@phdthesis{Ullrich2013,
  author    = {Ullrich, Sybille},
  title     = {Biochemische und biophysikalische Analyse der strukturellen Integrit{\"a}t von Channelrhodopsin 2 und dessen Mutanten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-92006},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Channelrhodopsin 2 (ChR2) aus dem Augenfleck von C. rheinhardtii geh{\"o}rt zur Gruppe der mikrobiellen Rhodopsine (Typ1-Rhodopsine). ChR2 besteht aus einem extrazellul{\"a}r gelegenen N-Terminus, 7 Transmembranhelices und einem zytosolisch gelegenen C-Terminus. Der lichtreaktive Bestandteil (Chromophor) all-trans-Retinal ist via Schiff´ Base kovalent an ein Lysinrest der siebten Transmembranhelix gebunden. Bei Applikation von Blaulicht isomerisiert all-trans- zu 13-cis-Retinal, was in einer Konformations{\"a}nderung und dem {\"O}ffnen des Kanals resultiert. Abh{\"a}ngig vom elektrochemischen Gradienten k{\"o}nnen ein- und zweiwertige Kationen in die Zelle ein- oder aus der Zelle herausstr{\"o}men. Eine retinalabh{\"a}ngige Stabilit{\"a}t konnte bereits f{\"u}r Bakteriorhodopsin (BR) best{\"a}tigt werden (Booth, Farooq et al. 1996, Turner, Chittiboyina et al. 2009, Curnow and Booth 2010), bez{\"u}glich ChR2 waren bisher nur wenige Daten verf{\"u}gbar (Hegemann, Gartner et al. 1991, Lawson, Zacks et al. 1991). Die heterologe Expression von wildtypischem und modifiziertem ChR2 in Oozyten von X. laevis erlaubte einen detaillierteren Einblick in die retinalabh{\"a}ngige Stabilit{\"a}t und pH-abh{\"a}ngige Dunkelleitf{\"a}higkeit von Guanidinium. Wildtypisches Chop2 zeigte bei Zugabe von Retinal zum Inkubationsmedium, direkt nach RNA-Injektion, Stromamplituden im µA-Bereich und deutliche Fluoreszenzintensit{\"a}ten. Ausschließlich endogen vorhandenes Retinal hatte verminderten Fluoreszenzen und Stromamplituden zur Folge, was auf ein geringes Vorhandensein von Chop2-Proteinen in der Plasmamembran hindeutete. Da die Inkubation {\"u}ber Nacht in retinalsupplementierter L{\"o}sung nur eine minimale Erh{\"o}hung des resultierenden Stromes erbrachte, deuten die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse stark auf eine verminderte Stabilit{\"a}t des Proteins bei fehlender Bindung des Kofaktors Retinal. Das Einf{\"u}gen einer aromatischen Aminos{\"a}ure (Y/F/W) an Position 159 f{\"u}hrte zu einer, von der Retinalsupplementation unabh{\"a}ngigen, in beiden Ans{\"a}tzen gleichwertigen Expressionsst{\"a}rke. Diese {\"a}usserte sich in {\"a}quivalenten Fluoreszenzintensit{\"a}ten. Die erhaltenen Stromamplituden wiesen eine starke Differenz auf: ohne Zugabe zus{\"a}tzlichen Chromophors lag die Stromst{\"a}rke bei nur wenigen Nanoampere, die bei Inkubation in einer retinalhaltigen L{\"o}sung {\"u}ber Nacht auf das Niveau von retinalsupplementierten Oozyten anstieg. Des Weiteren konnte die Zunahme der Stromamplitude innerhalb von 15 Minuten beobachtet werden, wenn die vermessenen Oozyten mit einer retinalhaltigen L{\"o}sung perfundiert wurden. Zusammengefasst weisen die Ergebnisse auf eine Stabilisierung des aromatisch substituierten Proteins hin. Bei der von Berndt et al. (2011) beschriebenen Mutante T159C konnten diese Eigenschaften nicht nachgewiesen werden. Die Modifikation der Retinalbindestelle (K257) in Verbindung mit einer aromatischen Substitution an Position 159 resultierte in deutlichen Fluoreszenzintensit{\"a}ten, unabh{\"a}ngig von der Retinalverf{\"u}gbarkeit bei, in beiden F{\"a}llen, fehlenden lichtaktivierten Str{\"o}men. Diese und die gleichwertigen Bandenst{\"a}rken des Proteinimmunoblots von aromatisch substituierten ChR2-Varianten unterst{\"u}tzen die Hypothese der retinalunabh{\"a}ngigen Stabilit{\"a}t zus{\"a}tzlich. Die Ergebnisse legen, im Falle von Chop2-WT, eine Degradation des Apoproteins nahe. Bei Einf{\"u}gen einer aromatischen AS an Position 159 ist das Apoprotein davor gesch{\"u}tzt (siehe Abb. 75). Infolge der strukturellen Similarit{\"a}t, dem Vorhandensein delokalisierter π-Elektronen und der r{\"a}umlichen Gr{\"o}ße der aromatischen AS ist eine strukturelle Ver{\"a}nderung des Apoproteins denkbar, die eine Degradation aufgrund von nunmehr unzug{\"a}nglichen Ubiquitinierungsstellen verhindert. Des Weiteren besteht die M{\"o}glichkeit, dass sich bei fehlender Bindung des Kofaktors Wassermolek{\"u}le in der N{\"a}he der Bindetasche befinden, welche von umliegenden Aminos{\"a}uren (u.a. T159, D156) unter großem Energieaufwand koordiniert werden und die strukturelle Integrit{\"a}t bis hin zur Degradation beeintr{\"a}chtigen k{\"o}nnen. Dies k{\"o}nnte durch eine Erh{\"o}hung der Hydrophobizit{\"a}t bei Einf{\"u}gen einer aromatischen Aminos{\"a}ure verhindert werden. Bei Substitutionen durch eine aromatische AS (Y/W/F) an Position 159 zeigte sich ein weiteres, bisher nicht beschriebenes, Charakteristikum. Bei Perfusion der Oozyten mit einer guanidiniumhaltigen L{\"o}sung, konnten in Abh{\"a}ngigkeit des pH-Wertes ohne die Applikation von Licht St{\"o}me im µA Bereich aufgezeichnet werden. Die Gr{\"o}ße der Stromamplitude korreliert hierbei mit dem Anstieg des pH-Wertes und der Konzentration an Guanidiniumionen der perfundierten L{\"o}sung und kann durch das Hinzuf{\"u}gen von 1mM Lanthan reversibel geblockt werden. Des Weiteren konnten die vorgenommenen Messungen die Ergebnisse der retinalabh{\"a}ngigen Degradation verifizieren, da der Einstrom von Gua+ sowohl bei retinalsupplementierter Inkubation, als auch bei ausschließlich endogen vorhandenem Retinal zu beobachten war. Des Weiteren zeigte auch die Doppelmutante T159Y/K257R trotz ihres Unverm{\"o}gens Retinal zu binden, die beschriebenen lichtunabh{\"a}ngigen Str{\"o}me. Die Ergebnisse bei Substitution durch Phenylalanin (F) stellen eine Abweichung des Musters dar. Bei Inkubation von T159F-injizierten Zellen bei ausschließlich endogen vorhandenem Retinal konnte eine stark erh{\"o}hte Guanidiniumleitf{\"a}higkeit festgestellt werden, diese kam jedoch bei retinalsupplementierter Inkubation nicht zum Tragen. Dies k{\"o}nnte ein Hinweis auf eine sterische Hinderung durch das gebundene Chromophor sein, die bei den Substitutionen durch Tyrosin und Tryptophan, m{\"o}glicherweise durch unterschiedliche chemische Eigenschaften der AS, nicht auftreten. Die hervorgerufene pH-Abh{\"a}ngigkeit kann in zwei m{\"o}glichen Ursachen begr{\"u}ndet liegen: • Vorhandensein einer (de)protonierbaren Gruppe wie Histidin, Arginin oder Lysin, die als pH-Sensor dienen k{\"o}nnte • Deprotonierung der Schiff´ Base durch Guandininium Das Vorhandensein eines pH-Sensors konnte durch die vorgenommenen Modifikationen von H114, R115, R120 und H249 nicht best{\"a}tigt werden. Bei Substitution von K257 (in Verbindung mit T159Y) zu Arginin (R) konnte weiterhin ein pH-abh{\"a}ngiger Gua+-Dunkelstrom festgestellt werden. Die Modifikation zu Alanin (A) oder Glutamin (Q) hingegen resultierte im Ausbleiben der Str{\"o}me. Der Austausch einer basischen zu einer neutralen Gruppe ohne protonierbaren Rest deutet auf die Beteiligung der Schiff´ Base bzw. der Aminos{\"a}ure an Position 257 am Mechanismus der Dunkelleitf{\"a}higkeit hin.},
  subject      = {Elektrophysiologie},
  language  = {de}
}