@phdthesis{Bank2014,
  author    = {Bank, Stephanie},
  title     = {LC-ESI und MALDI-Massenspektrometrische Analyse nativer und derivatisierter Zucker und Glykane},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-106085},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Glykane sind weitverbreitete Biomolek{\"u}le, die meist in Form von Glykokonjugaten, wie beispielsweise als Glykoproteine oder Glykolipide, vorliegen. Durch die Interaktion von Glykanen mit Glykan-bindenden Proteinen wird eine Vielzahl an biochemischen Prozessen ausgel{\"o}st, sowohl physiologischer, als auch pathologischer Art. Die Aufkl{\"a}rung der beteiligten Glykanstrukturen ist daher nicht nur wichtig f{\"u}r das Verst{\"a}ndnis dieser Prozesse, sondern kann auch Hinweise auf verschiedene Erkrankungen geben. Die Identifizierung von Glykanstrukturen kann {\"u}ber verschiedene Wege erfolgen. In der instrumentellen Analytik spielt dabei vor allem die ESI- und MALDI Massenspektrometrie eine wichtige Rolle, da diese sowohl f{\"u}r Detektion, als auch Fragmentierung großer Biomolek{\"u}le geeignet sind. Um die Analyse von Zuckern mittels chromatographischer und massenspektrometrischer Methoden zu erleichtern, werden h{\"a}ufig Derivatisierungsreagenzien eingesetzt. Diese verringern die Polarit{\"a}t der Zucker und erleichtern die Detektion durch das Einbringen von Chromo- oder Fluorophoren. Zur Derivatisierung am reduzierenden Terminus von Glykanen und Zuckern eignen sich vor allem Aminierungsreagenzien oder Hydrazide. Hydrazide haben gegen{\"u}ber anderen Derivatisierungsreagenzien den Vorteil einer einfachen, salzfreien Umsetzung, aus der ein stabiles Derivat mit geschlossenem terminalen Zuckerring hervorgeht. F{\"u}r die vorliegende Arbeit wurde die Derivatisierung mit den neuen Hydrazid Reagenzien INH und BINH, sowie dem bereits von Dr. P. Kapkov{\´a} bearbeiteten BACH untersucht. Als Vergleich dienten die underivatisierten Kohlenhydrate, wie auch das standardm{\"a}ßig eingesetzte Aminierungsreagenz 2-AB. Dabei sollte das Ver-halten verschiedener Zucker und Glykane in Bezug auf chromatographische Trennung, Signalintensit{\"a}t und Fragmentierung analysiert werden. Zun{\"a}chst wurde die Umsetzung von Mono-, Di- und Trisacchariden mit den neuen Derivatisierungsreagenzien INH und BINH optimiert. Dadurch konnte bei beiden Substanzen die komplette Umsetzung der Zucker in ihre Derivate gew{\"a}hrleistet werden. Auch die Derivatisierung mit Hilfe der Mikrowelle konnte bei INH erfolgreich durchgef{\"u}hrt werden. Auf diese Weise ließ sich die Reaktionszeit, im Vergleich zu den im Thermo-mixer® ben{\"o}tigten 90 Minuten, auf 20 Minuten verk{\"u}rzen. Aufgrund der großen Men-gen an Zucker und Derivatisierungsreagenz, die f{\"u}r die Umsetzung in der Mikrowelle n{\"o}tig sind, war der Versuch jedoch nur f{\"u}r INH geeignet. Im n{\"a}chsten Schritt wurde das Trennverhalten der verschiedenen Mono-, Di- und Tri-saccharid-Derivate auf RP-C18- und HILIC-Phasen untersucht. Bei den Monosaccha-riden konnte durch keines der Derivate eine vollst{\"a}ndige Trennung auf einer der Pha-sen erreicht werden. Das beste Ergebnis wurde durch INH auf der HILIC-S{\"a}ule erzielt, doch auch dort konnten die Epimere Glucose, Mannose und Galactose nicht vollst{\"a}n-dig separiert werden. Die Trennung der Disaccharide Maltose, Cellobiose und Lactose konnte auf der HILIC-Phase mit allen Derivaten außer BACH erfolgreich durchgef{\"u}hrt werden, auf der RP-C18 erwies sich dagegen nur 2-AB als geeignet. Bei den Trisac-chariden 3'SLN und 6'SLN konnten sowohl underivatisierte Zucker, als auch s{\"a}mtliche Derivate mittels HILIC getrennt werden. Auch auf der C18-Phase war eine Trennung der BINH, BACH und 2-AB-Derivate m{\"o}glich. Des Weiteren konnte durch die Derivati-sierungen die Signalintensit{\"a}t gegen{\"u}ber den underivatisierten Zuckern deutlich gesteigert werden. Nach ihrer Trennung lassen sich massegleiche Di- und Trisaccharide anhand des Fragmentierungsmusters unterscheiden. W{\"a}hrend bei den underivatisierten Disaccha-riden Maltose, Cellobiose und Lactose die charakteristischen Fragmente nur schwach sichtbar waren, konnte mit Hilfe der Hydrazide INH, BINH und BACH die Differenzie-rung deutlich erleichtert werden. Die 2-AB-Derivatisierung zeigte dagegen keine Ver-besserung der Fragmentierungseigenschaften. Bei der Unterscheidung der Trisaccharide 3'SLN und 6'SLN waren ebenfalls sowohl underivatisierte, als auch Hydrazid-derivatisierte Zucker im Vorteil gegen{\"u}ber den 2-AB-Derivaten. Die Derivatisierung der N-Glykane von Ribonuclease B und Ovalbumin f{\"u}hrte bei der Analyse mittels MALDI-TOF zu einer deutlichen Steigerung der Sensitivit{\"a}t. Beispiels-weise ließen sich bei den Glykanen des Ovalbumins durch die Derivatisierungen drei zus{\"a}tzliche Strukturen im Vergleich zu den nativen Glykanen detektieren. Auch das Fragmentierungsverhalten der Glykane am MALDI-TOF/TOF konnte mit Hilfe der Derivatisierungen erheblich verbessert werden. Besonders die Umsetzung mit BINH f{\"u}hrte zu einer Vielzahl charakteristischer Ringfragmente, wodurch die Aufkl{\"a}rung der verschiedenen Glykanstrukturen deutlich vereinfacht wurde. Auch im Vergleich zu 2 AB zeigten die Hydrazid-Derivate sowohl bessere Fragmentierungseigenschaften, als auch eine einfachere Handhabung f{\"u}r die Messung mittels MALDI-MS. Eine weitere M{\"o}glichkeit zur Identifikation von Glykanstrukturen liegt in der spezifischen Bindung durch Lektine. Diese Untersuchung gibt des Weiteren auch einen Hinweis auf funktionelle Eigenschaften der Glykane. Daf{\"u}r wird die hohe Affinit{\"a}t von Biotin-haltigen Derivatisierungsreagenzien zu Avidin und Streptavidin genutzt. Nach der auf diese Weise erfolgten Immobilisierung der Glykane k{\"o}nnen diese mittels spezifischer Lektine nachgewiesen werden. Die Eignung des neuen Derivatisierungsreagen-zes BINH f{\"u}r diese Zwecke wurde anhand eines Glykan-Arrays getestet. Dadurch ließ sich best{\"a}tigen, dass BINH-derivatisierte Glykane und Zucker sowohl in der Lage sind an Streptavidin zu binden, als auch durch Lektine nachgewiesen werden k{\"o}nnen. Daher kann davon ausgegangen werden, dass BINH grunds{\"a}tzlich f{\"u}r den Einsatz in bio-chemischen Methoden geeignet ist. Zusammenfassend l{\"a}sst sich sagen, dass die Derivatisierung von Kohlenhydraten mit INH, BINH und BACH zu einer deutlichen Verbesserung der Trenn- und Fragmentierungseigenschaften f{\"u}hrten. Dadurch konnten Identifizierung und Strukturanalyse sowohl von kleinen Zuckern, als auch von Glykanen erleichtert werden. Im Vergleich zu dem Standard-Derivatisierungsreagenz 2-AB zeigten die Hydrazide nicht nur im Bereich der Fragmentierungen, sondern auch durch die einfachere Derivatisierungsreaktion wesentliche Vorteile.},
  subject      = {MALDI-MS},
  language  = {de}
}