@phdthesis{Schiller2009,
  author    = {Schiller, Markus},
  title     = {Neue Derivate der Etacryns{\"a}ure: Synthese und biologische Aktivit{\"a}t},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-39368},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Etacryns{\"a}ure - ein langj{\"a}hrig eingesetztes Diuretikum - und verschiedene ihrer Derivate sind als nichtpeptidische Inhibitoren von Cystein-Proteasen bekannt. Einige Amid-Derivate besitzen bez{\"u}glich des SARS-CoV sowohl enzymhemmende (SARS-CoV-Mpro) als auch antivirale Wirkung. Das elektrophile Strukturfragment des Molek{\"u}ls, das als Michael-Akzeptor eine Reaktion mit dem active-site Cystein-Rest der Protease eingehen kann, ist die a,b-unges{\"a}ttigte Carbonyleinheit in der Acyl-Seitenkette. Ausgehend von der Etacryns{\"a}ure als Leitstruktur wurden durch Strukturvariationen neue Etacryns{\"a}ure-Derivate, bevorzugt Amid-Derivate, dargestellt. Zus{\"a}tzlich zu diesen Verbindungen wurden außerdem weitere Etacryns{\"a}ure-Derivate synthetisiert, die durch Biotin- und Deuterium-Markierung als Modellsubstanzen zum In-vitro-Nachweis des Wirkstoffes in biochemischen und spektroskopischen Assays dienen. Als deuterierte Spezies wurde mit der d9-Etacryns{\"a}ure ein hochdeuteriertes Wirkstoff-Analogon dargestellt. Der Grad der Deuterium-Markierung konnte durch Kupplung von d13-n-Hexylamin an die d9-Etacryns{\"a}ure noch auf ein d22-Amid-Derivat erweitert werden. Insgesamt konnten neben dem direkten d9-Analogon des Wirkstoffes drei weitere Amid-Derivate erhalten werden. Zur Testung der erhaltenen Substanzen an der SARS-CoV-Mpro war die Synthese eines FRET-Substrats erforderlich. Daf{\"u}r wurde mittels automatisierter SPPS ein Dekapeptid mit dem FRET-Donor-Akzeptor-Paar Anthranils{\"a}ure - Nitrotyrosin hergestellt. Das Substrat besitzt die Sequenz H2N-Abz-Ser-Val-Thr-Leu-Gln-Ser-Gly-Tyr(NO2)-Arg(Mts)-COOH. Der Km-Wert f{\"u}r die SARS-CoV-Mpro wurde unter Ber{\"u}cksichtigung des inner filter effect zu 190 ± 23 µM bestimmt. Zur Evaluation der enzymhemmenden Aktivit{\"a}t wurden die synthetisierten Inhibitoren an den drei Enzymen SARS-CoV-Mpro, SARS-CoV-PLpro und Cathepsin L getestet. Als potenteste Inhibitoren wurden das Bromanisol MS07 (Ki = 52.7 µM, SARS-CoV-Mpro) sowie das Norethyl-Derivat der Etacryns{\"a}ure MS21 (Ki = 22.8 µM, Cathepsin L) identifiziert. Alle getesteten Verbindungen zeigten an der SARS-CoV-PLpro keine Aktivit{\"a}t. Im Rahmen des SFB 630 wurden mit den synthetisierten Verbindungen weitere Testungen an Bakterien, den Protozoen Leishmania major und Typanosoma brucei brucei sowie an Makrophagen durchgef{\"u}hrt. Dabei zeigten die Verbindungen MS38, MS40 und MS41 eine besondere Wirksamkeit. Es konnten zwar im Wachstumstest sowie im Biofilmtest Aktivit{\"a}ten gegen den Bakterienstamm Staphylococcus epidermidis sowie die Hemmung der Biofilmbildung von S. epidermidis festgestellt werden. Die zur Hemmung notwendigen Mindestkonzentrationen lagen oberhalb der Konzentrationen, die auch cytotoxisch auf Makrophagen wirkt. {\"A}hnliches gilt f{\"u}r die Aktivit{\"a}t an L. major. Bez{\"u}glich T. b. brucei zeigen diese drei Verbindungen jedoch eine erh{\"o}hte Aktivit{\"a}t mit MHK-Werten von < 1 µM. Das bedeutet, dass f{\"u}r eine Hemmung eine Konzentration erforderlich ist, die um Faktor 4 bis 11 unterhalb der cytotoxischen Konzentration liegt. Dieser Wert konnte nur noch durch das Biotin-markierte Derivat MS57 (IC50 T. b. brucei: 0.69 µM; IC50 Makrophagen: 33.8 µM) {\"u}bertroffen werden. Weitere Untersuchungen mit der Biotin-markierten Verbindung MS57 zeigten zudem eine Hemmung von Falcipain-2 und -3 sowie von Plasmodium falciparum mit IC50-Werten von 3.0 µM (FP-2) 11.9 µM (FP-3) und 9.0 µM (P.f.). Weiterhin konnte mit Hilfe der Massenspektrometrie eine Bindung von MS57 an FP-2 nachgewiesen werden. Diese findet aber offensichtlich nicht im aktiven Zentrum des Enzyms statt. Die deuterierten Derivate der Etacryns{\"a}ure kamen als Modellsubstanzen zur Etablierung eines CARS-Mikroskopie-Assays zur spektroskopischen Wirkstoffdetektion zum Einsatz. Dabei war es bisher m{\"o}glich, das CARS-Signal der d9-Etacryns{\"a}ure in DMSO-L{\"o}sung bis zu einer Konzentration von 500 µM zu erfassen. Quantenchemische Berechnungen zur Simulation des Reaktionsmechanismus des active-site-Cystein-Restes der SARS-CoV-Mpro mit Michael-Systemen als elektrophilem warhead zeigten, dass es sich dabei um einen zweistufigen Prozess handelt, bei dem nach erfolgter Deprotonierung des Thiols der Angriff an der Doppelbindung erfolgt. Zudem ergaben die Berechnungen, dass sowohl Halogenarylsubstituenten am Carbonylkohlenstoff sowie exo-konfigurierte Systeme sich energetisch g{\"u}nstig auswirken. Diese Trends konnten durch kinetische NMR-Experimente durch Umsetzung einer Reihe von Modellsubstanzen mit p-Methoxythiophenolat best{\"a}tigt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass f{\"u}r die betrachteten Systeme die Umsetzung innerhalb von wenigen Minuten, sp{\"a}testens aber innerhalb von 90 Minuten zu 99 \% erfolgt ist.},
  subject      = {Etacryns{\"a}ure},
  language  = {de}
}