@phdthesis{Leitschuh2018,
  author    = {Leitschuh, Andrea},
  title     = {Endotheliale Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe zur Anwendung im Tissue Engineering},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-153180},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {In der regenerativen Medizin gewinnt die Herstellung eines funktionsf{\"a}higen und biokompatiblen Gewebeersatzes durch Techniken des Tissue Engineerings zunehmende Bedeutung. Eine Grundlage dieser Technologie bilden k{\"o}rpereigene Zellen, die sich in vitro kultivieren und in verschiedene Gewebetypen differenzieren lassen, sogenannte adulte mesenchymale Stammzellen. Diese k{\"o}nnen u.a. aus Fettgewebe leicht und in gr{\"o}ßerer Anzahl isoliert und kultiviert werden (adipose-derived stem cells, ASC). In Anwesenheit Zelllinien-spezifischer Induktoren lassen sich diese Zellen zu Adipozyten, Osteoblasten und Chondrozyten differenzieren und f{\"u}r die Herstellung entsprechender Gewebekonstrukte nutzen. Eine erfolgreiche Differenzierung dieser Stammzellen zu Endothelzellen k{\"o}nnte in den durch Tissue Engineering generierten Gewebekonstrukten die Ausbildung eines funktionsf{\"a}higen Blutgef{\"a}ßsystems in vivo beschleunigen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die endotheliale Differenzierung von ASC unter Zusatz angiogener Wachstumsfaktoren sowie hypoxischer Behandlung der Zellen zu untersuchen und im Hinblick auf eine Anwendung im Tissue Engineering zu optimieren. Dabei sollte gleichzeitig untersucht werden, ob unter diesen Bedingungen die Differenzierung der ASC in eine andere Zelllinie (Adipozyten) m{\"o}glich ist. Die Untersuchungen wurden mit Stammzellen durchgef{\"u}hrt, welche mittels Liposuktion aus subkutanem Fettgewebe gewonnen wurden. Diese Zellen wurden zun{\"a}chst vergleichend in endothelzellspezifischem Medium mit angiogenen Faktoren (VEGF, bFGF) bzw. unter hypoxischen Bedingungen (3\% Sauerstoff) kultiviert und die Differenzierung zu Endothelzellen anhand verschiedener endothelzellspezifischer Marker nachgewiesen. Zun{\"a}chst wurde mittels Immunfluoreszenzf{\"a}rbung die Expression des endothelialen Oberfl{\"a}chenantigens CD31 untersucht. Eine Quantifizierung der CD31-positiven Zellpopulation erfolgte im Anschluss durch Ausz{\"a}hlung mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops. Die endotheliale Differenzierung der ASC konnte bereits nach Zugabe der einzelnen Wachstumsfaktoren nachgewiesen werden. Der kombinierte Einsatz der beiden Faktoren f{\"u}hrte zu einem Anstieg CD31-positiver Zellen. Des Weiteren ließ sich eine st{\"a}rkere induktive Wirkung f{\"u}r bFGF im Vergleich zu VEGF demonstrieren. Durch Kultivierung der Zellen unter hyoxischen Bedingungen konnte ebenfalls eine endotheliale Differenzierung erzielt werden. Diese entsprach im Umfang etwa dem Ausmaß an differenzierten Zellen unter Wachstumsfaktoreneinfluss in Normoxie. Als aussichtsreichste Kultivierungsstrategie f{\"u}r die endotheliale Differenzierung der ASC stellte sich jedoch die Kultivierung der Zellen unter Einsatz der Wachstumsfaktorenkombination (bFGF und VEGF) in Hypoxie dar. Hier konnte zum einen eine Abh{\"a}ngigkeit von der Konzentration der eingesetzten Faktoren demonstriert werden und zum andern ein Synergismus zwischen Hypoxie und kombiniertem Wachstumsfaktoreneinsatz festgestellt werden. Denn die Anzahl an CD31-positiven Zellen in der Gruppe mit den hochkonzentriert zugesetzten Wachstumsfaktoren entsprach nicht einfach der Addition der Zellzahl unter Einzelbedingungen, sondern lag deutlich h{\"o}her. Insgesamt ist das Ausmaß der endothelial differenzierten ASC im Vergleich zur Ausgangspopulation allerdings als gering zu beurteilen, denn nur 0,5 - 1,1\% der eingesetzten ASC zeigten endotheliale Marker. Zur weiteren Charakterisierung der endothelial differenzierten ASC wurden die endothelzellspezifische Aufnahme von DilacLDL, ein mit dem Farbstoff Dil markiertes Lipoprotein, und die tube formation auf Matrigel untersucht. Hier konnte bei einigen Zellen die Inkorporation von DilacLDL nachgewiesen werden. Beim Matrigel-Assay zeigten sich allerdings deutliche morphologische Unterschiede im Vergleich zu naiven Endothelzellen. Eine Immunfluoreszenzf{\"a}rbung gegen den von Willebrand Faktor fiel negativ aus. Um den positiven Einfluss der hypoxischen Kulturbedingungen weiter zu ermitteln, wurde der Effekt der Hypoxie auf die Sekretion angiogener Wachstumsfaktoren am Beispiel von VEGF mittels enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) untersucht. Es zeigte sich ein deutlicher Anstieg der endogenen VEGF-Sekretion unter hypoxischen Bedingungen im Vergleich zur Normoxie. Die Steigerung der endogenen Wachstumsfaktorsekretion hat m{\"o}glicherweise einen Anteil am Mechanismus des Hypoxieeffektes. Hier sollten weitere Untersuchungen, allen voran zur bFGF-Sekretion angeschlossen werden. Neben der endothelialen Differenzierung der ASC wurde {\"u}berpr{\"u}ft, ob unter den oben genannten Bedingungen eine ad{\"a}quate Adipogenese stattfindet. Das wurde durch quantitative Messung des Triglyceridgehalts sowie Untersuchung der Expression adipogener Marker wie CEBPα, PPARγ, FABP und GLUT 4 erfasst. Hier konnte gezeigt werden, dass die Adipogenese der Stammzellen unter den beschriebenen Bedingungen unbeeintr{\"a}chtigt bleibt und somit eine Anwendung im TE von Fettgewebe m{\"o}glich macht. Mit der endothelialen Differenzierung unter unterschiedlichen Bedingungen zeigen die Ergebnisse der Arbeit eine Facette des Potentials der ASC. Ob die endothelial differenzierten ASC tats{\"a}chlich zu einer Verbesserung der Vaskularisierung von TE-Konstrukten f{\"u}hren, sollte in einer weiterf{\"u}hrenden In-vivo-Studie evaluiert werden.},
  subject      = {endothelial},
  language  = {de}
}