@phdthesis{Hartmann2014,
  author    = {Hartmann, Michael},
  title     = {Charakterisierung inaktivierender posttranslationaler Modifikationen des GC-A-Rezeptors f{\"u}r das atriale natriuretische Peptid (ANP)},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-97959},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Das atriale natriuretische Peptid (ANP) wird infolge einer Zunahme des atrialen Drucks aus den Myozyten des Atriums sezerniert. Es spielt lokal eine bedeutende, protektive Rolle und wirkt der Entstehung von Herzhypertrophie und Fibrose entgegen. Dar{\"u}ber hinaus kommt ANP vor allem eine wichtige Rolle als endokrines Hormon zu, das den arteriellen Blutdruck und das Blutvolumen regelt. Diese physiologischen Effekte vermittelt das Herzhormon durch seinen Rezeptor, das Transmembranprotein Guanylatzyklase A (GC-A). Durch Bindung von ANP an die extrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne der GC-A wird intrazellul{\"a}r, durch die katalytische Dom{\"a}ne des Rezeptors, der sekund{\"a}re Botenstoff cGMP gebildet. Patienten mit einer, durch Bluthochdruck verursachten Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz weisen erh{\"o}hte ANP-Konzentrationen im Plasma auf. Die durch ANP vermittelten, protektiven Effekte sind allerdings vermindert. Zahlreiche Studien haben in vitro gezeigt, dass die chronische Inkubation der GC-A mit ihrem Liganden, sowie die Behandlung von GC-A exprimierenden Zellen mit Hormonen wie Angiotensin II, zur Desensitisierung des Rezeptors f{\"u}hren. Der Verlust der Funktionsf{\"a}higkeit geht einher mit der Dephosphorylierung des Rezeptors an spezifischen, intrazellul{\"a}r lokalisierten Aminos{\"a}uren. Durch die Erforschung dieses Mechanismus und Identifizierung m{\"o}glicher Interaktionspartner in vivo k{\"o}nnte der Grundstein f{\"u}r neue oder verbesserte Therapieformen gelegt werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine k{\"u}rzlich identifizierte Isoform des GC-A-Rezeptors identifiziert, die durch alternatives Spleißen des Exons 4 entsteht und in einer Vielzahl untersuchter Gewebe der Maus vorkommt. Die Deletion umfasst 51 Basenpaare und resultiert in einem um 17 Aminos{\"a}uren verk{\"u}rzten GC-A-Rezeptor (GC-AΔLys314-Gln330). Molekulare Modellierungen der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen des wildtypischen GC-A-Rezeptors und der Isoform zeigten, dass sich die Deletion im membrannahen Bereich der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne und damit deutlich entfernt von der ANP-Bindungsdom{\"a}ne befindet. Oberfl{\"a}chenbiotinylierungs- und Zellfraktionierungsversuche zeigten, dass die Isoform des GC-A-Rezeptors an der Oberfl{\"a}che von Zellmembranen transient transfizierter HEK 293-Zellen pr{\"a}sentiert wird. Jedoch zeigten die ANP-Stimulationsexperimente unter Anwendung von cGMP-Radioimmunassay (cGMP-RIA) und F{\"o}rster-Resonanzenergietransfer (FRET)-Messungen, dass die Isoform nicht zur ANP-vermittelten intrazellul{\"a}ren cGMP-Bildung stimuliert werden kann. Im Rahmen von ANP-Bindungsstudien mit 125I-ANP wurde gezeigt, dass GC-AΔLys314-Gln330 die F{\"a}higkeit zur Bindung des Liganden ANP verloren hat. Jedoch zeigten die Koimmunpr{\"a}zipitationsversuche, dass die Isoform des GC-A-Rezeptors Heterodimere mit dem wildtypischen GC-A-Rezeptor bilden und dadurch die ligandeninduzierte Bildung von cGMP reduzieren kann. In vivo konnte gezeigt werden, dass unter Angiotensin II-induzierter Hypertonie die mRNA-Expression f{\"u}r GC-AΔLys314-Gln330 in der Lunge gesteigert, und gleichzeitig die ANP-vermittelte cGMP-Bildung deutlich reduziert ist. Daher kann davon ausgegangen werden, dass das alternative Spleißen ein regulierender Mechanismus ist, der auf den ANP/GC-A-Signalweg Einfluss nimmt. Angiotensin II-induziertes alternatives Spleißen des GC-A-Gens kann daher einen neuen Mechanismus f{\"u}r die Verringerung der Sensitivit{\"a}t des GC-A-Rezeptors gegen{\"u}ber ANP darstellen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden transgene Tiere mit kardiomyozytenspezifischer {\"U}berexpression eines Epitop-getaggten GC-A-Rezeptors generiert. Durch dieses Modell sollte es erm{\"o}glicht werden, den Rezeptor aus murinem Gewebe anreichern und aufreinigen zu k{\"o}nnen um danach Analysen zu posttranslationalen Ver{\"a}nderungen und m{\"o}glichen Interaktionspartnern durchzuf{\"u}hren. Zun{\"a}chst wurde in eine FLAG-Epitop-getaggte GC-A zus{\"a}tzlich ein HA-tag, sowie eine Erkennungssequenz f{\"u}r die Protease des tobacco etch virus (TEV) eingef{\"u}gt. Die Expression und Funktionsf{\"a}higkeit des modifizierten Rezeptors wurde durch ANP-Stimulationsexperimente unter Anwendung von cGMP-RIA und FRET-Messungen verifiziert. Die Funktionsf{\"a}higkeit der TEV-Erkennungssequenz wurde durch die Elution mittels TEV-Protease nach Immunpr{\"a}zipitation (IP) nachgewiesen. In vivo wurde an M{\"a}usen die Expression und Lokalisation der GC-A auf Proteinebene, unter Anwendung von Zellfraktionierungsexperimenten und Immunpr{\"a}zipitationen, {\"u}berpr{\"u}ft. Die entstandenen transgenen Tiere zeigten eine deutliche, in den Zellmembranen von Kardiomyozyten lokalisierte, {\"U}berexpression des Rezeptors. Dieser konnte {\"u}ber das HA-tag angereichert und aufgereinigt werden. Um die Funktionsf{\"a}higkeit des modifizierten Rezeptors in vivo nachzuweisen, wurde in zwei Versuchsreihen kardiale Hypertrophie durch chronische Applikation von Angiotensin II induziert. Es wurde postuliert, dass die {\"U}berexpression funktionsf{\"a}higer GC-A im Herzen die Tiere vor Herzhypertrophie sch{\"u}tzt. Die Ergebnisse der Studien zeigen allerdings, dass die generierten transgene Tiere trotz kardiomyozytenspezifischer {\"U}berexpression des Rezeptors nicht den erwarteten Schutz vor Herzhypertrophie aufwiesen, sondern {\"a}hnlich wie ihre wildtypischen Geschwistertiere reagieren. Jedoch gelang es mit Hilfe des {\"U}berexpressionsmodells zusammen mit anderen Mitarbeitern der AG Kuhn eine zuvor in vitro beschriebene Interaktion des GC-A-Rezeptors mit den Kationenkan{\"a}len TRPC3 und TRPC6 in vivo nachzuweisen. Somit besteht die M{\"o}glichkeit die Epitope und das murine {\"U}berexpressionsmodell auch zuk{\"u}nftig zu nutzen, um Interaktionspartner der GC-A zu identifizieren.},
  subject      = {Guanylatzyklase},
  language  = {de}
}