@phdthesis{Hettwer2024,
  author    = {Hettwer, Anette},
  title     = {Entwicklung und Charakterisierung einer l{\"o}slichen und funktionalen BMP-2-Variante},
  doi       = {10.25972/OPUS-32680},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-326800},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2024},
  abstract  = {Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind potente Differenzierungs- und Wachstumsfaktoren, die strukturell der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) - Superfamilie zugeordnet werden. Sie spielen eine Schl{\"u}sselrolle in einer Vielzahl an zellul{\"a}ren Prozessen ab den fr{\"u}hen Stadien der Embryogenese. Dadurch sind BMPs nicht nur f{\"u}r die korrekte Festlegung der embryonalen K{\"o}rperachse verantwortlich, sondern regulieren als multifunktionale Mediatoren neben der Morphogenese auch Proliferation, Differenzierung und Apoptose unterschiedlicher Zelltypen. Bone Morphogenetic Proteins sind somit f{\"u}r die Aufrechthaltung der Hom{\"o}ostase im adulten K{\"o}rper mitverantwortlich. Ihre Funktionalit{\"a}t vermitteln die BMPs {\"u}ber eine Signalkaskade, indem sie als dimeres Protein spezifische transmembrane Serin/Threonin-Kinaserezeptoren von Typ I und Typ II in einem heteromeren Komplex assemblieren. Die intrazellul{\"a}re Signalweiterleitung verl{\"a}uft {\"u}ber verschiedene Signalkaskaden (Smad-Proteine oder MAPKs), wodurch final im Zellkern {\"A}nderungen auf der Ebene der Gentranskription ausgel{\"o}st werden. Laut der namensgebenden Eigenschaft fungieren einige Wachstumsfaktoren als aktive Induktoren der Knochenbiosynthese. Ihre Anwesenheit ist essentiell f{\"u}r die vielen zellul{\"a}ren Prozesse, die w{\"a}hrend einer Frakturheilung auftreten, wobei eine Knochenneubildung ebenso stark abh{\"a}ngig ist vom Zusammenspiel verschiedener Stimulatoren und Inhibitoren, die die BMPs in ihrer Aktivit{\"a}t regulieren. Bedingt durch ihr großes Potential fanden die erstmals durch Marshal Urist 1965 aus Knochenmaterial isolierten BMP-Proteine ihren Einsatz in der regenerativen Medizin. Kommerziell erh{\"a}ltlich und bereits seit vielen Jahren in der klinischen Anwendung befindet sich derzeit das rhBMP-2 und rhBMP-7. Diese beiden Wachstumsfaktoren werden u.a. verwendet, um die Heilungsprozesse von langwierigen Schienbeinfrakturen zu verbessern, aber auch bei degenerativen Wirbels{\"a}ulenerkrankungen und in der Kieferchirurgie. Jedoch f{\"u}hrt die schlechte L{\"o}slichkeit des BMPs aufgrund der ausgepr{\"a}gten Aggregationstendenz zu gravierenden Problemen, nicht nur w{\"a}hrend der biotechnologischen Herstellung, sondern auch bei der klinischen Anwendung. Der Schwerpunkt des Optimierungsbedarfs der BMP-2 Herstellung im Rahmen dieser Doktorarbeit lag daher auf der Etablierung eines prokaryotischen Expressionssystems f{\"u}r die l{\"o}sliche Produktion von BMP-2. Daf{\"u}r wurde zun{\"a}chst der Fokus auf die ung{\"u}nstigen L{\"o}slichkeitseigenschaften des Wachstumsfaktors gelegt. Um die hohe Aggregationsneigung des BMP-2 w{\"a}hrend der Produktion in Escherichia coli zu minimieren, wurden anhand einer Algorithmus-basierten Analyse BMP-2-Varianten entworfen, in denen Aminos{\"a}uren mit stark hydrophoben Eigenschaften gegen solche mit hydrophilem Charakter ausgetauscht wurden. Hierdurch konnten die zur Aggregation neigenden Bereiche des BMP-2 weitestgehend eliminiert werden. Es wurden f{\"u}r die bez{\"u}glich ihrer L{\"o}slichkeit optimierten Proteinvarianten unterschiedliche Expressionsstrategien etabliert, wodurch dimere BMP-2-Muteine in angepassten chromatographischen Profilen mit einem Aufreinigungsschritt und ohne jegliche Renaturierungsmaßnahmen gewonnen wurden. Allerdings verbleiben hierbei Restmengen an bakteriellen Kontaminationen, die vorwiegend aus endogenen ribosomalen E. coli-Proteinen stammen und nicht vollst{\"a}ndig entfernt werden konnten. W{\"a}hrend der umfassenden in vitro Charakterisierung der BMP-2-Varianten konnte durch massenspektroskopische Analysen die Gesamtmasse beider Zielproteine best{\"a}tigt werden, wobei sequenzspezifische Fragmente eine eindeutige Identifikation der eingebrachten Mutationen erm{\"o}glichten. CD-spektroskopische Analysen erweitert um Auswertealgorithmen konnten die wesentlichen Wt-BMP-2-typischen Sekund{\"a}rstrukturelemente identifizieren. Die neu generierten BMP-2-Varianten zeigen in der dynamischen Lichtstreuungsanalyse stark verminderte Aggregationstendenz im Vergleich zum Wildtyp-BMP-2. Dessen Aggregationsverhalten wurde durch die kombinierte Analytik seiner mikrofluidischen Diffusion und der dynamischen Lichtstreuung zum ersten Mal {\"u}ber den Konzentrationsbereich von 0.5 µM bis 100 mM genau charakterisiert. Erste zellbiologische Versuche verliefen ohne Erfolg, wodurch die biologische Aktivit{\"a}t der BMP-Varianten nicht abschließend gekl{\"a}rt werden konnte. Die simple Methode zur Expression und Aufreinigung der hydrophilisierte BMP-2-Muteine aus dieser Dissertation kann leicht in einen gr{\"o}ßeren Produktionsmaßstab {\"u}berf{\"u}hrt werden. BMP 2 kann dadurch schneller und kosteng{\"u}nstiger hergestellt werden. Final bleibt es jedoch erforderlich, die biologische Aktivit{\"a}t der neuen l{\"o}slichen BMP-2-Varianten vollst{\"a}ndig zu charakterisieren, um deren ganzes Funktionsspektrum zu entdecken. Der Fokus weiterer Forschung sollte zudem auf die verbleibende Oligomerisierungstendenz und die bestehende Kontamination mit Fremdproteinen gelegt werden, da diese beiden Faktoren letztendlich die Ausbeute an dimeren BMP-2 Varianten aus diesem System derzeit minimieren.},
  subject      = {Knochen-Morphogenese-Proteine},
  language  = {de}
}