the naturally induced protective humoral response requires several infections to be primed and is of short duration, the work presented here investigates if Shigella is able to directly interact with T cells. Indeed, it has been shown that Shigella was able to invade and proliferate inside T cells. Furthermore, Shigella was able to inhibit T cell migration through a TTSA effector. Moreover, the Shigella effector IpgD, a phosphoinositide 4-phosphatase that specifically dephosphorylates phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate (PIP2) into phosphatidylinositol-(5)-monophosphate (PI(5)P), was identified as the effector responsible for the observed inhibition. It could be demonstrated that IpgD was responsible for a reduction of intracellular PIP2 levels in T cells. Further experiments showed a reduced level of phosphorylated ezrin, radixin and moesin (ERM) proteins in infected, as well as with IpgD transfected, T cells. The ERM protein family plays an imported role in signal transduction and motility and their activity is closely related to the binding of PIP2. Therefore, the low level of PIP2 leads to a dephosphorylation of the ERM proteins which inhibits T cells response to chemokine stimulation. Indeed, IpgD transfected T cells show a reduced ability to re-localise the ERM proteins upon chemokine stimulation. Targeting T cell motility, via TTSA effectors, could explain the low level of specific T cell priming during Shigella infection. This is the first report of Shigella induced manipulation of T cell function and on the inhibition of T cell migration by a bacterial effector.},
  subject      = {Medizinische Mikrobiologie},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Siegl2009,
  author    = {Siegl, Alexander},
  title     = {Einzelzell-basierte Methoden zur Charakterisierung Schwamm-assoziierter Bakterien},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37443},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Schw{\"a}mme (Phylum Porifera) sind der {\"a}lteste rezente Tierstamm der Erde. Insbesondere marine Vertreter dieser sessilen Invertebraten sind oftmals mit einem mikrobiellen Konsortium assoziiert, welches hochgradig wirtsspezifisch und phylogenetisch divers ist. Die Biomasse dieser Mikroflora kann dabei rund die H{\"a}lfte der Masse eines Schwamms ausmachen. Die Komplexit{\"a}t des Konsortiums sowie der Mangel an kultivierbaren Vertretern der Schwamm-spezifischen Kladen erschwert dabei eine gezielte funktionelle Charakterisierung. Von besonderem Interesse hierbei ist das exklusiv in marinen Schw{\"a}mmen vorzufindende Candidatus Phylum Poribacteria, f{\"u}r das bislang kein kultivierter Vertreter vorliegt. Die metabolisch aktiven und hochabundanten Poribakterien liegen in der extrazellul{\"a}ren Matrix des Schwammes vor und zeichnen sich durch das Vorhandensein einer Nukleoid-{\"a}hnlichen intrazellul{\"a}ren Struktur aus. Ziel dieser Promotionsarbeit war es, neue Einzelzell-basierte Methoden auf das Gebiet der funktionellen Charakterisierung von Bakterien anzuwenden, welche spezifisch mit dem mediterranen Schwamm Aplysina aerophoba assoziiert sind. Dabei wurden sowohl kultivierungs-abh{\"a}ngige, als auch kultivierungs-unabh{\"a}ngige Versuchsans{\"a}tze verfolgt. Das Hauptaugenmerk dieser Studien lag dabei auf dem Candidatus Phylum Poribacteria. W{\"a}hrend auf dem ‚dilution-to-extinction'-Prinzip beruhende Hochdurchsatz-Kultivierungen nicht zum Erhalt einer Schwammsymbionten-Reinkultur f{\"u}hrten, konnten durch eine Kombination aus FACS-Vereinzelung von Schwamm-assoziierten Bakterien und anschließenden Einzel-Genom-Amplifizierungen (‚whole genome amplifications') umfassende Einblicke in die metabolischen Kapazit{\"a}ten von Schwammsymbionten gewonnen werden. Ferner gelang durch die Anwendung dieser neuen kultivierungs-unabh{\"a}ngigen Methode eine spezifische Verkn{\"u}pfung von Phylogenie und Funktion Schwamm-assoziierter, nicht-kultivierbarer Bakterien. So konnte im Rahmen dieser Dissertation eine neue nicht-ribosomale Peptidsynthetase (NRPS) einem Vertreter einer Schwamm-spezifischen Chloroflexi-Klade zugewiesen werden. Ferner gelang die Zuordnung einer exklusiv in marinen Schw{\"a}mmen vorgefundenen Polyketidsynthase (Sup-PKS) zu den Poribacteria. Die Klonierung von hochmolekularer, Einzel-Genom-amplifizierter DNA in Cosmide gew{\"a}hrte zudem Einblicke in den genomischen Kontext dieser, mit dem bakteriellen Sekund{\"a}rmetabolismus assoziierten Gene. Die Pyrosequenzierung eines amplifizierten, von einem einzelnen Poribakterium abstammenden Genoms f{\"u}hrte zudem zum Erhalt von rund zwei Megabasen an genetischer Information {\"u}ber diese Schwammsymbionten. Dadurch wurden detaillierte Informationen {\"u}ber den poribakteriellen Prim{\"a}r- und Sekund{\"a}rstoffwechsel gewonnen. Die Auswertung der automatisch annotierten 454-Daten erlaubte die Rekonstruktion von Stoffwechselwegen, so z.B. der Glykolyse oder des Citratzyklus und best{\"a}tigte das Vorhandensein eines Sup-PKS-Gens im poribakteriellen Genom. Ferner konnten Gemeinsamkeiten mit den Schwesterphyla Planctomycetes, Chlamydiae und Verrucomicrobia gefunden werden. Zudem zeigte die vergleichende Analyse mit einem poribakteriellen Referenzklon aus einer bestehenden Metagenombank die genomische Mikroheterogenit{\"a}t innerhalb dieses Phylums. Nicht zuletzt konnte die Auswertung der poribakteriellen 454-Sequenzierung eine Reihe von m{\"o}glichen Symbiose-Determinanten aufdecken, die beispielsweise am Austausch von Metaboliten zwischen den Interaktionspartnern beteiligt sind. Die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit stellen die Basis f{\"u}r eine gezielte und detaillierte funktionelle Beschreibung einzelner Bakterien innerhalb komplexer mikrobieller Konsortien dar, wie sie in marinen Schw{\"a}mmen vorzufinden sind. Dieser Studie gew{\"a}hrte erstmalig umfassende Einblicke in das genomische Potential der nicht-kultivierten, Schwamm-assoziierten Poribacteria. Weiterf{\"u}hrende Einzelzell-basierte Experimente werden in Zukunft dazu beitragen, das Bild von der Interaktion zwischen Bakterien und eukaryontischen Wirten zu komplettieren.},
  subject      = {Genomik},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Donat2009,
  author    = {Donat, Stefanie},
  title     = {Molekulare und funktionelle Charakterisierung der Serin/Threonin-Proteinkinase PknB und -Phosphatase Stp in Staphylococcus aureus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-41893},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Um {\"A}nderungen in seiner Umwelt wahrnehmen zu k{\"o}nnen, ben{\"o}tigt S. aureus unterschiedliche Signaltransduktionssysteme. In dieser Arbeit wurde erstmals die Eukaryoten-{\"a}hnliche Serin/Threonin-Proteinkinase (STPK) PknB umfassend charakterisiert. Die posttranslationale Proteinmodifikation mittels Phosphorylierung spielt sowohl in Eukaryoten als auch in Prokaryoten eine wichtige Rolle. Man glaubte lange, dass die Phosphorylierung von Serin-, Threonin- und Tyrosinresten ein nur auf Eukaryoten beschr{\"a}nkter Regulationsmechanismus ist. Dagegen wurde die Phosphorylierung an Histidin- und Aspartatresten durch die Zweikomponenten-Systeme allein den Prokaryoten zugeordnet. Die Genomanalysen der letzten Jahre identifizierten jedoch STPKs und Serin/Threonin-Proteinphosphatasen (STPP) in nahezu allen prokaryotischen Genomen. Auch S. aureus codiert f{\"u}r eine STPK, die eine hohe Homologie zu den beschriebenen STPKs aufweist. In dieser Arbeit wurden mittels Microarray-Analyse einer \&\#916;pknB-Mutante im Stamm 8325 erste Hinweise zur Funktion von PknB als Regulator der Zellwandsynthese sowie zentraler Stoffwechselwege gewonnen. Es wurden mittels Phosphopreoteom-Analysen in vivo-Substrate identifiziert und weiterhin die Kinase biochemisch charakterisiert.},
  subject      = {Staphylococcus aureus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Putze2009,
  author    = {Putze, Johannes},
  title     = {Studien zur Verbreitung und genetischen Struktur des Colibactin-Genclusters in Enterobacteriaceae},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-47259},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Horizontaler Gentransfer zwischen Bakterien - sogar zwischen verschiedenen Spezies - ist ein wichtiger Mechanismus f{\"u}r den Austausch genetischer Information. Dies kann dem Rezipienten einen selektiven Vorteil verleihen, z. B. durch die schnelle Aneignung von Genclustern, die f{\"u}r Pathogenit{\"a}ts- oder Fitnessfaktoren kodieren. Die Variabilit{\"a}t bakterieller Genome durch Aneignung und Inkorporation genetischen Materials in das Genom tr{\"a}gt somit erheblich zur Evolution von Bakterien bei. Bakterielle Genome neigen allerdings dazu, nutzlose genetische Information zu verlieren und daher kann horizontal erworbener DNA h{\"a}ufig eine distinkte biologische Funktion zugeordnet werden. Das Colibactin-Gencluster, welches zuerst in Escherichia coli gefunden wurde, weist mehrere Charakteristika einer horizontal erworbenen genomischen Insel auf. Die Gr{\"o}ße dieser genomischen Insel betr{\"a}gt 54 kb und sie umfasst 20 offene Leseraster (ORFs), von denen acht f{\"u}r putative Polyketidsynthasen (PKS), nichtribosomale Peptidsynthasen (NRPS) und Hybride dieser kodieren. Colibactin {\"u}bt einen zytopathischen Effekt (CPE) auf eukaryotische Zellen in vitro aus. Nach Kokultivierung Colibactin-Gencluster-positiven Bakterien mit eukaryotischen Zellen kommt es zu DNA Doppelstrang Br{\"u}chen, Zellzyklus-Arrest in der G2-Phase, Megalozytose und schließlich zum Zelltod. Diese Effekte sind mit denen des Zyklomodulins „Cytolethal Distending Toxin" (CDT) vergleichbar, allerdings konnte die biologische Funktion des Colibactins in vivo bisher nicht aufgekl{\"a}rt werden. Das Colibactin-Gencluster wurde bisher nur in Escherichia coli St{\"a}mmen der phylogenetischen Gruppe B2 als individuelle genomische Insel, integriert im tRNA-asnW-Gen, vorgefunden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte das Colibactin-Gencluster auch in E. coli der phylogenetischen Gruppe B1 und in Citrobacter koseri, Enterobacter aerogenes und Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae nachgewiesen werden. In diesen Bakterienst{\"a}mmen ist das Colibactin-Gencluster Teil eines genetischen Elements, das {\"A}hnlichkeit zu integrativen und konjugativen Elementen (ICE) aus E. coli und K. pneumoniae aufweist. Im Gegensatz zur hochkonservierten Integrationsstelle des Colibactin-Genclusters in tRNA-asnW in E. coli der phylogenetischen Gruppe B2 konnte die Integrationsstelle dieses ICE in E. coli der Gruppe B1 in tRNA-asnU bestimmt werden. In Bakterienst{\"a}mmen der Spezies K. pneumoniae subsp. pneumoniae wurden vier verschiedene Integrationsstellen in f{\"u}nf analysierten St{\"a}mmen identifiziert. Neben der Studien zur Verbreitung und chromosomalen Integration des Colibactin-Genclusters wurden Kolonisierungsstudien im murinen streptomycinbehandelten Intestinaltrakt mit E. coli Stamm Nissle 1917 durchgef{\"u}hrt, um eine m{\"o}gliche Funktion des Colibactins im Darmtrakt n{\"a}her zu untersuchen. Weder in nicht-kompetitiven noch in kompetitiven Versuchsdurchf{\"u}hrungen konnte dabei ein Kolonisierungsvorteil durch Colibactin nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass das Colibactin-Gencluster in verschiedenen Spezies der Enterobacteriaceae vorhanden und funktional ist. Das Auftreten dieses sowohl als individuelle genomische Insel als auch als Teil eines ICE veranschaulicht die genetische Plastizit{\"a}t dieses Elements und die Bedeutung des horizontalen Transfers genetischen Materials. Die biologische Funktion des Colibactins in vivo bleibt weiterhin unklar und k{\"o}nnte sowohl die bakterielle Fitness als auch die Virulenz beeinflussen.},
  subject      = {Enterobacteriaceae},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Dude2009,
  author    = {Dude, Marie-Adrienne},
  title     = {Die Expression der Multiadh{\"a}sionsdom{\"a}nenproteine PfCCp5 und PfFNPA in Plasmodium falciparum und Cysteinprotease-Inhibitoren als potentielle Wirkstoffe gegen Malaria},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-45863},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Der Erreger der Malaria tropica, Plasmodium falciparum, ist f{\"u}r eine j{\"a}hrliche Todesrate von {\"u}ber einer Million Menschen verantwortlich. Rasch zunehmende Erregerresistenzen gegen g{\"a}ngige Antimalariamedikamente und das Fehlen eines Impfstoffes machen die Suche nach neuen therapeutischen Ans{\"a}tzen und Medikamenten unerl{\"a}sslich. Sexualstadienspezifische Oberfl{\"a}chenproteine des Parasiten sind attraktive Zielstrukturen f{\"u}r die Entwicklung von TBV, welche eine Entwicklung von P. falciparum in der M{\"u}cke unterbrechen. Die Suche nach multiplen tier- oder bakterien{\"a}hnlichen, extrazellul{\"a}ren Adh{\"a}sionsdom{\"a}nen im Genom von P. falciparum f{\"u}hrte zur Identifizierung einer Familie von sechs Proteinen mit hochkonservierten Adh{\"a}sionsmodulen, die vermutlich an Parasit-Parasit- oder Parasit-Wirtsinteraktionen beteiligt sind, was sie zu potentiellen Kandidaten f{\"u}r Komponenten von TBV macht. Aufgrund ihrer gemeinsamen LCCL-Dom{\"a}ne wurden diese Proteine PfCCp1 bis PfCCp5 sowie PfFNPA benannt. PfFNPA besitzt keine LCCL-Dom{\"a}ne, es ist jedoch {\"a}hnlich aufgebaut wie PfCCp5 und wurde daher mit in die PfCCp-Familie integriert. Die in der parasitophoren Vakuole reifer Gametozyten lokalisierenden PfCCp1- bis PfCCp3-Proteine werden w{\"a}hrend der Gametogenese teilweise freigesetzt und umgeben matrix{\"a}hnlich entstehende Exflagellationszentren. In PfCCp2- und PfCCp3-defizienten Parasiten ist die Wanderung der Sporozoiten aus den Mitteldarmoozysten in die Speicheldr{\"u}sen der M{\"u}cke blockiert. Sexualstadien-spezifische Expression und eine wichtige Funktion bei der Entwicklung des Erregers in der M{\"u}cke sind die Hauptkriterien f{\"u}r potentielle TBV-Kandidaten. Diese viel versprechenden Daten waren Anlass, in der vorliegenden Arbeit, die bisher nur hypothetischen PfCCp5- und PfFNPA-Proteine genauer zu untersuchen. Expressionsstudien von PfCCp5 und PfFNPA mittels RT-PCR, Western-Blot-, Immunfluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopischen-Analysen zeigten, dass sie sowohl plasmamembranassoziiert in der parasitophoren Vakuole als auch intrazellul{\"a}r in reifen Gametozyten exprimiert werden. Beide Proteine sind in Gameto-zyten ab dem Stadium II detektierbar und weisen in unreifen Gametozyten ein punktiertes Expressionsmuster auf. In reifen Gametozyten konzentriert sich ihre Expression dagegen v. a. auf die Zellpole. Ferner werden PfCCp5 und PfFNPA auf der Oberfl{\"a}che von Makrogameten, jedoch nicht in Mikrogameten und Ookineten exprimiert. Zus{\"a}tzlich wird PfCCp5 in einem Teil reifer Schizonten eines gametozyten-bildenden Parasiten-Stammes exprimiert. Durch Integration eines Komplementations-Konstukts in die 3-untranslatierte Region von PfCCp5 bzw. PfFNPA konnte gezeigt werden, dass beide Gene genetisch manipulierbar sind. Mit PfCCp5- bzw. PfFNPA-KO-Konstrukten transfizierte WT-Parasiten wachsen nach erfolgter positiver Selektion jedoch nicht mehr. Diese Daten lassen vermuten, dass PfCCp5 und PfFNPA eine essentielle Funktion in den Blutstadien bzw. bei Gametozytenbildung haben. Zur weiteren Analyse von PfFNPA wurde ein verk{\"u}rztes Protein durch Integration eines weiteren PfFNPA-KO-Konstrukts in den Locus von WT-Parasiten generiert. Erste Analysen des PfFNPA-KO-Ph{\"a}notyps deuten darauf hin, dass durch die Ausschaltung der 3'-Region des Gens das Protein nicht mehr korrekt exprimiert wird, obwohl keine morphologischen Ver{\"a}nderungen der Blutstadien des Parasiten feststellbar sind. Außerdem werden PfCCp5 und PfFNPA ko-abh{\"a}ngig in PfCCp1-, PfCCp2- und PfCCp3-KO-Gametozyten exprimiert. Ko-Immunpr{\"a}zipitationsstudien zeigten, dass beide Proteine mit den anderen PfCCp-Mitgliedern interagieren. Affinit{\"a}tschromato-graphiestudien deckten dann direkte Interaktionen einzelner PfCCp-Dom{\"a}nen auf. Hierbei sind v. a. die LCCL-, die SR- und die NEC- Dom{\"a}ne an Proteininteraktionen beteiligt, was die Hypothese einer Komplexbildung der PfCCp-Familie w{\"a}hrend der Gametogenese des Erregers st{\"u}tzt. Transmissionsblockierungsstudien sollen nun die Eignung ausgew{\"a}hlter PfCCp-Proteine als TBV-Komponenten n{\"a}her beleuchten. Zunehmende Resistenzen gegen gebr{\"a}uchliche Malariamedikamente veranlassen zur Suche nach neuen Angriffspunkten zur Behandlung der Erkrankung. Die maßgeblich an der H{\"a}moglobinhydrolyse beteiligten plasmodialen Cysteinproteasen Falcipain-2 und Falcipain-3 sind m{\"o}gliche Ziele f{\"u}r die Entwicklung neuer Antimalariawirkstoffe. In der vorliegenden Arbeit wurden peptidomimetische 1,4-Benzodiazepin- und nicht-peptidische Etacryns{\"a}urederivate in vitro auf ihre antiplasmodiale Wirkung an P. falciparum-Blutstadien getestet. Ein erstes Screening hatte gezeigt, dass die eine Vinylsulfonkopfgruppe tragenden 1,4 Benzodiazepinderivate rekombinant exprimiertes Falcipain-2 irreversibel hemmen. In vitro konnte dann auch eine antiplasmodiale Aktivit{\"a}t f{\"u}r diese Verbindungen festgestellt werden. Dockingstudien und HPLC-Assays mit den Etacryns{\"a}urederivaten deckten eine Hemmung der Cysteinprotease Papain und der SARS-Mpro-Hauptprotease der Coronaviren auf. Weiterhin konnte in einem Screening an rekombinant exprimiertem Falcipain-2 und Falcipain-3 eine inhibitorische Wirkung f{\"u}r einen Teil dieser Etacryns{\"a}urederivate festgestellt werden. Der In-vitro-Test an P. falciparum-Blutstadien deckte dann eine schwache antiplasmodiale Aktivit{\"a}t von fluorsubstituierten Etacryns{\"a}urederivaten und von Derivaten mit einer modifizierten Etacryns{\"a}urepartialstruktur auf. Der viel versprechendste Inhibitor dieser Studie wurde nun zur Identifizierung potentieller Bindungspartner mittels Affinit{\"a}tsbindungsstudien biotyniliert. Zusammenfassend besitzen beide getesteten Wirkstoffklassen eine inhibierende Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber Cysteinproteasen womit sie die Grundlage f{\"u}r die Entwicklung neuer, effektiverer plasmodialer Cysteinproteaseinhibitoren bieten.},
  subject      = {Plasmodium falciparum},
  language  = {de}
}
@phdthesis{AlbertWeissenberger2009,
  author    = {Albert-Weißenberger, Christiane},
  title     = {Regulation of the Flagellar Biogenesis in Legionella pneumophila},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-34335},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {The bacterial pathogen Legionella pneumophila replicates intracellularly in protozoa, but can also cause severe pneumonia, called Legionnaires' disease. The bacteria invade and proliferate in the alveolar macrophages of the human lung. L. pneumophila bacteria exhibit a biphasic life cycle: replicative bacteria are avirulent; in contrast, transmissive bacteria express virulence traits and flagella. Primarily aim of this thesis was to evaluate the impact of the regulatory proteins FleQ, FleR, and RpoN in flagellar gene regulation. Phenotypic analysis, Western blot and electron microscopy of regulatory mutants in the genes coding for FleQ, RpoN and FleR demonstrated that flagellin expression is strongly repressed and that these mutants are non-flagellated in transmissive phase. Transcriptomic studies of these putative flagellar gene expression regulators demonstrated that fleQ controls the expression of numerous flagellar biosynthetic genes. Together with RpoN, FleQ controls transcription of 14 out of 31 flagellar class II genes, coding for the basal body, hook, and regulatory proteins. Unexpectedly, 7 out of 15 late flagellar genes class III and IV) are expressed dependent on FleQ but independent of RpoN. Thus, in contrast to the commonly accepted view that enhancer binding proteins as FleQ always interact with RpoN to initiate transcription, our results strongly indicate that FleQ of L. pneumophila regulates gene expression RpoN-dependent as well as RpoN-independent. Moreover, transcriptome analysis of a fleR mutant strain elucidated that FleR does not regulate the flagellar class III genes as previously suggested. Instead FleR regulates together with RpoN numerous protein biosynthesis and metabolic genes. Based on these experimental results our modified model for the transcriptional regulation of flagellar genes in L. pneumophila is that flagellar class II genes are controlled by FleQ and RpoN, while flagellar class III and IV genes are controlled in a fleQ-dependent but rpoN-independent manner. Although all L. pneumophila strains share the same complex life style, various pathotypes have evolved. This is reflected by the genomes, which contain e.g. genomic islands. The genomic island Trb-1 of L. pneumophila Corby, carries all genes necessary for a type-IV conjugation system, an integrase gene and a putative oriT site. The second aim of this thesis was to investigate the implication of this genomic island in conjugative DNA transfer. Using conjugation assays we showed that the oriT site located on Trb-1 is functional and contributes to conjugation between different L. pneumophila strains. As this is the first oriT site of L. pneumophila known to be functional our results provide evidence that conjugation is a major mechanism for the evolution of new pathotypes in L. pneumophila.},
  subject      = {Legionella pneumophila},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Reidl2009,
  author    = {Reidl, Sebastian},
  title     = {Funktionale Charakterisierung an der Biofilmbildung beteiligter Faktoren pathogener und kommensaler Escherichia coli},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35684},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Multizellul{\"a}re Gemeinschaften in Form bakterieller Biofilme stellen aus medizinischer Sicht ein großes klinisches Problem dar. H{\"a}ufig lassen sich chronische oder rezidivierende Erkrankungen aber auch nosokomiale Infektionen auf die multizellul{\"a}re Lebensweise von humanpathogenen Erregern zur{\"u}ckf{\"u}hren. Sowohl fakultativ als auch obligat pathogene Escherichia coli-St{\"a}mme besitzen eine Vielzahl unterschiedlicher Faktoren, die die Biofilmbildung beeinflussen. Daran beteiligt sind unter anderem Flagellen, extrazellul{\"a}re polymere Substanzen, Adh{\"a}sine oder Oberfl{\"a}chen-assoziierte Proteine wie Autotransporter. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die funktionale Charakterisierung des Proteins Antigen 43 (Ag43). Aufgrund seiner Autoaggregation-vermittelnden Eigenschaft tr{\"a}gt Ag43 ebenfalls zur Mikrokoloniebildung und Biofilmreifung bei. Antigen 43 ist ein Autotransporterprotein, welches innerhalb der Bakterienspezies Escherichia coli weit verbreitet ist. Interessanterweise besitzen viele E. coli-Isolate gleich mehrere identische oder {\"a}hnliche Kopien von agn43, die in der Regel von variablen Genombereichen (genomische Inseln, Plasmide) kodiert werden. Am Beispiel der Antigen 43-Varianten des uropathogenen Escherichia coli (UPEC)-Stammes 536 (O6:K15:H31), des kommensalen E. coli Isolats Nissle 1917 (O6:K5:H1) sowie des E. coli K-12-Laborstammes MG1655 (OR:H48:K-) ist die Bedeutung des Autotransporterproteins im Rahmen dieser Arbeit n{\"a}her untersucht worden. Hierf{\"u}r wurden die verschiedenen agn43-Allele in ein geeignetes Vektorsystem kloniert und im Adh{\"a}sin-freien Escherichia coli K-12-Stamm MG1655 \&\#916;fim\&\#916;flu exprimiert. Da Antigen 43 in Wildtypst{\"a}mmen posttranslational glykosyliert vorliegt, sind die Experimente zus{\"a}tzlich unter Einfluß der heterologen, AIDA I-spezifischen Heptosyltransferase Aah ('Autotransporter Adhesin Heptosyltransferase') durchgef{\"u}hrt worden. Anhand von Bindungsstudien (intermolekulare Autoaggregation, Zelladh{\"a}sionstests) wurde gezeigt, daß sich einzelne Ag43-Varianten teilweise in ihren Eigenschaften unterscheiden. Im direkten Vergleich mit AIDA-I ('Adhesin Involved in Diffuse Adherence') enteropathogener Escherichia coli (EPEC) konnte f{\"u}r Ag43 nur eine Funktion als schwaches Adh{\"a}sin nachgewiesen werden. Die heterologe O-Glykosylierung beeinflußte die Funktionalit{\"a}t des Antigen 43 in unterschiedlichem Ausmaß. Je nach Autotransporter-Variante f{\"u}hrte die Heptosylierung entweder zu signifikant reduzierten Affinit{\"a}ten, oder sie hatte keinen Effekt auf die Bindungskapazit{\"a}t des Ag43. Antigen 43 weist zudem strukturelle Homologien zu vergleichbaren Dom{\"a}nen anderer Autotransporter auf. F{\"u}r viele dieser Proteine konnte bereits eine adh{\"a}sive oder invasive Funktion nachgewiesen werden. Eine m{\"o}gliche Interaktion von Ag43 mit eukaryontischen Rezeptoren ist hingegen noch nicht bzw. nur unvollst{\"a}ndig untersucht worden. In Overlay assays und ELISAs wurde f{\"u}r Antigen 43 hier erstmals die spezifische Bindung an die extrazellul{\"a}ren Matrixkomponenten Kollagen und Laminin gezeigt. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, daß das Escherichia coli spezifische Autotransporterprotein Antigen 43 nicht nur an der bakteriellen Biofilmbildung, sondern auch an der Besiedlung epithelialer Gewebe beteiligt sein kann. Seine Expression verschafft Bakterien einen Kolonisationsvorteil, der mit erh{\"o}hter Fitneß einhergeht. Die Aah-vermittelte O-Glykosylierung scheint f{\"u}r die Funktionalit{\"a}t von Ag43 nicht zwingend erforderlich zu sein. Des weiteren ist im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Testsystem entwickelt worden, das auf der Basis von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungen (FISH) die Differenzierung von verschiedenen (uro-)pathogenen Mikroorganismen erm{\"o}glicht. Das etablierte Protokoll eignet sich nicht nur f{\"u}r die diagnostische Erregeridentifizierung, sondern auch in Abh{\"a}ngigkeit des Probenmaterials zur Untersuchung von (Multispezies-)Biofilmen.},
  subject      = {Escherichia coli},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Rupp2009,
  author    = {Rupp, Ingrid},
  title     = {Die Gametogenese des humanpathogenen Malariaerregers Plasmodium falciparum - eine Charakterisierung von daran beteiligten Proteasen sowie die Beschreibung und Funktionsanalyse von dabei auftretenden interzellul{\"a}ren Gametenfilamenten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-47830},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Malaria stellt mit einer Mortalit{\"a}t von {\"u}ber einer Million Menschen pro Jahr die bedeutsamste Tropenkrankheit f{\"u}r den Menschen dar. Wachsende Resistenzen der Malariaerreger gegen{\"u}ber den verf{\"u}gbaren Medikamenten erh{\"o}hen mehr denn je den Druck, neue Therapiem{\"o}glichkeiten sowie einen Impfstoff gegen diese Krankheit zu entwickeln. Eine Unterbrechung des sexuellen Fortpflanzungszyklus im Laufe der Transmission von Mensch zu Stechm{\"u}cke w{\"u}rde zu einem Verbreitungsstopp des Erregers f{\"u}hren. Sowohl die Identifizierung von molekularen Wechselwirkungen als auch die Erforschung von an Fertilisationsereignissen beteiligten Prozessen sind wichtige Schritte, um die Sexualphase des Erregers aufzukl{\"a}ren und neue Angriffspunkte f{\"u}r Medikamente oder Vakzine zu entwickeln. Dem Genom von P. falciparum konnten 92 putative Proteasen zugeordnet werden, von denen nur ein geringer Bruchteil charakterisiert worden ist. Unter Anwendung von Protease-Inhibitoren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Exflagellation der m{\"a}nnlichen Gameten die Beteiligung von Proteasen verschiedener Kategorien ben{\"o}tigt. Die Ergebnisse belegten, dass die Aktivit{\"a}t von zwei oder mehr Serinproteasen, von Falcipain-{\"a}hnlichen Cysteinproteasen, von nicht-Thermolysin-{\"a}hnlichen Zink-Metalloproteasen und von Aspartatproteasen f{\"u}r den erfolgreichen Abschluss der m{\"a}nnlichen Gametogenese eine wichtige Voraussetzung ist. Die Lokalisation des Cysteinproteasen- und Falcipain-hemmenden Inhibitors bADA konnte erstmals im Zytosol von Sexualstadien nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurden zus{\"a}tzlich die Proteasen Calpain, DPAP2, GPI8, Metacaspase 2, Plasmepsin 6 und PfSub3 n{\"a}her untersucht. RT-PCR-Analysen konnten die Transkription der sechs ausgesuchten Proteasen in gemischten asexuellen Parasiten sowie zum Großteil in Gametozyten, Gameten und Zygoten belegen. Die Transformation von asexuellen Parasiten mit entsprechenden knockout-Konstrukten deckte f{\"u}r Metacaspase 2 und PfSub3 auf, dass sie im asexuellen Vermehrungszyklus nicht essentiell und die entsprechenden Genloci f{\"u}r Rekombinationsereignisse zug{\"a}nglich sind. Die Ergebnisse der {\"u}brigen Transformationen deuteten darauf hin, dass Calpain essentiell im asexuellen Vermehrungszyklus und dass der Genlocus von Plasmepsin 6 f{\"u}r Rekombinationsereignisse unzug{\"a}nglich ist. Proteinexpressionsstudien anhand von Western-Blot-Analysen und Immunfluoreszenzstudien f{\"u}r PfSub3 konnten Hinweise darauf liefern, dass diese Serinprotease in asexuellen Parasiten, nicht-aktivierten sowie aktivierten Sexualstadien exprimiert wird. Aufgrund der in dieser Arbeit generierten Ergebnisse konnten im Laufe der Gametogenese auftretende Gametenfilamente morphologisch beschrieben sowie Hinweise auf ihre m{\"o}gliche Funktion erlangt werden. Durch die Anwendung von Immunfluoreszenzstudien, rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen sowie die Analyse lebender Gameten konnte gezeigt werden, dass die bis zu 180 µm langen Filamente am Ende geschlossen sind und einen Durchmesser von ca. 200 nm aufweisen. Die tubul{\"a}ren Zellausl{\"a}ufer konnten weiterhin als verzweigte sowie nicht-verzweigte Ausl{\"a}ufer der parasit{\"a}ren Plasmamembran dargestellt werden, die mit Zytoplasma gef{\"u}llt sind. Es konnte belegt werden, dass die Aktin-assoziierten Filamente in periodischen Abst{\"a}nden von beulenartigen Ausw{\"o}lbungen unterbrochen werden und dass sie in rasterelektronenmikroskopischen Analysen ein perlschnurartiges Erscheinungsbild aufweisen. Weiterhin wurde dokumentiert, dass die Zellausl{\"a}ufer mit typischen sexualstadienspezifischen Proteinen wie Pfs25, Pfs230, Pfs48/45 und PfCCp4 assoziiert vorliegen, wobei das Fehlen einzelner dieser Proteine jedoch nicht das Ausbilden der Gametenfilamente verhinderte. Als typisches Charakteristikum der Filamente konnte ihre Eigenschaft beschrieben werden, mehrere Makrogameten und zum Teil Gametozyten in einem Zellkluster miteinander netzartig zu verbinden, wobei bis zu neun Filamente von einem Makrogameten ausgehend beobachtet werden konnten. Die Gametenfilamente zeigten ebenfalls die F{\"a}higkeit, an umliegende nicht-infizierte Erythrozyten sowie mit asexuellen Parasiten infizierte Erythrozyten zu adh{\"a}rieren. Die Filamente waren bereits f{\"u}nf Minuten nach der Aktivierung der Gametozyten und im Laufe der Gametogenese bei 33 bis 73 \% der Zellen nachweisbar. Die Gametenfilamente blieben bis zu 12 Stunden nach Aktivierung der Gametozyten mit der Zelloberfl{\"a}che verbunden. Der aktive Einzug eines Zellfilaments sowie die Bildung der Gametenfilamente im Mitteldarm der Stechm{\"u}cke konnte ebenfalls demonstriert werden. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse lieferten unter anderem den Grundbaustein einer formulierten Funktionshypothese f{\"u}r diese Gametenfilamente. Es wird angenommen, dass die Filamente aufgrund ihrer adh{\"a}siven Eigenschaften im Laufe der Befruchtung von Plasmodium im Mitteldarm der Stechm{\"u}cke auftreten. M{\"o}glicherweise bedienen sich vitale Gameten dieser Strukturen, um andere Sexualstadien zu finden und sie zu verbinden.},
  subject      = {Plasmodium falciparum},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Friedrich2009,
  author    = {Friedrich, Torben},
  title     = {New statistical Methods of Genome-Scale Data Analysis in Life Science - Applications to enterobacterial Diagnostics, Meta-Analysis of Arabidopsis thaliana Gene Expression and functional Sequence Annotation},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-39858},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Recent progresses and developments in molecular biology provide a wealth of new but insufficiently characterised data. This fund comprises amongst others biological data of genomic DNA, protein sequences, 3-dimensional protein structures as well as profiles of gene expression. In the present work, this information is used to develop new methods for the characterisation and classification of organisms and whole groups of organisms as well as to enhance the automated gain and transfer of information. The first two presented approaches (chapters 4 und 5) focus on the medically and scientifically important enterobacteria. Its impact in medicine and molecular biology is founded in versatile mechanisms of infection, their fundamental function as a commensal inhabitant of the intestinal tract and their use as model organisms as they are easy to cultivate. Despite many studies on single pathogroups with clinical distinguishable pathologies, the genotypic factors that contribute to their diversity are still partially unknown. The comprehensive genome comparison described in Chapter 4 was conducted with numerous enterobacterial strains, which cover nearly the whole range of clinically relevant diversity. The genome comparison constitutes the basis of a characterisation of the enterobacterial gene pool, of a reconstruction of evolutionary processes and of comprehensive analysis of specific protein families in enterobacterial subgroups. Correspondence analysis, which is applied for the first time in this context, yields qualitative statements to bacterial subgroups and the respective, exclusively present protein families. Specific protein families were identified for the three major subgroups of enterobacteria namely the genera Yersinia and Salmonella as well as to the group of Shigella and E. coli by applying statistical tests. In conclusion, the genome comparison-based methods provide new starting points to infer specific genotypic traits of bacterial groups from the transfer of functional annotation. Due to the high medical importance of enterobacterial isolates their classification according to pathogenicity has been in focus of many studies. The microarray technology offers a fast, reproducible and standardisable means of bacterial typing and has been proved in bacterial diagnostics, risk assessment and surveillance. The design of the diagnostic microarray of enterobacteria described in chapter 5 is based on the availability of numerous enterobacterial genome sequences. A novel probe selection strategy based on the highly efficient algorithm of string search, which considers both coding and non-coding regions of genomic DNA, enhances pathogroup detection. This principle reduces the risk of incorrect typing due to restrictions to virulence-associated capture probes. Additional capture probes extend the spectrum of applications of the microarray to simultaneous diagnostic or surveillance of antimicrobial resistance. Comprehensive test hybridisations largely confirm the reliability of the selected capture probes and its ability to robustly classify enterobacterial strains according to pathogenicity. Moreover, the tests constitute the basis of the training of a regression model for the classification of pathogroups and hybridised amounts of DNA. The regression model features a continuous learning capacity leading to an enhancement of the prediction accuracy in the process of its application. A fraction of the capture probes represents intergenic DNA and hence confirms the relevance of the underlying strategy. Interestingly, a large part of the capture probes represents poorly annotated genes suggesting the existence of yet unconsidered factors with importance to the formation of respective virulence phenotypes. Another major field of microarray applications is gene expression analysis. The size of gene expression databases rapidly increased in recent years. Although they provide a wealth of expression data, it remains challenging to integrate results from different studies. In chapter 6 the methodology of an unsupervised meta-analysis of genome-wide A. thaliana gene expression data sets is presented, which yields novel insights in function and regulation of genes. The application of kernel-based principal component analysis in combination with hierarchical clustering identified three major groups of contrasts each sharing overlapping expression profiles. Genes associated with two groups are known to play important roles in Indol-3 acetic acid (IAA) mediated plant growth and development as well as in pathogen defence. Yet uncharacterised serine-threonine kinases could be assigned to novel functions in pathogen defence by meta-analysis. In general, hidden interrelation between genes regulated under different conditions could be unravelled by the described approach. HMMs are applied to the functional characterisation of proteins or the detection of genes in genome sequences. Although HMMs are technically mature and widely applied in computational biology, I demonstrate the methodical optimisation with respect to the modelling accuracy on biological data with various distributions of sequence lengths. The subunits of these models, the states, are associated with a certain holding time being the link to length distributions of represented sequences. An adaptation of simple HMM topologies to bell-shaped length distributions described in chapter 7 was achieved by serial chain-linking of single states, while residing in the class of conventional HMMs. The impact of an optimisation of HMM topologies was underlined by performance evaluations with differently adjusted HMM topologies. In summary, a general methodology was introduced to improve the modelling behaviour of HMMs by topological optimisation with maximum likelihood and a fast and easily implementable moment estimator. Chapter 8 describes the application of HMMs to the prediction of interaction sites in protein domains. As previously demonstrated, these sites are not trivial to predict because of varying degree in conservation of their location and type within the domain family. The prediction of interaction sites in protein domains is achieved by a newly defined HMM topology, which incorporates both sequence and structure information. Posterior decoding is applied to the prediction of interaction sites providing additional information of the probability of an interaction for all sequence positions. The implementation of interaction profile HMMs (ipHMMs) is based on the well established profile HMMs and inherits its known efficiency and sensitivity. The large-scale prediction of interaction sites by ipHMMs explained protein dysfunctions caused by mutations that are associated to inheritable diseases like different types of cancer or muscular dystrophy. As already demonstrated by profile HMMs, the ipHMMs are suitable for large-scale applications. Overall, the HMM-based method enhances the prediction quality of interaction sites and improves the understanding of the molecular background of inheritable diseases. With respect to current and future requirements I provide large-scale solutions for the characterisation of biological data in this work. All described methods feature a highly portable character, which allows for the transfer to related topics or organisms, respectively. Special emphasis was put on the knowledge transfer facilitated by a steadily increasing wealth of biological information. The applied and developed statistical methods largely provide learning capacities and hence benefit from the gain of knowledge resulting in increased prediction accuracies and reliability.},
  subject      = {Genomik},
  language  = {en}
}