@phdthesis{Hartung2013,
  author    = {Hartung, Andreas Walter},
  title     = {Entwicklung neuartiger pharmakologischer Wirkstoffe als Inhibitoren des HSF-1/HSP70-Systems zur Behandlung des Multiplen Myeloms},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-91390},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Das Multiple Myelom (MM) zeichnet sich durch eine krankhafte Entartung der Plasmazellen im Knochenmark aus und gilt heute trotz zahlreicher Behandlungsfortschritte immer noch als unheilbar. Als attraktive Zielstrukturen f{\"u}r neue Therapiem{\"o}glichkeiten haben sich in den vergangenen Jahren „Heat-Shock"-Proteine etabliert. Diese liegen h{\"a}ufig {\"u}berexprimiert vor und sind bei der Stabilisierung mehrerer onkogener Signalwege des MM von zentraler Bedeutung. Zun{\"a}chst wurden von Pharmaunternehmen verschiedene Inhibitoren von HSP90 entwickelt, die sich in pr{\"a}klinischen MM-Studien als erfolgreich herausstellten, in klinischen Studien jedoch nur eine begrenzte Wirksamkeit zeigten, da eine Inhibition von HSP90 zu einer schnellen HSF-1-vermittelten Hochregulation der HSP70- Expression f{\"u}hrt. Dies kompensiert die Inhibition von HSP90 und f{\"u}hrt damit zu einer Abschw{\"a}chung der Anti-Tumoraktivit{\"a}t. Eine duale Hemmung von HSP90 und des HSF-1/HSP70-Systems wird daher als vielversprechende Strategie f{\"u}r eine wirksame Behandlung des MM betrachtet. Die vorliegende Arbeit, die im Rahmen der klinischen Forschergruppe 216 erstellt wurde, befasst sich daher mit der Entwicklung von Inhibitoren des HSF-1/HSP70-Systems. Hierzu wurden zwei unabh{\"a}ngige Strategien verfolgt. Neben einem indirekten Ansatz, der auf einer blockierten HSP70-Expression via Inhibition des HSF-1-Signalwegs beruht, stand die direkte Inhibition von HSP70 im Fokus. Die erzielten Ergebnisse im Einzelnen: 1) In Anlehnung an den HSF-1-Inhibitor NZ28 (12) sollte untersucht werden, ob das dort enthaltene Tetrahydroisochinolin-Ger{\"u}st eine Leitstruktur f{\"u}r die Entwicklung von Hemmstoffen des HSF-1-Signalwegs darstellt. Hierzu wurde eine Reihe unterschiedlich substituierter Tetrahydroisochinolinon-Derivate hergestellt. Die Synthese erfolgte {\"u}ber eine sequenzielle Ugi-Heck-Reaktion, da hierbei drei Substituenten des Tetrahydro- isochinolin-Ger{\"u}sts hochflexibel und unabh{\"a}ngig voneinander variiert werden k{\"o}nnen und sich so leicht ein breites Spektrum verschiedener Tetrahydroisochinolinon-Derivate aufbauen l{\"a}sst. Eine Bioaktivit{\"a}tsanalyse zeigte jedoch, dass keine der so erhaltenen Verbindungen (26) die HSF-1-vermittelte HSP70-Expression zu inhibieren vermochte. Um den Einfluss des spezifischen Substitutionsmusters der via Ugi-Heck-Reaktion erhaltenen Produkte zu untersuchen, wurde außerdem eine Auswahl der als HSP70- Inhibitoren synthetisierten Tetrahydroisochinolinone (24 und 36) im HSF-1-Assay getestet. Da auch f{\"u}r diese Verbindungen keine Inhibition des Signalwegs beobachtet werden konnte, besteht Grund zur Annahme, dass substituierte Tetrahydroisochinolin-Derivate nicht als Leitstruktur f{\"u}r die Entwicklung von HSF-1-Inhibitoren geeignet sind. 2) Im Gegensatz zu den synthetisierten Tetrahydroisochinolinonen zeigten einige der als Zwischenprodukte der Ugi-Heck-Reaktion isolierten α-Acylaminocarboxamide, die durch ein Michael-System charakterisiert sind, eine Inhibition der HSF-1-vermittelten HSP70- Expression. Zwar konnten keine eindeutigen Struktur-Wirkungsbeziehungen bez{\"u}glich einzelner Substituenten abgeleitet werden, aber es zeigte sich, dass die beobachtete Bioaktivit{\"a}t nicht vom enthaltenen Michael-System abh{\"a}ngig ist. Dem Wirkprinzip der α-Acylaminocarboxamide scheint somit keine kovalente Bindung mit nukleophilen Seitenketten von Proteinen zugrunde zu liegen, was das Potenzial unspezifischer Interaktionen reduziert. 3) Bei der Ugi-Multikomponentenreaktion wurden als Carbons{\"a}urederivate auch β-Acyl-substituierte Acryls{\"a}uren eingesetzt. Dabei wurde beobachtet, dass dieser Austausch zur Bildung von pharmakologisch interessanten 2,5-Diketopiperazinderivaten (35) f{\"u}hrt. Die in nur einem Reaktionsschritt erhaltenen 2,5-DKPs zeigten eine spezifische und dosisabh{\"a}ngige antiproliferative Wirkung auf aktivierte T-Zellen, was sie als potenzielle Wirkstoffkandidaten f{\"u}r die Behandlung von unbeabsichtigten T-Zell-vermittelten Autoimmunantworten interessant macht (AG Topp). Eine Analyse der Struktur-Wirkungsbeziehungen zeigte unter anderem eine Pr{\"a}ferenz f{\"u}r trans-konfigurierte 2,5-DKPs. Die Aktivit{\"a}t der potentesten Verbindungen der syntheti- sierten Serie lag in derselben Gr{\"o}ßenordnung wie die der Positiv-Kontrolle 17-Dimethoxyaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-DMAG, 4b). 4) Ausgangspunkt f{\"u}r die Entwicklung neuartiger HSP70-Inhibitoren war das Ergebnis eines virtuellen Screenings (AG Sotriffer), das darauf abzielte die Proteinfunktion durch eine Interaktion mit dem Interdom{\"a}nen-Interface von HSP70 zu blockieren. Im ersten Schritt wurde eine diastereoselektive und hochflexible Reaktionssequenz zum virtuelle Screening-Hits (trans-24a) etabliert, mit der im zweiten Schritt eine Bibliothek verwandter Substanzen aufgebaut wurde. Gezielte strukturelle Modifikationen erlaubten dabei wesentliche Strukturelemente zu identifizieren sowie Informationen f{\"u}r die Generierung von Derivaten mit h{\"o}herer Aktivit{\"a}t zu gewinnen. Die wichtigsten Erkenntnisse dabei waren: - Ausschließlich trans-konfigurierte Tetrahydroisochinolinon-Derivate sind wirksam. - Carboxamide (Pos. 4) sind aktiver als analoge Carbons{\"a}uren. - Die Methoxyfunktion am Phenylsubstituenten in Pos.3 ist f{\"u}r die Aktivit{\"a}t wichtig, dagegen f{\"u}hrt das Entfernen der OCH3- Gruppe am Phenylring in Pos. 2 zu einer Aktivit{\"a}tssteigerung. - Eine aliphatische MeNH-Einheit am exozyklischen Amid reduziert die Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber Arylamidsubstituenten um eine Zehnerpotenz. Dar{\"u}ber hinaus f{\"u}hrt ein terti{\"a}rer Dimethylcarboxamid-Rest zum vollst{\"a}ndigen Aktivit{\"a}tsverlust. Zur Falsifizierung der postulierten Bindetasche wurden zus{\"a}tzlich gezielt Derivate mit sterisch anspruchsvollen Substituenten (Tetrahydronaphthyl, Phenoxyphenyl) hergestellt, die nicht in der Lage sein sollten im berechneten Bindemodus am Interdom{\"a}nen-Interface zu binden. Dabei stand das so ermittelte verf{\"u}gbare Platzangebot in Einklang mit den aufgrund der Docking-Analysen getroffenen Annahmen. Um die Enantioselektivit{\"a}t der Aktivit{\"a}t der trans-Verbindungen zu pr{\"u}fen, wurde f{\"u}r zwei repr{\"a}sentative Carboxamide (24a und 24i) eine Enantiomerentrennung mittels chiraler HPLC durchgef{\"u}hrt und die Enantiomere einzeln getestet. Dabei erwiesen sich die R,R-Derivate als Tr{\"a}ger der Anti-MM-Wirksamkeit. Zur Absch{\"a}tzung der Permeabilit{\"a}t wurden die PSA-Werte der Carboxamide (24) berechnet. Mit Ausnahme der hydroxylsubstituierten Verbindung 24r lagen die Werte aller Derivate (24a-q) in einem Bereich von 65-88{\AA}2, was einen akzeptablen Resorptionsanteil von 55-90\% erwarten l{\"a}sst. Die Bestimmung der Lipophilie der hergestellten Carboxamide mittels HPLC ergab einen logD-Bereich von 1-3, in dem Wirkstoffe einen ausgewogenen lipophilen Charakter besitzen. Die Effizienz der hergestellten Inhibitoren wurde dar{\"u}ber hinaus anhand der ermittelten LE- (engl. ligand efficiency) und LLE-Werte (engl. ligand lipophilic efficiency) beurteilt. Die g{\"u}nstigste Kombination aus LE und LLE wurde f{\"u}r Verbindung 24j (EC50 = 0.20 μM) ermittelt. Dieses Derivat zeichnet sich durch einen Phenylsubstituenten in Position2 des Tetrahydroisochinolin-Ger{\"u}sts, einen Methoxyphenylrest in Position3 und einen Pyrimidinsubstituenten am exozyklischen Amid aus. Zur Beurteilung unspezifisch toxischer Effekte wurde neben der Wirksamkeit an MM-Zellen auch der Einfluss der Tetrahydroisochinolin-Derivate auf die Viabilit{\"a}t von mononukle{\"a}ren Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) untersucht (AG Chatterjee). W{\"a}hrend die aktivsten Carboxamide an MM-Zellen im submikromolaren Bereich wirksam waren, zeigte mit Ausnahme des phenolsubstituierten Derivats trans-24r keine der getesteten Verbindungen toxische Effekte an PBMCs (EC50 > 100 μM). Dar{\"u}ber hinaus legen detaillierte Westernblot-Analysen einen HSP70-spezifischen Wirkmechanismus nahe. Außerdem f{\"u}hrte eine duale Hemmung von HSP70 und HSP90 durch gleichzeitige Inkubation mit trans-24i und NVP-AUY922 (5) zu einem additiven pro-apoptotischen Effekt bei MM-Zellen. Aufgrund der vielversprechenden In-vitro-Ergebnisse und seiner guten L{\"o}slichkeit wurde trans-39c in vivo untersucht. Zu diesem Zweck wurden zun{\"a}chst die physikochemischen Parameter pKa, logP und L{\"o}slichkeit sowie die Plasma-Proteinbindung ermittelt (in Kooperation mit AG Meinel). Auf Basis einer im Anschluss durchgef{\"u}hrten Pharmakokinetik-Simulation wurden zwei unterschiedliche Dosierungen gew{\"a}hlt. Toxizit{\"a}tsuntersuchungen von trans-39c zeigten keine H{\"a}molyseaktivit{\"a}t und keinen Effekt auf die Viabilit{\"a}t von Leber- und Nierenzellen (H. Bruhn). F{\"u}r die In-vivo-Studie wurde ein murines MM-Modell verwendet, das auf MOPC-315.BM-Luciferase+-Zellen basiert und eine nicht-invasive In-vivo-Bestimmung der Tumorentwicklung via Biolumineszenz erm{\"o}glicht (AG Beilhack). {\"U}ber einen Zeitraum von zehn Tagen wurde zwei Gruppen mit jeweils f{\"u}nf Tieren behandelt. Dazu wurde trans-39c (4 bzw. 40 μg) im Abstand von 12 h intraperitoneal appliziert. Alle Versuchstiere tolerierten die Behandlung und die mit einer Dosis von 40 μg therapierte Gruppe zeigte eine signifikante Reduktion des Tumorwachstums gegen{\"u}ber einer unbehandelten Kontrollgruppe. Dieses Ergebnis konnte zus{\"a}tzlich durch eine im Anschluss durchgef{\"u}hrte Ex-vivo-Untersuchung best{\"a}tigt werden, bei der die Tumorlast in verschiedenen Knochen und Geweben ermittelt wurde. Die Tetrahydroisochinolinon-Derivate haben sich damit als ausgezeichnete Leitstruktur f{\"u}r die Weiterentwicklung als HSP70-Inhibitoren erwiesen und k{\"o}nnten in Zukunft zu einem deutlichen Fortschritt bei der Behandlung des Multiplen Myeloms beitragen.},
  subject      = {Plasmozytom},
  language  = {de}
}