@phdthesis{Neubert2019,
  author    = {Neubert, Franziska},
  title     = {Markierung postsynaptischer Proteine f{\"u}r die hochaufl{\"o}sende Fluoreszenzmikroskopie},
  doi       = {10.25972/OPUS-19239},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-192394},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Das menschliche Gehirn ist ein Organ, das aufgrund seiner Komplexit{\"a}t und zellul{\"a}ren Diversit{\"a}t noch am wenigsten verstanden ist. Eine der Ursachen daf{\"u}r sind zahlreiche Herausforderungen in diversen neurobiologischen Bild-gebungsverfahren. Erst seit der Erfindung der hochaufl{\"o}senden Fluoreszenz-mikroskopie ist es m{\"o}glich, Strukturen unterhalb der Beugungsgrenze zu visua-lisieren und somit eine maximale Aufl{\"o}sung von bis zu 20 nm zu erreichen. Zus{\"a}tzlich h{\"a}ngt die F{\"a}higkeit, biologische Strukturen aufzul{\"o}sen, von der Markierungs-gr{\"o}ße und -dichte ab. Derzeit ist die h{\"a}ufigste Methode zur Proteinf{\"a}rbung die indirekte Antik{\"o}rperf{\"a}rbung, bei der ein Fluorophor-markierter Sekund{\"a}rantik{\"o}rper an einen Epitop-spezifischen Prim{\"a}rantik{\"o}rper bindet. Dabei kann der Abstand von Zielstruktur und Fluorophor bis zu 30 nm betragen, was eine Aufl{\"o}sungs-verminderung zur Folge haben kann. Aufgrund dessen wurden in dieser Arbeit alternative Markierungsmethoden getestet, um postsynaptische Proteine sicht-bar zu machen. Zun{\"a}chst wurde der postsynaptische N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor mit Hilfe konventioneller indirekter Antik{\"o}rperf{\"a}rbung markiert. Hier war die NR1-Untereinheit des NMDA-Rezeptors von besonderem Interesse, da diese in der Autoimmunerkrankung Anti-NMDA-Rezeptor-Enzephalitis invol-viert ist. Patienten dieser seltenen Krankheit bilden Autoantik{\"o}rper gegen die NR1-Untereinheit, wodurch ein schneller reversibler Verlust der NMDA-Rezeptoren auf der Postsynapse induziert wird. Wichtige Informationen k{\"o}nnen nicht mehr ausreichend weitergegeben werden, was psychiatrische und neurologi-sche St{\"o}rungen zur Folge hat. In dieser Arbeit wurden sowohl kommerzielle NR1-Antik{\"o}rper, als auch rekombinante monoklonale NR1-Antik{\"o}rper von Patien-ten mit Anti-NMDA-Rezeptor-Enzephalitis getestet. In konfokalen und in hochaufgel{\"o}sten SIM- (engl. structured illumination microscopy) und dSTORM- (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy) Messun-gen konnten kommerzielle NR1-Antik{\"o}rper keine erfolgreichen F{\"a}rbungen erzielen. Dagegen erwiesen sich die rekombinanten monoklonalen NR1-Patientenantik{\"o}rper als sehr spezifisch, sowohl in prim{\"a}ren Neuronen als auch im Hippocampus von murinen Gehirnschnitten und lieferten gute Kolokalisati-onen mit dem postsynaptischen Markerprotein Homer. Um die optische Aufl{\"o}sung zu verbessern, wurde eine neue Markierungs-methode mit sog. „Super-Binde-Peptiden" (SBPs) getestet. SBPs sind modifi-zierte Peptide, die erh{\"o}hte Affinit{\"a}ten und Spezifit{\"a}ten aufweisen und mit ei-ner Gr{\"o}ße von ~ 2,5 nm wesentlich kleiner als Antik{\"o}rper sind. In dieser Arbeit best{\"a}tigte sich ein kleines hochspezifisches SPB, das an den Fluoreszenzfarb-stoff Tetra- methylrhodamin (TMR) gekoppelt ist, als effektiver Marker f{\"u}r das Ankerpro-tein Gephyrin. Gephyrin ist f{\"u}r die Lokalisation und Verankerung einiger post-synaptischer Rezeptoren zust{\"a}ndig, indem es sie mit dem Cytoskelett der Zelle verbindet. SIM-Messungen in prim{\"a}ren Neuronen zeigten eine bessere Clus-terrepr{\"a}sentation bei der F{\"a}rbung von Gephyrin mit SBPs, als mit Antik{\"o}rper-f{\"a}rbung. Zus{\"a}tzlich wurden Kolokalisationsanalysen von Gephyrin zusammen mit dem inhibito-rischen pr{\"a}synaptischen vesikul{\"a}ren GABA-Transporter VGAT durchgef{\"u}hrt. Eine weitere F{\"a}rbemethode stellte die bioorthogonale Click-F{\"a}rbung durch die Erweiterung des eukaryotischen genetischen Codes (engl. genetic code ex-pansion, GCE) dar. Dabei wurde eine unnat{\"u}rliche, nicht-kanonische Amino-s{\"a}ure (engl. non-canonical amino acid, ncAA) ins Zielprotein eingebaut und in Kombination mit der Click-Chemie ortsspezifisch mit organischen Tetrazin-Farbstoff-Konjugaten angef{\"a}rbt. Organische Fluorophore haben den Vorteil, dass sie mit einer Gr{\"o}ße von 0,5 - 2 nm sehr klein sind und damit die nat{\"u}rli-chen Funktionen der Proteine in der Zelle kaum beeinflussen. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass der tetramere postsynaptische NMDA-Rezeptor durch die Amber-Supres-sionsmethode bioorthogonal angef{\"a}rbt werden konnte. Aus sieben verschiede-nen Amber-Mutanten der NR1-Untereinheit stellte sich die Y392TAG-NR1-Mutante als diejenige mit der besten Proteinexpression, F{\"a}rbeeffizienz und rezeptorfunktionalit{\"a}t heraus. Dies konnte durch Fluoreszenzmikroskopie- und Whole-Cell Patch-Clamp-Experimenten gezeigt werden. Die bioorthogo-nale Click-F{\"a}rbung durch GCE eignete sich f{\"u}r die F{\"a}rbung des NMDA-Rezeptors in verschiedenen Zelllinien, mit unterschiedlichen Tetrazin-Farbstoff-Konjugaten und f{\"u}r Lebendzellexperimente. In dSTORM-Messungen erwies sich das Tetrazin-Cy5-Farbstoff-Konjugat als ideal aufgrund seiner Gr{\"o}-ße, Photostabilit{\"a}t, Helligkeit und seines geeigneten Blinkverhaltens, sodass eine homogene NMDA-Rezeptorverteilung auf der Zellmembran gezeigt wer-den konnte. NR1-Antik{\"o}rperf{\"a}rbungen wiesen dagegen starke Clusterbildun-gen auf. Die Ergebnisse konnten belegen, dass kleinere Farbstoffe eine deut-lich bessere Zug{\"a}nglichkeit zu ihrem Zielprotein haben und somit besser f{\"u}r die hochaufl{\"o}sende Fluoreszenzmikroskopie geeignet sind.},
  subject      = {hochaufl{\"o}sende Fluoreszenzmikroskopie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Rauschenberger2021,
  author    = {Rauschenberger, Vera},
  title     = {Stiff-person syndrome - Pathophysiological mechanisms of glycine receptor autoantibodies},
  doi       = {10.25972/OPUS-20958},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-209588},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {The Stiff-person syndrome (SPS) is a rare autoimmune disease that is characterized by symptoms including stiffness in axial and limb muscles as well as painful spasms. Different variants of SPS are known ranging from moderate forms like the stiff-limb syndrome to the most severe form progressive encephalomyelitis with rigidity and myoclonus (PERM). SPS is elicited by autoantibodies that target different pre- or postsynaptic proteins. The focus of the present work is on autoantibodies against the glycine receptor (GlyR). At start of the present thesis, as main characteristic of the GlyR autoantibody pathology, receptor cross-linking followed by enhanced receptor internalization and degradation via the lysosomal pathway was described. If binding of autoantibodies modulates GlyR function and therefore contributes to the GlyR autoantibody pathology has not yet been investigated. Moreover, not all patients respond well to plasmapheresis or other treatments used in the clinic. Relapses with even higher autoantibody titers regularly occur. In the present work, further insights into the disease pathology of GlyRα autoantibodies were achieved. We identified a common GlyRα1 autoantibody epitope located in the far N-terminus including amino acids A1-G34 which at least represent a part of the autoantibody epitope. This part of the receptor is easily accessible for autoantibodies due to its location at the outermost surface of the GlyRα1 extracellular domain. It was further investigated if the glycosylation status of the GlyR interferes with autoantibody binding. Using a GlyRα1 de-glycosylation mutant exhibited that patient autoantibodies are able to detect the de-glycosylated GlyRα1 variant as well. The direct modulation of the GlyR analyzed by electrophysiological recordings demonstrated functional alterations of the GlyR upon autoantibody binding. Whole cell patch clamp recordings revealed that autoantibodies decreased the glycine potency, shown by increased EC50 values. Furthermore, an influence on the desensitization behavior of the receptor was shown. The GlyR autoantibodies, however, had no impact on the binding affinity of glycine. These issues can be explained by the localization of the GlyR autoantibody epitope. The determined epitope has been exhibited to influence GlyR desensitization upon binding of allosteric modulators and differs from the orthosteric binding site for glycine, which is localized much deeper in the structure at the interface between two adjacent subunits. To neutralize GlyR autoantibodies, two different methods have been carried out. Transfected HEK293 cells expressing GlyRα1 and ELISA plates coated with the GlyRα1 extracellular domain were used to efficiently neutralize the autoantibodies. Finally, the successful passive transfer of GlyRα1 autoantibodies into zebrafish larvae and mice was shown. The autoantibodies detected their target in spinal cord and brain regions rich in GlyRs of zebrafish and mice. A passive transfer of human GlyRα autoantibodies to zebrafish larvae generated an impaired escape behavior in the animals compatible with the abnormal startle response in SPS or PERM patients.},
  subject      = {Glycinrezeptor},
  language  = {en}
}