@phdthesis{Plank2019,
  author    = {Plank, Christina},
  title     = {Untersuchung von Dihydroisochinolinonderivaten als m{\"o}gliche Inhibitoren von Hsc70},
  doi       = {10.25972/OPUS-16265},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-162655},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Einhergehend mit einer steigenden Lebenserwartung nimmt auch die Zahl der am Multiplen Myelom Erkrankten zu. Bis dato gibt es nur wenige Therapieans{\"a}tze dieser selten vorkommenden Blutkrebserkrankung. Im Zusammenhang mit der Entstehung des Multiplen Myeloms stehen vor allem zwei bedeutende Hitzeschockproteine: Hsp90 und Hsp70. Beide haben die Aufgabe, Zellen vor Apoptose zu sch{\"u}tzen. In proliferierenden Plasmazellen ist eine {\"U}berexpression an Hsp90 zu beobachten. Entwickelte Inhibitoren f{\"u}hrten zwar zu einer verminderten Hsp90-Aktivit{\"a}t, allerdings wurde diese durch eine vermehrte Expression von Hsp70 kompensiert, weshalb Myelomzellen weiterhin proliferierten. Aus diesem Grund bietet sich Hsp70 als weiterer Angriffspunkt in der Therapierung des Multiplen Myeloms an. Die bislang entwickelten Inhibitoren binden entweder an die Nukleotid- oder Substratbindedom{\"a}ne. Da beide Stellen unspezifisch sind, wurden durch virtuelles Screening potenzielle Inhibitoren f{\"u}r Hsp70 identifiziert, welche in vitro und in vivo tats{\"a}chlich Effekte hinsichtlich der Herunterregulierung von Hsp70 zeigten. Ob die entwickelten Substanzen jedoch direkt an Hsp70 binden, war die Fragestellung der vorliegenden Arbeit. In dieser Arbeit wurde untersucht, inwiefern die entwickelten Inhibitoren an Hsp70 binden und dieses inhibieren. Die humane Hsp70-Familie besitzt sechzehn Mitglieder, die alle {\"a}hnliche Aufgaben und Strukturmerkmale aufweisen. F{\"u}r die durchgef{\"u}hrten Versuche wurde die Hsp70-Isoform Hsc70 verwendet. In einem Protein-Ligand-Assay konnte gezeigt werden, dass die meisten Verbindungen durch Aggregatbildung zu einer Inhibition von Hsc70 f{\"u}hrten. Durch Zugabe von Detergenz konnten die gebildeten Aggregate aufgebrochen und so der Inhibitionseffekt aufgehoben bzw. deutlich reduziert werden. Damit konnte gezeigt werden, dass die in Zell- und Mausversuchen beobachteten Effekte vermutlich nicht auf eine direkte Inhibition von Hsc70 zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind. Ob diese Effekte nun ebenfalls auf Aggregatbildung beruhen oder aber ein anderes Protein als das vermutete Hsc70 inhibiert wird, was {\"u}ber eine Signalkaskade zur Inhibition von Hsc70 f{\"u}hrt, w{\"a}re eine interessante Fragestellung f{\"u}r weitere Untersuchungen. Da sowohl in NMR-Versuchen als auch dem durchgef{\"u}hrten Protein-Ligand-Assay gezeigt werden konnte, dass die vormals als potenzielle Inhibitoren entwickelten Verbindungen nur schwach aktiv sind, wurde durch Fragment-basierte Ans{\"a}tze eine andere Bindestelle f{\"u}r m{\"o}gliche Inhibitoren identifiziert. Hierbei konnte N-Acetyl-D-Glucosamin in der Nukleotidbindedom{\"a}ne von Hsc70 detektiert werden. Hieraus k{\"o}nnten sich neue Ans{\"a}tze zur Entwicklung neuartiger in silico entwickelter Hsc70-Inhibitoren ergeben. Ausgangspunkt f{\"u}r die Docking-Studien zur Entwicklung neuer Hsp70-Inhibitoren war die Kristallstruktur von bHsc70 ED 1-554, einer trunkierten Doppelmutante des nativen Hsc70. Bis dato ist diese 554 Aminos{\"a}uren umfassende Mutante die einzige Hsc70-Variante von der die Zweidom{\"a}nenstruktur kristallisiert werden konnte. F{\"u}r dieses Konstrukt wurde zun{\"a}chst ein optimiertes Aufreinigungsprotokoll entwickelt, um dann Kristallisationsversuche mit ausgew{\"a}hlten AH-Verbindungen, die in den Docking-Studien entwickelt wurden, durchzuf{\"u}hren. Hierbei konnte jedoch keine Bindung festgestellt werden. Die Kristallisation mit Ver-155008, einem bekannten Hsc70-Inhibitor, f{\"u}hrte jedoch zur ersten Zweidom{\"a}nenstruktur von Hsc70 mit gebundenem Ver-155008. Neben der obigen Fragestellung wurde außerdem untersucht, wie funktional aktiv das trunkierte Hsc70-Konstrukts ist. Hier zeigte sich, dass aufgrund des fehlenden C-Terminus zwar eine geringe Aktivit{\"a}t von 30 \% im Vergleich zur Volll{\"a}nge zu beobachten war. F{\"u}r eine nahezu vollst{\"a}ndige R{\"u}ckfaltungsaktivit{\"a}t ist aber der C-Terminus essentiell. Weiterhin konnte in ITC-Versuchen der Kd-Wert von Ver-155008 an die verwendete Mutante ermittelt werden, der dem bereits bekannten Kd von Ver-155008 an das native Hsc70 {\"a}hnlich ist.},
  subject      = {Hitzeschockproteine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hoffmann2017,
  author    = {Hoffmann, Helene},
  title     = {Identifying regulators of tumor vascular morphology},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-142348},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2017},
  abstract  = {In contrast to normal vessels, tumor vasculature is structurally and functionally abnormal. Tumor vessels are highly disorganized, tortuous and dilated, with uneven diameter and excessive branching. Consequently, tumor blood flow is chaotic, which leads to hypoxic and acidic regions in tumors. These conditions lower the therapeutic effectiveness and select for cancer cells that are more malignant and metastatic. The therapeutic outcome could be improved by increasing the functionality and density of the tumor vasculature. Tumor angiogenesis also shows parallels to epithelial to mesenchymal transition (EMT), a process enabling metastasis. Metastasis is a multi-step process, during which tumor cells have to invade the surrounding host tissue to reach the circulation and to be transported to distant sites. We hypothesize that the variability in the phenotype of the tumor vasculature is controlled by the differential expression of key transcription factors. Inhibiting these transcription factors might be a promising way for angiogenic intervention and vascular re-engineering. Therefore, we investigated the interdependence of tumor-, stroma- and immune cell-derived angiogenic factors, transcription factors and resulting vessel phenotypes. Additionally, we evaluated whether transcription factors that regulate EMT are promising targets for vascular remodeling. We used formalin fixed paraffin embedded samples from breast cancer patients, classified according to estrogen-, progesterone- and human epidermal growth factor receptor (HER) 2 status. Establishing various techniques (CD34 staining, laser microdissection, RNA isolation and expression profiling) we systematically analyzed tumor and stroma-derived growths factors. In addition, vascular parameters such as microvessel size, area, circularity and density were assessed. Finally the established expression profiles were correlated with the observed vessel phenotype. As the SNAI1 transcriptional repressor is a key regulator of EMT, we examined the effect of vascular knockdown of Snai1 in murine cancer models (E0771, B16-F10 and lewis lung carcinoma). Among individual mammary carcinomas, but not among subtypes, strong differences of vascular parameters were observed. Also, little difference between lobular carcinomas and ductal carcinomas was found. Vessel phenotype of Her2 enriched carcinomas was similar to that of lobular carcinomas. Vessel morphology of luminal A and B and basal-like tumors resembled each other. Expression of angiogenic factors was variable across subtypes. We discovered an inverse correlation of PDGF-B and VEGF-A with vessel area in luminal A tumors. In these tumors expression of IL12A, an inhibitor of angiogenesis, was also correlated with vessel size. Treatment of endothelial cells with growth factors revealed an increased expression of transcription factors involved in the regulation of EMT. Knockdown of Snai1 in endothelial cells of mice increased tumor growth and decreased hypoxia in the E0771 and the B16-F10 models. In the lewis lung carcinomas, tumor vascularity and biodistribution of doxorubicin were improved. Here, doxorubicin treatment in combination with the endothelial cell-specific knockdown did slow tumor growth. This shows that SNAI1 is important for a tumor's vascularization, with the significance of its role depending on the tumor model. The methods established in this work open the way for the analysis of the expression of key transcription factors in vessels of formalin fixed paraffin embedded tumors. This research enables us to find novel targets for vascular intervention and to eventually design novel targeted drugs to inhibit these targets.},
  subject      = {Antiangiogenese},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Carstensen2018,
  author    = {Carstensen, Anne Carola},
  title     = {Identification of novel N-MYC interacting proteins reveals N-MYC interaction with TFIIIC},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-143658},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {N-MYC is a member of the human MYC proto-oncogene family, which comprises three transcription factors (C-, N- and L-MYC) that function in multiple biological processes. Deregulated expression of MYC proteins is linked to tumour initiation, maintenance and progression. For example, a large fraction of neuroblastoma displays high N-MYC levels due to an amplification of the N-MYC encoding gene. MYCN-amplified neuroblastoma depend on high N-MYC protein levels, which are maintained by Aurora-A kinase. Aurora-A interaction with N-MYC interferes with degradation of N-MYC via the E3 ubiquitin ligase SCFFBXW7. However, the underlying mechanism of Aurora-A-mediated stabilisation of N-MYC remains to be elucidated. To identify novel N-MYC interacting proteins, which could be involved in N-MYC stabilisation by Aurora-A, a proteomic analysis of purified N-MYC protein complexes was conducted. Since two alanine mutations in MBI of N-MYC, T58A and S62A (N-MYC mut), disable Aurora-A-mediated stabilisation of N-MYC, N-MYC protein complexes from cells expressing either N-MYC wt or mut were analysed. Proteomic analysis revealed that N-MYC interacts with two deubiquitinating enzymes, USP7 and USP11, which catalyse the removal of ubiquitin chains from target proteins, preventing recognition by the proteasome and subsequent degradation. Although N-MYC interaction with USP7 and USP11 was confirmed in subsequent immunoprecipitation experiments, neither USP7, nor USP11 was shown to be involved in the regulation of N-MYC stability. Besides USP7/11, proteomic analyses identified numerous additional N-MYC interacting proteins that were not described to interact with MYC transcription factors previously. Interestingly, many of the identified N-MYC interaction partners displayed a preference for the interaction with N-MYC wt, suggesting a MBI-dependent interaction. Among these were several proteins, which are involved in three-dimensional organisation of chromatin domains and transcriptional elongation by POL II. Not only the interaction of N-MYC with proteins functioning in elongation, such as the DSIF component SPT5 and the PAF1C components CDC73 and CTR9, was validated in immunoprecipitation experiments, but also with the POL III transcription factor TFIIIC and topoisomerases TOP2A/B. ChIP-sequencing analysis of N-MYC and TFIIIC subunit 5 (TFIIIC5) revealed a large number of joint binding sites in POL II promoters and intergenic regions, which are characterised by the presence of a specific motif that is highly similar to the CTCF motif. Additionally, N-MYC was shown to interact with the ring-shaped cohesin complex that is known to bind to CTCF motifs and to assist the insulator protein CTCF. Importantly, individual ChIP experiments demonstrated that N-MYC, TFIIIC5 and cohesin subunit RAD21 occupy joint binding sites comprising a CTCF motif. Collectively, the results indicate that N-MYC functions in two biological processes that have not been linked to MYC biology previously. Furthermore, the identification of joint binding sites of N-MYC, TFIIIC and cohesin and the confirmation of their interaction with each other suggests a novel function of MYC transcription factors in three-dimensional organisation of chromatin.},
  subject      = {Biologie},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Zoelch2019,
  author    = {Z{\"o}lch, Michael Ludwig},
  title     = {Effekt der Interleukin-1 Rezeptor-assoziierten Kinase 2 (IRAK2)-Mutation N333D auf den Signalweg von TLR4},
  doi       = {10.25972/OPUS-18067},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-180678},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {IRAK2 besitzt eine Schl{\"u}sselrolle im Signalweg des TLR4. Fehlregulationen dieses Signalwegs f{\"u}hren zu fehlgeleiteten Immunreaktionen, die auch die Entstehung und Progression von Krebserkrankungen f{\"o}rdern. Bevor IRAK2 als therapeutisches Ziel in Frage kommen kann, muss erst noch weitere Klarheit {\"u}ber die grunds{\"a}tzliche Funktionsweise dieses Proteins bestehen. So ist f{\"u}r IRAK2 aufgrund der Substitution einer Aminos{\"a}ure in der Kinase-Dom{\"a}ne im Vergleich zu IRAK1 noch nicht abschließend gekl{\"a}rt, ob es sich um eine aktive Kinase oder eine Pseudokinase handelt und ob diese Ver{\"a}nderung eine Erh{\"o}hung oder eine Erniedrigung der Funktion im TLR4-Signalweg nach sich zieht. Um diese Fragen anzugehen, wurde in dieser Arbeit Asparagin im vermeintlich aktiven Zentrum (Aminos{\"a}ure 333) wieder zur Asparagins{\"a}ure [N333D] revertiert und damit versucht die Phosphorylierungsaktivit{\"a}t zu steigern bzw. vergleichbar zu IRAK1 wiederherzustellen. Das Einbringen der Mutation in IRAK2 erfolgte mittels ortsspezifischer Mutagenese. Mit dieser und anderen Mutanten und mit wildtypischem IRAK2 wurden durch die CRISPR/Cas9-Methode generierte IRAK2-defiziente 264.7 Makrophagen rekonstituiert und damit ein System etabliert, mit dem der Einfluss der Mutation auf den Signalweg des TLR4 nach Stimulation mit LPS quantitativ analysiert werden konnte. Sowohl die indirekte NF-κB-Messung {\"u}ber CD40-Expression als auch die direkte NF-κB-Messung {\"u}ber die NF-κB-getriebene Expression eines Reportergens (cyan fluorescent protein) ergab, dass IRAK2[N333D] die LPS-abh{\"a}ngige NF-κB-Aktivierung {\"u}ber den TLR4 Signalweg schlechter erm{\"o}glicht als IRAK2. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die in der Entwicklungsgeschichte aufgetretene Ver{\"a}nderung des aktiven Zentrums von IRAK2 im Vergleich zu IRAK1 zu einer besseren Aktivierung der MyD88-abh{\"a}ngigen NF-κB-Aktivit{\"a}t f{\"u}hrte und somit eine erh{\"o}hte und l{\"a}nger anhaltende Signalleitung erm{\"o}glichte. Diese Erkenntnis kann als weiterer Schritt hin zu einem besseren Verst{\"a}ndnis der Funktion des IRAK2-Proteins und zu einer m{\"o}glichen zuk{\"u}nftigen Verwendung von IRAK2 als Ziel therapeutischer Behandlungen gesehen werden.},
  subject      = {Toll-like-Rezeptoren},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Klemm2020,
  author    = {Klemm, Theresa Antonia},
  title     = {Minor differences cause major effects: How differential oligomerization regulates the activities of USP25 and USP28},
  doi       = {10.25972/OPUS-19108},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-191080},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {Deubiquitinases are regulators of the ubiquitin proteasome system that counteract the ubiquitination cascade by removing ubiquitin from substrates and cleaving ubiquitin chains. Due to their involvment in various important pathways, they are associated with several diseases and may thus present promising drug targets. The two related ubiquitin specific proteases USP25 and USP28 share a highly conserved amino acid sequence but perform distinct biological functions. USP28 plays roles in cell cycle regulation and was also linked to several types of cancer. It adopts oncogenic functions by rescuing the oncoproteins MYC and JUN from proteasomal degradation, which is induced by the E3-ligase SCF (FBW7). Opposingly, USP28 also regulates the stability of the tumor suppressor FBW7 itself. USP25 contributes to a balanced innate immune system by stabilizing TRAF3 and TRAF6 and lately was found to promote Wnt-signaling by deubiquitinating TNKS. Due to the high level of identity of both proteases, a recent attempt to inhibit USP28 led to cross reactivity against USP25. In our study, we characterized both USP25 and USP28 structurally and functionally using x-ray crystallography, biochemical as well as biophysical approaches to determine similarities and differences that can be exploited for the development of specific inhibitors. The crystal structure of the USP28 catalytic domain revealed a cherry-couple like dimer that mediates self-association by an inserted helical subdomain, the USP25/28 catalytic domain inserted domain (UCID). In USP25, the UCID leads to formation of a tetramer composed of two interlinked USP28-like dimers. Structural and functional analysis revealed that the dimeric USP28 is active, whereas the tetrameric USP25 is auto inhibited. Disruption of the tetramer by a cancer-associated mutation or a deletion-variant activates USP25 through dimer formation in in vitro assays and leads to an increased stability of TNKS in cell studies. Furthermore, in vitro data showed that neither ubiquitin nor substrate binding led to the activation of the USP25 tetramer construct. With the structure of the C-terminal domain of USP25, we determined the last unknown region in the enzyme as a separately folded domain that mediates substrate interactions. Combined the structures of the USP25 and USP28 catalytic domains and the functional characterization of both enzymes provide novel insights into the regulation of USPs by oligomerization. Furthermore, we identified individual features of each protease that might be explored for the development of specific small molecule inhibitors.},
  subject      = {Oligomerisation},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Auer2021,
  author    = {Auer, Daniela},
  title     = {Impact of the chlamydial deubiquitinase ChlaDUB1 on host cell defense},
  doi       = {10.25972/OPUS-17846},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-178462},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {The human pathogen Chlamydia trachomatis is the main cause of sexually transmitted infections worldwide. The obligate intracellular bacteria are the causative agent of several diseases that reach from conjunctivitis causing trachoma and blindness as well as salpingitis and urethritis which can lead to infertility if left untreated. In order to gain genetically engineered Chlamydia that inducible knock down specific gene expression, the CRISPRi system was established in C. trachomatis. In a proof of principle experiment it was shown that C. trachomatis pCRISPRi:gCdu1III target ChlaDUB1 expression and reduce the protein amount up to 50 \%. Knock-down of the DUB did not influence protein levels of anti-apoptotic Mcl-1 and did not make cells susceptible for apoptosis. However, reduced dCas9 protein size, bacterial growth impairment and off target effects interfering with the GFP signal, form obstacles in CRISPRi system in Chlamydia. For routinely use of the CRISPRi method in C. trachomatis further investigation is needed. Since the bacterial life cycle includes two morphological and functional distinct forms, it is essential for chlamydial spread to complete the development cycle and form infectious progeny. Therefore, Chlamydia has evolved strategies to evade the host immune system in order to stay undetected throughout the developmental cycle. The bacteria prevent host cell apoptosis via stabilization of anti-apoptotic proteins like Mcl-1, Survivin and HIF-1α and activate pro-survival pathways, inhibiting invasion of immune cells to the site of infection. The host cell itself can destroy intruders via cell specific defense systems that involve autophagy and recruitment of professional immune cells. In this thesis the role of the chlamydial deubiuqitinase ChlaDUB1 upon immune evasion was elucidated. With the mutant strain Ctr Tn-cdu1 that encodes for a truncated DUB due to transposon insertion, it was possible to identify ChlaDUB1 as a potent opponent of the autophagic system. Mutant inclusions were targeted by K48 and K63 chain ubiquitination. Subsequently the inclusion was recognized by autophagic receptors like p62, NBR1 and NDP52 that was reversed again by complementation with the active DUB. Xenophagy was promoted so far as LC3 positive phagosomes formed around the inclusion of Ctr Tn-cdu1, which did not fuse with the lysosome. The detected growth defect in human primary cells of Chlamydia missing the active DUB was not traced back to autophagy, but was due to impaired development and replication. It was possible to identify Ankib1, the E3 ligase, that ubiquitinates the chlamydial inclusion in a siRNA based screen. The activating enzyme Ube1 and the conjugating enzyme Ube2L3 are also essential in this process. Chlamydia have a reduced genome and depend on lipids and nutrients that are translocated from the host cell to the inclusion to proliferate. Recruitment of fragmented Golgi stacks to the inclusion surface was prevented when ChlaDUB1 was inactive, probably causing diminished bacterial growth. Additionally, the modification of the inclusion by Ankib1 and subsequent decoration by autophagic markers was not only present in human but also murine cells. Comparison of other Chlamydia strains and species revealed Ankib1 to be located at the proximity of the inclusion in C. trachomatis strains only but not in C. muridarum or C. pneumoniae, indicating that Ankib1 is specifically the E3 ligase of C. trachomatis. Moreover, the role of ChlaDUB1 in infected tissue was of interest, since ChlaDUB1 protein was also found in early EB stage and so might get in contact with invading immune cells after cell lysis. While bacteria spread and infect new host cells, Chlamydia can also infect immune cells. Infection of human neutrophils with Ctr Tn-cdu1 shows less bacterial survival and affirms the importance of the DUB for bacterial fitness in these cells.},
  subject      = {Chlamydia},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Lyga2017,
  author    = {Lyga, Sandra},
  title     = {Glycoprotein hormone receptor signaling in the endosomal compartment},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-139994},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2017},
  abstract  = {G protein-coupled receptors (GPCRs) are the major group of cell-surface receptors that transmit extracellular signals via classical, G protein-dependent pathways into the cell. Although GPCRs were long assumed to signal exclusively from the cell-surface, recent investigations have demonstrated a possibly completely new paradigm. In this new view, GPCR continues signaling via 3´,5´-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) after their agonist-induced internalization of ligand/receptor complexes into an intracellular compartment, causing persistent cAMP elevation and apparently specific signaling outcomes. The thyroid stimulating hormone (TSH) receptor is one of the first GPCRs, which has been reported to show persistent signaling after ligand removal (Calebiro et al., 2009). In the meantime, signaling by internalized GPCR become a highly investigated topic and has been shown for several GPCRs, including the parathyroid hormone receptor (Ferrandon et al., 2009), D1 dopamine receptor (Kotowski et al., 2011) and beta2-adrenergic receptor (Irannejad et al., 2013). A recent study on the beta2-adrenergic receptor revealed that internalized receptor not only participates in cAMP signaling, but is also involved in gene transcription (Tsvetanova and von Zastrow, 2014). However, a biological effect of GPCR signaling at intracellular sites, which would demonstrate its physiological relevance, still remained to be shown. To investigate GPCR signaling from intracellular compartment under physiological condition, two different cellular models were utilized in the present study: intact ovarian follicles expressing luteinizing hormone (LH) receptors and primary thyroid cells expressing TSH receptors. Intact ovarian follicles were obtained from a transgenic mouse expressing, a F{\"o}rster/Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) sensor for cAMP to monitor cAMP/LH receptor signaling. This study provides the first accurate spatiotemporal characterization of cAMP signaling, which is derived from different cell layers of an intact ovarian follicle. Additionally, it could be shown that cAMP diffusion via gap junctions is implicated in spreading the LH-induced cAMP signals from one the outermost (mural granulosa) to the innermost (cumulus oophorus) cell layer of an ovarian follicle. Interestingly, LH receptor stimulation was associated with persistent cAMP signaling after LH removal and negligible desensitization of the cAMP signal. Interfering with receptor internalization with a dynamin inhibitor dynasore did not only prevent persistent LH-induced cAMP signaling, but also impaired the resumption of meiosis in follicle-enclosed oocytes, a key biological effect of LH. In order to investigate the downstream activation of protein kinase A (PKA) in primary thyroid cells, FRET sensors with different subcellular localization (plasma membrane, cytosol and nucleus) were transiently transfected into primary thyroid cells of wild-type mice via electroporation. Interestingly, TSH stimulation causes at least two distinct phases of PKA activation in the global primary thyroid cell, which are temporally separated by approximately 2 min. In addition, PKA activation in different subcellular compartments are characterized by dissimilar kinetics and amplitudes. Pharmacological inhibition of TSH receptor internalization largely prevented the second (i.e. late) phase of PKA activation as well as the subsequent TSH-dependent phosphorylation of CREB and TSH-dependent induction of early genes. These results suggest that PKA activation and nuclear signaling require internalization of the TSH receptor. Taken together, the data of the present study provide strong evidence that GPCR signaling at intracellular sites is distinct from the one occurring at the cell-surface and is highly physiologically relevant.},
  subject      = {GPCR},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Wollny2019,
  author    = {Wollny, Claudia},
  title     = {Der p97-Kofaktor UBXD1 ist ein neuer Regulator des NF-kB-Signalweges},
  doi       = {10.25972/OPUS-13243},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-132430},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Die essenzielle, Ubiquitin-selektive ATPase p97 reguliert eine Vielzahl unterschiedlicher Prozesse in Eukaryoten. Dazu z{\"a}hlen Proteinqualit{\"a}tskontrolle, DNA-Reparatur, Signaltransduktion, Zellzykluskontrolle, Autophagie sowie das endolysosomale System. Diese unterschiedlichen Funktionen von p97 werden durch die Bindung von Kofaktoren engmaschig gesteuert und kontrolliert. Die gr{\"o}ßte und am besten untersuchte Gruppe von p97-Kofaktoren sind die Proteine der UBX Familie. Diese zeichnen sich durch den Besitz einer UBX-Dom{\"a}ne aus, welche die Bindung an p97 vermittelt. Das in h{\"o}heren Eukaryoten konservierte Familienmitglied UBXD1 besitzt dar{\"u}ber hinaus mit einer PUB-Dom{\"a}ne und einem VIM-Motiv noch mindestens zwei weitere p97-Bindemodule. UBXD1 kann an Vesikel des endolysosomalen Degradationssytems lokalisieren, seine genauen zellul{\"a}ren Funktionen sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung von humanem UBXD1. Daf{\"u}r wurden Kandidaten eines zuvor durchgef{\"u}hrten Yeast-Two-Hybrid-Screens auf ihre Two Hybrid-Interaktion mit unterschiedlichen UBXD1-Varianten getestet. Dar{\"u}ber hinaus wurde durch Immunpr{\"a}zipitationsexperimente untersucht, ob die Kandidatenproteine auch in S{\"a}ugerzellen mit UBXD1 interagieren. Als vielversprechende neue Bindungspartner von UBXD1 wurden so die Ubiquitin-Ligase TRIAD3A und das Ubiquitin-editierende Protein A20 identifiziert. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen UBXD1 und A20 von einer funktionellen PUB Dom{\"a}ne und dem siebten Zinkfinger Motiv von A20 abh{\"a}ngig ist. Da sowohl TRIAD3A als auch A20 negative Regulatoren des NF B Signalweges sind, wurde daraufhin untersucht, ob auch UBXD1 eine Funktion in diesem Signalweg besitzt. Tats{\"a}chlich war in UBXD1-depletierten HeLa 57A-Zellen die NF B-abh{\"a}ngige Expression eines Reportgens nach Aktivierung des Signalweges durch TNF, IL-1, Doxorubicin und H2O2 stark reduziert. Dabei spricht die verringerte Aktivierung nach unterschiedlichen Stimuli f{\"u}r eine generelle Rolle von UBXD1 im NF B Signalweg. Durch quantitative Echtzeit-PCR konnte gezeigt werden, dass in HeLa- und HEK293T-Zellen nach UBXD1-Depletion auch die Expression endogener NF B Zielgene verringert ist. Da in UBXD1-depletierten Zellen nach Stimulation mit TNF oder IL-1 bereits die Kerntranslokation des NF B-Transkriptionsfaktor p65 reduziert ist, ist davon auszugehen, dass UBXD1 an einer fr{\"u}heren Phase der Aktivierung des Signalweges beteiligt ist. M{\"o}glicherweise ist dies darauf zur{\"u}ckzuf{\"u}hren, dass UBXD1 bekannte Funktionen von A20 reguliert und etwa die Bindung von A20 an Vesikel des endolysosomalen Systems oder an lineare Ubiquitinketten beeinflusst. Diese Arbeit beschreibt somit eine neue Funktion des p97-Kofaktors UBXD1 im NF B-Signalweg.},
  subject      = {Ubiquitin},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Pelz2015,
  author    = {Pelz, Jann-Patrick},
  title     = {Strukturbiologische Untersuchungen zur Chaperone-vermittelten Zusammenlagerung spleißosomaler U-snRNPs},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-116973},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Durch die Spleißreaktion werden nicht-kodierende Sequenzelemente (Introns) aus eukaryotischen Vorl{\"a}ufer-mRNAs entfernt und die kodierenden Sequenzelemente (Exons) miteinander zu einem offenen Leserahmen verbunden. Dieser zentrale Prozessierungsschritt w{\"a}hrend der eukaryotischen Genexpression wird durch das Spleißosom katalysiert, das aus den vier kleinen nukle{\"a}ren Ribonucleoproteinpartikeln (snRNPs) U1, U2, U4/U6 und U5, sowie einer Vielzahl weiterer Proteinfaktoren gebildet wird. Alle snRNPs besitzen eine gemeinsame ringf{\"o}rmige Kernstruktur, die aus sieben gemeinsamen Sm-Proteinen (SmB/B'-D1-D2-D3-E-F-G) besteht, die ein einzelstr{\"a}ngiges Sequenzmotiv auf der snRNAs binden. W{\"a}hrend sich diese, als Sm-Core-Dom{\"a}ne bezeichnete Struktur in vitro spontan ausbilden kann, erfolgt die Zusammenlagerung in vivo in einem assistierten und hochregulierten Prozess. Dieser ist abh{\"a}ngig von insgesamt mindestens 12 trans-agierenden Faktoren, die in den PRMT5- und SMN-Komplexen organisiert sind. Der PRMT5-Komplex agiert in der fr{\"u}hen Phase der Zusammenlagerung, indem er die Sm-Proteine durch die Untereinheit pICln rekrutiert und die symmetrische Methylierung von Argininresten in den C terminalen Schw{\"a}nzen von SmB/B', SmD1 und SmD3 katalysiert. Als Resultat dieser fr{\"u}hen Phase befinden sich die Sm-Proteine SmD1-D2-E-F-G und SmB/B'-D3 in zwei getrennten und durch pICln organisierten Komplexen. W{\"a}hrend SmB/B'-D3-pICln am PRMT5-Komplex gebunden bleibt, existiert der zweite Komplex als freies Intermediat mit einem Sedimentationskoeffizienten von 6S. Diese Intermediate k{\"o}nnen nicht mit RNA assoziieren, sodass f{\"u}r die Fortsetzung des Zusammenlagerungsprozesses die Interaktion der Sm-Proteine mit pICln aufgel{\"o}st werden muss. Dies geschieht in der sp{\"a}ten Phase der Sm-Core-Zusammenlagerung, in der die Sm-Proteine vom SMN-Komplex (bestehend aus SMN, Gemin2-8 und unrip) {\"u}bernommen werden und pICln dissoziiert wird. Dadurch werden die Sm-Proteine f{\"u}r ihre Interaktion mit der snRNA aktiviert und k{\"o}nnen auf die Sm-Bindestelle transferiert werden, wodurch die Formierung des Sm-Core abgeschlossen wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit Hilfe einer Kombination r{\"o}ntgenkristallographischer und elektronenmikroskopischer Methoden zwei wichtige Intermediate dieses Zusammenlagerungs-prozesses strukturbiologisch charakterisiert werden. Bei diesen Intermediaten handelt es sich um den 6S-Komplex, sowie um ein Sm-Protein-Transferintermediat mit einem Sedimentations-koeffizienten von 8S. In diesem ist der 6S-Komplex an zwei zentrale Untereinheiten des SMN-Komplexes (SMN und Gemin2) gebunden, w{\"a}hrend pICln den Komplex noch nicht verlassen hat. Der 8S-Komplex stellt daher ein „gefangenes" Intermediat zwischen der fr{\"u}hen und sp{\"a}ten Phase der Zusammenlagerung dar. Zun{\"a}chst gelang es eine erste Kristallform des rekombinant hergestellten 8S-Komplexes zu erhalten, die jedoch keine Strukturl{\"o}sung erlaubte. Durch eine kombinierte Optimierung der Kristallisationsbedingung und der verwendeten Proteine wurde eine weitere {\"a}hnliche Kristallform erhalten, mit der die Kristallstruktur des 8S-Komplexes gel{\"o}st werden konnte. Die Kristallisation des 6S-Komplexes gelang im Anschluss auf Basis der Hypothese, dass Kristalle beider Komplexe aufgrund der kompositionellen Verwandtschaft zwischen 6S und 8S auch {\"A}hnlichkeiten in der Architektur ihrer Kristallgitter aufweisen k{\"o}nnten. Daher wurden innerhalb von pICln gezielt Aminos{\"a}uren substituiert, die sich innerhalb von Kristallkontakten der 8S-Kristalle befanden und konformationell eingeschr{\"a}nkt waren. Mit entsprechend rekonstituierten 6S-Pr{\"a}parationen konnten dann zwei Kristallformen erzeugt werden, die eine Strukturl{\"o}sung des 6S-Komplexes erm{\"o}glichten. Durch die Kristallstruktur des 6S-Komplexes konnte f{\"u}r pICln eine strukturelle Mimikry der Sm-Proteine identifiziert werden. Diese erm{\"o}glicht eine Bindung der Sm-Proteine und eine fr{\"u}hzeitige topologische Organisation des Sm-Pentamers D1-D2-F-E-G in einer geschlossenen hexameren Ringstruktur. Die Kristallstruktur des 8S-Komplexes zeigt, wie der SMN-Komplex {\"u}ber Gemin2 an das Sm-Pentamer bindet. In Kombination mit einer EM-Struktur des 8S-Komplexes gelang es weiterhin, einen plausiblen Mechanismus f{\"u}r die Elimination von pICln und die Aktivierung der Sm-Proteine f{\"u}r die snRNA-Bindung zu formulieren. Somit konnten diese Arbeiten zu einem besseren Verst{\"a}ndnis der Funktionen von trans-agierenden Faktoren bei Zusammenlagerung von RNA-Protein-Komplexen in vivo beitragen.},
  subject      = {Spleißosom},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Christmann2022,
  author    = {Christmann, Gabriel},
  title     = {USP 10 als Deubiquitinase f{\"u}r β-Catenin},
  doi       = {10.25972/OPUS-27299},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-272998},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2022},
  abstract  = {Der WNT-Signalweg ist ein hochkonservierter Signalweg, dessen zentraler intrazellul{\"a}rer Regulationsschritt die Proteinstabilit{\"a}t des Proteins β-Catenin ist. Deregulierende Mutationen in diesem sind fr{\"u}he Ereignisse bei der Entstehung von Darmtumoren. Ist der Abbau von β-Catenin gest{\"o}rt, so ist unabh{\"a}ngig von {\"a}ußerer Kontrolle der Signalweg konstitutiv aktiviert und liefert ein Wachstumssignal. Untersuchungen haben aber gezeigt, dass beim Vorliegen solcher Mutationen immer noch eine - unzureichende - Ubiquitinylierung und ein Abbau von β-Catenin stattfindet. Ziel dieser Studie war Deubiquitinasen (DUBs) zu finden, die durch ihre Aktivit{\"a}t den Abbau von β-Catenin verhindern. Mithilfe eines siRNA Screens in der Vorarbeit konnten DUBs als Kandidaten f{\"u}r einen CRISPR Ansatz ausgew{\"a}hlt werden. APC Wildtyp HEK293T Zellen und Darmkrebszellen wurden mit lentiviralen CRISPR/Cas9 Vektoren infiziert, in welche sgRNAs gegen exonische Sequenzen von DUBs geklont waren. Einzelne Zellklone von USP10 CRISPR Zellen wurden weiter untersucht. In Western Blots und Immunofluoreszenz zeigte sich bei den USP10 CRISPR Zellen eine verminderte Expression von USP10 und damit einhergehend β-Catenin. Proteinstabilit{\"a}tsversuche mit MG132 und Cycloheximid zeigten einen erh{\"o}hten Abbau von β-Catenin in HEK293T USP10 CRISPR Zellen, vor allem nach Stimulierung des WNT-Signalwegs durch LiCl. In Aktivierungsassays (Luciferase und TOP-GFP FACS) des WNT-Signalwegs zeigte sich in HEK293T Zellen nach Behandlung mit LiCl eine geringere Aktivierung in den USP10 CRISPR Zellen. In einem Wachstumsassay zeigten HT29 USP10 CRISPR ein geringeres Wachstum als Kontrollzellen. W{\"a}hrend in einer histologischen F{\"a}rbung von Mausgewebe eine erh{\"o}hte Expression von USP10 nachweisbar war, zeigten sich in einer TMA F{\"a}rbung kein eindeutiger Unterschied zwischen gesundem Gewebe und Tumorgewebe. Die Studie identifiziert USP10 als eine m{\"o}gliche DUB f{\"u}r β-Catenin und potenzielles Ziel f{\"u}r eine Beeinflussung des mutierten WNT-Signalwegs in Darmkrebszellen.},
  subject      = {Darmkrebs},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Turakhiya2019,
  author    = {Turakhiya, Ankit},
  title     = {Functional characterization of the role of ZFAND1 in stress granule turnover},
  doi       = {10.25972/OPUS-16375},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-163751},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Protein quality control systems are critical for cellular proteostasis and survival under stress conditions. The ubiquitin proteasome system (UPS) plays a pivotal role in proteostasis by eliminating misfolded and damaged proteins. However, exposure to the environmental toxin arsenite results in the accumulation of polyubiquitylated proteins, indicating an overload of the UPS. Arsenite stress induces the rapid formation of stress granules (SGs), which are cytoplasmic assemblies of mRNPs stalled in translation initiation. The mammalian proteins ZFAND2A/B (also known as AIRAP and AIRAPL, respectively) bind to the 26S proteasome, and ZFAND2A has been shown to adapt proteasome activity to arsenite stress. They belong to a small subfamily of AN1 type zinc finger containing proteins that also comprises the unexplored mammalian member ZFAND1 and its yeast homolog Cuz1. In this thesis, the cellular function of Cuz1 and ZFAND1 was investigated. Cuz1/ZFAND1 was found to interact with the ubiquitin-selective, chaperone-like ATPase Cdc48/p97 and with the 26S proteasome. The interaction between Cuz1/ZFAND1 and Cdc48/p97 requires a predicted ubiquitin-like domain of Cuz1/ZFAND1. In vivo, this interaction was strongly dependent on acute arsenite stress, suggesting that it is a part of the cellular arsenite stress response. Lack of Cuz1/ZFAND1 caused a defect in the clearance of arsenite induced SG clearance. ZFAND1 recruits both, the 26S proteasome and p97, to arsenite-induced SGs for their normal clearance. In the absence of ZFAND1, SGs lack the 26S proteasome and p97, accumulate defective ribosomal products and become aberrant. These aberrant SGs persist after arsenite removal and undergo degradation via autophagy. ZFAND1 depletion is epistatic to the expression of pathogenic mutant p97 with respect to SG clearance, suggesting that ZFAND1 function is relevant to the multisystem degenerative disorder, inclusion body myopathy associated with Paget's disease of bone and frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis (IBMPFD/ALS).},
  subject      = {ubiquitin},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Klingler2023,
  author    = {Klingler, Philipp},
  title     = {Exploration of proteasome interactions with human platelet function},
  doi       = {10.25972/OPUS-32108},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-321089},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {Platelets are anucleated cell fragments derived from megakaryocytes. They play a fundamental role in hemostasis, but there is rising evidence that they are also involved in immunological processes. Despite absence of a nucleus, human platelets are capable of de novo protein synthesis and contain a fully functional proteasome system, which is, in nucleated cells, involved in processes like cell cycle progression or apoptosis by its ability of protein degradation. The physiological significance of the proteasome system in human platelets is not yet fully understood and subject of ongoing research. Therefore, this study was conducted with the intention to outline the role of the proteasome system for functional characteristics of human platelets. For experimentation, citrated whole blood from healthy donors was obtained and preincubated with proteasome inhibitors. In addition to the commonly used bortezomib, the potent and selective proteasome inhibitor carfilzomib was selected as a second inhibitor to rule out agent-specific effects and to confirm that observed changes are related to proteasome inhibition. Irreversibly induced platelet activation and aggregation were not affected by proteasome blockade with bortezomib up to 24 hours. Conversely, proteasome inhibition led to enhanced threshold aggregation and agglutination up to 25 \%, accompanied by partial alleviation of induced VASP phosphorylation of approximately 10-15 \%. Expression of different receptors were almost unaffected. Instead, a significant increase of PP2A activity was observable in platelets after proteasome blockade, accompanied by facilitated platelet adhesion to coated surfaces in static experiments or flow chamber experiments. Carfilzomib, used for the first time in functional experimentation with human platelets in vitro, led to a dose-dependent decrease of proteasome activity with accumulation of poly ubiquitylated proteins. Like bortezomib, carfilzomib treatment resulted in enhanced threshold aggregation with attenuated VASP phosphorylation. As the main conclusion of this thesis, proteasome inhibition enhances the responsiveness of human platelets, provided by an alleviation of platelet inhibitory pathways and by an additional increase of PP2A activity, resulting in facilitated platelet adhesion under static and flow conditions. The proteasome system appears to be involved in the promotion of inhibitory counterregulation in platelets. The potential of proteasome inhibitors for triggering thromboembolic adverse events in patients must be clarified in further studies, in addition to their possible use for targeting platelet function to improve the hemostatic reactivity of platelets.},
  subject      = {Thrombozyt},
  language  = {en}
}