@phdthesis{Stimmler2004, author = {Stimmler, Patrick}, title = {Zytogenetischer und durchflusszytometrischer Nachweis von Mosaizismus bei Fanconi An{\"a}mie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-8927}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Im Rahmen dieser Arbeit wurden sechs FA-Patienten und eine Patientin, bei der eine Fanconi An{\"a}mie ausgeschlossen wurde, auf das Vorhandensein eines Mosaizismus untersucht. Dabei wurde bei allen Patienten eine zytogenetische Chromosomenbruchanalyse durchgef{\"u}hrt und die Ergebnisse mit den Daten der durchflusszytometrischen Zellzyklusanalyse verglichen. Bei einer FA-Patientin konnte weder in der Chromosomenbruchanalyse noch in der Zellzyklusanalyse das Vorhandensein eines Mosaizismus nachgewiesen werden. Bei drei FA-Patienten gab es in der Auswertung der Metaphasen auf Chromosomenbr{\"u}chigkeit den Hinweis auf das Vorliegen einer Mosaik-Konstellation, wobei dies in einem Fall (Proband 5) besonders ausgepr{\"a}gt war. Die Zellzyklusanalyse konnte das Vorhandensein eines Mosaizismus jedoch in allen drei F{\"a}llen nicht best{\"a}tigen. Bei einer FAPatientin zeigten sich die Chromosomen in der Chromosomenbruchanalyse nahezu unauff{\"a}llig. Die erfolgreiche und komplette Selbstkorrektur spiegelte sich auch eindeutig in der Zellzyklusanalyse wider. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die zytogenetische Chromosomenbruchanalyse zum Nachweis eines Mosaizismus besser geeignet ist als die Zellzyklusanalyse, da sie eine h{\"o}here Sensitivit{\"a}t zu haben scheint. Um eine definitive Aussage sowohl {\"u}ber die Sensitivit{\"a}t, als auch die Spezifit{\"a}t beider Untersuchungen machen zu k{\"o}nnen, ist es n{\"o}tig FAPatienten im Verlauf mehrmals zu untersuchen. Dabei m{\"u}sste sowohl eine Chromosomenbruchanalyse als auch eine Durchflusszytometrie durchgef{\"u}hrt werden und die Ergebnisse dann mit dem klinischen Befinden bzw. den Blutwerten (H{\"a}matokrit/H{\"a}moglobinwert, Leukozyten-und Thrombozytenzahl) verglichen werden. Da das Vorhandensein eines Mosaizismus Konsequenzen f{\"u}r die Diagnose und eventuell Therapiefestlegung hat, erscheinen weitere Untersuchungen diesbez{\"u}glich sinnvoll.}, language = {de} } @phdthesis{Boehm2005, author = {B{\"o}hm, Christian}, title = {Zytogenetische Untersuchungen an Pankreaskarzinom-Zelllinien transgener TGFalpha/p53+/-M{\"a}use}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18623}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Sechs verschiedene Tumorzelllinien aus duktalen Pankreaskarzinomen transgener TGFalpha/p53+/-M?se wurden molekular-zytogenetisch durch Spectral Karyotyping analysiert, um Hinweise auf sekund?e genetische Ver?derungen zu erhalten, die f? die Tumorgenese in diesem Mausmodell verantwortlich sind. Es wurden haupts?hlich numerische Abberationen mit hypertriploiden bis hypotetraploiden Karyotypen detektiert, wohingegen durchschnittlich nur 4,3 Strukturaberrationen pro Metaphase nachgewiesen werden konnten. Fast immer stellten sich einige kleine Markerchromosomen dar, die durch SKY nicht eindeutig identifiziert werden konnten. Auff?ligste Ver?derung der Zelllinie TD2 (MMUPaTu7 und 8=7B) war ein gro?s Markerchromosom, dessen proximaler Anteil mit drei charakteristischen dunklen Banden aus Material von Chromosom 11 bestand, w?rend der distale Abschnitt zu Chromosom 5 geh?te. Durch FISH-Analyse mit spezifischen BAC-Proben f? das Chromosom 11 konnte hierf? eine Amplifikation der Kandidatengene Egfr und c-Rel festgestellt werden. Auch in den anderen Zelllinien traten geh?ft Strukuraberrationen des Chromosoms 11 auf, f? die ebenfalls eine Beteiligung dieser Genloci postuliert werden kann. Weitere strukturelle Ver?derungen betrafen Chromosom 15 mit c-Myc-Amplifikationen in Form von extrachromosomalen "double minutes", welche in h?eren Passagen der Zelllinie TD2 als homogeneously stained regions (HSR) integriert an variablen Positionen des Chromosoms 6 sichtbar wurden. In den analysierten Metaphasen trat zus?zlich h?fig ein vergr{\"o}ßertes Chromosom 8 auf, allerdings im Bandenmuster mit unterschiedlichen Amplifikationseinheiten, wobei ein Gewinn des dort lokalisierten Transkriptionsfaktors Jun-B m?lich w?e. F? eine genauere Charakterisierung der in die verschiedenen Strukturaberrationen involvierten Kandidatengene sind gezielte FISH-Analysen mit lokusspezifischen BAC-Proben oder andere weiterf?rende molekular-genetische Untersuchungen erforderlich.}, language = {de} } @phdthesis{Kern2006, author = {Kern, Christine}, title = {Zytogenetische Analysen von multiplen Chromosomen- Translokationen bei der Maus mit spektraler Karyotypenanalyse}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21097}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Das Mausmodell war in der S{\"a}ugetiergenetik schon immer ein interessantes Forschungsobjekt, insbesondere die in bestimmten geographischen Gebieten vorkommenden Mauspopulationen mit zahlreichen Robertson`schen Translokationen. Mit Kreuzungsversuchen von Mauspopulationen mit unterschiedlichen Robertson`schen Translokationen lassen sich chromosomale Interaktionen in der Meiosephase und morphogenetische Auswirkungen von dadurch entstandenen Mono- oder Trisomien untersuchen. Mit Hilfe der Spektralen Karyotypisierung gelang es in dieser Arbeit die chromosomale Anordnung in der Meiose bei Mauspopulationen mit Robertson`schen Translokationen exakt darzustellen. Hierbei wurde diese Technik an Meiosezellen der Maus etabliert. Es konnten dabei interessante Lagebeziehungen zwischen Meioseformationen und frei liegenden Chromosomen beobachtet werden. Auch fiel die erhebliche Stabilit{\"a}t der Multivalent- Formationen der F1- Tochtergeneration auf. Die Spektrale Karyotypisierung erwies sich hierbei als {\"a}ußerst effizientes Verfahren, das aufgrund seiner relativ unkomplizierten Handhabung, seiner sehr guten Reproduzierbarkeit und universellen Einsetzbarkeit als Screening Verfahren ideal erscheint Um die dabei gewonnenen Ergebnisse richtig interpretieren zu k{\"o}nnen sind sicherlich weitere Untersuchungen auf molekularer Ebene n{\"o}tig.}, language = {de} } @phdthesis{Larsen2015, author = {Larsen, Mirjam}, title = {Zur genetischen Heterogenit{\"a}t der Muskeldystrophien: alternative genetische Ursachen der Myotonen Dystrophie und FSHD}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-123431}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2015}, abstract = {Die klinische Symptomatik verschiedener erblicher Muskelerkrankungen verl{\"a}uft oft erstaunlich {\"a}hnlich mit Muskelschw{\"a}che und -schwund als den hervorstechenden Alltagsproblemen. Dem gegen{\"u}ber sind die genetischen Grundlagen sehr vielf{\"a}ltig mit > 250 bisher identifizierten Genen (musclegenetable.org). Auch innerhalb eines definierten Krankheitsbildes werden verschiedene genetische Ursachen nebeneinander gefunden, was durch die Verkn{\"u}pfung in einem gemeinsamen Pathomechanismus begr{\"u}ndet sein kann. Die vorliegende Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit verschiedenen Aspekten dieser genetischen Heterogenit{\"a}t am Beispiel der beiden h{\"a}ufigen Muskelerkrankungen Myotone Dystrophie (DM) und Facioscapulohumerale Muskeldystrophie (FSHD), bei denen alternative genetische Ursachen, sowie ankn{\"u}pfende Fragestellungen untersucht wurden. Das erste Projekt dieser Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit Fragestellungen, welche die DM betreffen. Die DM Typ 1 und Typ 2 (DM1 und DM2) bilden zusammen die h{\"a}ufigste Muskelerkrankung im Erwachsenenalter. Sie ist durch die gemeinsamen Symptome Myotonie, Muskelschw{\"a}che und Katarakt sowie die Beteiligung weiterer Organsysteme gekennzeichnet, was sie zu einer multisystemischen Erkrankung macht. Die genetische Ursache liegt f{\"u}r beide Formen in einer Repeatexpansion eines Mikrosatelliten in der untranslatierten Region zweier Gene (DMPK in DM1, CNBP in DM2). Dem gemeinsamen Pathomechanismus liegt eine toxische Funktionsgewinn-Mutation des expandierten RNA-Transkripts zugrunde. Die beiden bekannten Formen der DM sind ph{\"a}notypisch h{\"a}ufig nicht unterscheidbar, weshalb in vielen F{\"a}llen beide Erkrankungen molekulargenetisch untersucht werden m{\"u}ssen. Dabei ist die Diagnostik der DM durch die Notwendigkeit des Nachweises von sehr großen Repeatexpansionen recht aufw{\"a}ndig und die Bestimmung der Repeatl{\"a}nge im Fall der DM2 nur eingeschr{\"a}nkt m{\"o}glich. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Test zum Nachweis der Repeatexpansionen auf der Basis der Methode des Molecular Combing entwickelt, welche den gleichzeitigen Nachweis der beiden Loci von DM1 und DM2 erlaubt und zus{\"a}tzlich eine direkte Messung der Repeatl{\"a}nge erm{\"o}glicht. Das Molecular Combing ist eine fluoreszenz-mikroskopische Einzelmolek{\"u}l-Analysemethode, durch die es erstmals m{\"o}glich wurde, die vermutete somatische Instabilit{\"a}t bei DM2 darzustellen. Das zweite DM-Teilprojekt besch{\"a}ftigt sich mit der Identifikation m{\"o}glicher alternativer genetischer Ursachen f{\"u}r die Erkrankung. Dies wurde anhand einer Kohorte von 138 DM1- und DM2-negativen Indexpatienten mit dem typischen DM-Ph{\"a}notyp untersucht. Ausgehend von dem gemeinsamen Pathomechanismus wurden die prim{\"a}ren Krankheitsgene DMPK und CNBP, sowie CELF1 und MBNL1, welche wichtige Rollen auf sekund{\"a}rer Ebene des Pathomechanismus spielen, mittels Next Generation Sequencing untersucht. Dabei wurde eine auff{\"a}llige Variante in DMPK gefunden, keine Varianten in CNBP oder CELF1 und drei Varianten in MBNL1, was auf MBNL1 als Kandidatengen einer alternativen Ursache f{\"u}r DM hinweist. MBNL1 ist ein gewebespezifischer Spleißregulator, welcher einen Wechsel von einem fetalen zu einem adulten Spleißmuster im Muskel steuert. Die Pathogenit{\"a}t einer der Varianten wurde in einem RNA-Spleißassay mit MBNL1-Targetgenen untersucht. Dabei konnten keine spezifischen Spleiß-Effekte festgestellt werden, aber eine Verminderung des Expressionsniveaus im Sinne einer Haploinsuffizienz. Die 3D-Modellierung dieser Variante deutet auf {\"A}nderungen der Oberfl{\"a}chenladungen in MBNL1 hin. Der Nachweis der Pathogenit{\"a}t der Varianten und somit die Urs{\"a}chlichkeit von MBNL1-Mutationen f{\"u}r DM konnte hiermit nicht abschließend gekl{\"a}rt werden. Die gefundenen Ergebnisse regen jedoch hoffentlich zu nachfolgenden Studien an. Das zweite Projekt dieser Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit Fragestellungen um die FSHD. Diese bildet die dritth{\"a}ufigste Muskelerkrankung, charakterisiert durch eine oft asymmetrische Schw{\"a}che der Muskulatur von Gesicht, Schulterg{\"u}rtel und Oberarmen. Genetisch ist die FSHD Typ 1 (FSHD1) mit einer Kontraktion des Makrosatelliten D4Z4 verkn{\"u}pft, was eine Relaxation der Chromatinstruktur der Region mit sich bringt und damit die ektopische Expression des apoptotisch wirkenden Proteins DUX4 erm{\"o}glicht. Die pathogene Auspr{\"a}gung dieser Funktionsgewinn-Mutation findet dabei nur in Verbindung mit einem FSHD-permissiven Haplotyp statt. Auf der Grundlage des gleichen Pathomechanismus wurde eine zweite Form der FSHD (FSHD2) vorgestellt, bei der die Chromatinrelaxation unabh{\"a}ngig von der L{\"a}nge von D4Z4 durch einen Defekt in dem an der DNA-Methylierung beteiligten Gen SMCHD1 assoziiert sein soll. Die Vererbung von FSHD2 verl{\"a}uft digenisch mit Mutationen in SMCHD1 und dem FSHD-permissiven Haplotyp auf zwei unabh{\"a}ngigen Loci. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Kohorte von 55 FSHD1-negativen Patienten mit dem typischen FSHD-Ph{\"a}notyp untersucht. Dabei wurden der Haplotyp, die Methylierung von D4Z4 sowie das SMCHD1-Gen analysiert. Es konnten neun Patienten mit einem Defekt in SMCHD1 identifiziert werden. In einer zweiten Kohorte von 45 FSHD1-positiven Patienten wurde untersucht, ob SMCHD1-Mutationen auch in Kombination mit einer Kontraktion von D4Z4 vorkommen. Dieser Fall von FSHD1+2 konnte f{\"u}r drei Patienten gezeigt werden, welche außerdem einen auff{\"a}llig schweren Ph{\"a}notyp zeigten. SMCHD1 kann also als Modifier-Gen f{\"u}r die Schwere der Erkrankung bei FSHD1 angesehen werden. Damit wurden insgesamt zw{\"o}lf SMCHD1-Mutationstr{\"a}ger identifiziert, davon sind zehn der Varianten noch nicht beschrieben worden. F{\"u}r alle erkrankten Mutationstr{\"a}ger konnte eine Methylierung von D4Z4 ≤ 20 \% ermittelt werden, was als diagnostisches Kriterium verwendet werden kann. Mit einem Anteil von 16,3 \% Mutationstr{\"a}ger in der FSHD1-negetiven Kohorte bildet FSHD2 einen bedeutenden Anteil an dem Krankheitsbild der FSHD, weshalb die entwickelten Analysen in die Routinediagnostik eingegliedert wurden. Das zweite Teilprojekt der FSHD besch{\"a}ftigt sich mit der Funktion des SMCHD1-Gens bei der X-Inaktivierung (XI). Es ist bekannt, dass SMCHD1 bei weiblichen M{\"a}usen an der Aufrechterhaltung der XI mitwirkt. Die Untersuchung der XI bei FSHD2-Frauen ergab eine extreme Verschiebung der erwarteten XI von 50:50 auf 0:100 oder 100:0 bei sechs von 13 Patientinnen. Die {\"u}brigen sieben zeigten eine XI im Normalbereich von > 20:80 oder < 80:20. Der Befund der einseitigen Verschiebung k{\"o}nnte auf einen negativen Selektionsdruck gegen{\"u}ber Zellen mit unvollst{\"a}ndiger XI hindeuten. Es w{\"a}re interessant zu untersuchen, ob sich der gleiche Effekt auch in einer gr{\"o}ßeren Kohorte wiederfindet und ob er sich mit der Art der Mutation korrelieren l{\"a}sst.}, subject = {Myotonische Dystrophie}, language = {de} } @phdthesis{Endres2003, author = {Endres, Karlheinz}, title = {Zellzykluseffekte von Mitomycin C}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12647}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {ZELLZYKLUSEFFEKTE VON MITOMYCIN C Im Rahmen dieser Arbeit sollten die durch Mitomycin C (MMC) exogen induzierten Zellzyklusst{\"o}rungen mit den endogenen St{\"o}rungen des Zellzyklus bei Fanconi-An{\"a}mie in unterschiedlichen Zellsystemen (periphere Blutlymphozyten, lymphoblastoide Zellen und Fibroblasten) verglichen werden. Die Zellzyklusanalysen wurden mit der zweidimensionalen Durchflusszytometrie nach dem BrdU/Hoechst 33258-Ethidiumbromid Verfahren durchgef{\"u}hrt. Mit diesem Verfahren ist es m{\"o}glich zwischen proliferierenden und nichtproliferierenden Zellen (Ellwart, Stunkel et al. 1981) zu unterscheiden und Verteilungen der Zellen in bis zu vier Zellzyklusphasen mit quantitativer Analyse der Populationen w{\"a}hrend der G0-G1-, G1-, S- und G2-Phasen zu erfassen (Kubbies 1989). Das Ausscheiden von Zellen aus dem Zellzyklus kann dabei {\"u}ber die Akkumulation in den entsprechenden Phasenanteilen des Zellzyklus erfasst werden. Die Induktion von Zellzyklusst{\"o}rungen erfolgte mit dem bifunktionellen Alkylanz Mitomycin C. Die Applikation von Mitomycin C (MMC) f{\"u}hrte dabei vor allem zu einer dosisabh{\"a}ngigen Zunahme der G2-Phasenanteile der Zellzyklen, was als Akkumulation von Zellen innerhalb dieses Kompartiments zu verstehen ist. Diese Akkumulation konnte bei den durchflußzytometrischen Zellzyklusanalysen mit der abgeleiteten Gr{\"o}ße Summe der G2-Phasen / Wachstumsfraktion (S G2/GF) proliferationsunabh{\"a}ngig erfasst werden. Die konzentrationsabh{\"a}ngige Zunahme der G2-Phasenakkumulation und die unterschiedliche Verteilung innerhalb der Zellzyklen wurden mit den beiden Parametern Increased S G2+G2`/GF und Increased S G2/GF festgehalten und ausgewertet. Die Untersuchungen mit peripheren Blutlymphozyten, lymphoblastoiden Zellen (B-LCL) und Fibroblasten von gesunden Kontrollpersonen zeigten, dass sich die durch Mitomycin C induzierten DNA-Sch{\"a}digungen bei durchflußzytometrischen Zellzyklusanalysen vor allem als G2-Phasenakkumulation darstellen. Demgegen{\"u}ber lagen die ermittelten Werte der S G2/GF von Fa-Individuen bereits bei Standardzellkulturen {\"u}ber denen der gesunden Versuchspersonen. Vor allem bei den Zellzyklusstudien mit peripheren Blutlymphozyten von Fanconi-An{\"a}mie Patienten zeigten sich bereits endogen eine massive Erh{\"o}hung der G2-Phasenanteile. Im Vergleich zu den untersuchten Kontrollen war die Mitomycin C induzierte Akkumulation von Zellen in den G2-Phasen nicht beliebig steigerbar. Die untersuchten Zellsysteme zeigten verschiedene Proliferationsmuster und reagierten mit einer unterschiedlich starken Arretierung von Zellen in den G2-Phasen bei Zugabe von Mitomycin C. Als sensitivste Zellart reagierten subkutane menschliche Fibroblasten bei Applikation von Mitomycin C. Bei den durchgef{\"u}hrten Zellzyklusanalysen zeigte sich aber auch, dass bei hohen Konzentration von Mitomycin C (MMC) die zytoxischen Effekte von Mitomycin C {\"u}berwiegen und es zu einem starken R{\"u}ckgang des Zellwachstums kommt. Da die exogen induzierten Zellzyklusst{\"o}rungen durch Mitomycin C bei gesunden Kontrollpersonen mit den typischen endogenen St{\"o}rungen des Zellzyklus bei Fa-Individuen vergleichbar waren, kann als m{\"o}gliche Ursache f{\"u}r Fanconi-An{\"a}mie auf einen DNA-Reparaturdefekt geschlossen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auch Zellen von obligat heterozygoten Fa-Individuen mit dem BrdU/Hoechst 33258-Ethidiumbromid Verfahren untersucht. War bei Fa-homozygoten Patienten bereits endogen die Akkumulation von Zellen in den G2-Phasen deutlich gegen{\"u}ber den gesunden Kontrollpersonen erh{\"o}ht, so konnte dies f{\"u}r Fa-heterozygote Individuen nicht gezeigt werden. Die ermittelten Werte der Summe der G2-Phasen / Wachstumsfraktion (S G2/GF) lagen zwar dabei vor allem bei den untersuchten peripheren Blutlymphozyten und subkutanen Fibroblasten etwas {\"u}ber den Kontrollen. Mit den hier vorgelegten Daten aus den Zellzyklusanalysen war aber keine Unterscheidung zwischen den obligat heterozygoten Fa-Individuen und den gesunden Probanden m{\"o}glich. Die Ergebnisse stehen dennoch im Einklang mit den zytogenetischen Untersuchungen auf erh{\"o}hte Chromosomenbruchraten bei Verdacht auf Fanconi-An{\"a}mie.}, language = {de} } @phdthesis{Orlitsch2002, author = {Orlitsch, Carolin}, title = {Zellzyklusdiagnostik bei Fanconi An{\"a}mie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-6456}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {In der vorliegenden Arbeit werden die Ergebnisse der Fanconi An{\"a}mie Diagnostik am Humangenetischen Institut der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg des Jehres 1999 analysiert und validiert.}, language = {de} } @phdthesis{Schoenborn2008, author = {Schoenborn, Veit}, title = {Whole Genome Amplification von Plasma-DNA und Entwicklung eines Ausschlusskriteriums zur Verbesserung der Genotypisierungsqualit{\"a}t}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37136}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Plasma- und Serumproben waren in fr{\"u}heren epidemiologischen Studien h{\"a}ufig das einzige biologische Material, das gesammelt und untersucht wurde. Diese Studien besitzen gerade durch ihren sehr langen Untersuchungszeitraum einen riesigen Informationsgehalt und w{\"a}ren ein unbezahlbarer Schatz f{\"u}r genetische Analysen. Oft ist aufgrund damals mangelnder Akquirierung jedoch keine genomische DNA verf{\"u}gbar. Um die in Plasmaproben in geringer Menge vorkommende DNA verwenden zu k{\"o}nnen, extrahierten wir die DNA mit Hilfe von magnetischen Partikeln und setzten sie in eine Whole Genome Amplification (WGA) mittels \&\#934;29-DNA-Polymerase ein. Wir stellten 88 Probenp{\"a}rchen, bestehend aus einer WGA-Plasma-DNA und der korrespondierenden Vollblut-DNA derselben Person, zusammen und genotypisierten bei diesen neun hochpolymorphe Short Tandem Repeats (STR) und 25 SNPs. Die durchschnittliche innerhalb der Probenpaare auftretende Diskordanzrate betrug 3,8\% f{\"u}r SNPs sowie 15,9\% f{\"u}r STRs. Basierend auf den Ergebnissen der H{\"a}lfte der Probenpaare entwickelten wir einen Ausschlussalgorithmus und validierten diesen in der anderen H{\"a}lfte der Probenpaare. Mit diesem ist es m{\"o}glich, zum Einen diejenigen Proben mit einer guten DNA-Qualit{\"a}t herauszufiltern, um Genotypisierungsfehler zu vermeiden, und zum Anderen jene Proben mit insuffizienter DNA-Qualit{\"a}t auszuschließen. Nachdem Proben, die f{\"u}nf oder mehr homozygote Loci in dem 9-STR-Markerset aufwiesen, ausgeschlossen wurden, resultierte dies in einer Ausschlussrate von 22,7\% und senkte die durchschnittliche Diskordanzrate auf 3,92\% f{\"u}r STRs bzw. 0,63\% f{\"u}r SNPs. Bei SNPs entspricht dieser Wert ungef{\"a}hr der Fehlerquote, wie er auch bei Genotypisierungen mit Vollblut-DNA in vielen Laboratorien auftritt. Unsere Methode und das Ausschlusskriterium bieten damit neue M{\"o}glichkeiten, um zuverl{\"a}ssige DNA aus archivierten Plasmaproben wiederzugewinnen. Dieser Algorithmus ist auch besser geeignet, als nur die eingesetzte DNA-Menge in die WGA-Reaktion als Kriterium zu ben{\"u}tzen.}, subject = {Whole Genome Amplification}, language = {de} } @phdthesis{Karkazis2008, author = {Karkazis, Andreas}, title = {Vergleich von sozialrechtlichen Gestaltungsm{\"o}glichkeiten der medizinischen Versorgung in der Humangenetik an der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg durch das SGB V / 2004}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-34679}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {„Die berufspolitische Situation f{\"u}r die Humangenetischen Institute hat sich an den Universit{\"a}ten in den letzten zwei Jahren leider nicht verbessert. Vielen Instituten wurde der Zugang zur Erbringung von Kassenleistungen deutlich erschwert bzw. g{\"a}nzlich entzogen." (Grimm, T.; Zerres, K., 2005, S. 41). Eine Analyse der Rechtsform und Aufbauorganisation sowie der Leistungen des Instituts f{\"u}r Humangenetik an der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg kann als Grundlage dienen, um die Auswirkungen einer entzogenen Kassenzulassung besser verstehen zu k{\"o}nnen. Zudem erm{\"o}glicht eine solche Betrachtung die Ableitung von Erfordernissen, die eine optimale Rechtsform und Aufbauorganisation des Instituts f{\"u}r Humangenetik an der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg erf{\"u}llen sollte. Zusammenfassend k{\"o}nnen dann die aktuellen und zuk{\"u}nftigen Rahmenbedingungen f{\"u}r die humangenetische Leistungserbringung bei bestehender Rechtsform und Aufbauorganisation beschrieben werden. Es wird deutlich, dass aufgrund eines drohenden Entzuges der Kassenzulassung eine Gef{\"a}hrdung der Erbringung humangenetischer Leistungen an der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg besteht. Die Finanzierung der erbrachten Leistungen in der Patientenversorgung wird zu ca. 75\% von den gesetzlichen Krankenkassen getragen. Ein Wegbrechen eines solchen Leistungsumfanges h{\"a}tte kaum kompensierbare Auswirkungen auf Forschung, Lehre, Weiterbildung und die Patientenversorgung an sich. Durch die Reformen des SGB aus dem Jahre 2004 sind verschiedene Alternativen zur bestehenden Rechtsform und Aufbauorganisation m{\"o}glich geworden. Hierbei handelt es sich um Hochschulambulanzen (gem. \S117 SGB V), Integrierte Versorgung (gem. \S140 SGB V) und Medizinische Versorgungszentren (gem. \S95 SGB V). Zudem gibt es die M{\"o}glichkeit einer „Praxis im Institut"-Kooperation. Diese Alternativen werden in der hier vorliegenden Arbeit kurz einzeln charakterisiert, um dann eine Bewertung der m{\"o}glichen Rechtsformen und Aufbauorganisationen gem{\"a}ß am Institut bestehender Erfordernisse zu erm{\"o}glichen. Die vergleichende Betrachtung wird zeigen, dass ein Medizinisches Versorgungszentrum (MVZ) eine gute M{\"o}glichkeit darstellt, die beschriebene Problematik zu l{\"o}sen und die Erfordernisse des Instituts zu erf{\"u}llen. Im Anschluss werden die rechtlichen und organisatorischen Ausgestaltungsm{\"o}glichkeiten eines MVZs zur Erbringung humangenetischer Leistungen beleuchtet. Hierbei wird im Besonderen auf die gesetzlichen Gr{\"u}ndungsvoraussetzungen eingegangen. Die Anforderungen an Gr{\"u}nder, Rechtsform, Leistungserbringer und {\"a}rztliche Leitung werden detailliert beschrieben, und die jeweiligen Gestaltungsm{\"o}glichkeiten im Hinblick auf die am Institut bestehenden Erfordernisse gewertet. Im Anschluss kann der Zulassungsprozess des MVZs an sich betrachtet werden.}, subject = {Humangenetik}, language = {de} } @phdthesis{Heinrich2005, author = {Heinrich, Tilman}, title = {Validierung der Zellzyklusdiagnostik bei Ataxia telangiectasia}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14654}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Methode der durchflusszytometrischen Zellzyklusanalyse von Lymphozyten bei Patienten mit der klinischen Verdachtsdiagnose Ataxia telangiectasia beschrieben. Hierzu wurden die Daten von 327 Patienten ausgewertet. In 82 F{\"a}llen ergab sich eine Best{\"a}tigung der Verdachtsdiagnose, in 225 F{\"a}llen konnte das Vorliegen dieser Erkrankung ausgeschlossen werden, bei den {\"u}brigen untersuchten F{\"a}llen ergab die Zellzyklusanalyse Auff{\"a}lligkeiten hinsichtlich des Proliferationsverhaltens der untersuchten Zellen und/oder ihrer Strahlensensitivit{\"a}t, die eine eindeutige Zuordnung zu einer der beiden Gruppen (AT-postiv/AT-negativ) zun{\"a}chst nicht gestatteten. Diese Auff{\"a}lligkeiten lassen sich teils auf technische Probleme (geronnenes Blut, langer Zeitraum zwischen Blutentnahme und Analyse), teils auf biologische Besonderheiten (bestehende Begleiterkrankungen wie Leuk{\"a}mie, Lymphom) zur{\"u}ckf{\"u}hren. Die durchflusszytometrische Zellzyklusanalyse von Lymphozyten ergibt als diagnostisch relevante Parameter den Anteil der nicht-proliferierenden Zellen (G0,G1) sowie den Anteil der in der G2-Phase des 1. Zellzyklus verbleibenden Zellen bezogen auf die Wachstumsfraktion (G2/GF). Der Anteil der nicht-proliferierenden Zellen (G0,G1) ist ein Maß f{\"u}r die Stimulierbarkeit der Lymphozyten. Diese Stimulierbarkeit ist bei Zellen von AT-Patienten h{\"a}ufig vermindert, d.h. das Ausmaß der Mitogenantwort gibt ebenso einen Hinweis auf das Vorliegen der Erkrankung AT wie die Strahlensensitivit{\"a}t der Zellen. Letztere wird durch den zweiten der oben angef{\"u}hrten Parameter (G2/GF) repr{\"a}sentiert. Der f{\"u}r die Erkrankung AT charakteristische Funktionsverlust des ATM-Proteins, welches im unbeeintr{\"a}chtigten Zustand f{\"u}r die Kontrolle der Reparatur von strahleninduzierten DNA-Sch{\"a}digungen verantwortlich ist, f{\"u}hrt typischerweise zu einer Erh{\"o}hung des Anteils von Zellen in der G2-Phase, nachdem diese Zellen ionisierender Strahlung ausgesetzt waren. Die zweidimensionale Auftragung dieser Parameter (G0,G1 gegen G2/GF) erlaubt in der Regel bereits eine guten Abgrenzung der Gruppe der AT-positiven gegen die AT-negativen F{\"a}lle. Die Ber{\"u}cksichtigung eines weiteren Parameters, n{\"a}mlich des AFP-Wertes, gestattet dar{\"u}berhinaus in mehreren F{\"a}llen die Zuordnung der oben erw{\"a}hnten, zun{\"a}chst unklaren F{\"a}lle zu einer dieser Gruppen. Die durchflusszytometrische Zellzyklusanalyse von bestrahlten Lymphozyten kann daher als Screening-Methode bei der Untersuchung von Patienten mit der Verdachtsdiagnose Ataxia telangiectasia als ein dem CSA {\"u}berlegenes Verfahren angesehen werden. Die Kombination dreier Parameter: 1) Anteil der nicht-proliferierenden Zellen (G0,G1), 2) Anteil der in der G2-Phase des 1. Zellzyklus verbleibenden Zellen bezogen auf die Wachstumsfraktion (G2/GF) und 3) AFP-Wert erlaubt hierbei im Rahmen der AT-Diagnostik in >93\% der F{\"a}lle eine eindeutige Zuordnung zur Gruppe der AT-negativen bzw. AT-positiven F{\"a}lle.}, language = {de} } @phdthesis{Scholl2021, author = {Scholl, Eva Elena}, title = {Untersuchungen zur Informationsweitergabe in Familien mit erblichem Brust- und Eierstockkrebs}, doi = {10.25972/OPUS-24325}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-243253}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2021}, abstract = {F{\"u}r die hier beschriebene Studie wurde ein Fragebogen erstellt, welcher von 80 Tr{\"a}gerinnen und Tr{\"a}gern einer pathogenen Mutation in den Genen BRCA1 oder BRCA2 ausgef{\"u}llt wurde. Die Befragung sollte untersuchen, ob den Befragten das Risiko ihrer Verwandten, ebenso Mutationstr{\"a}ger zu sein, bewusst war. Weiterhin sollte ermittelt werden, ob sie die jeweiligen Risikopersonen dar{\"u}ber informierten. Es zeigte sich, dass den meisten Befragten dieses Risiko bekannt war. Einigen Personen schienen jedoch nicht genau zu wissen, welche Verwandten als „Risikopersonen" z{\"a}hlen. Insbesondere war nicht allen Befragten die M{\"o}glichkeit bewusst, dass auch M{\"a}nner die Mutation tragen und an ihre Kinder weitergeben sowie selbst an Brustkrebs erkranken k{\"o}nnen. Weiterhin gaben mehr als ein Viertel der Befragten an, dass sie mindestens ein Familienmitglied, obwohl es ihnen als Risikoperson bekannt war, nicht informierten. Als h{\"a}ufigste Grund hierf{\"u}r wurde mangelnder Kontakt genannt. Vor dem Hintergrund der Angaben der Befragten sowie der aktuellen Forschungslage werden in der vorliegenden Arbeit M{\"o}glichkeiten diskutiert, wie die Anzahl der informierten Angeh{\"o}rigen verbessert werden k{\"o}nnte.}, subject = {Brustkrebs}, language = {de} } @phdthesis{Gehrig2003, author = {Gehrig, Andrea}, title = {Untersuchungen zu den molekularen Ursachen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis - vom Gendefekt zum Mausmodell}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7212}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Heredit{\"a}re Netzhautdegenerationen betreffen weltweit etwa 15 Millionen Menschen. Sie sind klinisch und genetisch auff{\"a}llig heterogen. Bisher wurden 139 verschiedene chromosomale Genorte mit Netzhautdystrophien assoziiert, wovon inzwischen 90 Gene identifiziert werden konnten. Mit Hilfe verschiedener Klonierungsstrategien konnte in der vorgelegten Arbeit ein Beitrag zur Aufkl{\"a}rung der genetischen Ursachen einiger ausgew{\"a}hlter Retinopathien geleistet werden. So konnte durch die Positionsklonierung das Gen, das mit der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis (RS) assoziiert ist, identifiziert werden. Funktionelle Analysen des Genproduktes sowie die Generierung eines Mausmodells der RS geben einen Einblick in die Physiologie der Retina sowie den Pathomechanismus der Erkrankung. Die genomische Organisation des Interphotorezeptor-Matrixproteoglykans-1 (IMPG1) wurde aufgekl{\"a}rt und die chromosomale Lokalisation auf 6q13-15 bestimmt. Damit kartierte das Gen in eine Region, in die die Genorte f{\"u}r 7 Retinopathien des Menschen kartiert wurden. Durch Kopplungs- und Mutationsanalysen konnten unsere Arbeiten ausschließen, daß IMPG1 mit North Carolina Makuladystrophie (MCDR1) oder der progressiven bifokalen chorioretinalen Atrophie (PBCRA) in Zusammenhang steht. Die Diacylglycerin Kinase-3 (DAGK3) konnte nach der Bestimmung der genomischen Organisation in die Region 3q27-28 kartiert werden. Dieser chromosomale Abschnitt deckt sich mit der chromosomalen Lokalisation der autosomal dominanten Optikusatrophie (OPA1). Auch hier konnte mit Hilfe von Mutationsanalysen ein Ausschluß des Gens erfolgen. Die X-gebundene juvenile Retinoschisis ist eine h{\"a}ufige Ursache juveniler Makula-degenerationen und betrifft etwa 300.000 junge M{\"a}nner weltweit. Charakteristische Kennzeichen der Erkrankung sind Aufspaltungen in den inneren Netzhautschichten, die zu zystischen Ver{\"a}nderungen der zentralen Retina f{\"u}hren. Ungef{\"a}hr 50 \% der Patienten entwickeln auch periphere Manifestationen. Durch die Arbeit unserer und anderer Forschergruppen konnte der Krankheitslokus in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert werden. Durch einen Vergleich der genomischen DNA Sequenzen mit {\"o}ffentlich zug{\"a}nglichen ESTs (expressed sequence tags) konnte ein retinaspezifisches Transkript identifiziert werden. Es besteht aus 6 Exonen und kodiert f{\"u}r ein putatives 224 Aminos{\"a}uren großes Protein, das sekretiert wird und ein hochkonserviertes Discoidindom{\"a}nen-Motiv enth{\"a}lt. Discoidindom{\"a}nen sind in Zelladh{\"a}sion oder in Zell-Zell Interaktionen involviert. Mutationsanalysen in RS-Patienten best{\"a}tigten, daß es sich bei diesem Transkript um RS1, d.h. um das krankheitsassoziierte Gen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis handelte. Das RS1-Protein (Retinoschisin) kommt in homo-oligomeren Komplexen, die {\"u}ber Disulfidbr{\"u}cken miteinander verbunden sind, auf der Zelloberfl{\"a}che der Photorezeptoren und der Bipolaren sowie in den synaptischen Regionen der {\"a}ußeren (OPL) und innere plexiformen Schicht (IPL) vor. Um die Funktion des normalen Retinoschisins zu untersuchen und um einen Einblick in die RS-Pathogenese zu bekommen, wurde nach der Charakterisierung des orthologen murinen Gens (Rs1h) eine Retinoschisin-defiziente knock-out Maus generiert. Ophthalmologische und histologische Untersuchungen der Rs1h-/Y-Maus zeigen signifikante Parallelen zu dem RS-Erkrankungsbild des Menschen. Damit stellt die Rs1h knock-out Maus ein ideales Tiermodell f{\"u}r die Untersuchung des zugrundeliegenden Krankheitsmechanismusses dar. So konnten wir inzwischen zeigen, daß apoptotische Prozesse zur Degeneration der Photorezeptoren f{\"u}hren. Gegenw{\"a}rtig werden mit diesem Tiermodell erste gentherapeutische Versuche durchgef{\"u}hrt. Diese Arbeiten sollen Aufschluß dar{\"u}ber geben, ob ein Adeno-assoziierter Virus (AAV)-Transfer des RS1 Gens in die erkrankte Retina ein m{\"o}glicher Therapieansatz f{\"u}r RS auch beim Menschen sein k{\"o}nnte.}, subject = {Maus}, language = {de} } @phdthesis{Sauer2001, author = {Sauer, Christian}, title = {Untersuchungen zu den genetischen Ursachen heredit{\"a}rer Netzhautdegenerationen des Menschen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1936}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Die Positionsklonierung hat sich als erfolgreiche Strategie zur Identifizierung und Isolierung von Genen erwiesen. Da ihre Anwendung im Allgemeinen keine Informationen {\"u}ber den zugrundeliegenden Pathomechanismus einer Erkrankung voraussetzt, eignen sich die Methoden der Positionsklonierung in besonderem Maße f{\"u}r die Erforschung heredit{\"a}rer Netzhauterkrankungen. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurden sie zur Untersuchung ausgew{\"a}hlter retinaler Degenerationen eingesetzt. Dabei konnten wichtige Beitr{\"a}ge f{\"u}r die Aufkl{\"a}rung der genetische Ursachen dieser Erkrankungen geleistet werden. Die autosomal dominante North Carolina Makuladystrophie (NCMD) oder die zentral areol{\"a}re Pigmentepitheldystrophie (CAPED) sind allelische Erkrankungen mit allenfalls gering progredientem Verlauf. Ihr Genlokus liegt in einem etwa 7,2 cM großen Bereich auf 6q14-q16.2 zwischen den DNA-Markern D6S424 und D6S1671. Mit Hilfe von 21 polymorphen DNA-Markern welche den NCMD-Lokus (MCDR1) flankieren, wurden Kopplungsanalysen in drei deutschen NCMD-Familien durchgef{\"u}hrt. Die Analyse der krankheitsassoziierten Haplotypen erbrachte Hinweise auf einen gemeinsamen Vorfahren aller drei Familien. Dar{\"u}ber hinaus konnte der MCDR1-Lokus auf 3,2 cM eingeengt werden und wird von den Markern D6S249 und D6S475 flankiert. Dies bedeutet einen wichtigen Schritt auf dem Weg zur Klonierung des zugrundeliegenden Krankheitsgens. Eine h{\"a}ufige Ursache f{\"u}r den fr{\"u}hzeitigen Verlust der zentralen Sehsch{\"a}rfe bei Jungen ist die X-gebundene juvenile Retinoschisis (RS). Ihr Genlokus wurde in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert, wo er von den DNA-Markern DXS418 und DXS999/DXS7161 flankiert wird. Die Analyse von EST-Sequenzen aus dieser Region erm{\"o}glichte die Isolierung eines neuen retinaspezifischen Transkriptes, welches als RS1 bezeichnet wurde. Das RS1-Gen besteht aus sechs Exonen und codiert ein Protein, welches eine in der Evolution hoch konservierte Discoidin-Dom{\"a}ne enth{\"a}lt. Diese Dom{\"a}ne ist in anderen Proteinen u.a. an der Ausbildung von Zell-Zell-Interaktionen beteiligt. Mutationsanalysen in betroffenen Personen aus neun nicht-verwandten RS-Familien ergaben neun verschiedene Sequenzver{\"a}nderungen die mit dem Krankheitsbild der jeweiligen Familie segregierten. Einen ersten Einblick in die zeitliche und r{\"a}umliche Expression ergab die Untersuchung des murinen Orthologs Rs1h mit Hilfe von Northern Blot, RT-PCR und RNA in situ-Hybridisierungen. Rs1h wird in der Maus haupts{\"a}chlich in den Photorezeptoren exprimiert. Die Expression beginnt erst postnatal und ist mit der Entwicklung der Photorezeptoren korreliert. Das Auftreten zahlreicher weißlich-gelber Flecken, sogenannter Drusen, in radi{\"a}rer Anordung am hinteren Augenpol ist das charakteristische Merkmal einer Gruppe von Netzhauterkrankungen mit gemeinsamer {\"A}tiologie, die unter dem Begriffen Doynsche Honigwaben Dystrophie (DHRD), Malattia Leventinese (MLVT) oder radi{\"a}re Drusen zusammengefasst werden. Der Genlokus dieser Erkrankung wurde auf den kurzen Arm von Chromosom 2 in den Bereich 2p16 kartiert. Die Durchsuchung von EST-Datenbanken f{\"u}hrte zur Identifizierung des neuronal exprimerten Gens pNEU60. Dieses besteht aus zwei Exonen, wobei der vollst{\"a}ndige codierende Bereich im zweiten Exon liegt. Die Analyse des pNEU60-Proteins ergab eine Struktur aus sieben Transmembrandom{\"a}nen, dem gemeinsamen Merkmal G-Protein gekoppelter Rezeptoren, wie z.B. Rhodopsin. Patienten mit radi{\"a}ren Drusen zeigten keinerlei Sequenzver{\"a}nderungen in pNEU60. Die Untersuchung von fast 200 Patienten mit der ph{\"a}notypisch sehr {\"a}hnlichen altersbedingten Makuladegeneration (AMD), f{\"u}hrte zur Identifizierung von drei potentiellen Mutationen, darunter eine nonsense-Mutation, sowie zwei polymorphen Ver{\"a}nderungen. Die Assoziation einer einzigen missense-Mutation (R345W) im ubiquit{\"a}r exprimierten Gen EFEMP1 (EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1) mit der DHRD und MLVT wurde von einer amerikanischen Arbeitsgruppe nachgewiesen. Die R345W Mutation in diesem proximal zu pNEU60 liegenden Gen wurde in den zur Verf{\"u}gung stehenden zwei MLVT-Familien sowie einer DHRD-Familie nachgewiesen. Bei der Analyse von 14 Patienten mit sporadischen radi{\"a}ren Drusen konnte weder die R345W Mutation, noch irgendeine andere krankheitsassoziierte Mutation nachgewiesen werden. Es wurden jedoch drei polymorphe Sequenzvarianten, sowie zwei polymorphe Di- bzw. Trinukleotidsequenzen identifiziert. Die Klonierung des orthologen EFEMP1-Gens des Rinds diente als Voraussetzung zur Untersuchung der Interaktionsf{\"a}higkeit von EFEMP1 mit anderen Proteinen. Mit der Anwendung des Hefe Zwei-Hybrid Systems konnte gezeigt werden, dass die EGF-Dom{\"a}nen von EFEMP1 eine Interaktion mit sich selbst erm{\"o}glichen. Die Einf{\"u}hrung der R345W Mutation hatte dabei keinen Einfluss auf diese Wechselwirkungen. Die beschriebene Interaktion mit dem zur Familie der Ubiquiline geh{\"o}renden Protein DA41 konnte nicht reproduziert werden. Das Gen welches mit der inkompletten Form der X-gebundenen kongenitalen station{\"a}ren Nachtblindheit (CSNB2) assoziiert ist, codiert die a1-Untereinheit des retinaspezifischen spannungsabh{\"a}ngigen L-Typ Kalziumkanals (CACNA1F). Mit Hilfe von RT-PCR Analysen und RNA in situ-Hybridisierungen wurde die r{\"a}umliche Expression dieses Gens in der Netzhaut untersucht. Dabei wurde das CACNA1F-Transkript in der {\"a}ußeren und inneren K{\"o}rnerschicht, sowie in der Ganglienzellschicht nachgewiesen.}, subject = {Netzhautdegeneration}, language = {de} } @phdthesis{Meyer2010, author = {Meyer, Johanna}, title = {Untersuchungen von Cyrillic 2.13 zur Absch{\"a}tzung der Mutations- und Erkrankungswahrscheinlichkeit bei erblichem Mamma- und Ovarialkarzinom}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65757}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {In dieser Arbeit wird anhand eines W{\"u}rzburger Studienkollektivs von erblich an Brust-und Ovarialkrebs Erkrankten, das 150 Ratsuchende umfasst, das Risikokalkulationsprogramm Cyrillic 2.13 zur Absch{\"a}tzung von Mutations- und Erkrankungswahrscheinlichkeiten bei erblichem Brust- und Ovarialkrebs untersucht. Es werden die vom Programm berechneten Mutationswahrscheinlichkeiten mit dem tats{\"a}chlichen Mutationsstatus der Probanden verglichen. Außerdem werden Stammb{\"a}ume der Probanden auf Angeh{\"o}rige 1. und 2. Generation gek{\"u}rzt, um zu untersuchen, ob dies die errechneten Ergebnisse beeinflusst. Es zeigt sich hierbei jedoch kein signifikanter Unterschied.}, subject = {Brustkrebs}, language = {de} } @phdthesis{Engel2019, author = {Engel, Jakob}, title = {Untersuchung der Korrelation von Genotyp und Ph{\"a}notyp bei der Hypophosphatasie}, doi = {10.25972/OPUS-18175}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-181751}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2019}, abstract = {Die Arbeit zeigt, dass die Symptome der HPP sehr variabel und unterschiedlich stark auftreten k{\"o}nnen. Dies erschwert die klinische Diagnosestellung der Erkrankung. Nahezu alle Patienten berichteten von starken Knochen-, Gelenk,- und Muskelschmerzen, von Karies und Parodontose sowie von vermehrten Frakturen, die zum Teil weitere chronische Schmerzen und Wiederholungsfrakturen erzeugen. Eine deutlich verminderte Leistungsf{\"a}higkeit im Vergleich zu Gleichaltrigen wurde ebenso h{\"a}ufig angegeben. Es konnte keine eindeutige Ph{\"a}notyp -  Genotyp Korrelation gefunden werden, allerdings geben die Daten einen deutlichen Hinweis, dass Patienten mit zwei Mutationen am st{\"a}rksten symptomatisch betroffen sind. Ebenfalls konnten keine Unterschiede zwischen dominant negativen Mutationen und nicht dominant negativen Mutationen gefunden werden.}, subject = {Hypophosphatasie}, language = {de} } @phdthesis{Kreuzer2011, author = {Kreuzer, Mirjam}, title = {Umgang mit der Legasthenie - vier Fallbeschreibungen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-69896}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Die Fallbeschreibungen der vorliegenden Arbeit befassen sich mit der Entwicklung von vier Legasthenikern bis in das Erwachsenenalter hinein. Dabei wird besonders auf die schulische und berufliche Entwicklung, die F{\"o}rderung und Therapie sowie die psychische Situation eingegangen. Anschließend erfolgt ein Vergleich mit weiteren Studien, die Legastheniker {\"u}ber einen l{\"a}ngeren Zeitraum begleitet haben. Es wird deutlich, dass die Entwicklung von Kindern mit einer Lese-Rechtschreibst{\"o}rung entscheidend von verschiedenen Rahmenbedingungen, wie zum Beispiel einer fr{\"u}hen legastheniespezifischen F{\"o}rderung, einer schulischen Ber{\"u}cksichtigung der Lese-Rechtschreibst{\"o}rung, der Unterst{\"u}tzung durch die Familie und der Herkunft abh{\"a}ngt. Unter optimalen Rahmenbedingungen haben auch Legastheniker die Chance, einen ihrer Intelligenz entsprechenden Schulabschluss und einen gehobenen Beruf zu erlangen.}, subject = {Legasthenie}, language = {de} } @phdthesis{Schulz2003, author = {Schulz, Heidi}, title = {Towards a comprehensive description of the human retinal transcriptome: identification and characterization of differentially expressed genes}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7278}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {The human retina is a multilayered neuroectodermal tissue specialized in the transformation of light energy into electric impulses which can be transmitted to the brain where they are perceived as vision. Since the retina is easily accessible and functional aspects are directly recordable, the study of this tissue has been at the forefront of neuroscience research for over a century. Studies have revealed that the distinct functions of the retina require a large degree of differentiation which is achieved by the coordinated function of approximately 55 different cell types. The highly structured anatomy and the functional differentiation of the retina is a result of its distinctive transcriptome and proteome. Due to the complexity of the retina it has been difficult to estimate the number of genes actively transcribed in this tissue. Great efforts in the elucidation of retinal disease genes have led to the identification of 139 retina disease loci with 90 of the corresponding genes cloned thus far . In contrast to the success in the hereditary disorders, efforts to identify the genetic factors conferring manifestations known as age-related macular degeneration (AMD) have revealed sparse results. AMD is a retinal disease affecting a significant percentage of the older population. This disorder is likely due to exogenic as well as genetic factors. To further our understanding of retinal physiology and facilitate the identification of genes underlying retinal degenerations, particularly AMD, our efforts concentrated on the systematic analysis of the retinal transcriptome. Since approximately half of all retinal degeneration-associated genes identified to date are preferentially expressed in retina, it is plausible that the investigation of gene expression profiles and the identification of retina-expressed transcripts could be an important starting point for characterizing candidate genes for the retinal diseases. The expressed sequence tags approach included the assessment of all retinal expressed sequence tags (EST) clusters indexed in the UniGene database and of 1080 single-pass ESTs derived from an in-house generated human retina suppression subtracted hybridization (SSH) cDNA library. In total, 6603 EST clusters were evaluated during this thesis and detailed in-silico analysis was performed on 750 EST clusters. The expression of the genes was evaluated using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), followed by confirmation using quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (qRT-PCR), as well as conventional and virtual Northern blot analysis. The expression profiling of 337 selected EST clusters led to the identification of 111 transcripts, of which 60 are specific or abundant to the retina, 3 are expressed at high levels in the retinal pigment epithelium (RPE), and 48 are expressed in brain as well as in retina. The EST approach used to select candidate transcripts allowed us to assess the effectiveness of the two available resources, the UniGene database and the retinal SSH (retSSH) cDNA library. From the results obtained, it is evident that the generation of suppression subtracted libraries to identify cell-specific transcripts constitutes the most straight-forward and efficient strategy. In addition to the high percentage of candidate genes that are identified from an SSH cDNA library, it has the added benefit that genes expressed at low levels can be identified. Furthermore, comparison of our retina-enriched gene set with previously published studies demonstrated only limited overlap of the identified genes further confirming the valuable source of retinal genes from our retinal SSH cDNA library. The effort of our and other groups has resulted in the establishment of the full-length coding sequence of 55 of the 111 genes uniquely or preferentially expressed in the retina. Using various methods such as bioinformatical analysis, EST assembly, cDNA library screening, and rapid amplification of cDNA ends (RACE) a number of genes were cloned in the scope of this thesis including C1orf32, C4orf11, C7orf9, C12orf7, C14orf29, DAPL1, and GRM7. Bioinformatic analyses and cDNA library screening were used to isolate the full-length cDNA sequence and determine the genomic organization of C7orf9, also identified as RFRP. This 1190 bp retina-specific transcript from chromosome 7p15.3 encodes a precursor protein for at least two small neuropeptides, referred to as RFRP-1 and RFRP-3. Since C7orf9 is localized in the critical region for dominant cystoid macular dystrophy (CYMD) its role in the pathology was investigated. Southern blot analysis and sequencing of samples from two affected individuals of the original pedigree used to localize the disease gene excluded the gene from involvement in this disease. Multiple isoforms of the C12orf7 gene were assembled from a number of clones identified from library screenings, PCR amplifications, and RACE experiments. The gene variants, transcribed from chromosome 12q13.13, have been found to be expressed exclusively in retina. Because of the multiple alternative splicing of the gene, we can only speculate about the nature of the protein it encodes. The longest transcript, which includes all six exons plus the last intervening sequence, encodes a 471 aa protein which contains a nuclear localization signal and five ankyrin repeats. The existence of many isoforms is also observed in mouse suggesting that they may have a relevant role in cellular physiology. Five novel splice variants of the glutamate metabotropic receptor 7 (GRM7) resulting from the use of alternative 3'-end exons were identified and characterized. One of the novel variants, GRM7_v3, encodes a 924 aa protein and is therefore the longest putative GRM7 protein reported to date. Even though they are not retina-specific, the isoforms are preferentially expressed in the nervous system. Although the functional properties of the specific carboxyl-termini are still unclear, it is known that axon targeting of GRM7_v1 is mediated by the last 60 aa of the protein. Hence the novel isoforms may direct the protein to specific subcellular localizations. The C1orf32 gene, preferentially expressed in retina, is organized in 10 exons and is transcribed from chromosome 1q24.1. Bioinformatic analyses of the 639 aa putative protein not only identified the mouse and rat orthologous genes but also the LISCH7 gene as a potential member of the same family. Since the LISCH7 protein has been shown to function as a low density lipoprotein receptor, the C1orf32 protein may be involved in retinal lipid homeostasis. Disturbances in lipid metabolism have been proposed as one of the pathways involved in AMD etiology. Thus, the role of C1orf32 in this complex disease should be investigated. Expression analyses of the death-associated protein-like 1 (DAPL1) gene revealed that it is expressed in both the retina and the RPE at high levels. The 552 bp transcript encodes a 107 aa putative protein and is transcribed from chromosome 2q24.1. In-silico analyses identified an additional 12 related proteins from various species which share high similarity constituting a novel protein family. The similarity to the death-associated-protein (DAP) is particularly interesting since this protein has been found to be indispensable for programmed cell death. Therefore, DAPL1 is an excellent candidate for retinal disease as apoptosis is generally the ultimate cause in retinal degeneration. The retina-specific C4orf11 and C14orf29 genes localized on chromosome 4q21.22 and 14q22.1, respectively, are both transcribed in more than one isoform. The encoded proteins do not contain any known domains but because of their retina-specific expression they may be important for proper retinal physiology. As part of the long-term goals of the project, several of the cloned genes are being genotyped to construct single nucleotide polymorphism (SNP) maps. Projects to investigate haplotype frequencies of candidate genes in large cohorts of controls and AMD patients are ongoing. Thus, by establishing a collection of 111 genes expressed exclusively or preferentially in the retina, the present work has laid the foundation for future research in retinal diseases.}, subject = {Netzhaut}, language = {en} } @phdthesis{Prell2024, author = {Prell, Andreas}, title = {The effects of paternal age on DNA methylation of developmentally important genes in human and bovine sperm}, doi = {10.25972/OPUS-34786}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-347866}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2024}, abstract = {Western societies are steadily becoming older undergoing a clear trend of delayed parenthood. Children of older fathers have an undeniably higher risk for certain neurodevelopmental disorders and other medical conditions. Changes in the epigenetic landscape and especially in DNA methylation patterns are likely to account for a portion of this inherited disease susceptibility. DNA methylation changes during the ageing process are a well-known epigenetic feature. These so-called age-DMRs exist in developmentally important genes in the methylome of several mammalian species. However, there is only a minor overlap between the age-DMR datasets of different studies. We therefore replicated age-DMRs (which were obtained from a genome wide technique) by applying a different technical approach in a larger sample number. Here, this study confirmed 10 age-DMRs in the human and 4 in the bovine sperm epigenome from a preliminary candidate list based on RRBS. For this purpose, we used bisulphite Pyrosequencing in 94 human and 36 bovine sperm samples. These Pyrosequencing results confirm RRBS as an effective and reliable method to screen for age-DMRs in the vertebrate genome. To decipher whether paternal age effects are an evolutionary conserved feature of mammalian development, we compared methylation patterns between human and bovine sperm in orthologous regulatory regions. We discovered that the level of methylation and the age effect are both species-specific and speculate that these methylation marks reflect the lineage-specific development of each species to hit evolutionary requirements and adaptation processes. Different methylation levels between species in developmentally important genes also imply a differing mutational burden, representing a potential driver for point mutations and consequently deviations in the underlying DNA sequence of different species. Using the example of different haplotypes, this study showed the great effect of single base variations on the methylation of adjacent CpGs. Nonetheless, this study could not provide further evidence or a mechanism for the transfer of epigenetic marks to future generations. Therefore, further research in tissues from the progeny of old and young fathers is required to determine if the observed methylation changes are transmitted to the next generation and if they are associated with altered transcriptional activity of the respective genes. This could provide a direct link between the methylome of sperm from elderly fathers and the development potential of the next generation.}, subject = {Epigenetik}, language = {en} } @phdthesis{AbdelRahman2003, author = {Abdel Rahman, Faisal Mirghani}, title = {Systematic analysis of genes expressed in the retinal pigment epithelium (RPE) and identification of candidates for genetic susceptibility to age-related macular degeneration (AMD)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7053}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Age related macular degeneration (AMD) is the leading cause of visual impairment in the elderly and the major cause of blindness in the developed world. To date, the molecular mechanisms underlying the disease are not well understood although in recent years a primary involvement of the retinal pigment epithelium (RPE) has become evident. The aim of the present study is to systematically analyse genes which are differentially expressed in the RPE, and to assess their possible association with mechanisms and pathways likely to be related to retinal disease, in particular AMD. Towards this goal, 2379 expressed sequence tags (ESTs) were established from an inhouse generated RPE cDNA library. This library was constructed by using the suppression subtraction hybridization (SSH) technique which normalises redundant sequences and ensures enrichment of rare transcripts. In a first phase, 1002 ESTs were sequenced and subjected to comprehensive alignment with public nucleotide and protein databases. A search of the 1002 ESTs against the human genome draft sequence yielded 168 known genes, 51 predicted genes, 15 unknown transcripts and 41 clones with no significant similarity. Reverse Northern blot hybridization was performed for 318 EST clusters to identify abundantly expressed genes in the RPE and to prioritize subsequent analyses. Representative clones were spotted onto a nylon membrane and hybridized with cDNA probes of driver (heart and liver) and tester (RPE) used in the cDNA library construction. Subsequently, 107 EST clusters were subjected to Northern blot hybridizations. These analyses identified 7 RPE-specific, 3 retina-specific, 7 RPE/retina-specific, and 7 tissue restricted transcripts, while 29 EST clusters were ubiquitously expressed, and evaluation was not possible for another 54 EST clusters. Of the 24 transcripts with specific or restricted expression, 16 clones were selected for further characterization. The predicted gene MGC2477 and 2 novel isoforms of the human transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 3 (TRPM3) were cloned and further described in detail. In addition, polymorphic variations for these 2 genes as well as for the human MT-Protocadherin gene were determined. For MGC2477, 15 single nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified, with 13 having a frequency of the minor allele greater than 20\%. 10 of the 15 SNPs have not been reported in so far in public SNP repertoires. Partial assessment of the TRPM3 gene yielded 35 SNPs. Of these, 30 (85.7\%) were highly frequent (0.17-0.5\%), and 14 (40\%) were novel. The MT-Protocadherin gene revealed 35 SNPs, including 28 (80\%) with high frequency of the minor allele. 23 (65.7\%) were novel SNPs. These SNPs will be used to construct the most common haplotypes. These will be used in case/control association studies in 400 AMD patients and 200 ethnically and aged matched controls to assess a possible contribution of these genes in the etiology of AMD.}, subject = {Senile Makuladegeneration / Pigmentepithel / Genexpression}, language = {en} } @phdthesis{Milenkovic2006, author = {Milenkovic, Vladimir M.}, title = {Structural and functional analysis of bestrophin}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19372}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Morbus Best (OMIM 153700), auch als vitelliforme Makuladystrophie Typ 2 (VMD2) bezeichnet, ist eine autosomal dominant vererbte Makuladystrophie mit juvenilem Beginn. Die Erkrankung geht einher mit einer Ansammlung von Lipofuscin-{\"a}hnlichem Material im sowie unterhalb des retinalen Pigmentepithels (RPE). Das bei Morbus Best mutierte VMD2- Gen kodiert f{\"u}r ein 585 Aminos{\"a}uren langes Transmembranprotein, genannt Bestrophin, und wird vorwiegend im RPE exprimiert. Das Protein hat eine komplexe Membrantopologie mit 4-6 putativen Transmembrandom{\"a}nen (TMD) und ist vermutlich in den Ca2+-abh{\"a}ngigen Transport von Chloridionen durch die Plasmamembran involviert. Die {\"u}berwiegende Mehrheit der krankheitsassoziierten Ver{\"a}nderungen bei M. Best Patienten sind Missense-Mutationen, die innerhalb der hochkonservierten N-terminalen H{\"a}lfte des Proteins nahe der mutmaßlichen Transmembrandom{\"a}nen akkumulieren. Der Zusammenhang zwischen Pathologie und identifizierter Mutationen bzw. der Chloridkanal- Funktion von Bestrophin-1 ist noch unklar. Um die biologische Funktion von Bestrohin-1 weiter aufzukl{\"a}ren und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der BMD besser zu verstehen, wurde mit Hilfe des GAL4-basierenden Hefe-Zwei-Hybridsystems (Y2H) nach interagierenden Partnern von Bestrophin-1 gesucht. Ein Screen in einer bovinen RPE cDNABank mit verschiedenen verk{\"u}rzten Fragmenten von Bestrophin-1 ergab 53 m{\"o}gliche interagierende Partner. Allerdings schlossen anschließende Verifikationsexperimente die Kandidatengene aus. Somit deuten die Resultate dieser umfangreichen YH2-Studie daraufhin, dass Bestrophin f{\"u}r das herk{\"o}mmliche Zwei-Hybrid-System nicht geeignet ist. Zum einen k{\"o}nnte dies daran liegen, dass das Protein ein integraler Bestandteil der Membran ist und zum anderen, dass m{\"o}glicherweise der Transport der gew{\"a}hlten Bestrophin-Fragmente zum Nukleus nicht stattfindet. Dies gilt jedoch als Grundvoraussetzung f{\"u}r eine Proteininteraktion im Hefe-2-Hybridsystem. Bestrophin geh{\"o}rt zu einer großen Familie von integralen Membranproteinen, von der bis heute bereits {\"u}ber 100 Mitglieder bei verschiedenen Organismengruppen wie denS{\"a}ugern, Insekten und W{\"u}rmern identifiziert werden konnten. Als auff{\"a}lligste Besonderheit in der Familie der Bestrophine zeigt sich neben einer nicht-variablen RFP-Dom{\"a}ne (Arginin- Phenylalanin-Prolin) eine evolution{\"a}r hochkonservierte N-terminale Region. Um die phylogenetische Beziehung der Bestrophine zu untersuchen sowie den Aufbau und die Funktion von konservierten Motiven innerhalb der Familienmitglieder zu identifizieren, wurde diese konservierte N-terminale Region sowohl bioinformatisch wie auch Chapter Two: Zusammenfassung 4 phylogenetisch weiter untersucht. Die phylogenetische Analyse der Bestrophin Homologen brachte vier evolution{\"a}r konservierte Familienmitglieder in S{\"a}ugern hervor, die jeweils eine starke Homologie zu den Proteinen VMD2, VMD2-L1 bis VMD2-L3 des Menschen zeigen. Die signifikante {\"A}hnlichkeit der Proteinsequenz innerhalb der vier Familienmitglieder l{\"a}sst die Schlussfolgerungen zu, dass zum einen jedes einzelne Familienmitglied ihre eigene evolution{\"a}r konservierte Funktion hat und zum anderen dass die Divergenz des Bestrophins in verschiedene Familienmitglieder zeitlich vor der Divergenz der verschiedenen S{\"a}ugerspezien erfolgt sein muss.}, subject = {Makuladegeneration}, language = {en} } @phdthesis{Pokall2003, author = {Pokall, J{\"o}rg Fabian}, title = {Somatische Gentherapie monogener Erbkrankheiten - Einfache L{\"o}sungen f{\"u}r einfache Defekte?}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7994}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Die Jahrtausendwende bildete den Rahmen einer lebhaften Zeit in der Gentherapie. {\"O}ffentlichkeitswirksame Berichte von bahnbrechenden Erfolgen schienen die M{\"u}hen jahrzehntelanger Grundlagenforschung endlich zu den prognostizierten Ergebnissen gef{\"u}hrt zu haben, wenn auch vorerst nur in recht kleinen Nischen des Feldes. Begleitet von gesch{\"a}rfter {\"o}ffentlicher Aufmerksamkeit, vor allem nach einem Todesfall im Rahmen einer gentherapeutischen Studie, schuf die Publikation des ersten therapeutischen Erfolges bei der „Severe Combined Immuno Deficiency" (SCID) im Millenniumsjahr eine willkommene Atempause f{\"u}r die somatische Gentherapie. Da bei monogenen Defekten im Gegensatz zu polygenen bzw. multifaktoriell bedingten Leiden die Reparatur des jeweiligen Genlokus theoretisch zu einer vollst{\"a}ndigen Korrektur f{\"u}hrt, waren erste gentherapeutische Fortschritte vor allem in diesem Feld prognostiziert worden. Allerdings stellten sich diese {\"U}berlegungen sehr bald als ein in der t{\"a}glichen Praxis der Laborarbeit mit immer neuen Hindernissen behaftetes Unternehmen heraus, so dass entgegen vorschnell ge{\"a}ußerter Ank{\"u}ndigungen die erwarteten L{\"o}sungen meist nur in Ans{\"a}tzen zu Stande kamen. Ziel dieser Arbeit ist es, anhand ausgew{\"a}hlter monogener Erbkrankheiten den derzeitigen Stand der somatischen Gentherapie einer eingehenden Analyse zu unterziehen.}, language = {de} } @phdthesis{Ernst2014, author = {Ernst, Simon Jonas}, title = {Serum-Creatin-Kinase Spiegel von Konduktorinnen der Duchenneschen und Beckerschen Muskeldystrophie unter besonderer Ber{\"u}cksichtigung einer Schwangerschaft}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-107469}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Diese Arbeit analysiert die Serum-Creatin-Kinase Spiegel von Konduktorinnen der Duchenneschen und Beckerschen Muskeldystrophie. Besonderes Augenmerk dieser Arbeit liegt auf den CK-Werten von schwangeren Konduktorinnen f{\"u}r die Muskeldystrophie Duchenne und Becker. Es werden Unterschiede im CK-Wert zwischen Schwangeren und nicht Schwangeren aufgezeigt. Die Berechnung der Odds-Ratio f{\"u}r die Gruppen der schwangeren Frauen soll es erm{\"o}glichen, auch nach bereits eingetretener Schwangerschaft, eine m{\"o}glichst genaue Ermittlung des Carrierstatus durchzuf{\"u}hren. Die CK-Werte wurden auch f{\"u}r nicht schwangere Frauen reevaluiert. Es wurden retrospektiv {\"u}ber einen Zeitraum von 7 Jahren Daten f{\"u}r die CK-Werte von Frauen gesammelt und ausgewertet, bei denen es innerhalb der Familie zu F{\"a}llen von Beckerscher oder Duchennescher Muskeldystrophie kam. Die Bestimmung der Serum Creatin-Kinase erfolgte nach der von der IFCC empfohlenen Methode bei 37 °C. Die Auswertung der Daten erfolgte nach folgenden Kriterien. Es wurden folgende Gruppen gebildet: Muskeldystrophie Duchenne, Muskeldystrophie Becker und Kontrollen. Innerhalb dieser Gruppen wurden zwei Altersgruppen gebildet. Die Altersgrenze lag bei 16 Jahren. Schwangere Frauen wurden getrennt von Frauen bei denen keine Schwangerschaft bestand analysiert. Die gewonnenen Daten wurden nach folgenden Gesichtspunkten ausgewertet: Die CK-Werte wurden logarithmiert, um einer Normalverteilung zu entsprechen. Die logarithmierten Creatin-Kinase Werte aller Gruppen waren normalverteilt. Die Verteilung der Daten innerhalb der relevanten Gruppen unterschied sich signifikant voneinander. Die Anzahl der ausgewerteten CK-Werte f{\"u}r die Gruppe der schwangeren BMD {\"U}bertr{\"a}gerinnen war deutlich zu klein. Es wurde der Mindestumfang f{\"u}r diese Gruppe ermittelt, um in zuk{\"u}nftigen Analysen signifikante Ergebnisse zu erhalten. F{\"u}r die Gruppe der nicht schwangeren {\"U}bertr{\"a}gerinnen f{\"u}r die Duchennesche Muskeldystrophie bestand ein signifikanter Zusammenhang zwischen Alter und CK-Wert. Es konnte eine Regressionsgerade bestimmt werden und anhand dieser eine Alterskorrektur durchgef{\"u}hrt werden. Die Odds Ratio, die anhand des CK-Werts einer Frau errechnet wird, ist ein Element f{\"u}r die individuelle Risikoberechnung. Es ließ sich anhand der statistischen Kennwerte, Mittelwert µ und Standardabweichung σ, der einzelnen Gruppen Formeln zur Berechnung der Odds Ratio herleiten. Abschließend erfolgte die Berechnung der Sensitivit{\"a}t und Spezifit{\"a}t der CK-Wert Bestimmung.}, subject = {Becker-Kiener-Syndrom}, language = {de} } @phdthesis{Fach2004, author = {Fach, Cornelia}, title = {Selektive Amplifikation, Klonierung und Sequenzierung eines hypermutablen Bereiches des Fanconi-An{\"a}mie-A (FANCA)-Gens aus Fibroblasten-Kulturen unterschiedlicher Passagen und Genotypen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-10464}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Fanconi-An{\"a}mie geh{\"o}rt zu den Chromosomenbruch-Syndromen und zeichnet sich durch eine genomische Instabilit{\"a}t aus. Die genomische Instabilit{\"a}t ist auch Ursache h{\"a}ufiger R{\"u}ckmutationen. Solche kommen vermehrt in Genabschnitten hoher Sequenzvariabilit{\"a}t vor. Insbesondere gilt dies f{\"u}r das Exon 10 des FANCA-Gens. Dieser Abschnitt des Gens wurde herausgesucht, da dieser als hypermutabler Bereich in der Literatur beschrieben ist. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Sequenzen des Exon 10 somatische Instabilit{\"a}t aufweisen. Hierzu wurden Fibroblasten eines Patienten und entsprechende Kontrollen in der Zellkultur seriell passagiert und gealtert. Im Zuge der Zellalterung konnte gezeigt werden, dass sich die Wachstumsrate verringerte. Die Zellen, die mit MMC behandelt wurden, stellten das Wachstum nach 1-2 Zellpassagen ein. Der Sequenzabschnitt aus FANCA wurde aus isolierter DNA der Zellen amplifiziert und im PCR-TOPO TA kloniert. Die erhaltenen Klone wurden sequenziert. Die Sequenzanalysen ergaben als h{\"a}ufigste Basensubstitution einen T nach C Austausch oder revers komplement{\"a}r einen Austausch von A nach G. Dies wird als Artefakt interpretiert. Vermutliche Ursache ist die relativ hohe Fehlerrate der Taq-Polymerase. F{\"u}r die Amplifizierung des Genomabschnittes aus dem FANCA-Gen sollte eine Polymerase verwendet werden, die eine h{\"o}here Genauigkeit als die Taq-Polymerase aufweist, wie z. B. die Pfu-Polymerase.}, language = {de} } @phdthesis{Krueger2005, author = {Kr{\"u}ger, Miriam}, title = {Sch{\"a}tzungen der m{\"a}nnlichen und weiblichen Mutationsraten bei Duchennescher Muskeldystrophie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15833}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Die vorliegende Arbeit besch\&\#228;ftigt sich mit der Bestimmung des Verh\&\#228;ltnisses der m\&\#228;nnlichen und weiblichen Mutationsraten bei der Duchenneschen Muskeldystrophie (DMD), wobei jeweils zwischen Deletionen und Punktmutationen unterschieden wird. Bei der Duchenneschen Muskeldystrophie handelt es sich um eine X-chromosomal rezessiv vererbte Krankheit. Es existiert derzeit keine kausale Therapie, die Patienten versterben meist im 2. Lebensjahrzehnt. Heterozygote Frauen, die in der Regel ph\&\#228;notypisch gesund sind, kommen als \&\#220;bertr\&\#228;gerinnen der Krankheit in Frage. Bislang gibt es keine absolut verl\&\#228;sslichen direkte Heterozygotentests, es k\&\#246;nnen nicht alle \&\#220;bertr\&\#228;gerinnen identifiziert werden. Stattdessen wird bei einer genetischen Beratung das Risiko einer Frau, \&\#220;bertr\&\#228;gerin zu sein, berechnet. Hierbei werden zun\&\#228;chst mit Hilfe des Familienstammbaums sowie weiteren Ph\&\#228;notypinformationen wie dem Creatinkinase-Wert (CK), Informationen erfasst. F\&\#252;r die Berechnung sind dann die Neumutationsrate f\&\#252;r DMD im Allgemeinen sowie das Verh\&\#228;ltnis der m\&\#228;nnlichen (Ny) und weiblichen (My) Mutationsraten Grundlage (k = Ny / My). Die m\&\#246;glichst genaue Kenntnis des genannten Quotienten k ist daher wesentlich f\&\#252;r die Ermittlung des Heterozygotenrisikos, um eine kompetente genetische Beratung dieser Frauen zu erm\&\#246;glichen. Es galt urspr\&\#252;nglich die Annahme Ny = My und somit k =1. Aufgrund der durchgef\&\#252;hrten Berechnungen konnte gezeigt werden, dass die Mutationsraten in weiblichen Keimzellen (My) und in m\&\#228;nnlichen Keimzellen (Ny) nicht, wie anf\&\#228;nglich angenommen, gleich gro\&\#223; sind. Es ist also My ungleich Ny, und somit k ungleich 1. Insbesondere muss hierbei zwischen Deletionen und Punktmutationen unterschieden werden. Es l\&\#228;sst sich sagen, dass f\&\#252;r Deletionen My > Ny gilt, w\&\#228;hrend f\&\#252;r Punktmutationen My < Ny gilt (k = 3,04 also Ny ca 3 My). Die Ergebnisse zeigen, dass ca. 60\% der Punktmutationen in der Spermatogenese entstehen, w\&\#228;hrend fast die Gesamtheit der Deletionen in der Oogenese entsteht. Diese Erkenntnis hat f\&\#252;r die humangenetische Beratung einer m\&\#246;glichen Konduktorin f\&\#252;r die Duchennesche Muskeldystrophie eine gro\&\#223;e Bedeutung. Aufgrund unserer Berechnungen k\&\#246;nnen wir davon ausgehen, dass bei Deletionen n\&\#228;herungsweise 50\% der F\&\#228;lle tats\&\#228;chliche Neumutationen sind, w\&\#228;hrend es sich in 50\% der F\&\#228;lle bei den M\&\#252;ttern um Konduktorinnen handelt. Damit ist die die Zahl der tats\&\#228;chlichen Neumutationen deutlich h\&\#246;her als durch theoretische \&\#220;berlegungen fr\&\#252;her angenommen (33\%), w\&\#228;hrend die Zahl der Konduktorinnen deutlich niedriger ist als angenommen (66\%). F\&\#252;r eine Mutter, die ein Kind mit Duchennescher Muskeldystrophie geboren hat, bei dem eine Deletion vorliegt, gilt nun, dass das Risiko, erneut ein krankes Kind zu geb\&\#228;ren, signifikant niedriger ist als das gesch\&\#228;tzte Risiko unter der Annahme gleicher Mutationsraten in Oogenese und Spermatogenese. F\&\#252;r Punktmutationen k\&\#246;nnen wir davon ausgehen, dass etwa 20\% der F\&\#228;lle tats\&\#228;chliche Neumutationen sind, w\&\#228;hrend es sich in 80\% der F\&\#228;lle bei den M\&\#252;ttern um Konduktorinnen handelt. Damit ist die die Zahl der tats\&\#228;chlichen Neumutationen deutlich niedriger, w\&\#228;hrend die Zahl der Konduktorinnen deutlich h\&\#246;her ist als angenommen. F\&\#252;r eine Mutter, die ein Kind mit Duchennescher Muskeldystrophie geboren hat, bei dem eine Punktmutation vorliegt, gilt nun, dass das Risiko, erneut ein krankes Kind zu geb\&\#228;ren, deutlich h\&\#246;her ist als zun\&\#228;chst angenommen.}, language = {de} } @phdthesis{Aichinger2007, author = {Aichinger, Eric}, title = {Risikoberechnung bei der Muskeldystrophie Duchenne und der Muskeldystrophie Becker}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27000}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Risikoberechnung in Familien mit Muskeldystrophie Duchenne oder Muskeldystrophie Becker. Unter Ber{\"u}cksichtigung eines Keimzellmosaiks, heterogener Neumutationsraten und der M{\"o}glichkeit homozygot betroffener Frauen.}, language = {de} } @phdthesis{Rudorf2006, author = {Rudorf, Antje}, title = {Rekombinationsh{\"a}ufigkeit in Abh{\"a}ngigkeit vom Entbindungsalter der M{\"u}tter f{\"u}r das DMD-Gen (Xp 21.2)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17452}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den Zusammenhang zwischen Alter und Rekombi-nationsrate f{\"u}r den Duchenne-Muskeldystrophie-Genabschnitt auf dem X-Chromosom (Xp21.2) zu ermitteln. In der vorliegenden Arbeit wurden von {\"u}ber 200 am Humangenetischen Institut der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg untersuchten Familien 110 informative Stammb{\"a}ume ausgewertet. Bei diesen Familien waren bereits im Rahmen der genetischen Beratung mehrere flankierende und intragene Marker des DMD-Genes bekannt. Um eine Vergleichbarkeit der einzelnen Personen zu erreichen, wurden die Grenzen des zu untersuchenden DNA-Bereiches bei den Markern DYS I,II,III sowie STR 56 gesetzt. Die Frauen wurden anschließend nach dem Entbindungsalter in drei Gruppen eingeteilt. Gruppe 1 beinhaltet die unter 30-j{\"a}hrigen, Gruppe 2 die 30- bis 35-j{\"a}hrigen und Gruppe 3 die {\"u}ber 35-j{\"a}hrigen Frauen. Rekombinationen fanden sich in Gruppe 1 bei 17 von 129, in Gruppe 2 bei 9 von 40 und in Gruppe 3 bei 2 von 20 Frauen. Aus diesen Ergebnissen l{\"a}ßt sich \&\#967;² mit 2,513 bestimmen. Erst ab einem Wert von 5,99 kann man jedoch von einer Signifikanz sprechen. Somit gibt es keinen Zusammenhang zwischen dem Alter der Frauen bei der Entbindung und der Rekombinationsrate. Aufgrund anderer Arbeiten zum Thema Rekombinationsrate bei Autosomen in Abh{\"a}ngigkeit vom Alter wurde eine Abnahme der Rate im h{\"o}heren Alter erwartet. Dies konnte jedoch bei der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. M{\"o}gliche Fehlerquellen liegen hierbei in der stark variierenden Gruppengr{\"o}ße, dem Stichprobenumfang und falsch positiver Zuordnung bei der Phasenfestlegung. Außerdem besteht die M{\"o}glichkeit eines unterschiedlichen Rekombinatinsverhaltens bei Gonosomen im Vergleich zu Autosomen. Das Ergebnis dieser Arbeit ist trotz fehlender Signifikanz im Hinblick auf die genetische Beratung so zu beurteilen, daß j{\"u}ngere Frauen (< 30 Jahre) kein erh{\"o}htes Risiko f{\"u}r eine Rekombination tragen als {\"A}ltere (> 35 Jahre) und es damit in der Risikoberechnung bez{\"u}glich des Alters keine Unterschiede gibt.}, language = {de} } @phdthesis{Weber2007, author = {Weber, Natalia}, title = {Psychosoziale Aspekte bei heredit{\"a}rer Mamma/Ovarial-Ca-Belastung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28330}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der psychischen Befindlichkeit und anderer gesundheitsbezogenen Konditionen der Frauen und M{\"a}nner mit famili{\"a}ren Mamma- und Ovarialkarzinomrisiko sowie die Kl{\"a}rung hinsichtlich der Bew{\"a}ltigung und Auswirkung genetischer Risikoinformation. Es wurden Risikowahrnehmung, Informationsstand, Inanspruchnahme der Beratungsangebote sowie der Fr{\"u}herkennungsmaßnahmen, Einstellung gegen{\"u}ber genetischer Brustkrebsdiagnostik und famili{\"a}rer/sozialer Kommunikation untersucht. Die vollst{\"a}ndig ausgef{\"u}llten Frageb{\"o}gen von Ratsuchenden und Betroffenen, die an der Beratung und Befragung im Zentrum f{\"u}r „Famili{\"a}ren Brust-/Eierstockkrebs" teilgenommen haben, wurden von uns ausgewertet. F{\"u}r die beratenden Institutionen ist das Wissen der vielf{\"a}ltigen psychischen und sozialen Folgen bei den Testsuchenden und deren Familien sehr wichtig. Nur so kann das Betreuungskonzept und das Beratungsangebot verbessert werden.}, subject = {Brustkrebs}, language = {de} } @phdthesis{Macht2002, author = {Macht, Anna}, title = {Pr{\"a}natale FISH-Diagnostik am Institut f{\"u}r Humangenetik der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg im Zeitraum von 01/1998-08/1999}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-308}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) hat in viele Gebiete der modernen Medizin und Biologie Einzug gehalten. Ein wichtiges Anwendungsfeld hat sie in der pr{\"a}natalen Diagnostik gefunden. An kultivierten Interphasekernen sowie Metaphasechromosomen eingesetzt kann sie zus{\"a}tzliche Informationen zur zytogenetischen Analyse liefern. Chromosomenspezifische Sonden k{\"o}nnen auch auf native Fruchtwasserzellen, Chrorionzottenzellen und fetale Blutzellen hybridisiert werden. Seit einigen Jahren wird FISH an unkultivierten Amniozyten bei bestimmten Indikationen erg{\"a}nzend zur herk{\"o}mmlichen Chromosomenanalyse durchgef{\"u}hrt. Nach der Hybridisierung werden die Prozents{\"a}tze der Kerne mit disomem (2 Signale) und aberrantem (z.B. 3 Signale bei Trisomie) Signalmuster analysiert. F{\"u}r eine zuverl{\"a}ssige Information m{\"u}ssen mindestens 50 Kerne pro Sonde ausgewertet werden. Bei weniger als 10 Prozent aneuploiden Kernen wird das Ergebnis als unauff{\"a}llig gewertet, bei mehr als 60 Prozent aberranten Kernen als auff{\"a}llig und dazwischen als uneindeutig bzw. kontrollbed{\"u}rftig. Die konventionelle Chromosomenanalyse erfordert in der Regel ein 2-3w{\"o}chige Zellkultur. Das Ergebnis der FISH-Analyse ist dagegen nach 1-3 Tagen erh{\"a}ltlich, verk{\"u}rzt so die f{\"u}r die werdende Mutter oft qu{\"a}lende Wartezeit betr{\"a}chtlich und ist damit besonders f{\"u}r Hochrisikogruppen geeignet. Mit FISH f{\"u}r die Chromosomen 13, 18, 21 und XY k{\"o}nnen k{\"o}nnen bis zu 90 Prozent der im 2. Trimenon erwarteten Chromosomenanomalien diagnostiziert werden. 10-15 Prozent der Anomalien, z.B. strukturelle Aberrationen k{\"o}nnen mit dieser Methode grunds{\"a}tzlich nicht erfasst werden. Technische Probleme, wie z.B. Versagen der Hybridisierung, eine zu geringe Anzahl auswertbarer Kerne oder eine Kontamination der nativen Fruchtwasserprobe mit Zellen m{\"u}tterlichen Ursprungs k{\"o}nnen die Aussagekraft des Tests betr{\"a}chtlich herabsetzen. In der vorliegenden Arbeit werden die ersten 129 FISH-Untersuchungen an unkultivierten Fruchtwasserproben, die am Institut f{\"u}r Humangenetik in W{\"u}rzburg in der klinischen Diagnostik durchgef{\"u}hrt wurden, retrospektiv aufbereitet. Die einzelnen F{\"a}lle werden nach den oberngenannten Kriterien in Gruppen mit unauff{\"a}lligen, auff{\"a}lligen und problematischen FISH-Befunden aufgeteilt. Der Anteil der letztgenannten Gruppe ist recht groß: In lediglich 20 Prozent (n=26) der F{\"a}lle konnten 50 Zellkerne pro Sonde ausgewertet werden, in 22 Prozent (n=28) der F{\"a}lle war das Ergebnis mit 10-60 Prozent aberranten Kernen uneindeutig und in 26 Prozent (n=33) der F{\"a}lle schlug die Hybridisierung f{\"u}r mindestens eine Sonde fehl. Dennoch konnten 79 Prozent (15/19) der erkennbaren Anomalien korrekt identifiziert werden: 5 Trisomie 21-F{\"a}lle, darunter eine Robertson-Translokation, 3 Trisomie 18-F{\"a}lle, 4 F{\"a}lle mit Triploidie, 2 F{\"a}lle mit Monosomie X und eine Fall mit dem Chromosomensatz 48, XXY, +21. Nicht diagnostiziert wurden aufgrund von fehlgeschlagener Hybridisierung 2 F{\"a}lle mit Trisomie 21 und ein Fall mit Trisomie 13. ein Fall von Trisomie 18 zeigte ein unauff{\"a}lliges Signalmuster. Es traten keine falsch positiven Befunde auf. F{\"u}nf F{\"a}lle mit strukturellen Aberrationen entgingen der FISH-Analyse. In der folgenden Arbeit werden die Anzahl auswertbarer Kerne, die Signalverteilung in den verschiedenen Gruppen, Probleme bei Hybridisierung oder Auswertung und beeinflussende Faktoren wie Indikation, Gestationsalter, Farbe und Menge des Fruchtwassers beschrieben. In der Diskussion wird auf grunds{\"a}tzliche technische Besonderheiten der FISH-Analyse eingegangen, wie z.B. Sondenqualit{\"a}t, Gestationsalter und Zellzahl. Das Problem der Kontamination der Fruchtwasserproben mit m{\"u}tterlichen Zellen wird erl{\"a}utert. Anschließend wird nochmals auf die pathologischen, problematischen und diskrepanten FISH-Befunde eingegangen. Daten und Erfahrungen verschiedener Arbeitsgruppen aus der Literatur werden jeweils ber{\"u}cksichtigt und mit den eigenen Daten in Beziehung gesetzt. Sensitivit{\"a}t und Spezifit{\"a}t der Methode werden diskutiert. FISH kann eine wertvolle Erg{\"a}nzung zum Goldstandard der pr{\"a}natalen Diagnostik und insbesondere der psychischen Entlastung der Patientin dienen. Einen vollst{\"a}ndigen Ersatz der konventionellen Technik kann sie wegen der oben erw{\"a}hnten Limitationen nicht bieten. Die Entscheidung {\"u}ber die Anwendung der FISH-Diagnostik, wie auch der Pr{\"a}nataldiagnostik {\"u}berhaupt, sollte der betroffenen Frau {\"u}berlassen werden und erst nach ausf{\"u}hrlicher Information {\"u}ber Vor- und Nachteile sowie m{\"o}gliche Konsequenzen, im Idealfall im Rahmen einer Genetischen Beratung, erfolgen.}, language = {de} } @phdthesis{Schaafhausen2011, author = {Schaafhausen, Anne}, title = {Proteininteraktionen der Vitamin K Epoxid Reduktase Proteine VKORC1 und VKORC1L1}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55442}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Seit der Entdeckung des ersten Gens f{\"u}r den Vitamin K Epoxid-Reduktase-Komplex (VKORC1), dem Schl{\"u}ssel-Enzym f{\"u}r die Regenerierung von Vitamin K, sind keine zus{\"a}tzlichen Komponenten des Komplexes beschrieben worden. Die einzige bekannte Funktion von VKORC1 ist bislang die Reduktion von Vitamin K-2,3-Epoxid, welches bei der post-translationalen Carboxylierung von Proteinen als oxidierter Kofaktor anf{\"a}llt, und im sogenannten Vitamin K-Zyklus regeneriert wird. VKORC1 ist zugleich das Zielprotein antikoagulativer Medikamente der Coumarin-Gruppe, wie Warfarin oder Marcumar. Mutationen im VKORC1-Gen f{\"u}hren zu einem signifikanten Effekt auf die ben{\"o}tigte Coumarin-Dosis und die Stabilit{\"a}t der H{\"a}mostase in der Thrombosebehandlung mit Antikoagulanzien. Gleichzeitig mit VKORC1 wurde ein stark sequenz-homologes Protein identifiziert, das „VKORC1-like1" (VKORC1L1) genannt wurde und dessen physiologische Funktion zu Beginn dieser Arbeit v{\"o}llig unbekannt war. Die vorliegende Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit zwei Aspekten des Vitamin K-Stoffwechsels: A. Den enzym-kinetischen Eigenschaften und der subzellul{\"a}ren Lokalisation des VKORC1L1-Proteins sowie B. der Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, die Interaktionspartner der beiden VKOR-Proteine sein k{\"o}nnen. Die Ergebnisse k{\"o}nnen wie folgt zusammengefasst werden: A.1. Die enzym-kinetischen Untersuchungen zeigen starke {\"A}hnlichkeiten zwischen VKORC1 und VKORC1L1: Beide Enzyme haben eine Vitamin K-Epoxidase- und -Reduktase-Aktivit{\"a}t, wobei die Affinit{\"a}ten zu Vitamin K2-Epoxid deutlich h{\"o}her sind als die zu Vitamin K1-Epoxid. Beide Enzyme sind durch Warfarin hemmbar und der Austausch der vermutlich am Elektronentransfer beteiligten Cysteine an homologen Positionen f{\"u}hrt in beiden Proteinen zu einem fast vollst{\"a}ndigen Verlust der Aktivit{\"a}t. A.2. Mittels Ko-Lokalisation konnte VKORC1L1 - wie VKORC1 - in der ER-Membran lokalisiert werden. Folglich schließen wir, dass VKORC1L1 eine {\"a}hnliche Struktur, die gleiche zellul{\"a}re Lokalisation und zumindest in vitro auch eine VKOR-Aktivit{\"a}t hat und daher eventuell eine weitere Komponente des VKOR-Komplexes darstellen k{\"o}nnte. Allerdings sprechen gewichtige Argumente dagegen, dass beide Proteine funktionell austauschbar sind: Sowohl bei Patienten mit Mutationen in VKORC1 (VKCDF2-Erkrankung), als auch bei VKORC1-Knock-out M{\"a}usen kann das intaktes VKORC1L1-Protein die inaktivierende Mutation im C1-Gen nicht kompensieren. B.1. Mit einem f{\"u}r Membranproteine adaptierten, modifizierten Yeast-Two-Hybrid Screen (Split-Ubiquitin-System) konnten mit VKORC1 und VKORC1L1 als K{\"o}der 114 Proteine aus einer Leber-cDNA-Bank als potentielle Interaktionspartner identifiziert werden. Davon wurden 6 Proteine aufgrund ihrer Trefferh{\"a}ufigkeit und funktioneller {\"U}berlegungen mit Hilfe von Ko-Immunpr{\"a}zipitationsexperimenten und Ko-Immunlokalisation n{\"a}her untersucht. Interessanterweise zeigen die beiden Trefferlisten starke {\"U}berschneidungen. B.2. Es konnte eine in vitro- Interaktion von VKORC1 mit sich selbst und mit VKORC1L1 nachgewiesen werden, die bisher nicht bekannt war. Dies k{\"o}nnte auf der hohen Sequenz- und Struktur-Homologie der beiden Proteine beruhen, f{\"u}hrt aber auch zu neuen Hypothesen bez{\"u}glich des Vitamin K-Stoffwechsels. B.3. Die Interaktion von VKORC1 und dem „stress-associated endoplasmic reticulum protein 1" (SERP1) bringt Vitamin K in Zusammenhang mit oxidativem Stress. Dazu passen auch die neuesten Ergebnisse aus der Arbeitsgruppe von Johannes Oldenburg (vormals W{\"u}rzburg, jetzt Bonn) zur Funktion von VKORC1L1, die eine protektive Rolle von Vitamin K beim Schutz der Zelle vor reaktiven Sauerstoffverbindungen nahe legen. Ob und wie Vitamin K und VKORC1L1 einen neuen Schutzmechanismus gegen Sauerstoffradikale bilden bedarf weiterer Untersuchungen. B.4. Ferner wurde eine Interaktion zwischen VKORC1 und dem „Emopamil-binding-protein" (EBP) nachgewiesen. Mutationen in EBP f{\"u}hren zu der seltenen genetischen Krankheit Chondrodysplasia punctata. Die {\"A}hnlichkeit der Symptomatik zwischen Chondrodysplasia punctata und der sogenannten Warfarin-Embryopathie, die durch {\"u}berh{\"o}hte Dosierung von Coumarinen w{\"a}hrend der Schwangerschaft verursacht wird, legt einen Zusammenhang zwischen Vitamin K- und dem Kalziumstoffwechsel nahe. B5. In den Ko-Immunpr{\"a}zipitationsexperimenten nicht best{\"a}tigt haben sich die initial positiven Proteine Protein-Disulfid-Isomerase (PDIA6), CD63, und Fibrinogen-Gamma (FGG). Die Ergebnisse geben Hinweise auf neue Funktionen der VKOR-Proteine beim Schutz vor oxidativem Stress und in der Verbindung zum Kalzium-Stoffwechsel. Beide Aspekte bed{\"u}rfen weiterf{\"u}hrender Untersuchungen. Im Hinblick auf diese neuen Funktionen w{\"a}re auch eine kritische Betrachtung der {\"u}brigen 85 prim{\"a}ren Treffer des Split-Ubiquitin-Screens sinnvoll.}, subject = {Vitamin-K-Gruppe}, language = {de} } @phdthesis{Gavvovidis2010, author = {Gavvovidis, Ioannis}, title = {Prim{\"a}re Mikrozephalie: Einblicke in Expression und Funktion von MCPH1/Microcephalin und seiner Isoformen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51816}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Prim{\"a}re Mikrozephalie (MCPH) ist eine heterogene, autosomal rezessive St{\"o}rung des Menschen, die durch eine enorme Reduzierung des Hirnvolumens und variable geistige Behinderung ohne zus{\"a}tzliche neurologische Defizite charakterisiert ist. F{\"u}nf einzeln urs{\"a}chliche Gene sind bislang identifiziert. Zellul{\"a}res Merkmal von Patienten mit biallelischen Mutationen im MCPH1-Gen ist die vorzeitige Chromosomenkondensation in der G2-Phase des Zellzyklus sowie die verz{\"o}gerte Chromosomendekondensation in der darauf folgenden G1-Phase (PCC-Syndrom). In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass MCPH1 f{\"u}r zwei Haupttranskripte kodiert: Full-length-MCPH1 und ein Transkript ohne die Sequenz der letzten f{\"u}nf Exons (MCPH1De9-14). Das vom Full-length-Transkript kodierte Polypeptid enth{\"a}lt eine N-terminale und zwei C-terminale BRCT-Dom{\"a}nen, w{\"a}hrend der MCPH1De9-14-Isoform die beiden C-terminalen BRCT-Dom{\"a}nen fehlen. Beide Varianten zeigen eine {\"a}hnliche H{\"o}he der Gewebe-spezifischen Expression und sind in bestimmten f{\"o}talen Organen st{\"a}rker vertreten als in adulten. Beide Isoformen werden w{\"a}hrend des Zellzyklus antagonistisch reguliert. Beide sind Zellkern-spezifische Proteine. Drei Kernlokalisierungssequenzen wurden in silico identifiziert. Die funktionelle Untersuchung dieser Signale ergab, dass zwei von ihnen unabh{\"a}ngig voneinander den Kerntransport des Proteins bewerkstelligen k{\"o}nnen. Die alleinige Expression der jeweiligen Variante ist ausreichend, um die defekte Chromosomenkondensation in MCPH1-defizienten Zellen zu komplementieren. Fehlende Komplementation mit der Deletionsvariante MCPH1De1-7 weist die N-terminale Region von MCPH1 als unentbehrlich zur Verhinderung von PCC aus. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten auf eine redundante Funktion der beiden Isoformen in der Regulierung der Chromosomenkondensation hin. Im Gegensatz dazu verhalten sie sich unterschiedlich im Bezug auf die DNA-Schadensantwort. W{\"a}hrend Full-length-MCPH1 in strahlungsinduzierten Reparaturfoci lokalisiert werden kann, wird f{\"u}r MCPH1De9-14 keine Kolokalisierung mit phosphoryliertem H2AX nach DNA-Schadensinduktion beobachtet. Zusammenfassend kann man feststellen, dass das MCPH1-Gen f{\"u}r unterschiedliche Isoformen mit differenzieller Regulation auf RNA-Ebene und verschiedenen Funktionen auf Protein-Ebene kodiert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erleichtern das Verst{\"a}ndnis der diversen Funktionen von MCPH1 in der Zelle.}, subject = {Mikrozephalie}, language = {de} } @phdthesis{Marquardt2001, author = {Marquardt, Andreas}, title = {Positionsklonierung des Morbus Best-Gens VMD2}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-414}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Die Dissertation beschreibt die Positionsklonierung von VMD2, einem Krankheitsgen des Menschen, dass der dominant vererbten vitelliformen Makuladystrophie Typ 2 (VMD2) zugrundeliegt. Zu diesem Zweck wurde zun{\"a}chst ein etwa 1.4 Mbp großer Klon-'Contig' aus artifiziellen Phagenchromosomen ('phage artificial chromosomes', PAC) erstellt, der die VMD2-Kandidatengenregion auf Chromosom 11q12-q13.1 physikalisch repr{\"a}sentiert. Durch die Identifizierung polymorpher (CA)n-Dinukleotidmarker aus dem kritschen Intervall und anschließender Kopplungsanalyse gelang es, die Kandidatengenregion auf ca. 500 kbp zu reduzieren. In der {\"o}ffentlichen Datenbank (GenBank) bereitgestellte Nukleins{\"a}uresequenzen zweier genomischer Klone aus dem Kern des relevanten chromosomalen Bereichs von zusammen etwa 290 kbp wurden dazu genutzt, {\"u}ber eine Kombination aus computergest{\"u}tzter Vorhersagen kodierender Sequenzen, Kartierung von EST-Klonen ('expressed sequence tags'), RT-PCR-Analysen und, wenn erforderlich, 5'-RACE-Experimenten, acht neue Gene des Menschen zu isolieren. Von den charakterisierten Genen erwiesen sich mehrere als potentielle Kandidaten f{\"u}r VMD2. Ein Gen, provisorisch als Transkriptionseinheit TU15B bezeichnet, konnte durch eine Mutationsanalyse schließlich eindeutig mit der Erkrankung assoziiert werden und wurde 1998 als VMD2 publiziert. Drei Gene aus der untersuchten Region kodieren Mitglieder einer Familie von Fetts{\"a}uredesaturasen (FADS1, FADS2 und FADS3), w{\"a}hrend ein anderes Gen ('Rabin3 interacting protein-like 1'; RAB3IL1) signifikante Sequenzidentit{\"a}t zu einem Transkript der Ratte besitzt, welches das GTPase-interagierende Protein Rabin3 kodiert. Den putativen Translationsprodukten drei weiterer Gene (C11orf9, C11orf10 und C11orf11) konnte bislang keine pr{\"a}zise Funktion zugeschrieben werden. Mit FTH1 ('ferritin heavy chain 1') und FEN1 ('flap endonuclease 1') liegen zudem zwei bekannte Gene im analysierten Intervall, deren cDNA-Sequenzen bereits 1984 bzw. 1995 von anderen Forschungsgruppen isoliert und publiziert wurden. Zweifellos kann die Region als sehr genreicher Abschnitt des menschlichen Genoms bezeichnet werden. Neben der Erstellung des PAC-'Contigs', der Einengung der VMD2-Kandidatenregion und der Klonierung von VMD2 war die vollst{\"a}ndige genetische Charakterisierung der genannten Fetts{\"a}uredesaturase-Gene ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit. Unabh{\"a}ngig von der Klonierung und Charakterisierung des VMD2-Gens sowie der chromosomal eng benachbarten Gene, richtete sich mein Interesse schließlich noch auf drei Gene des Menschen, provisorisch als TU51, TU52 und TU53 bezeichnet, die gemeinsam mit VMD2 eine Genfamilie bilden und auf den Chromosomen 19p13.2-p13.12 (TU51), 12q14.2-q15 (TU52) und 1p32.3-p33 (TU53) lokalisiert werden konnten. Durch die Aufkl{\"a}rung der kodierenden Nukleins{\"a}uresequenzen der Gene wurden konservierte Sequenzabschnitte innerhalb der Genfamilie erkennbar, die auf wichtige funktionelle Abschnitte der Translationsprodukte schließen lassen.}, subject = {Makuladystrophie}, language = {de} } @phdthesis{Reichenbach2020, author = {Reichenbach, Juliane Renate}, title = {Paternal age effects on sperm DNA methylation and its impact on the next generation}, doi = {10.25972/OPUS-19980}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-199805}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2020}, abstract = {The effect of late parenthood on the offspring´s physical and mental health status has recently become an increasingly important topic of discussion. Studies on neurodevelopmental disorders in children of older parents (Naserbakht et al., 2011) outline the negative consequences of aging fathers as unpredictable compared to the better-understood unfavorable maternal influences (Cedars et al. 2015). This may be due to the fact that lifelong production of male gametes becomes more susceptible to error, not only for somatic mutations. Non-genomic mechanisms such as epigenetic methylation also alter DNA dynamically throughout life (Jones et al., 2015) and influence the aging human sperm DNA (Jenkins et al., 2014). These methylation changes may be transmitted to the next generation via epigenetic inheritance mechanisms (Milekic et al., 2015), which may negatively impact the sensitive epigenetic regulation of cell differentiation in the embryonic period (Curley et al., 2011; Spiers et al., 2015). Accordingly, Nardone et al. (2014) reported several hypomethylated regions in autistic patients, illustrating potential epigenetic influences on the multifactorial pathogenesis of neuropsychiatric disorders. In the present study, the methylation status of five gene regions in the sperm DNA of males of different ages was analyzed by two techniques - pyrosequencing and deep bisulfite sequencing. Two gene regions, FOXK1 and DMPK, showed a highly significant age-related methylation loss and FOXK1 a reduced methylation variation at the level of single alleles. In addition, the examined gene region of FOXK1 showed significant methylation changes in the fetal cord blood DNA of the respective offspring of the sperm donor. This fact suggests a transfer of age-related methylation loss to the next generation. Interestingly, a methylation analysis at the level of single alleles showed that the methylation loss was inherited exclusively by the father. FOXK1 is a transcription factor that plays an important role in the epigenetic regulation of the cell cycle during embryonic neuronal development (Huang et al., 2004; Wijchers et al., 2006). For this reason, the methylation status of FOXK1 in the blood of autistic patients and an age- and sex-matched control group was investigated. While both groups showed age-associated FOXK1 methylation loss, a faster dynamics of methylation change was observed in the autistic group. Although further studies are needed to uncover inheritance mechanisms of epigenetic information, the present results show an evident influence of age-related methylation changes on offspring. When advising future fathers, it is important to consider how the paternal epigenome is altered by aging and can have a negative impact on the developing embryo.}, subject = {Epigenetik}, language = {en} } @phdthesis{Riemens2023, author = {Riemens, Renzo J. M.}, title = {Neuroepigenomics in Alzheimer's disease: The single cell ADds}, isbn = {978-94-6423-524-1}, doi = {10.25972/OPUS-25457}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-254574}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2023}, abstract = {Die Forschung, die in dieser Arbeit zusammengestellt wird, kann in zwei Teile geteilt werden. Der erste Teil, bestehend aus vier Kapiteln, konzentriert sich auf die Rolle der epigenetischen Dysregulation in der {\"A}tiopathophysiologie der sporadischen Alzheimer-Krankheit (sAD). Neben Einblicken in die neuesten Entwicklungen in neuroepigenomischen Studien zu dieser Krankheit geht der erste Teil der Arbeit auch auf verbleibende Herausforderungen ein und gibt einen Ausblick auf m{\"o}gliche Entwicklungen auf diesem Gebiet. Der zweite Teil, der drei weitere Kapitel umfasst, konzentriert sich auf die Anwendung von auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) basierenden Krankheitsmodellen f{\"u}r das Studium der AD, einschließlich, aber nicht beschr{\"a}nkt auf mechanistische Studien zur epigenetischen Dysregulation unter Verwendung dieser Plattform. Neben der Skizzierung der bisherigen Forschung mit iPSC-basierten Modellen f{\"u}r sAD gibt der zweite Teil der Arbeit auch Einblicke in die Gewinnung krankheitsrelevanter Nervenkulturen auf Basis der gezielten Differenzierung von iPSCs und beinhaltet dar{\"u}ber hinaus einen experimentellen Ansatz f{\"u}r den Aufbau eines solchen Modellsystems.}, subject = {Epigenetik}, language = {en} } @phdthesis{Knies2018, author = {Knies, Kerstin}, title = {Neue Fanconi-An{\"a}mie-Gene als W{\"a}chter des Genoms}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-150669}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2018}, abstract = {Fanconi An{\"a}mie (FA) geh{\"o}rt zu den seltenen Chromsomeninstabilit{\"a}ts-Syndromen. Urs{\"a}chlich f{\"u}r die Erkrankung sind biallelische Mutationen mit autosomal rezessiver Vererbung in einem der bisher bekannten 21 Genen (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U und -V). Eine Ausnahme stellen FANCB und FANCS dar, die X-chromosomal rezessiv bzw. mit einem dominant negativen Effekt vererbt werden. Die Genprodukte sind als Teil des FA/BRCA-DNA-Reparatur Netzwerks bei der Beseitigung von DNA-Interstrang-Quervernetzungen (ICL) involviert. ICLs f{\"u}hren zu einer Stagnation der Replikationsgabel und blockieren somit wichtige zellul{\"a}re Prozesse wie Replikation und Transkription, sodass eine Aufrechterhaltung der Genomstabilit{\"a}t nicht mehr gew{\"a}hrleistet ist. FA ist gekennzeichnet durch angeborene Fehlbildungen, fortschreitendes Knochenmarkversagen und eine erh{\"o}hte Pr{\"a}disposition gegen{\"u}ber Krebserkrankungen. Die Diagnose basiert auf ph{\"a}notypischen Auff{\"a}lligkeiten und wird auf zellul{\"a}rer Ebene durch die Hypersensititv{\"a}t gegen{\"u}ber DNA-quervernetzenden Substanzen wie Mitomycin C (MMC) best{\"a}tigt. Da nicht jeder Patient einer bisher bekannten Komplementationsgruppe zugeordnet werden kann und herk{\"o}mmliche molekulare Diagnostikverfahren mit der steigenden Anzahl an FA-Genen m{\"u}hsam, zeitaufw{\"a}ndig und teuer geworden sind, war es n{\"o}tig, neue molekulare Verfahren wie Whole Exome Sequencing (WES) zu etablieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Potential dieser Methode im Bezug auf die FA-Genotypisierung erforscht. Bei der Suche nach einer optimalen Anwendung des WES, untersuchten wir verschiedene Anreicherungs- und Sequenziertechniken. Dennoch f{\"u}hren Fehler in den Datenbanken sowie Pseudogene zu falschen Dateninterpretationen und -darstellungen und stellen somit eine Herausforderung dar. Trotzdem zeigen unserer Daten, dass WES eine wertvolle Methode in der Molekulardiagnostik von FA ist. Dies best{\"a}tigte sich durch die Zuordnung mehrerer, vorher unklassifizierter FA-Patienten zu den bekannten Komplementationsgruppen und der Erg{\"a}nzung eines siebten Patienten zum Subtyp FA-P, im Rahmen von zwei Next Generation Sequencing (NGS) Publikationen. Außerdem wurden mit Hilfe von WES zwei neue FA-Gene (FANCQ und FANCW) im Rahmen dieser Arbeit gefunden, wobei XPF (FANCQ) das erste Gen {\"u}berhaupt war, welches anhand von NGS detektiert wurde. ERCC4/XPF ist eine strukturspezifische Endonuklease, die durch ein Gen kodiert wird, welches bereits vorher mit den Krankheiten Xeroderma Pigmentosum (XP) und dem segmentalen XFE progeroid Syndrom in Verbindung gebracht wurde. Unsere Daten zeigen, dass abh{\"a}ngig von der Mutation in XPF, Patienten eine der drei unterschiedlichen Funktionsst{\"o}rungen aufweisen. Dies hebt die multifunktionale Stellung der XPF Endonuklease im Rahmen der Genomstabilit{\"a}t und von humanen Erkrankungen hervor. Das zweite Gen, das w{\"a}hrend dieser Arbeit entdeckt wurde, ist die WD40-Dom{\"a}ne tragende E3 Ubiquitin Ligase RFWD3, die k{\"u}rzlich mit DNA Reparatur und insbesondere HR verkn{\"u}pft wurde. Wir konnten zeigen, dass eine RFWD3 Mutation in der WD40-Dom{\"a}ne bei einem FA-Patienten mit der genetischen Erkrankung Fanconi An{\"a}mie assoziiert ist. Die HR ist in RFWD3 (FANCW) mutierten Zellen gest{\"o}rt, was auf einer verminderten Relokalisation von mutiertem RFWD3 an das Chromatin und einer defekten Interaktion mit RPA beruht. Des Weiteren weisen Rfwd3 defiziente M{\"a}use typische Merkmale anderer FA-Mausmodelle auf, wie verminderte Fertilit{\"a}t, ovarielle und testikul{\"a}re Atrophie sowie eine reduzierte Lebenserwartung. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass neue molekulare Ans{\"a}tze wie NGS ein wertvolles Hilfsmittel in der FA-Diagnostik sind um bisher unklassifizierte Patienten einer Komplementationsgruppe zuordnen zu k{\"o}nnen. Zudem konnten mit Hilfe dieser Technik zwei neue Gene identifiziert werden. Deren Charakterisierung tr{\"a}gt zu einer Vervollst{\"a}ndigung und weiteren Aufkl{\"a}rung des FA/BRCA-DNA-Reparatur-Netzwerks bei.}, subject = {DNA Reparatur}, language = {de} } @phdthesis{Hossfeld2005, author = {Hoßfeld, Andrea}, title = {Mutationsscreening im Ryanodinrezeptor 1 bei Patienten mit maligner Hyperthermie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-16545}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {In der vorliegenden Arbeit wurden aus den Testzentren W{\"u}rzburg und Wien DNA-Proben von Patienten, die im Laufe einer An{\"a}sthesie eine maligne Hyperthermie (MH) entwickelt hatten, und deren Angeh{\"o}rigen auf MH-verursachende Mutationen im Gen f{\"u}r den Ryanodinrezeptor 1 (RYR 1) untersucht. Es wurde dabei eine Hotspotregion des RYR 1 ausgew{\"a}hlt, f{\"u}r die bereits im Vorfeld mehrere Mutationen bekannt waren. Das Screening wurde mit Hilfe der Methode single-stranded conformation polymorphism (SSCP) durchgef{\"u}hrt. Eine dem abweichenden Laufverhalten eventuell zugrunde-liegende Mutation wurde anschließend durch die automatische Sequenzierung identifiziert. Unter 190 Patienten aus 126 Familien konnte in 18 F{\"a}llen eine Mutation gefunden werden. Das entspricht einer Detektionsrate von 14,29\%. Insgesamt traten 10 verschiedene Mutationen auf, von denen eine (G6377A) vorher noch nicht beschrieben war. Die Mutationsh{\"a}ufigkeiten unterschieden sich zum Teil erheblich innerhalb der beiden untersuchten Populationen und im Vergleich zu Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen. Alle Indexpatienten und viele Angeh{\"o}rige hatten sich bereits einem in-vitro-Kontrakturtest (IVCT) zur Diagnostik der MH unterzogen. So konnten die Ergebnisse des IVCT mit denen der genetischen Untersuchung verglichen werden. Es fand sich eine gute {\"U}bereinstimmung, die die Zuverl{\"a}ssigkeit des IVCT st{\"u}tzt. Begleitend zur Screeninguntersuchung wurden die Methoden SSCP und automatische Sequenzierung hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit im Screening großer Patientenkollektive bewertet. Bei vergleichbarer Sicherheit ist mit dem SSCP in k{\"u}rzerer Zeit bei geringerem Kostenaufwand eine gr{\"o}ßere Anzahl an Patientenproben auswertbar. Der Stellenwert der genetischen Diagnostik bei der MH wurde als ideale Methode zur Identifikation betroffener Familienmitglieder in MH-Familien mit bekannter Mutation best{\"a}tigt.}, language = {de} } @phdthesis{Blaurock2002, author = {Blaurock, Claudia}, title = {Mosaikbildung bei Fanconi-An{\"a}mie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1181548}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Die Fanconi-An{\"a}mie ist eine autosomal-rezessiv vererbte Krankheit, die mit progredientem Knochenmarksversagen, Fehlbildungen und Tumoren einhergeht. Diagnostiziert wird diese Krankheit durch eine vermehrte Chromosomenbr{\"u}chigkeit nach Behandlung mit Diepoxybutan oder Mitomycin C oder durch einen erh{\"o}hten Anteil von Zellen in der G2-Phase in der Durchflußzytometrie. Bei einigen Patienten wurden Verl{\"a}ufe mit stabilen Blutbildern beschrieben. Als Erkl{\"a}rung wurde das Vorhandensein einer Mosaikkonstellation bei diesen Patienten diskutiert. Hier wird ein FA-Patient der Komplementationsgruppe A beschrieben, bei dem es im Alter von 2 Jahren zu einer Thrombozytopenie kam und ein dysplastisches Knochenmark vorlag. Zus{\"a}tzlich liegt bei dem Patienten noch ein Wachstumshormonmangel bei dysplastischer Hypophyse vor. Im Alter von 3 ½ Jahren kam es zu einer deutlichen Stabilisierung des Blutbildes; auch fand sich bei wiederholten Knochenmarkspunktionen ein normozellul{\"a}res Mark. Nachdem zuvor die Diagnose FA mittels Chromosomenbruchanalyse und Durchflußzytometrie gestellt und sp{\"a}ter durch Untersuchung von Fibroblasten best{\"a}tigt worden war, stellte sich jetzt die Frage eines Mosaiks. Weitere Zellzyklusanalysen ergaben ann{\"a}hernd normale Befunde. Bei einer weiteren, im Alter von 6 Jahren durchgef{\"u}hrten Chromosomenbruchanalyse zeigte sich eine bimodale Verteilung der MMC-Sensitivit{\"a}t. Auf Grund dieser Bimodalit{\"a}t, also der Koexistenz von defekten und intakten Zellen, kann von der Existenz einer Mosaikkonstellation ausgegangen werden, die f{\"u}r das Auftreten intakter Zellen verantwortlich ist und dadurch zu einer Stabilisierung des Blutbildes gef{\"u}hrt hat. Die erste Mutation des Patienten wurde auf Exon 10 gefunden, wo anstelle von Glutamins{\"a}ure ein Stopcodon gebildet wird. Ob die Mosaikkonstellation im vorliegenden Fall durch intragenes Crossover oder Genkonversion entstanden ist, kann erst nach der Identifizierung der Mutation auf dem zweiten Allel des Patienten abgekl{\"a}rt werden.}, language = {de} } @phdthesis{Balzar2004, author = {Balzar, Alla}, title = {Morbidit{\"a}t und Mortalit{\"a}t sowie Prognose kleiner Fr{\"u}hgeborener < 32 Schwangerschaftswochen 1995 bis 2001}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-13205}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {In der vorliegenden Arbeit wurden die Krankenbl{\"a}tter 366 kleiner Fr{\"u}hgeborener (Schwangerschaftswochen (SSW) 23/0 bis 32/0), die im Zeitraum von 1995 bis 2001 in der Frauenklinik des Klinikums S{\"u}d N{\"u}rnberg aus Einlingsschwangerschaften geboren wurden, retrospektiv ausgewertet. 136 Schwangere wurden nach einem vorzeitigen Blasensprung entbunden. 16 Kinder sind innerhalb der Neonatalperiode gestorben. Erfasst wurden zum einen wichtige pr{\"a}- und peripartale Faktoren, u.a. m{\"u}tterliches Alter und Risiko,Schwangerschaftsalter, Indikation zur Schwangerschaftsbeendigung und Entbindungsmodus, und zum anderen fetale Outcome-Parameter wie Gewicht, Apgar Score, Nabelarterien-pH-Wert, Base Excess und Intubation. Dar{\"u}ber hinaus wurden f{\"u}r jedes Kind die Morbidit{\"a}tsdiagnosen und bei gestorbenen Kindern die Todesursachen aufgenommen. In 37 \% der F{\"a}lle lag der Fr{\"u}hgeburt ein vorzeitiger Blasensprung zugrunde, in 31 \% eine vorzeitige Wehent{\"a}tigkeit. Die {\"u}brigen 32 \% wurden durch maternofetale Pathologie hervorgerufen. Das Gewicht der Fr{\"u}hgeborenen lag zu 75 \% unter 1500 g. In einer schweren Azidose befanden sich 6 \% der Kinder. Eine starke Abh{\"a}ngigkeit der Outcome-Parameter von Poleinstellung und Entbindungsmodus war nicht zu beobachten. Fr{\"u}hgeborene nach fetaler Entbindungsindikation wiesen ein schlechteres Outcome auf als nach maternaler Indikation. Von den beobachteten Krankheiten kam das Atemnotsyndrom am h{\"a}ufigsten vor (in 63 \% der F{\"a}lle), bei 20 \% der Kinder III.-IV. Grades. Hochgradige Retinopathie (Grade III-IV) wurde in 5,4 \%, retrolentale Fibroplasie in 0,6 \% der F{\"a}lle diagnostiziert. Ein Drittel der Kinder erkrankten an einer Sepsis. Bei 18 \% entwickelte sich im Verlauf eine bronchopulmonale Dysplasie. Schwere Hirnblutungen (III.-IV. Grades) erlitten 4,5 \% der Fr{\"u}hgeborenen, periventrikul{\"a}re Leukomalazie 3,6 \% und nekrotisierende Enterokolitis 1,5 \%. Die genannten Krankheiten traten mit zunehmendem Schwangerschaftsalter weniger h{\"a}ufig auf. Die Prognose verbesserte sich besonders stark in den SSW 28-30. 6 von 16 Todesf{\"a}llen (38 \%) entfielen auf die ersten 24 Lebensstunden. Die Todesursachen waren Unreife/Mangelgeburt (31 \%), Sepsis (31 \%), Fehlbildungen und intrauterine Asphyxie (jeweils 13 \%). Die neonatale Mortalit{\"a}tsrate nahm mit zunehmendem Geburtsgewicht deutlich ab: Von 33 \% f{\"u}r Fr{\"u}hgeborene unter 500 g, auf 3 \% ab 1000 g. Die mittlere Latenzperiode nach einem vorzeitigen Blasensprung betrug 9,1 Tage (in 90 \% der F{\"a}lle bis zu 3 Wochen, Maximum: 10 Wochen). Kinder beider betrachteter Gruppen von 23-28 und 29-32 SSW profitierten vom angewendeten konservativen Management: Bez{\"u}glich der Lungenreife war eine klare Verbesserung zu beobachten, falls die RDS-Prophylaxe 48 Stunden vor der Geburt abgeschlossen war. Sepsis kam zwar in der Gruppe mit niedrigerem Gestationsalter h{\"a}ufiger vor, war jedoch nicht direkt abh{\"a}ngig von der Latenzperiode. Im Vergleich mit anderen aktuellen Studien lagen die in dieser Arbeit festgestellten Morbidit{\"a}tsraten etwa gleichauf. Die Kinder des eigenen Kollektivs entwickelten aber seltener intraventrikul{\"a}re H{\"a}morrhagie und periventrikul{\"a}re Leukomalazie. Die starke Abnahme von Morbidit{\"a}t und Mortalit{\"a}t mit zunehmendem Schwangerschaftsalter wird in den Vergleichsstudien {\"a}hnlich berichtet. Eine nicht vernachl{\"a}ssigbare {\"U}berlebenschance kann bereits ab 23 SSW gegeben sein (4 von 6 dieser Kinder {\"u}berlebten die Neonatalperiode). Die Chancen auf ein gesundes {\"U}berleben jedoch steigen besonders in den SSW 28-30. Daher ist in den sehr fr{\"u}hen SSW die Prolongation der Schwangerschaft zu empfehlen.}, language = {de} } @phdthesis{Kellner2009, author = {Kellner, Dorothee}, title = {Molekulargenetische Diagnostik von FGFR-/TWIST-Defekten im Verlauf: eine retrospektive Studie im Zeitraum 2000-2004}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-46884}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Im Zeitraum 2000 - 2004 wurden dem Institut f{\"u}r Humangenetik der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg insgesamt 12.049 Patienten zur molekulargenetischen Diagnostik zugewiesen. Anforderungen zum Ausschluss von FGFR-/TWIST-Defekten machen hierbei 6\% des gesamten Patientenguts aus (714 untersuchte Patienten). Innerhalb der Krankheitsgruppe der FGFR-/TWIST-Defekte steht die molekulargenetische Best{\"a}tigung bzw. der Ausschluss eines Muenke-Syndroms mit 219 Patienten im Zeitraum 2000-2004 an erster Stelle. An zweiter Stelle folgt das Saethre-Chotzen-Syndrom mit 180 untersuchten Patienten. Am dritth{\"a}ufigsten wurden Anfragen zur molekulargenetischen Diagnostik bei Verdacht auf ein Crouzon-/bzw. Pfeiffer-Syndrom (152 Patienten) gestellt. Die Zahl der Anforderungen blieb im F{\"u}nfjahresverlauf relativ konstant, d. h. es gab in Bezug auf die Anzahl der untersuchten Patienten/Jahr nur geringf{\"u}gige Fluktuationen. Die Anforderungen einer molekulargenetischen Diagnostik bei klinischem Verdacht auf FGFR-/TWIST- Defekte kamen schwerpunktm{\"a}ßig aus W{\"u}rzburg, M{\"u}nchen, Ansbach, Erfurt und Berlin. Am h{\"a}ufigsten konnte die klinische Verdachtsdiagnose beim Apert-Syndrom durch den Mutationsnachweis im FGFR2-Gen best{\"a}tigt werden (in 67\% der F{\"a}lle). An zweiter Stelle, d. h. in 33\% der F{\"a}lle, konnte durch die molekulargenetische Diagnostik des FGFR3-Gens die Verdachtsdiagnose der Achondroplasie best{\"a}tigt werden. Am dritth{\"a}ufigsten, d.h. in 20\% der F{\"a}lle konnten die Genanalysen die Verdachtsdiagnose Crouzon-/bzw. Pfeiffer-Syndrom best{\"a}tigen. Die gr{\"o}ssten differentialdiagnostischen Schwierigkeiten bestehen klinischerseits offenbar beim Muenke-Syndrom (FGFR3) sowie beim Saethre-Chotzen-Syndrom (TWIST1) und der Hypochondroplasie (FGFR3). Bei diesen Entit{\"a}ten konnte die klinische Verdachtsdiagnose lediglich in weniger als 15\% der F{\"a}lle auf der molekulargenetischen Ebene best{\"a}tigt werden. Diese Ergebnisse verdeutlichen die ausgepr{\"a}gte ph{\"a}notypische Variabilit{\"a}t die bei den einzelnen Erkrankungen besteht. Die molekulargenetische Best{\"a}tigung bzw. der Ausschluss der klinischen Verdachtsdiagnose bildet die Grundlage f{\"u}r Prognose und Therapie der Patienten. Dies wird insbesondere hinsichtlich der Implikationen der molekulargenetischen Differenzierung zwischen den ph{\"a}notypisch {\"a}hnlichen Kraniosynostose-Syndromen (Saethre-Chotzen vs. Muenke) deutlich. Z. B. kennzeichnen progressive multisuturale Fusionen das Saethre-Chotzen-, nicht jedoch das Muenke-Syndrom. Wegen des hohen Risikos einer rekurrenten intrakraniellen Hypertension ben{\"o}tigen SCS-Patienten im Kindesalter eine regelm{\"a}ssige Kontrolle.}, subject = {W{\"u}rzburg / Institut f{\"u}r Humangenetik}, language = {de} } @phdthesis{Wolz1999, author = {Wolz, Werner}, title = {Molekulargenetische Analyse der Central Core Disease}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-2521}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {1999}, abstract = {Central Core Disease (CCD) ist eine neuromuskul{\"a}re Erkrankung aus dem Formenkreis der kongenitalen Myopathien. Die Symptomatik umfaßt eine verz{\"o}gerte motorische Entwicklung, eine nicht bis schwach progrediente Schw{\"a}che der Extremit{\"a}tenmuskulatur mit Betonung der distalen, unteren Gliedmaßen sowie Defekte des Skelettapparates wie Kyphoskoliosen, Kontrakturen und Fußanomalien. Die Zentralfibrillen-Myopathie, wie man die Erkrankung im Deutschen nennt, imponiert durch eine mehr oder minder regelm{\"a}ßige Assoziation mit der Veranlagung zur Malignen Hyperthermie (MHS), die wiederum von Mutationen im Ryanodinrezeptorgen (RYR1), einem sarkoplasmatischen Calciumkanal, verursacht wird. In genetischen Familienanalysen wurde die CCD ebenfalls zum RYR1-Gen auf dem Humanchromosom 19q13.1 kartiert, womit dieses Gen zum Kandidatengen f{\"u}r CCD avancierte. Es wurden in einigen wenigen Familien Mutationen im RYR1-Gen gefunden, die man f{\"u}r urs{\"a}chlich f{\"u}r die Auspr{\"a}gung der CCD h{\"a}lt. Mittlerweile h{\"a}uften sich aber Hinweise, daß die CCD, ebenso wie die MHS heterogene Ursachen haben kann und damit die Rolle des RYR1-Gens als Kandidat f{\"u}r das CCD-Gen zunehmend in Frage gestellt wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die Feinkartierung von CCD-Familien vorangetrieben, indem neue Familien gesammelt wurden und ein neuer, zusammengesetzter Mini-/ Mikrosatelliten-Marker charakterisiert wurde, der f{\"u}r die Feinkartierung an CCD-Familien eingesetzt werden konnte. Des weiteren wurden neuere Mikrosatelliten-Marker des Genethon-Konsortiums angewendet und die Koppelung der CCD-Familien zu Chromosom 19q13.1 konnte best{\"a}tigt werden, allerdings mit einigen Ausnahmen, so daß bei CCD ebenfalls heterogene Ursachen angenommen werden k{\"o}nnen. Ein weiteres Kandidatengen wurde mit dem MYH7-Gen f{\"u}r die beta-Kette des schweren Myosins auf Chromosom 14 vorgeschlagen, dies konnte aber weder best{\"a}tigt noch ausgeschlossen werden. Um die Rolle des RYR1-Gens f{\"u}r die CCD zu eruieren wurden die h{\"a}ufigsten bisher bei MHS-Familien gefundenen RYR1-Mutationen an CCD-Patienten untersucht. Lediglich in einer CCD/MHS-Familie konnte eine bereits bekannte Mutation best{\"a}tigt werden, das RYR1-Gen konnte nicht als verursachendes Gen der CCD best{\"a}tigt werden, allerdings konnte nicht das komplette Gen untersucht werden, aufgrund der großen Anzahl von Exons und der Gr{\"o}ße des Gens. Ein zweiter Teil der Arbeit bestand in der Suche nach neuen Transkripten aus Muskelgewebe in der genomischen Region 19q13.1 mit dem Endziel der Erstellung einer Transkriptionskarte dieser Region. Hier kam die cDNA-Selektion zur Anwendung mit einer PCR-amplifizierten cDNA-Bibliothek aus Muskelgewebe sowie ein gut charakterisiertes Cosmid-Contig aus dem Bereich des RYR1-Gens. Es konnte lediglich ein kurzes Transkript isoliert werden, das auf den genomischen Ursprung zur{\"u}ckkartiert, aber es konnte nicht n{\"a}her charakterisiert werden. Der dritte Teil der Arbeit stand im Zeichen der Kandidatengensuche im betreffenden Abschnitt q13.1 des Chromosoms 19. Anhand von genetischen Karten und Gendatenbanken sollten Gene gesucht werden, die in diesen Bereich kartieren und eine Expression im Skelettmuskel aufweisen und damit als Kandidat f{\"u}r die CCD in Frage kommen. Es wurden zwei Gene f{\"u}r nukle{\"a}r codierte Untereinheiten der mitochondrialen Cytochrom c Oxidase untersucht. Von dem Gen, das die muskelspezifische Isoform von COX VIIa codiert, konnte die genomische Sequenz und die Exon-Intron Struktur ermittelt werden sowie eine Promotor-Analyse anhand einer Datenbanksuche durchgef{\"u}hrt werden. Der Vergleich mit der Sequenz des homologen Gen des Rindes ergab, daß es sich um ein evolution{\"a}r konserviertes Gen handelt mit dem typischen Eigenschaften eines Haushaltsgens. Ein weiteres Kandidatengen stellt das Gen f{\"u}r die kleine Untereinheit des Calpains dar, das m{\"o}glicherweise direkt in die elektromechanische Koppelung zwischen Nerv und Muskel involviert ist und mit dem Ryanodinrezeptor interagiert. CCD-Patienten wurden mit der SSCP-Methode (Single-stranded conformation polymorphism) auf Mutationen in den Exons sowohl des COX7A1-Gens als auch des CANPS-Gens untersucht. In beiden F{\"a}llen konnten keine Mutationen gefunden werden. Die Suche nach dem CCD-Gen ist also nach wie vor offen.}, subject = {Muskelkrankheit}, language = {de} } @phdthesis{Foerster2006, author = {F{\"o}rster, Tanja}, title = {Molekulargenetik des Heredit{\"a}ren Angio{\"o}dems}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20340}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Das Heredit{\"a}re Angio{\"o}dem (HAE) ist eine seltene autosomal dominante Erkrankung, die durch einen angeborenen quantitativen oder funktionellen Defekt des C1-Inhibitors (C1-INH) verursacht wird. Das C1-INH-Protein, ein Serin Protease Inhibitor (Serpin) ist der einzige Inhibitor der C1s und C1r Komponenten des klassischen Wegs der Komplementaktivierung. Weiterhin reguliert er die Aktivierung der Faktoren XI und XII im intrinsischen Teil der Blutgerinnung und die Generierung von Kallikrein im Kontaktsystem. Durch die fehlende Kontrolle dieser Systeme kommt es zur vermehrten Bildung vasoaktiver Substanzen, die f{\"u}r die charakteristischen Symptome wie rezividierende, nicht juckende Schwellungen der Haut und Schleimh{\"a}ute sowie krampfartige Schmerzen im Abdomen verantwortlich sind. HAE-Attacken werden durch psychologischen und/oder physiologischen Stress ausgel{\"o}st und manifestieren sich h{\"a}ufig isoliert im Kehlkopfbereich, wobei die Gefahr des Erstickens durch ein Larynx- oder Glottis{\"o}dem droht. Die vorliegende Arbeit beschreibt die C1-INH-Genanalyse von 208 Familien mit 359 Mitgliedern, die aufgrund der Differentialdiagnose HAE zwischen 1999 und 2005 von spezialisierten klinischen Zentren eingesandt wurden. Bei 32 Patienten wurden durch Southern-Blot und dHPLC Untersuchungen große Deletionen des C1-INH-Gens nachgewiesen. Weiterhin wurden durch Komplett-Sequenzierung der 8 Exons und angrenzenden Intronbereiche des Gens identifiziert. Bei 96 Familien mit 172 Mitgliedern wurden 80 verschiedene Punktmutationen nachgewiesen, die bei Abschluss der vorliegenden Arbeit nicht in der Literatur beschrieben waren. Die HAE-Datenbank kann als Folge auf insgesamt 279 bekannte Mutationen im C1-INH-Gen erweitert werden. Da viele Patienten Missense-Mutationen unbekannter Kausalit{\"a}t aufwiesen, wurden 29 anhand ihrer Lokalisation oder Homologie ausgew{\"a}hlte Mutationen durch zielgerichtete Mutagenese in einen Expressionvektor eingef{\"u}gt und anschließend in HEK-293 Zellen exprimiert. Die Funktion der rekombinanten Proteine wurde mittels eines C1-INH-Aktivit{\"a}ts-Assays {\"u}berpr{\"u}ft. W{\"a}hrend bei den meisten rekombinant exprimierten mutanten Proteinen die Kausalit{\"a}t f{\"u}r das HAE durch sehr geringe C1-INH-Restaktivit{\"a}ten best{\"a}tigt werden konnten, zeigten einige mutante Proteine kaum beeintr{\"a}chtige Aktivit{\"a}ten. Die zugrunde liegenden Punktmutationen d{\"u}rften deshalb sehr seltene Polymorphismen sein. Um weiteren Aufschluss {\"u}ber die Auswirkungen der verschiedenen Mutationen zu erhalten, wurden diese in ein 3D-Modell des C1-INH eingebaut und mit einem wildtypischen C1-INH-Modell verglichen. Das verf{\"u}gbare Modell, das nicht auf Strukturdaten, sondern auf der Homolgie zu anderen Serpinen beruht und nur die Serpindom{\"a}ne erfasst, erwies sich jedoch bei einigen inaktivierenden Mutationen als unzureichend bzw. unvollst{\"a}ndig. Die C1-INH-Gendiagnostik konnte in den meisten F{\"a}llen eine Mutation bei den betroffenen Familien nachweisen und auch Mutationstr{\"a}ger vor der Erstmanifestation lebensbedrohender Symptome identifizieren. Die rekombinante Expression und Aktivit{\"a}tsmessung mutanter C1-INH-Proteine ist ein n{\"u}tzliches Hilfsmittel um die Kausalit{\"a}t von Missense-Mutationen aufzukl{\"a}ren und liefert wertvolle Einblicke in die Funktion individueller Aminos{\"a}uren im C1-INH-Protein.}, subject = {Gef{\"a}ßkrankheit}, language = {de} } @phdthesis{Rost2006, author = {Rost, Simone Esther}, title = {Molekulare Ursachen Vitamin K-abh{\"a}ngiger Gerinnungsst{\"o}rungen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17589}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Vitamin K ist ein essentieller Cofaktor f{\"u}r die posttranslationale Gamma-Carboxylierung von sog. Vitamin K-abh{\"a}ngigen Gerinnungsfaktoren, Knochenproteinen, Zellwachstum-regulierenden und weiteren Proteinen mit noch unbekannter Funktion. Defekte im Vitamin K-Stoffwechsel f{\"u}hren einerseits zu zwei verschiedenen Formen des famili{\"a}ren Mangels aller Vitamin K-abh{\"a}ngigen Gerinnungsfaktoren (VKCFD1 und 2) und andererseits zur Resistenz oder Hypersensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber Cumarinderivaten, wie Warfarin, die als Vitamin K-Antagonisten zur Antikoagulationstherapie bei thromboembolischen Erkrankungen, aber auch zur Bek{\"a}mpfung von Ratten und M{\"a}usen eingesetzt werden. Die Aufkl{\"a}rung und Charakterisierung der molekularen Ursachen dieser Erkrankungen wird in dieser Doktorarbeit anhand von Ver{\"o}ffentlichungen dokumentiert. Ausgehend von der Charakterisierung zweier Familien mit dem VKCFD2-Ph{\"a}notyp, wird die Kartierung des VKCFD2-Locus auf dem kurzen Arm von Chromosom 16 beschrieben. Durch eine systematische Mutationssuche in der ca. 130 Gene umfassenden Kandidatenregion von Chromosom 16 konnte das f{\"u}r diese Erkrankung und die Warfarinresistenz urs{\"a}chliche Gen ausfindig gemacht werden. Dabei handelt es sich um das Gen f{\"u}r die entscheidende Komponente der Vitamin K-Epoxid-Reduktase (VKORC1), die den Recycling-Prozess von Vitamin K im sog. Vitamin K-Zyklus katalysiert. Die Charakterisierung des VKORC1-Proteins umfasst dessen subzellul{\"a}re Lokalisation, den Vergleich orthologer Proteine in verschiedenen Species und die funktionelle Charakterisierung von rekombinant exprimiertem VKORC1. Durch positionsspezifische Mutagenesen und anschließende Expression in humanen Nierenzellen konnten mehrere f{\"u}r die Funktion der VKORC1 relevante Aminos{\"a}uren identifiziert werden. Die posttranslationale Modifikation der Vitamin K-abh{\"a}ngigen Proteine wird von der Gamma-Glutamyl-Carboxylase (GGCX) katalysiert. Defekte in diesem Enzym wurden von zwei verschiedenen Arbeitsgruppen als Ursache f{\"u}r die erste Form der VKCFD-Erkrankung nachgewiesen. In dieser Doktorarbeit werden drei weitere, von unserer Arbeitsgruppe identifizierte Mutationen im GGCX-Gen beschrieben, unter denen sich ein nachgewiesener Founder-Effekt an Position 485 des Proteins befindet. Die Arg485Pro-Variante wurde rekombinant in Insektenzellen exprimiert und konnte mittels kinetischer Studien als VKCFD1-verursachende Mutation verifiziert werden.}, subject = {Koagulopathie}, language = {de} } @phdthesis{Kocot2003, author = {Kocot, Arkadius}, title = {Molekulare Ursachen des heredit{\"a}ren Angio{\"o}dems}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9227}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Mutationen im C1-Inhibitor(C1-INH)-Gen manifestieren sich in Form autosomal dominant vererbter Angio{\"o}deme (heredit{\"a}res Angio{\"o}dem (HAE)), wobei zwei Typen unterschieden werden. W{\"a}hrend der HAE-Typ I mit einer H{\"a}ufigkeit von 85\% auftritt und durch erniedrigte C1-INH-Plasmaspiegel mit daraus resultierender niedriger Aktivit{\"a}t gekennzeichnet ist, liegt beim HAE-Typ II ein in seiner inhibitorischen Funktion eingeschr{\"a}nktes neben dem intakten Protein vor. Beide Typen unterscheiden sich nicht hinsichtlich ihrer klinischen Symptomatik und k{\"o}nnen zur Ausbildung eines lebensbedrohlichen Larynx{\"o}dems f{\"u}hren. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die molekulargenetischen Ursachen des heredit{\"a}ren Angio{\"o}dems untersucht. Mit Hilfe der DGGE als Screeningverfahren zur Mutationssuche im C1-Inhibitor-Gen wurde eine effiziente Methode etabliert, die eine Detektion von Punktmutationen, kleinen Deletionen und Insertionen erm{\"o}glichte. In deren Anschluss konnte durch Sequenzierung eine genaue Charakterisierung der Mutationen erfolgen. Im untersuchten Patientenkollektiv wurden 23 Mutationen bei Patienten mit HAE-Typ I identifiziert, von denen 19 bisher nicht bekannt waren. Dabei handelt es sich um 9 Missense- und 2 Nonsense-Mutationen, 5 kleine Deletionen (1-3 bp) sowie 3 Spleissmutationen, aus denen z. T. mit hoher Wahrscheinlichkeit ihre Bedeutung f{\"u}r die Ausbildung eines HAE erkl{\"a}rbar ist, wobei die Beurteilung der Kausalit{\"a}t der identifizierten Mutationen sich nach dem Mutationstyp und der Mutationslokalisation im Gen richtet. Erst durch die Charakterisierung des zugrundeliegenden Gendefekts wird eine Sicherung der Diagnose HAE und der Ausschluss anderer Differentialdiagnosen erm{\"o}glicht und f{\"u}hrt damit zu einer Steigerung der Behandlungssicherheit betroffener Patienten.}, language = {de} } @phdthesis{Stahl2006, author = {Stahl, Sonja}, title = {Molekulare Mechanismen der Neurodegeneration in der Grosshirnrinde von Kathepsin B und L-Doppelknockoutm{\"a}usen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21606}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Kathepsin B und L sind lysosomale Cysteinproteasen, die mit einer Reihe von pathologischen Prozessen, wie z. B. Cancerogenese, Tumorangiogenese und Neurodegeneration in Verbindung gebracht werden. Dennoch sind bis jetzt nur wenige Proteinsubstrate beschrieben. Ausserdem sind die Mechanismen der Regulation von Zellproliferation, -invasion und -apoptose durch Kathepsin B und L weitgehend unverstanden. Ein kombinierter Mangel beider Kathepsine f{\"u}hrt zu einer fr{\"u}hzeitigen Neurodegeneration in M{\"a}usen, die an neuronale Lipofuszinosen beim Menschen erinnert. In der vorliegenden Studie wurden Unterschiede in der Proteinzusammensetzung von wildtypischen und doppelt-defizienten Gehirnlysosomen quantifiziert. Eine Kombination von subzellul{\"a}rer Fraktionierung und LC-MS/MS unter Verwendung einer isobarischen Markierung (iTraqTM) erlaubte uns die gleichzeitige Untersuchung von zerebralen Lysosomen aus Wildtyp und Kathepsin B-/-L-/- M{\"a}usen. Ingesamt waren 19 Proteine signifikant erh{\"o}ht in Kathepsin B-/-L-/- Lysosomen. Die meisten erh{\"o}hten Proteine wurden der neuronalen Biosynthese, regenerierenden bzw. endozytotischen oder lysosomalen Kompartimenten zugeordnet. Der Anstieg von Calcyon, dem Delta/Notch- verwandten epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (DNER), Neurochondrin, Phospholipase D3, Rab14, Cathepsin D und Apolipoprotein E l{\"a}sst eine potentielle Rolle von Kathepsin B und L im Axonwachstum und der Synapsenbildung w{\"a}hrend der postnatalen Entwicklung des Zentralnervensystems vermuten.}, subject = {Kathepsin B}, language = {de} } @phdthesis{Neveling2007, author = {Neveling, Kornelia}, title = {Molecular causes and consequences of genetic instability with respect to the FA/BRCA Caretaker Pathway}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27383}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {In the context of this thesis, I investigated the molecular causes and functional consequences of genetic instability using a human inherited disease, Fanconi anemia. FA patients display a highly variable clinical phenotype, including congenital abnormalities, progressive bone marrow failure and a high cancer risk. The FA cellular phenotype is characterized by spontaneous and inducible chromosomal instability, and a typical S/G2 phase arrest after exposure to DNA-damaging agents. So far, 13 genes have been identified, whose biallelic (or, in the case of X-linked FANCB, hemizygous) mutations cause this multisystem disorder. The FA proteins interact in a multiprotein network, instrumental and essential in the cellular response to DNA damage. A more comprehensive summary of Fanconi anemia and its myriad clinical, cellular and molecular manifestations is provided in the introduction section of this thesis. The results of my experimental work are presented as published papers and manuscripts ready to be submitted. In the first publication, I investigated the connection between FA genes and bladder tumors. The question I tried to answer was whether a disruption of the FA/BRCA pathway may be a frequent and possibly causal event in bladder cancer, explaining the hypersensitivity of these cells to DNA-crosslinking agents. On the basis of my experimental data I arrived at the conclusion that disruption of the FA/BRCA pathway might be detrimental rather than advantageous for the majority tumor types by rendering them vulnerable towards DNA damaging agents and oxidative stress. The second publication deals with the gene coding for the core complex protein FANCE and tries to answer the question why FANCE is so rarely affected among FA-patients. The conclusion from these studies is that like FANCF, FANCE functions as a probable adaptor protein with a high tolerance towards amino acid substitutions which would explain the relative rareness of FA-E patients. I have also investigated the FANCL gene whose product functions as the catalytic subunit of the E3 ligase. The third publication addresses this issue by providing the first comprehensive description of genetic alterations and phenotypic manifestations in a series of three FA-L patients. The results of my study show that genetic alterations of FANCL are compatible with survival, these alterations may include large deletions such as so far common only in the FANCA gene, FA-L phenotypes can be mild to severe, and FANCL belongs to the group of FA genes that may undergo somatic reversion. The central protein of the FA/BRCA network, FANCD2, is the subject of the fourth publication presented in this thesis. Most importantly, we were able to show that there are no biallelic null mutations in FANCD2. Correspondingly, residual protein of both FANCD2-isotypes (FANCD2-S and FANCD2-L) was present in all available patient cell lines. This suggests that complete abrogation of the FANCD2 protein cannot be tolerated and causes early embryonic lethality. There are at least three FA proteins that are not required for the posttranslational modification of FANCD2. One of these proteins is the 5'-3' helicase BRIP1 (BRCA1-interacting protein 1), a protein that interacts directly with the breast cancer susceptibility protein BRCA1. I participated in the identification of BRIP1 as the FA protein FANCJ. This discovery is described in the fifth publication of this thesis. The newly discovered protein BRIP1/FANCJ seems to act as one of the mediators of genomic maintenance downstream of FANCD2. Another protein identified downstream of FANCD2 is PALB2. PALB2 was originally discovered as "partner and localizer of BRCA2". In a candidate gene approach we tested patients with early childhood cancers but without mutations in BRCA2 for mutations in PALB2 (publication 6). PALB2 was identified as a novel FA gene and designated FANCN. FA-N patients are very severely affected. The last publication included in my thesis describes the identification of the FA gene FANCI as the second monoubiquitinated member of the FA/BRCA pathway (publication 7). We identified biallelic mutations in KIAA1794 in four FA patients, thus proving the genuine FA-nature of this candidate sequence. The general discussion provides a synopsis of the results and conclusions of my work with the state of art of FA research.}, subject = {Fanconi-An{\"a}mie}, language = {en} } @phdthesis{Kraemer2003, author = {Kr{\"a}mer, Franziska}, title = {Molecular and Biochemical Investigations into VMD2, the gene associated with Best Disease}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5761}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Best disease (OMIM 153700) is an early-onset, autosomal dominant maculopathy characterized by egg yolk-like lesions in the central retina. The disease gene, the vitelliform macular dystrophy gene type 2 (VMD2), encodes a 585-aa VMD2 transmembrane protein, termed bestrophin. The protein is predominantly expressed on the basolateral side of the retinal pigment epithelium (RPE) and is thought to be involved in the transport of chloride ions. Bestrophin as well as three closely related VMD2-like proteins (VMD2L1-L3) contain multiple putative transmembrane (TM) domains and an invariant tripeptide (RFP) motif in the N-terminal half of the protein. This and the tissue-restricted expression to polarized epithelial cells are typical features of the VMD2 RFP-TM family. Best disease is predominantly caused by missense mutations, clustering in four distinct „hotspots" in the evolutionary highly conserved N-terminal region of the protein. To further augment the spectrum of mutations and to gain novel insights into the underlying molecular mechanisms, we screened VMD2 in a large cohort of affected patients. In total, nine novel VMD2 mutations were identified, raising the total number of known Best disease-related mutations from 83 to 92. Eight out of nine novel mutations are hotspot-specific missense mutations, underscoring their functional/structural significance and corroborating the dominant-negative nature of the mutations. Of special interest is a one-basepair deletion (Pro260fsX288) encoding a truncated protein with a deletion of an important functional domain (TM domain four) as well as the entire C-terminal half of bestrophin. For the first time, a nonsense mutation leading to a 50 \% non-functional protein has been identified suggesting that on rare occassions Best disease may be caused by haploinsufficiency. Molecular diagnostics strongly requires a reliable classification of VMD2 sequence changes into pathogenic and non-pathogenic types. Since the molecular pathomechanism is unclear at present, the pathogenicity of novel sequence changes of VMD2 are currently assessed in light of known mutations. We therefore initiated a publicly accessible VMD2 mutation database (http://www.uni-wuerzburg.de/humangenetics/vmd2.html) and are collecting and administrating the growing number of mutations, rare sequence variants and common polymorphisms. Missense mutations may disrupt the function of proteins in numerous ways. To evaluate the functional consequences of VMD2 mutations in respect to intracellular mislocalization and/or protein elimination, a set of molecular tools were generated. These included the establishment of an in vitro COS7 heterologous expression assay, the generation of numerous VMD2 mutations by site-directed mutagenesis as well as the development of bestrophin-specific antibodies. Surprisingly, membrane fractionation/Western blot experiments revealed no significant quantitative differences between intact and mutant bestrophin. Irrelevant of the type or location of mutation, incorporation of mutant bestrophin to the membraneous fraction was observed. Thus, impaired membrane integration may be ruled out as causative pathomechanism of Best disease consistent with a dominant-negative effect of the mutations. In a different approach, efforts were directed towards identifying and characterizing the VMD2 RFP-TM protein family in mouse. While clarification of the genomic organization of murine Vmd2 was required as basis to generate Vmd2-targeted animals (see below), the study of closely related proteins (Vmd2L1, Vmd2L2 and Vmd2L3) may provide further clues as to the function of bestrophin. For this, biocomputational as well as RT PCR analyses were performed. Moreover, the novel genes were analyzed by real time quantitative RT PCR, displaying predominant expression in testis, colon and skeletal muscle of Vmd2, Vmd2L1 and Vmd2L3 transcripts, respectively as well as in eye tissue. Interestingly, neither an ORF was determined for murine Vmd2L2 nor was the transcript present in a panel of 12 mouse tissues, suggesting that murine Vmd2L2 may represent a functionally inactive pseudogene. The murine Vmd2L3 gene, as its human counterpart, is a highly differentially spliced transcript. Finally, generating mouse models of Best disease will provide essential tools to investigate the pathophysiology of bestrophin in vivo. We have initiated the generation of two different mouse lineages, one deficient of Vmd2 (knock-out) and the other carrying a human disease-related mutation (Tyr227Asn) in the orthologous murine gene (knock-in). Genetic engineering of both constructs has been achieved and presently, four ES clones harboring the homologous recombination event (Vmd2+/-) have been isolated and are ready for the subsequent steps to generate chimeric animals. The resulting mouse lineages will represent two key models to elucidate the functional role of bestrophin in Best disease, in RPE development and physiology.}, subject = {Best-Krankheit}, language = {en} } @phdthesis{Meier2011, author = {Meier, Daniel}, title = {Konservierte transkriptionelle Regulationsmechanismen der Fanconi An{\"a}mie core complex Gene}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65552}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Fanconi An{\"a}mie (FA) ist eine autosomal rezessive, im Falle der Untergruppe FA-B X-chromosomale Erbkrankheit, die mit chromosomaler und genomischer Instabilit{\"a}t verbunden ist und sich durch große ph{\"a}notypische und genetische Heterogenit{\"a}t auszeichnet. Symptomatisch sind Knochenmarksversagen, eine Vielfalt angeborener Fehlbildungen, die weit {\"u}berdurchschnittliche Disposition f{\"u}r akute myeloische Leuk{\"a}mie (AML), Plattenepithelkarzinome (SCC) sowie eine zellul{\"a}re Hypersensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber DNA Doppelstrangvernetzenden Substanzen. FA wird kompliziert durch ein progressives Knochenmarksversagen. Die FA Proteine sind essentiell f{\"u}r die interstrand crosslink (ICL) repair sowie an anderen DNA Reparatursystemen, beteiligt. Bisher wurden haupts{\"a}chlich Regulationsmechanismen untersucht, die die FA Proteine betreffen. Die Regulation der Transkripte war bisher nahezu unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation der sogenannten FA core complex Gene untersucht. Dabei handelt es sich um acht Gene, deren Produkte im Falle eines DNA Schadens den ersten Proteinkomplex des FA/BRCA Signalweges bilden. F{\"u}r diese acht Gene wurden in dieser Arbeit die Promotoren identifiziert und ihr Aktivierungspotential charakterisiert. Dabei stellte sich heraus, dass diese ein starkes Potential f{\"u}r die Transkriptionsinitiierung besitzen. Des Weiteren zeigten sich Gemeinsamkeiten in Form von Sequenzmotiven sowie Transkriptionsfaktorbindestellen, die in allen core complex Genen nahezu identisch waren. Durch diese Analysen ergaben sich Hinweise, dass die untersuchten Gene durch Mitglieder des JAK/ STAT (STAT1/4) sowie des TGF-b Signalwegs (SMAD1/4) reguliert werden. Funktionelle Untersuchungen mittels siRNA sowie Fibroblastenzelllinen, die biallelische FANCA Mutationen trugen, best{\"a}tigten diese Verbindungen. So hatte der knockdown der entsprechenden Transkriptionsfaktoren einen reduzierenden Einfluss auf die Transkriptmenge der core complex Gene. FANCA-mutierte Zelllinen weisen reduzierte mRNAs von STAT und SMAD auf. Dar{\"u}ber hinaus fanden sich signifikante {\"A}nderungen der Transkriptmenge in 112 verschiedenen Mitgliedern dieser Signalwege in den FA-A Zellinien. Eines dieser Mitglieder, IRF1, zeigte fast identische Ergebnisse wie sie bei STAT1/4 sowie SMAD1/4 beobachtet werden konnten. Die vorliegende Arbeit tr{\"a}gt dazu bei, die transkriptionelle Regulation der core complex Gene besser zu verstehen. Die auff{\"a}lligen Gemeinsamkeiten ihrer Regulation liefern neue Argumente f{\"u}r eine Koevolution dieser Gene.}, subject = {Fanconi An{\"a}mie}, language = {de} } @phdthesis{Schmid2004, author = {Schmid, Christian}, title = {Klinik und Genetik der myotonen Dystrophie Curschmann-Steinert, der facio-scapulo-humeralen Muskeldystrophie und der Gliederg{\"u}rtelmuskeldystrophie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-13329}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Im ersten Teil dieser Arbeit wird {\"u}berpr{\"u}ft, inwieweit bei einer Patientengruppe, die molekulargenetisch negativ auf fazioscapulohumerale Muskeldystrophie untersucht wurde, differentialdiagnostisch eine myotone Dystrophie in Frage kommt. Der zweite Abschnitt hat zum Ziel, zu kontrollieren, ob im Patientenkollektiv derer, die negativ auf eine h{\"a}ufige Mutation im \&\#61537;-Sarkoglycangen (Adhalingen) getestet wurden, differentialdiagnostisch eine fazioscapulohumerale Muskeldystrophie in Betracht zu ziehen ist.}, language = {de} } @phdthesis{Goebel2003, author = {G{\"o}bel, Almut}, title = {Jugendliche und Erwachsene mit Cornelia-de-Lange-Syndrom : Darstellung der Mannigfaltigkeit des klinischen Erscheinungsbildes anhand der Beschreibung von 17 Probanden}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-10350}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Das Cornelia-de-Lange-Syndrom (CdLS) ist ein angeborenes Fehlbildungs- und Retardierungssyndrom, dessen Diagnose ausschließlich klinisch gestellt wird, wobei die charakteristischen Gesichtsz{\"u}ge, Fehlbildungen der oberen Extremit{\"a}ten, Minderwuchs und geistige Behinderung wichtige Kriterien sind. Seit den Erstbeschreibungen wurden viele Arbeiten {\"u}ber dieses Syndrom ver{\"o}ffentlicht, die sich jedoch meist auf Erfahrungen mit Kindern beschr{\"a}nken. Ziel dieser Arbeit ist es, jugendliche und erwachsene Patienten mit CdLS zu beschreiben, um durch einen Einblick in ihre Biographie die Kenntnisse {\"u}ber diese Erkrankung zu stabilisieren und betroffenen Familien die Mannigfaltigkeit des Syndroms zu veranschaulichen. In einem weiteren Abschnitt werden F{\"a}lle aus der Literatur vorgestellt, in denen die Problematik der Schwangerschaft von Patientinnen mit CdLS und die Vererbbarkeit der Erkrankung besondere Beachtung findet. Die Adressen der Probanden stellte der Arbeitskreis „Cornelia de Lange-Syndrom e.V." zur Verf{\"u}gung. Dieser Verein ist eine Initiative betroffener Familien, die deutschlandweit t{\"a}tig ist und derzeit {\"u}ber 80 Patienten mit der Diagnose CdLS erfaßt hat. Anhand der Angaben aus Frageb{\"o}gen und telefonischen Gespr{\"a}chen mit den Eltern werden 17 Probanden beschrieben.}, language = {de} } @phdthesis{Kenner2011, author = {Kenner, Julia Elke}, title = {Inzidenzsch{\"a}tzung der Gliederg{\"u}rtelmuskeldystrophien f{\"u}r Deutschland}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-75562}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Die LGMD ist eine seltene Erbkrankheit der Muskelfasern, die zur Abnahme der Muskelmasse und der Muskelkraft f{\"u}hrt. Das Institut der Humangenetik der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg ist eine der wenigen Stellen in Deutschland, die die molekulargenetische Diagnostik der LGMD 1B, 1C, 2A, 2B, 2D und 2I anbietet. Demnach liegen hier viele Daten vor und anhand dieser Daten konnten die Inzidenzen dieser Formen f{\"u}r Deutschland gesch{\"a}tzt werden. Zur Sch{\"a}tzung der LGMD-Inzidenz wurde eine andere Erkrankung herangezogen, die {\"a}hnlich selten auftritt wie die LGMD: DM1 und DM2. Die Sch{\"a}tzung ergab eine Inzidenz von 1: 33 000 f{\"u}r die autosomal-rezessiven Formen der LGMD und eine Inzidenz von 1: 272 000 f{\"u}r die autosomal-dominanten Formen der LGMD f{\"u}r Deutschland. Vergleicht man diese Daten mit den Daten aus der Weltliteratur , sieht man, dass die H{\"a}ufigkeiten nahezu identisch sind.}, subject = {Inzidenz }, language = {de} } @phdthesis{Kiene2022, author = {Kiene, Carmen}, title = {Immunozytogenetische Analysen an Interphase-Zellen und Meiose-Stadien der Maus}, doi = {10.25972/OPUS-27910}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-279109}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2022}, abstract = {In der vorliegenden Arbeit wurden mittels 5-Methylcytosin Immunof{\"a}rbung zytogenetische Analysen an Metaphasechromosomen aus der Mitose, an Interphase-Zellen verschiedener Organe und an Meiose-Stadien der Maus (Mus musculus) zur Detektion hypermethylierter DNA durchgef{\"u}hrt. Zus{\"a}tzlich erfolgte eine C-B{\"a}nderung an Metaphasechromosomen und Meiose-Stadien zum Nachweis von konstitutivem Heterochromatin.}, subject = {Cytogenetik}, language = {de} } @phdthesis{Damatova2011, author = {Damatova, Natalja}, title = {Identifizierung und Charakterisierung von krankheitsassoziierten Mikrodeletionen mit modernen molekularzytogenetischen Methoden}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65727}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Das Hauptziel der medizinischen Genetik ist es, die Ursachen f{\"u}r genetisch hervorgerufene Krankheiten zu finden, um eine bessere Behandlung der Patienten zu gew{\"a}hrleisten, sei es um die Medikamente auf den Metabolismus des Individuums anzupassen oder nat{\"u}rlich dazu, um die Krankheit selbst zu behandeln und in Zukunft auch heilen zu k{\"o}nnen. Um dieses Ziel zu erreichen werden immer neue Technologien entwickelt, die mit Hilfe von bereits etablierten Methoden auf ihre Eignung hin {\"u}berpr{\"u}ft werden m{\"u}ssen. Eine der neuesten Entwicklungen stellt die Array-Technologie dar. In dieser Studie wurde versucht zu {\"u}berpr{\"u}fen, inwieweit diese neue Methode zur Analyse von einzelnen bis wenigen Patienten mit bestimmten Syndromen geeignet ist. Daf{\"u}r wurden mehrere Patienten mir sehr unterschiedlichen Ph{\"a}notypen ausgesucht, die verschiedene Ursachen und Entstehungsmechanismen der genetischen und ph{\"a}notypischen Ver{\"a}nderung vermuten ließen. Die erste hier dargestellte Publikation beschreibt einen Fall mit einer einseitigen Schalleitungsschwerh{\"o}rigkeit, der mit einer Translokation der(18)t(18;22) mit der involvierten Deletion 22pter→q11.21, sowie den darin enthaltenden Genen der CES-Region, erkl{\"a}rt wurde. Der in der zweiten Publikation beschriebene Fall mit MR und Verhaltensauff{\"a}lligkeiten wurde mit einer intragenischen Mikrodeletion im Gen IL1RAPL1 korreliert. Zwei F{\"a}lle autoimmunbedingten Leberversagens bei einem Phelan-McDermid Syndrom wurden in der dritten Publikation prim{\"a}r auf eine Deletion des Gens PIM3 zur{\"u}ckgef{\"u}hrt. Ein autistischer Junge mit einer Entwicklungsverz{\"o}gerung und gewaltt{\"a}tigen Ausbr{\"u}chen zeigte in der vierten Publikation ein sehr komplexes Rearrangement mit mehreren Br{\"u}chen im Gen CNTNAP2 und Deletionen anderer Gene, die zusammen f{\"u}r den Ph{\"a}notyp verantwortlich sein k{\"o}nnen. Keine Mikrodeletion, sondern eine Epimutation in Chromosom 14q32.2 war die Ursache f{\"u}r die Adipositas mit einer Sprachentwicklungsverz{\"o}gerung bei einem Jungen, der in der f{\"u}nften Publikation beschrieben ist. Um die o. g. genetischen Ver{\"a}nderungen zu finden, wurden verschiedene Methoden wie die GTG-B{\"a}nderung, FISH, MLPA und verschiedene Array-Systeme verwendet. Mit jeder von diesen Methoden konnten neue und einander erg{\"a}nzende Daten zu den genetischen Ver{\"a}nderungen eines Individuums gewonnen werden. Keine der Methoden konnte f{\"u}r sich allein ein vollst{\"a}ndiges Bild liefern. Die GTG-B{\"a}nderung zeigt zwar das ganze Genom, hat aber die Limitierung der niedrigen Aufl{\"o}sung. Sie konnte dennoch Anhaltspunkte f{\"u}r h{\"o}heraufl{\"o}sende Untersuchungsmethoden geben. Dazu geh{\"o}rte die FISH, die entweder zur feineren Aufl{\"o}sung der B{\"a}nderungsdaten oder zur Best{\"a}tigung von Array-Befunden verwendet wurde. Die MLPA wurde unterst{\"u}tzend auf der Suche nach sehr kleinen Ver{\"a}nderungen in eingegrenzten Regionen eingesetzt. In einigen der beschriebenen F{\"a}lle wurden trotz eines negativen B{\"a}nderungsbefundes aufgrund des auff{\"a}lligen Ph{\"a}notyps genetische Ursachen vermutet, und daher feiner aufl{\"o}sende Methoden eingesetzt. Die am h{\"o}chsten aufl{\"o}senden Array-basierten Methoden wurden eingesetzt, wenn ansonsten keine Ergebnisse zu erzielen waren, oder eine feinere Aufl{\"o}sung der vorhandenen Daten erreicht werden sollte. Anschließend konnten die Erkenntnisse {\"u}ber die Ver{\"a}nderungen mit dem Ph{\"a}notyp korreliert werden, um ein Kandidatengen oder eine Kandidatengenregion zu ermitteln. Aufgrund der großen Datenmenge aus den Array-Experimenten, waren zur Entscheidung {\"u}ber die Relevanz der Daten bez{\"u}glich der Entstehung des Ph{\"a}notyps umfassende Datenbank- und Literatur-Recherchen notwendig. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Array-Technologie einen großen Fortschritt darstellt, in der Suche nach Ursachen f{\"u}r genetische Erkrankungen. Sie hat aber technische Limitierungen und um das Problem der Ph{\"a}notyp-Genotyp-Korrelation zu vereinfachen, werden weltweit noch viele Daten gesammelt werden m{\"u}ssen. Das ist eine Frage der Zeit und der Weiterentwicklung geeigneter Technologien.}, subject = {Deletion }, language = {de} } @phdthesis{Voss2008, author = {Voß, Katrin}, title = {Identifizierung und Charakterisierung von Interaktiopnspartnern des humanen CCM3-Proteins}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28188}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Zerebrale kavern{\"o}se Malfomationen (CCM) sind vaskul{\"a}re Fehlbildungen im Gehirn. Sie sind gekennzeichnet durch stark dilatierte, blutgef{\"u}llte Gef{\"a}ße mit einschichtigem Endothel, denen Merkmale ausgereifter Blutgef{\"a}ße fehlen. Die klinischen Symptome reichen von Kopfschmerz bis hin zu h{\"a}morraghischem Schlaganfall. Eine genaue Vorhersage des Krankheitsverlaufs ist nicht m{\"o}glich und die neurochirurgische Dissektion ist in der Regel die Therapieform der Wahl. Die genauen molekularen Mechanismen der CCM-Pathogenese sind unbekannt. CCMs treten sporadisch oder famili{\"a}r geh{\"a}uft auf und folgen einem autosomal-dominanten Erbgang. Drei krankheitsverursachende Gene wurden in famili{\"a}ren CCMs identifiziert: CCM1/KRIT1, CCM2/MGC4607 und CCM3/PDCD10. Da Patienten mit einer Mutation in einem der drei CCM-Gene denselben klinischen Ph{\"a}notyp aufweisen, wurde angenommen, dass die CCM-Proteine (CCM1, CCM2 und CCM3) Bestandteile eines molekularen Signalwegs sind. In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass CCM3 mit CCM2 interagiert und zusammen mit CCM1 einen tern{\"a}ren Proteinkomplex bildet. Untersuchungen mit der humanen in-frame CCM2-Deletionsmutante CCM2:p.P11_K68del belegten, dass CCM2 das zentrale Ger{\"u}stprotein des CCM1/CCM2/CCM3-Proteinkomplexes ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass CCM3 an die Serin/Threonin-Kinase STK25 und an die Fas-assoziierte Phosphatase-1 (FAP-1) bindet. STK25 phosphoryliert CCM3 am Serin 39 und am Threonin 43. Die katalytische Dom{\"a}ne von FAP-1 dephosphoryliert CCM3. Untersuchungen mit der einzig bekannten humanen CCM3-Deletionsmutante, der aufgrund einer in-frame Deletion von Exon 5 im CCM3-Gen 18 Aminos{\"a}uren (CCM3:p.L33_K50del) fehlen, belegten zudem, dass in vitro dephosphoryliertes CCM3 Bestandteil des tern{\"a}ren CCM-Proteinkomplexes ist. W{\"a}hrend STK25 die Deletionsmutante nicht mehr binden und phosphorylieren konnte, war die Interaktion mit CCM2 und die Bildung des tern{\"a}ren CCMKomplexes nicht beeintr{\"a}chtigt. Somit k{\"o}nnte CCM3 {\"u}ber die Dephosphorylierung durch FAP-1 und die Phosphorylierung durch STK25 funktionell reguliert werden. Es stellte sich zudem heraus, dass CCM3 durch Induktion von oxidativem Stress mittels H2O2-Behandlung in humanen dermalen mikrovaskul{\"a}ren Endothelzellen herunterreguliert wird. Die in dieser Arbeit beschriebene Charakterisierung von CCM3-Interaktionen bringt CCM3 {\"u}ber seine Interaktionspartner erstmals in Zusammenhang mit molekularen Signalwegen, die an Prozessen der Angiogenese und vaskul{\"a}ren Entwicklung beteiligt sind. Die Ergebnisse liefern wichtige Hinweise f{\"u}r die Entschl{\"u}sselung der pathogenen Mechanismen zerebraler kavern{\"o}ser Malformationen und stellen einen ersten Schritt dar, um andere Behandlungsans{\"a}tze als den bisher angewandten chirurgischen Eingriff, der multiple Risiken birgt, entwickeln zu k{\"o}nnen.}, subject = {Angiogenese}, language = {de} } @phdthesis{Schneider2010, author = {Schneider, Eberhard}, title = {Identifizierung und Charakterisierung von Genen f{\"u}r sensorineurale H{\"o}rst{\"o}rungen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51231}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Ungef{\"a}hr 1 -3 Lebendgeborene von 1000 sind von einer H{\"o}rst{\"o}rung betroffen, wovon etwa 60\% der F{\"a}lle genetisch bedingt sind und in der Mehrzahl einem autosomal rezessiven Erbgang unterliegen. Die Ursachen dieser, zumeist das Innenohr betreffenden, Schallempfindungsst{\"o}rungen sind {\"a}ußerst heterogen. Rund 50 Gene konnten bisher mit angeborener, nicht-syndromaler Schallempfindungsschwerh{\"o}rigkeit in kausalen Zusammenhang gebracht werden, mit GJB2 als dem bislang bedeutendsten, das f{\"u}r bis zu 50\% aller F{\"a}lle verantwortlich ist. Die Identifizierung weiterer H{\"o}rst{\"o}rungsgene und deren Charakterisierung war Gegenstand dieser Arbeit. Daf{\"u}r wurden Positionsklonierungsverfahren einerseits und Patienten-screenings andererseits, angewandt. Wir fanden eine homozygote, reziproke Translokation 46,XY,t(10;11),t(10;11) bei einem Patienten mit kongenitaler Schallempfindungsschwerh{\"o}rigkeit. Beide Eltern und vier weitere Geschwister waren heterozygote Tr{\"a}ger der Translokation. Nach der Einengung der Bruchpunktregionen durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) von spezifischen BAC-Klonen, konnte der exakte Bruchpunkt mittels Vektor-Ligation der Fusionsfragmente und anschließender Sequenzierung bestimmt werden. PDZD7 ist ein PDZ-Dom{\"a}nen-kodierendes Gen auf Chromosom 10, das durch die Translokation beim Patienten zerrissen ist. PDZD7 ist ein Paralog zu den PDZDom{\"a}nen enthaltenden Genen Harmonin und Whirlin. Mutationen in beiden Genen k{\"o}nnen kongenitale nicht-syndromale Taubheit und das Usher-Syndrom verursachen, eine Erkrankung mit Taub- und Blindheit. Funktionelle Protein-Protein Interaktionsstudien und Genexpressionsmessungen konnten zeigen, dass PDZD7 mit den beiden Usher-Proteinen interagiert und im menschlichen Innenohr exprimiert wird. Diese Daten unterst{\"u}tzen eine starke Evidenz f{\"u}r PDZD7 als syndromales und nicht-syndromales H{\"o}rst{\"o}rungsgen. Weiterhin wurden durch Screenings eines H{\"o}rst{\"o}rungspatientenkollektives (n=534) genetische und epigentische, m{\"o}glicherweise pathogene Mechanismen charakterisiert. Diese Screenings wurden f{\"u}r PDZD7, CX30, CX30.3, CX43 (Exomsequenzierung); OTOF, KCNE1 (SNP-Typisierung); del(chr13:19,837,344- 19,968,698) (Deletionsscreening) und GJB2 (Promotermethylierung) durchgef{\"u}hrt.}, subject = {H{\"o}rst{\"o}rung}, language = {de} } @phdthesis{Doll2024, author = {Doll, Julia}, title = {Identifizierung und Charakterisierung neuer, mit H{\"o}rst{\"o}rungen assoziierter Gene und Varianten mittels Exom-Sequenzierung}, doi = {10.25972/OPUS-26109}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-261097}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2024}, abstract = {Laut des aktuellen Reports der Weltgesundheitsorganisation sind ca. 466 Millionen Menschen weltweit von einer H{\"o}rst{\"o}rung (HS) betroffen. Durch die enorme Heterogenit{\"a}t und die klinische Variabilit{\"a}t, die diese Erkrankung ausmacht, und viele bisher nicht mit HS assoziierte Gene, bleibt ein großer Teil der erblich bedingten HS in vielen Familien unaufgekl{\"a}rt. Die Entwicklung moderner Techniken, wie die Next-Generation Sequenzierung (NGS) und der Fortschritt bei der Untersuchung von Modellorganismen trugen jedoch in den letzten Jahren immens dazu bei, neue Gene zu identifizieren, die innerhalb des auditorischen Signalwegs oder damit assoziierten Strukturen beteiligt sind. Die vorliegende Arbeit umfasst Ergebnisse dreier Ver{\"o}ffentlichungen, in denen iranische und pakistanische Familien und eine deutsche Familie mit erblich bedingter HS untersucht und neue, krankheitsverursachende Varianten identifiziert und funktionell charakterisiert wurden. Im ersten Abschnitt konnten zwei neue rezessive Varianten im CDC14A-Gen als krankheitsverursachend identifiziert werden, die zu einem potentiellen Funktionsverlust des kodierten Proteins in einer iranischen und einer pakistanischen Familie f{\"u}hren. Mit Hilfe einer funktionellen Charakterisierung auf RNA-Ebene (Spleiß-Assay und RT-qPCR) konnte der Funktionsverlust beider Varianten best{\"a}tigt werden. Der zweite Abschnitt umfasst eine deutsche Familie mit sieben von einer HS betroffenen Familienmitgliedern, in der eine heterozygote missense Variante in MYO3A identifiziert wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte somit die erste autosomal dominante Variante in einer europ{\"a}ischen Familie mit einer bilingualen, sensorineuralen Hochtonschwerh{\"o}rigkeit beschrieben werden und der dominante Charakter von MYO3A best{\"a}tigt werden. Im dritten Abschnitt konnten die krankheitsverursachenden Varianten in 13 Familien aus einer Kohorte mit 21 pakistanischen Familien mit einer syndromalen und nicht-syndromalen HS ausfindig gemacht werden. Hierbei wurden sowohl bekannte, als auch bisher nicht beschriebene Varianten detektiert. Die Aufkl{\"a}rungsrate innerhalb dieser Kohorte betrug 61,9\% und es konnte somit das Spektrum syndromaler und nicht-syndromaler HS erweitert werden. Der letzte Abschnitt dieser Arbeit beschreibt eine iranische Familie mit einer milden HS und milden Intelligenzminderung, in der eine homozygote missense Variante im Kandidatengen DBN1 ausfindig gemacht wurde. Um die Funktion und die Auswirkungen eines potentiellen Verlusts des codierten Proteins Drebrin zu untersuchen, wurden immunhistochemische F{\"a}rbungen und auditorische Messungen an Dbn1 Knockout (KO)-M{\"a}usen durchgef{\"u}hrt. Hierbei konnte eine Expression innerhalb der Nervenfasern, die innere Haarzellen innervieren, nachgewiesen werden. Eine leicht verl{\"a}ngerte Latenz f{\"u}r die ABR-Welle IV in KO-M{\"a}usen im Vergleich zum Wildtyp ergab den Hinweis auf einen Defekt innerhalb des zentralen auditorischen Signalwegs, der m{\"o}glicherweise mit einer Sprachverarbeitungsst{\"o}rung im Menschen korreliert.}, subject = {H{\"o}rst{\"o}rung}, language = {de} } @phdthesis{Foerster2009, author = {F{\"o}rster, Johanna R.}, title = {Identifizierung und Analyse von Proteininteraktionen bei zwei Mitgliedern der MAGUK-p55-Subfamilie, MPP4 und MPP5}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37269}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Gegenstand der vorliegenden Untersuchungen waren das retinaspezifische palmitoylierte Membranprotein 4 (engl. membrane palmitoylated protein 4, MPP4) und das ubiquit{\"a}r exprimierte MPP5, die beide zur großen Familie der Membran-assoziierten Guanylatkinasen (engl. membrane-associated guanylate kinases, MAGUKs) geh{\"o}ren. Beide Proteine haben wichtige organisatorische Funktionen als Adapterproteine in der Netzhaut. MPP4 ist am Aufbau von pr{\"a}synaptischen Proteinkomplexen in den Photorezeptor-Ribbonsynapsen beteiligt. Ein Fehlen von MPP4 in M{\"a}usen f{\"u}hrt zum Verlust von einigen pr{\"a}synaptischen Proteinen von der Ribbonsynapse, was eine wichtige Rolle von MPP4 f{\"u}r die Organisation dieses Komplexes indiziert. Um neue Komponenten dieses Multiproteinkomplexes zu identifizieren, wurde in der vorliegenden Arbeit ein proteomischer Ansatz etabliert. Dazu wurde der MPP4-assoziierte Proteinkomplex aus Proteinextrakten der bovinen Retina durch Immunaffinit{\"a}tschromatographie isoliert, mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese aufgetrennt und resultierende Protein-spots massenspektrometrisch analysiert. Diese Untersuchungen identifizierten 18 kopr{\"a}zipitierte Proteine. Darunter waren der bekannte Interaktionspartner Veli3 und das MAGUK-Protein PSD95. F{\"u}r letzteres konnte gezeigt werden, dass speziell die \&\#946;-Isoform von PSD95 mit MPP4 {\"u}ber die N-terminalen L27-Dom{\"a}nen heterodimerisiert. Daneben konnte die Assoziation von MPP4 mit Hsc70 und Recoverin durch unabh{\"a}ngige Bindungs-assays verifiziert werden, wobei diese Interaktionen indirekt waren und m{\"o}glicherweise von retinaspezifischen Proteinen vermittelt werden. Diese Ergebnisse unterst{\"u}tzen die herausragende Rolle von MPP4 als Ger{\"u}stprotein f{\"u}r die Organisation eines Proteinkomplexes der Photorezeptorsynapse, der an der Regulierung der Ca2+-Hom{\"o}ostase in den pr{\"a}synaptischen Enden, sowie vermutlich auch an der Exozytose der synaptischen Vesikel beteiligt ist. Die {\"u}brigen kopr{\"a}zipitierten Proteine waren Bestandteile des Zytoskeletts und verschiedener Signalwege und wahrscheinlich unspezifische Kontaminanten. Das MPP5-Protein ist Teil eines evolution{\"a}r konservierten Proteinkomplexes, der f{\"u}r die Entstehung und Aufrechterhaltung der apikobasalen Polarit{\"a}t in Epithelzellen eine wichtige Rolle spielt und in der Netzhaut f{\"u}r die speziellen Zellverbindungen zwischen M{\"u}ller-Gliazellen und Photorezeptoren in der externen limitierenden Membran essentiell ist. Mutationen, die zu St{\"o}rungen in der Funktion dieses Proteinkomplexes f{\"u}hren, verursachen retinale Defekte bei Mensch (z.B. Retinitis Pigmentosa, Lebersche kongenitale Amaurose), Maus, Zebrafisch und Fruchtfliege. Die PDZ-Dom{\"a}ne von MPP5 bindet an den C-Terminus der CRB-Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurde die Auswirkung einer Punktmutation in der PDZ-Dom{\"a}ne von MPP5 (V301N), funktionell untersucht. Diese hat im Zebrafisch eine fehlende Photorezeptoradh{\"a}sion und die Zerst{\"o}rung der retinalen Architektur zur Folge. Es wurde gezeigt, dass die V301N-Mutation die Interaktion zwischen MPP5 und den drei CRB-Isoformen verhindert. Außerdem f{\"u}hrt sie zu einer Fehllokalisierung von heterolog exprimiertem MPP5V301N in MDCK-Zellen, die zudem einen erh{\"o}hten transepithelialen Widerstand aufweisen. {\"U}ber quantitative real-time PCR wurde in diesen Zellen eine verminderte Genexpression von Untereinheiten des apikalen epithelialen Natriumkanals ENaC und der basolateralen Na+/K+-ATPase festgestellt, was die Ursache f{\"u}r einen verminderten Ionenfluss durch die Zellschicht darstellen k{\"o}nnte. Somit {\"u}bt heterolog exprimiertes MPP5V301N in MDCK-Zellen einen dominanten Effekt aus, der m{\"o}glicherweise {\"u}ber einen Einfluss auf die Genregulation bestimmter Proteine vermittelt wird. Zur Untersuchung welche Auswirkungen die MPP5V301N-Mutation in vivo hat, wurde eine MPP5V301N-knock-in-Mauslinie generiert. Die bisherige Charakterisierung der M{\"a}use zeigte bei heterozygoten Tieren keinen {\"a}ußerlich erkennbaren Ph{\"a}notyp, wohingegen homozygote M{\"a}use nicht lebensf{\"a}hig waren. Vermutlich f{\"u}hrt das Vorkommen beider mutanter Allele in fr{\"u}hen embryonalen Stadien zum Abstoßen der Embryos. Das Mausmodell bietet die Basis f{\"u}r weitere Untersuchungen {\"u}ber die molekularen Konsequenzen einer Expression von MPP5V301N in der Netzhaut und anderen Geweben und wird Beitr{\"a}ge zur Aufkl{\"a}rung von Entstehungsmechanismen CRB1-MPP5-assoziierter Netzhauterkrankungen liefern.}, subject = {Netzhaut}, language = {de} } @phdthesis{Neumayr2007, author = {Neumayr, Annette}, title = {H{\"a}ufigkeit der proximalen myotonen Myopathie (PROMM/DM2) im Vergleich zur Myotonen Dystrophie (DM1) in der deutschen Bev{\"o}lkerung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25445}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Die Arbeit befasst sich mit Absch{\"a}tzung der H{\"a}ufigkeit der proximalen myotonen Myopahtie (PROMM/DM2) in der deutschen Bev{\"o}lkerung. Zugrunde liegend sind Daten aus dem Institut f{\"u}r Humangenetik der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg von 1993 bis 2006, sowie Daten der deutschlandweiten Diagnostik anbietenden Zentren aus den Jahren 2005 und 2006. Die Auswertung der Daten der Humangenetik in W{\"u}rzburg best{\"a}tigte die Vermutung, dass die myotone Dystrophie (DM1) und die proximale myotone Myopathie (PROMM/DM2) gleich h{\"a}ufig sind. Aus dem Wissen heraus, dass fr{\"u}here Angaben f{\"u}r die H{\"a}ufigkeit der DM1 nicht nur diese Erkrankung erfasst haben, sondern auch F{\"a}lle mit PROMM/DM2, kann man davon ausgehen, dass damalige H{\"a}ufigkeitsangaben anteilig beide Erkrankungen gemeinsam erfasssen. Das Ergebniss spricht f{\"u}r eine Inzidenz von 2,75/100.000 Einwohnern in Deutschland.}, subject = {PROMM}, language = {de} } @phdthesis{Rost2020, author = {Rost, Isabell}, title = {Gezielte Anreicherungs- und neue DNA-Sequenzierungsstrategien f{\"u}r die molekulare Analyse von Fanconi-An{\"a}mie-Genen}, doi = {10.25972/OPUS-15109}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-151096}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2020}, abstract = {Fanconi-An{\"a}mie (FA) ist, mit Ausnahme von Mutationen in FANCR/RAD51, eine autosomal-rezessive oder X-chromosomal vererbte Krankheit, die sich durch eine ausgesprochene klinische als auch genetische Heterogenit{\"a}t auszeichnet. Neben einem fortschreitenden Knochenmarksversagen z{\"a}hlen zu den typischen Merkmalen eine Vielzahl an angeborenen Fehlbildungen, wie beispielsweise Radialstrahlanomalien, Minderwuchs oder Pigmentierungsst{\"o}rungen. Zudem besteht f{\"u}r FA-Patienten ein {\"u}berdurchschnittlich hohes Risiko bereits in jungen Jahren an akuter myeloischer Leuk{\"a}mie oder soliden Tumoren zu erkranken. Bislang konnten in 21 FA-Genen (FANCA, -B, -C, - D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U oder -V) krankheitsverursachende Mutationen identifiziert werden, deren Proteinprodukte maßgeblich an der Aufrechterhaltung der Genomstabilit{\"a}t beteiligt sind und Komponenten des FA/BRCA-DNA-Reparaturweges darstellen. In der klassischen FA-Mutationsanalyse kommen meist Sanger-Sequenzierungen sowie MLPA- und Immunblot-Analysen zum Einsatz. Da im Wesentlichen keine Genotyp-Ph{\"a}notyp-Korrelation besteht, gestaltet sich, gerade bei seltenen FA-Komplementationsgruppen, der Nachweis von krankheitsverursachenden Mutationen oftmals sehr zeit- und kostenintensiv. W{\"a}hrend der letzten Jahre wurden verschiedene Strategien zur Anreicherung und Sequenzierung entwickelt, welche die parallele Sequenzanalyse einzelner ausgew{\"a}hlter Gene, ganzer Exome oder sogar des gesamten Genoms und somit eine kosten- und zeiteffiziente Mutationsanalyse erm{\"o}glichen. In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Anreicherungsmethoden mit anschließender Hochdurchsatzsequenzierung auf ihre Anwendbarkeit in der molekulargenetischen FA-Diagnostik getestet, um klassische Mutationsanalyse-Methoden zu erg{\"a}nzen oder m{\"o}glicherweise sogar ganz ersetzen zu k{\"o}nnen. Der erste Teil der Arbeit befasste sich mit der Etablierung eines FA-spezifischen Genpanels zur Genotypisierung von FA-Patienten. Nachdem die Methode zun{\"a}chst anhand von FA-Patienten mit bekannten Mutationen optimiert werden musste, erwies sie sich als effizienter Ansatz zum Nachweis krankheitsverursachender Mutationen bei FA-Patienten unbekannter Komplementationsgruppe. Durch die FA-Panelanalyse konnten 37 von 47 unklassifizierten Patienten einer FA-Komplementationsgruppe zugeordnet werden, indem deren kausalen Mutationen bestimmt wurden. In einem weiteren Ansatz sollte die Anwendbarkeit eines kommerziellen Anreicherungspanels zur FA-Diagnostik untersucht werden. Auch hier konnte ein Großteil der krankheitsverursachenden Mutationen von f{\"u}nf bekannten wie auch 13 nicht zugeordneten FA-Patienten detektiert und somit eine molekulargenetische Diagnose bei neun weiteren, zuvor unklassifizierten FA-Patienten, gestellt werden. Ferner wurden sechs ausgew{\"a}hlte Patienten, zus{\"a}tzlich zur Panelanreicherung, per Exomanalyse untersucht. Zum einen konnten Mutationen in bekannten FA-Genen best{\"a}tigt oder neu identifiziert werden. Zum anderen wurden auch potentiell pathogene Mutationen in DNA-Reparaturgenen außerhalb des FA/BRCA-Signalweges bei zwei Patienten mit unbest{\"a}tigter Verdachtsdiagnose FA verifiziert. So wurde bei mehreren Mitgliedern einer Familie mit unterschiedlichen Tumorerkrankungen eine zuvor unbeschriebene homozygote Nonsense-Mutation in der BER-Glykosylase NTHL1 nachgewiesen, f{\"u}r welche bislang erst zwei pathogene Mutationen als Ausl{\"o}ser eines neuen Krebssyndroms bekannt sind. Bei einem weiteren Patienten wurden compound-heterozygote Mutationen in RPA1 detektiert, ein Gen f{\"u}r das bislang noch kein Krankheitsbild bekannt ist. Mit Hilfe der drei verschiedenen Anreicherungsstrategien konnten insgesamt 47 von 60 unklassifizierten FA-Patienten 13 verschiedenen Komplementationsgruppen eindeutig zugeordnet werden. Es zeigte sich dabei ein breites Spektrum an neuen, bislang unbeschriebenen FA-Mutationen. Den gr{\"o}ßten Anteil an der Gesamtzahl der nachgewiesenen Mutationen hatten Spleißmutationen, die auf eine Auswirkung auf das kanonische Spleißmuster untersucht wurden, um einen pathogenen Effekt nachweisen zu k{\"o}nnen. Weiterhin schloss die Arbeit die Charakterisierung einzelner FA-Patienten bzw. Komplementationsgruppen mit ein. Dazu z{\"a}hlen die seltenen Untergruppen FA-T und FA-Q, f{\"u}r die jeweils ein neuer Patient identifiziert werden konnte. Durch die funktionelle Charakterisierung der dritten jemals beschriebenen FA-Q-Patientin konnten Einblicke in das Zusammenspiel der Reparatur von DNA-Quervernetzungen und der Nukleotidexzisionsreparatur gewonnen und die ph{\"a}notypische Variabilit{\"a}t von FA durch die subjektive als auch zellul{\"a}re UV-Sensitivit{\"a}t der Patientin erg{\"a}nzt werden. Dar{\"u}ber hinaus konnte das Mutationsspektrum in FA-I sowie FA-D2 erweitert werden. Eine genauere Untersuchung der Pseudogenregionen von FANCD2 erm{\"o}glichte dabei die gezielte Mutationsanalyse des Gens. Insgesamt konnten die Ergebnisse dieser Arbeit dazu beitragen, das Mutationsspektrum in FA zu erweitern und durch die Identifizierung und Charakterisierung einzelner Patienten neue Einblicke in verschiedene Komponenten des FA/BRCA-Signalweges zu erhalten. Es zeigte sich, dass neue DNA-Sequenzierungsstrategien in der FA-Diagnostik eingesetzt werden k{\"o}nnen, um eine effiziente Mutationsanalyse zu gew{\"a}hrleisten und klassische Methoden in Teilbereichen zu ersetzen.}, subject = {Fanconi-An{\"a}mie}, language = {de} } @phdthesis{Haertle2018, author = {Haertle, Larissa}, title = {Gestationsdiabetes und fetale Programmierung: Epigenetische Untersuchungen mit verschiedenen Next Generation Sequencing Techniken}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-156465}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2018}, abstract = {Eine intrauterine Gestationsdiabetes (GDM) Exposition induziert in den betroffenen Nachkommen eine lebenslang erh{\"o}hte Pr{\"a}disposition f{\"u}r metabolische und komplexe Erkrankungen. Die Krankheitssuszeptibilit{\"a}t wird dabei durch epigenetische Ver{\"a}nderungen vermittelt, die sich {\"u}ber die Regulation der Genaktivit{\"a}t auch auf das Expressionsniveau und den Ph{\"a}notypen auswirken. Um neue Gene zu finden, die eine Rolle in der fetalen Programmierung spielen, wurden in dieser Arbeit genomweite Methylierungsmuster von Nabelschnurbluten (FCBs) aus GDM-Schwangerschaften und Kontrollen miteinander verglichen. Mit Illumina Infinium HumanMethylation 450K Arrays konnten signifikante Gruppenunterschiede f{\"u}r insgesamt 65 CpG-Stellen (52 davon genassoziiert) festgestellt werden, die multiplem Testen standhielten. Mittels Pyrosequenzierung wurden vier dieser Kandidaten-Loci (ATP5A1, MFAP4, PRKCH, SLC17A4), sowie ein Gen aus der Literatur (HIF3A) genauer untersucht und die Effekte erfolgreich validiert. F{\"u}r das zugrundeliegende multivariate Regressionsmodell wurden die potenziellen St{\"o}rfaktoren Gestationsalter, kindliches Geschlecht und m{\"u}tterlicher BMI ber{\"u}cksichtigt. Der GDM-Effekt zeigte sich st{\"a}rker in der insulinbehandelten Subgruppe (I-GDM) als in der di{\"a}tisch behandelten (D GDM) und scheint insgesamt multifaktoriell bedingt zu sein, da viele Gene betroffen waren, jedoch alle mit einer vergleichsweise niedrigen Effekt-Gr{\"o}ße. Zus{\"a}tzlich konnten f{\"u}r den MEG3 Promotor, MEST und PEG3, drei von vier gepr{\"a}gten Genen, die mittels Deep Bisulfite Sequencings (DBS) analysiert wurden, ebenfalls signifikante Methylierungs-unterschiede zwischen der GDM- und Kontroll-Gruppe detektiert werden. Die identifizierten Gene stellen labile Zielregionen f{\"u}r die GDM-induzierte intrauterine Programmierung dar und k{\"o}nnen zuk{\"u}nftig n{\"u}tzliche Biomarker f{\"u}r Krankheitsdiagnosen und Prognosen sein. Mittels DBS k{\"o}nnen dar{\"u}ber hinaus Einzelmolek{\"u}l-Analysen durchgef{\"u}hrt werden, f{\"u}r die in differentiell methylierten Regionen (DMRs) anhand eines informativen SNPs die parentale Allel-Herkunft bestimmt und bei der Berechnung von Epimutationsraten einbezogen werden kann. Epimutationen wurde als solche gewertet, wenn sie ein > 50 \% abnormal (de)methyliertes Methylierungsprofil aufwiesen. Die DBS-Daten wurden mit zwei verschiedenen Sequenzierplattformen generiert (Roche GS Junior und Illumina MiSeq). F{\"u}r Zweitere wurde ein eigenes, unabh{\"a}ngiges Library-Pr{\"a}parations-Protokoll entwickelt. In Nabelschnurblut, adultem Blut und Viszeralfett wurden f{\"u}r die paternal exprimierte MEST Promotor DMR und die maternal exprimierte MEG3 intergenic (IG) DMR hohe Epimutationsraten f{\"u}r das jeweils unmethylierte Allel detektiert. Die gepr{\"a}gten (methylierten) Allele wiesen dagegen nur niedrige Epimutationsraten auf. Da MEST und MEG3 invers gepr{\"a}gte Gene sind, war die Hypermethylierung des nicht gepr{\"a}gten Allels (HNA) demnach unabh{\"a}ngig von der parentalen Allel-Herkunft. Die HNA scheint außerdem erst nach der Fertilisation aufzutreten, da in Spermien nur sehr wenige Epimutationen gefunden wurden. F{\"u}r die sekund{\"a}re MEG3 Promotor DMR (deren Pr{\"a}gung von der prim{\"a}ren MEG3 IG-DMR reguliert wird) wurde ein deutlich schw{\"a}cherer, wenngleich signifikanter HNA-Effekt im FCB gemessen, f{\"u}r die paternal exprimierte PEG3 Promotor DMR konnte dagegen kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden parentalen Epimutationsraten festgestellt werden. Der HNA-Effekt f{\"u}r die MEST DMR, MEG3 IG-DMR und MEG3 Promotor DMR war weder mit GDM noch mit Adipositas assoziiert und zeigte allgemein eine große interindividuelle Varianz. Die Aufrechterhaltung differenzieller Methylierungsmuster in Imprinting Kontrollregionen (ICRs) scheint in manchen Entwicklungs-Zeitspannen von großer Bedeutung und damit streng kontrolliert zu sein, sp{\"a}ter jedoch redundant zu werden, was sich in der Anreicherung von stochastischen sowie umweltinduzierten Fehlern auf dem nicht gepr{\"a}gten Allel {\"a}ußern kann. HNA-suszeptible gepr{\"a}gte Gene {\"a}hneln in mancherlei Hinsicht metastabilen Epiallelen. Diese Studie zeigt, dass sowohl stochastische Faktoren als auch Umweltstimuli w{\"a}hrend der fr{\"u}hen embryonalen Entwicklung u.a. {\"u}ber HNA-Effekte gepr{\"a}gte Gen-Netzwerke programmieren, die in Wachstumsprozesse involviert sind. Um tiefere Einblicke in allelspezifische Pr{\"a}gungsprofile zu erhalten, w{\"a}ren umfangreiche DBS HNA-L{\"a}ngsschnittstudien aller 50-100 human gepr{\"a}gten Gene in unterschiedlichen Gewebetypen und Differenzierungsstadien w{\"u}nschenswert.  }, subject = {Schwangerschaftsdiabetes}, language = {de} } @phdthesis{Buwe2013, author = {Buwe, Andrea}, title = {Geschlechts-chromosomale Kopplung der Fanconi An{\"a}mie Gene FANCC und FANCG im H{\"u}hnergenom und die geschlechtsspezifische Sensibilit{\"a}t der H{\"u}hnerzellen gegen{\"u}ber Mitomycin C}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-77593}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Fanconi An{\"a}mie ist eine seltene rezessiv vererbte Erkrankung, deren zu Grunde liegende Enzymdefekte in ein Netzwerk unterschiedlichster DNA-Reparaturproteine eingewoben sind. Phylogenetisch sind uns V{\"o}gel relativ nahe verwandt, was sie zu einem guten Modellorganismus jenseits der S{\"a}ugetiermodelle macht. Eine von H{\"u}hnerzellen abgeleitete Zelllinie (DT40) wurde bereits schon breit eingesetzt um die Funktion des FA-Signalwegs zu erforschen. Nachdem auch das H{\"u}hnergenom vollst{\"a}ndig entschl{\"u}sselt wurde, konnten zu fast allen FA-Genen Orthologe gefunden werden. Unter den zahlreichen FA-Genen sind f{\"u}r diese Arbeit vor allem FANCC und -G von Bedeutung, da beide Gene auf dem Z-Geschlechtschromosom des Huhns liegen und eine Inaktivierung des zweiten Z-Chromosoms beim Hahn {\"a}quivalent zur X-Inaktivierung beim Menschen nicht stattfindet. Somit sollte es ein ´nat{\"u}rliches´ Gendosisungleichgewicht zwischen den Geschlechtern geben. Im durchgef{\"u}hrten Southern Blot konnte keine geschlechtsspezifisch weibliche Bande (f{\"u}r FANCC und -G) gefunden werden. Somit ist davon auszugehen, dass die FA-Gene C und G ausschließlich auf dem Z-Chromosom lokalisiert sind. Dies wurde auch nochmals mittels FISH best{\"a}tigt - beide Gene fanden sich auf dem kurzen Arm des Z-Chromosoms (FANCC zentromernah, FANCG zentromerfern). Aus Studien mit DT40 Zellen ist bereits bekannt, dass FA defiziente Zellen {\"a}hnlich wie humane FA-Zellen eine Hypersensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber Substanzen zeigen, die DNA-crosslinks verursachen. In Anlehnung an die humane FA-Diagnostik wurden die neu etablierten embryonalen Fibroblasten mit unterschiedlichen Konzentrationen und Einwirkzeiten von MMC behandelt und die Sch{\"a}den ausgewertet. In allen Untersuchungen trugen die weiblichen Zellen mehr Sch{\"a}den davon als die m{\"a}nnlichen. Bei niedrigen Konzentrationen zeigte sich dies nur als Trend, bei h{\"o}heren MMC-Konzentrationen und l{\"a}ngeren Einwirkzeiten fanden sich bei fast allen durchgef{\"u}hrten Untersuchungen auch statistisch signifikante Unterschiede. Somit ergibt sich aus dieser Arbeit ein deutlicher Hinweis auf ein funktionelles Ungleichgewicht zwischen Henne und Hahn was die DNA-Reparatur nach Sch{\"a}digung durch MMC angeht.}, subject = {Mitomycin C}, language = {de} } @phdthesis{Hoefling2007, author = {H{\"o}fling, Christine}, title = {Gentherapie bei Fanconi An{\"a}mie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-26363}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Unter Fanconi An{\"a}mie versteht man eine rezessiv vererbbare Multisystem-Erkrankung, die einhergeht mit erh{\"o}hter spontaner Chromosomenbr{\"u}chigkeit, sowie erh{\"o}hter Anf{\"a}lligkeit f{\"u}r toxische Substanzen, wie Mitomycin C (MMC) oder Diepoxybutan (DEB).Gentherapeutische Versuche scheitern bei FA letztlich daran, dass bei fortgeschrittener aplastischer An{\"a}mie (= Knochenmarkversagen) die Gewinnung der zur erfolgreichen Transduktion erforderlichen Mengen an CD34 positiven Stamm-Blutzellen schwierig bis unm{\"o}glich ist. Die Fortschritte bei den Fremdspender-Transplantationen lassen erwarten, dass zuk{\"u}nftig nahezu alle FA-Patienten mit dieser Therapieform mit guten Erfolgsaussichten behandelt werden k{\"o}nnen. Insofern ist auch zu erwarten, dass die Option einer somatischen Gentherapie - trotz vielversprechenden Ergebnissen - zuk{\"u}nftig wieder an Bedeutung verlieren wird.}, subject = {Gentherapie}, language = {de} } @phdthesis{Schuster2012, author = {Schuster, Beatrice}, title = {Genotyping Fanconi Anemia : From Known to Novel Genes -From Classical Genetic Approaches to Next Generation Sequencing}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85515}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Fanconi anemia (FA) is an autosomal recessive or X-chromosomal inherited disorder, which is not only phenotypically but also genotypically very heterogeneous. While its hallmark feature is progressive bone marrow failure, many yet not all patients suffer additionally from typical congenital malformations like radial ray defects and growth retardation. In young adulthood the cumulative risk for developing hematological or other malignancies is compared to the general population several hundred-fold increased. The underlying molecular defect is the deficiency of DNA interstrand crosslink (ICL) repair. ICLs are deleterious lesions, which interfere with crucial cellular processes like transcription and replication and thereby can lead to malignant transformation, premature senescence or cell death. To overcome this threat evolution developed a highly complex network of interacting DNA repair pathways, which is conserved completely only in vertebrates. The so called FA/BRCA DNA damage response pathway is able to recognize ICLs on stalled replication forks and promotes their repair through homologous recombination (HR). Today we know 15 FA genes (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O and -P) whose products are involved in this pathway. Although more than 80\% of FA patients carry biallelic mutations in either FANCA, FANCC or FANCG, there are still some who cannot be assigned to any of the known complementation groups. This work aimed to indentify the di¬sease causing mutations in a cohort of those unassigned patients. Initial screens of the candidate genes FAN1, MHF1 and MHF2 did not reveal any pathogenic alterations. Moreover, FAN1 could be excluded as FA candidate gene because patients carrying a homozygous microdeletion including the FAN1 locus did not show a phenotype comparable to FA patients. In the case of MHF1 and MHF2 the reason for the negative screening result is not clear. Mutation carriers might be rare or, regarding the diverse and also FA pathway independent protein functions, phenotypically not comparable to FA patients. Nevertheless, this study contri¬buted to the identification and characterization of the most recent members of the FA pathway - RAD51C (FANCO), SLX4 (FANCP) and XPF (FANCQ). FANCO is one of the RAD51 paralogs and is involved in crucial steps of HR. But since the only reported FA-O patient has so far not developed any hematological anomalies, FANCO is tentatively designated as gene underlying an FA-like disorder. In contrast, patients carrying biallelic mutations in FANCP do not only show hematological anomalies, but as well congenital malformations typical for FA. The distinct role of FANCP in the FA pathway could not be determined, but it is most likely the coordination of structure-specific nucleases during ICL excision. One of these nucleases is the heterodimer XPF/ERCC1. XPF is probably disease causing in the complementation group FA-Q and is the first FA gene, which was identified by Next Generation Sequencing (NGS). Extraordinarily is that mutations in this gene had previously been reported to cause two other disorders, xeroderma pigmentosum and segmental progeria. Despite some overlaps, it was shown that the divergent phenotypes could clearly be distinguished and are caused by distinct functional defects of XPF. Additionally, this work aimed to improve and accelerate the genotyping process of FA patients in general. Therefore, classical approaches should be complemented or fully replaced by approa¬ches using NGS. Massively parallel sequencing of the whole exome proved to be most appro¬priate and the establishment of an FA-specific analysis pipeline facilitated improved molecular diagnostics by combining complementation group assignment and mutation analysis in one step. Consequently two NGS studies revealed the pathogenic defect in several previously unassigned FA patients and thereby added another patient to one of the most recent subtypes, FA-P. In summary, this work contributed not only to further completion of the FA/BRCA DNA repair network by adding three novel genes, it also showed that classical molecular approaches for re¬search as well as for diagnostics could be replaced by NGS.}, subject = {Fanconi An{\"a}mie}, language = {en} } @phdthesis{Hoehn2009, author = {H{\"o}hn, Katharina}, title = {Genotyp-Ph{\"a}notyp Korrelation bei Fanconi An{\"a}mie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37542}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Die Fanconi An{\"a}mie (FA) stellt eine sowohl genetisch als auch ph{\"a}notypisch {\"a}ußerst heterogene, autosomal rezessiv und X-chromosomal vererbte Erkrankung dar. Sie ist gekennzeichnet durch chromosomale Instabilit{\"a}t, ein chronisch progredientes Knochenmarkversagen, multiple kongenitale Fehlbildungen und eine Pr{\"a}disposition zu diversen Neoplasien. Auf zellul{\"a}rer Ebene ist die FA durch eine erh{\"o}hte spontane Chromosomenbr{\"u}chigkeit sowie einer Hypersensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber DNA-sch{\"a}digenden Agenzien charakterisiert. Bislang konnten 13 Komplementations-gruppen (FA-A bis FA-N) und ihre jeweiligen Gene identifiziert werden. Die FA-Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der Reparatur von DNA-Doppelstrang-br{\"u}chen. Die breite genetische Heterogenit{\"a}t der Fanconi An{\"a}mie und die große Anzahl privater Mutationen, aufgrund derer kaum interindividuelle Vergleiche m{\"o}glich sind, erschweren eine Genotyp-Ph{\"a}notyp Korrelation ebenso wie der compound-heterozygote Mutationsstatus vieler FA-Patienten. Bisherige Untersuchungen weisen darauf hin, dass die Art der jeweiligen Mutation einen gr{\"o}ßeren Einfluß auf die ph{\"a}notypische Auspr{\"a}gung der Erkrankung hat als die Art des betroffenen Gens. Zus{\"a}tzlich zeichnet die Fanconi An{\"a}mie eine große ph{\"a}notypische Variabilit{\"a}t aus, die sich in h{\"o}chst unterschiedlichen Krankheitsauspr{\"a}gungen und -verl{\"a}ufen {\"a}ußert. Um aussagekr{\"a}ftige Genotyp-Ph{\"a}notyp Korrelationen etablieren zu k{\"o}nnen, bedarf es einer ausreichenden Anzahl von FA-Patienten, bei denen sowohl die Komplementationsgruppe als auch die zugrunde liegende Mutation eindeutig definiert wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden exemplarisch die Krankheitsverl{\"a}ufe einiger Patienten (4 x FA-A, 1 x FA-B, 3 x FA-C, 1 x FA-D2 und 2 x FA-G) analysiert und mit den jeweiligen molekulargenetischen Befunden korreliert. Im Anschluss daran wurden in der Literatur beschriebene Genotyp-Ph{\"a}notyp Korrelationen erl{\"a}utert, verschiedene Mechanismen der ph{\"a}notypischen Variabilit{\"a}t dargestellt und abschließend pr{\"a}gnante Kasuistiken nochmals hervorgehoben.}, subject = {Fanconi-An{\"a}mie}, language = {de} } @phdthesis{Gross2002, author = {Groß, Michaela}, title = {Genomic changes in Fanconi anemia: implications for diagnosis, pathogenesis and prognosis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-6579}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Fanconi anemia (FA) is a genetically and phenotypically heterogenous autoso- mal recessive disease associated with chromosomal instability, progressive bone marrow failure, typical birth defects and predisposition to neoplasia. The clinical phenotype is similar in all known complementation groups (FA-A, FA-B, FA-C,FA-D1, FA-D2, FA-E, FA-F and FA-G). The cellular phenotype is characterized by hypersensitivity to DNA crosslinking agents (MMC,DEB), which is exploited as a diagnostic tool. Alltogether, the FA proteins constitute a multiprotein pathway whose precise biochemical function(s) remain unknown. FANCA, FANCC, FANCE, FANCF and FANCG interact in a nuclear complex upstream of FANCD2. Complementation group FA-D1 was recently shown to be due to biallelic mutations in the human breast cancer gene 2 (BRCA2). After DNA damage, the nuclear complex regulates monoubiquitylation of FANCD2, result- ing in targeting of this protein into nuclear foci together with BRCA1 and other DNA damage response proteins. The close connection resp. identity of the FA genes and known players of the DSB repair pathways (BRCA1, BRCA2, Rad51) firmly establishs an important role of the FA gene family in the maintenance of genome integrity. The chapter 1 provides a general introduction to the thesis describing the current knowledge and unsolved problems of Fanconi anemia. The following chapters represent papers submitted or published in scientific literature. They are succeeded by a short general discussion (chapter 7). Mutation analysis in the Fanconi anemia genes revealed gene specific mutation spectra as well as different distributions throughout the genes. These results are described in chapter 1 and chapter 2 with main attention to the first genes identified, namely FANCC, FANCA and FANCG. In chapter 2 we provide general background on mutation analysis and we report all mutations published for FANCA, FANCC and FANCG as well as our own unpublished mutations until the year 2000. In chapter 3 we report a shift of the mutation spectrum previously reported for FANCC after examining ten FA-patients belonging to complementation group C. Seven of those patients carried at least one previously unknown mutation, whereas the other three patients carried five alleles with the Dutch founder mu- tation 65delG and one allele with the Ashkenazi founder mutation IVS4+4A>T, albeit without any known Ashkenazi ancestry. We also describe the first large deletion in FANCC. The newly detected alterations include two missense mu- tations (L423P and T529P) in the 3´-area of the FANCC gene. Since the only previously described missense mutation L554P is also located in this area, a case can be made for the existence of functional domain(s) in that region of the gene. In chapter 4 we report the spectrum of mutations found in the FANCG gene com- piled by several laboratories working on FA. As with other FA genes, most muta- tions have been found only once, however, the truncating mutation, E105X, was identified as a German founder mutation after haplotype analysis. Direct compar- ison of the murine and the human protein sequences revealed two leucine zipper motifs. In one of these the only identified missense mutation was located at a conserved residue, suggesting the leucine zipper providing an essential protein-protein interaction required for FANCG function. With regard to genotype-phenotype correlations, two patients carrying a homozygous E105X mutation were seen to have an early onset of the hematological disorder, whereas the missense mutation seems to lead to a disease with later onset and milder clinical course. In chapter 5 we explore the phenomenon of revertant mosaicism which emerges quite frequently in peripheral blood cells of patients suffering from FA. We de- scribe the types of reversion found in five mosaic FA-patients belonging to com- plementation groups FA-A and FA-C. For our single FA-C-patient intragenic crossover could be proven as the mechanism of self-correction. In the remaining four patients (all of them being compound heterozygous in FANCA), either the paternal or maternal allele has reverted back to WT sequence. We also describe a first example of in vitro phenotypic reversion via the emergence of a compensat- ing missense mutation 15 amino acids downstream of the constitutional mutation explaining the MMC-resistance of the lymphoblastoid cell line of this patient. In chapter 6 we report two FA-A mosaic patients where it could be shown that the spontaneous reversion had taken place in a single hematopoietic stem cell. This has been done by separating blood cells from both patients and searching for the reverted mutation in their granulocytes, monocytes, T- and B-lymphocytes as well as in skin fibroblasts. In both patients, all hematopoietic lineages, but not the fibroblasts, carried the reversion, and comparison to their increase in erythrocyte and platelet counts over time demonstrated that reversion must have taken place in a single hematopoietic stem cell. This corrected stem cell then has been able to undergo self-renewal and also to create a corrected progeny, which over time repopulated all hematopoietic lineages. The pancytopenia of these patients has been cured due to the strong selective growth advantage of the corrected cells in vivo and the increased apoptosis of the mutant hematopoietic cells.}, subject = {Fanconi-An{\"a}mie}, language = {en} } @phdthesis{Langer2012, author = {Langer, Stefanie}, title = {Genetisches Modell der Spinalen Muskelatrophie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-78784}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Die proximale infantile und juvenile spinale Muskelatrophie (SMA) ist die zweith{\"a}ufigste autosomal rezessive Erbkrankheit nach der Mukoviszidose. Das haupts{\"a}chlich verantwortliche Gen, das survival motor neuron (SMN1) Gen, ist auf Chromosom 5 lokalisiert. Man unterscheidet Normalallele (mit einer oder zwei SMN1-Kopien) und Defektallele (einfache Deletion, große Deletion oder Punktmutation). F{\"u}r die vorliegende Arbeit wurden zahlreiche in der Literatur verf{\"u}gbare Daten zur SMA Typ I-III zusammengetragen und in ihrer Abh{\"a}ngigkeit in ein genetisches Modell gebracht, um so fehlende Parameter berechnen zu k{\"o}nnen. Etwa einer von 9.693 Lebendgeborenen ist von der Erkrankung betroffen, w{\"a}hrend einer von 6.117.733 Feten aufgrund von homozygoter großer Deletion pr{\"a}natal verstirbt. Mit einer berechneten unvollst{\"a}ndigen Penetranz von etwa 0,8418 ergibt sich, dass einer von 51.572 homozygot Deletierten oder compound-Heterozygoten nicht erkrankt. Dies ergibt eine Genfrequenz von etwa 1:90 und eine Heterozygotenwahrscheinlichkeit von 1:46. Die einzelnen Allelfrequenzen konnten wie folgt berechnet werden: einfache Deletion a (0-SMN1-Kopien): ≈ 0,0104; Normalallel b (1-SMN1-Kopie): ≈ 0,9527; Normalallel c (2-SMN1-Kopien): ≈ 0,0362; Punktmutation d (1-SMN1-Kopie): ≈ 0,0003; große Deletion g (0-SMN1-Kopien): ≈ 0,0004. Die Hardy-Weinberg-Regel ist eine wichtige Grundlage, um A-priori-Wahrscheinlichkeiten zu bestimmen. Es wird demonstriert, wie sich unter Ber{\"u}cksichtigung gesunder Angeh{\"o}rige, den Ergebnissen molekularer Tests sowie des genetischen Modells mit Hilfe des Bayesschen Rechnetableaus genauere Risikoberechnungen als bisher durchf{\"u}hren lassen.}, subject = {Spinale Muskelatrophie}, language = {de} } @phdthesis{Patzina2019, author = {Patzina, Tobias}, title = {Genetische Ver{\"a}nderungen am SOX9 Lokus bei Pierre-Robin-Sequenz}, doi = {10.25972/OPUS-18689}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-186893}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2019}, abstract = {Die Pierre-Robin-Sequenz ist eine angeborene kraniofaziale Fehlbildung, bei der h{\"a}ufig eine Triade von Symptomen, bestehend aus mandibul{\"a}rer Mikrognathie/Retrognathie, Glossoptose und einer Gaumenspalte, beobachtet werden kann. Aufgrund der Heterogenit{\"a}t der PRS und der h{\"a}ufigen Vergesellschaftung mit Syndromen, konnten {\"A}tiologie und Pathogenese der PRS bisher nur unzureichend gekl{\"a}rt werden. F{\"u}r einen Teil der Patienten mit isolierter PRS konnte eine famili{\"a}re H{\"a}ufung von PRS-F{\"a}llen nachgewiesen werden, was auf eine erbliche Komponente als krankheitsausl{\"o}senden Faktor hinweist. In diesem Zusammenhang konnten bei Patienten mit isolierter PRS geh{\"a}uft genetische Ver{\"a}nderungen mit einer Entfernung von {\"u}ber 1Mb zentromerisch (5´) von SOX9 auf dem Chromosom 17 detektiert werden. Es wird vermutet, dass diese genetischen Aberrationen am SOX9 Lokus eine gewebsspezifische Fehlregulation von SOX9 w{\"a}hrend der Embryonalentwicklung ausl{\"o}sen und somit urs{\"a}chlich f{\"u}r die Entstehung von PRS sein k{\"o}nnen. Das Ziel dieser Arbeit war es, eine W{\"u}rzburger Patientenkohorte mit isolierter PRS zu gewinnen und Informationen {\"u}ber die ph{\"a}notypischen Merkmale der Studienteilnehmer auszuwerten. Im Anschluss sollte die Patienten-DNS mittels molekulargenetischen Analysemethoden auf potenziell krankheitsausl{\"o}sende genetische Aberrationen am SOX9 Lokus untersucht werden. Zun{\"a}chst konnte eine Kohorte mit sieben PRS-Patienten erstellt und Informationen {\"u}ber die ph{\"a}notypischen Krankheitsmerkmale erfasst und ausgewertet werden. Anschließend wurden bei den Studienteilnehmern eine Array-CGH, eine quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion und im Bereich von drei konservierten, potenziell regulatorischen Elementen des SOX9 Lokus eine Sanger Sequenzierung durchgef{\"u}hrt. Die Array-CGH ergab zun{\"a}chst bei einem Patienten zwei große Deletionen im regulativen Umfeld des SOX9 Lokus, welche im Weiteren nicht durch qPCR best{\"a}tigt werden konnten. Letztendlich konnten durch die Sanger Sequenzierung 22 Varianten detektiert werden, wovon f{\"u}r drei Einzelnukleotid-Polymorphismen eine pr{\"a}disponierende Wirkung diskutierbar und f{\"u}r zwei Einzelnukleotid-Varianten eine urs{\"a}chlich pathogene Wirkung nicht auszuschließen ist.}, subject = {Robin-Syndrom}, language = {de} } @phdthesis{Kolokotronis2021, author = {Kolokotronis, Konstantinos}, title = {Genetische Ursachen heredit{\"a}rer Herzerkrankungen}, doi = {10.25972/OPUS-23116}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-231164}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2021}, abstract = {Heredit{\"a}re Kardiomyopathien sind durch klinische und genetische Heterogenit{\"a}t gekennzeichnet, welche die Kardiogenetik vor Herausforderungen stellt. In dieser Arbeit wurden manche dieser Herausforderungen angegangen, indem anhand einer Kohorte von 61 Patienten mit Kardiomyopathie bzw. prim{\"a}rer Arrhythmie eine Exom-Diagnostik mit anschließender stufenweiser Datenanalyse vorgenommen wurde. Ein Ziel der Arbeit war, die aktuellen diagnostischen Detektionsraten zu pr{\"u}fen sowie zu bewerten, ob eine erweiterte Exom-Diagnostik im Vergleich zur {\"u}blichen Genpanel-Analyse einen diagnostischen Zugewinn bringt. Zudem sollten potenzielle Krankheitsgene sowie komplexe Genotypen identifiziert werden. Die Ergebnisse zeigten, dass bei insgesamt 64\% der Patienten eine Variante von Interesse gefunden wurde. Hervorzuheben ist die hohe Detektionsrate in der gr{\"o}ßten Subkohorte, die aus Patienten mit dilatativer bzw. linksventrikul{\"a}rer Non-Compaction Kardiomyopathie bestand: 69\% und damit h{\"o}her im Vergleich zur in der Literatur berichteten Detektionsrate von bis zu 50\%. Im Rahmen der stufenweisen Daten-Auswertung zeigte sich zwar, dass die meisten kausalen Varianten in den ph{\"a}notypspezifischen Panels zu finden waren, die Analyse eines erweiterten Panels mit 79 Genen sowie der Gesamtexom-Daten aber zu einer zus{\"a}tzlichen Aufkl{\"a}rungsquote von 13\% bzw. 5\% f{\"u}hrte. Durch die Erweiterung der Diagnostik konnten interessante, teilweise neue Assoziationen zwischen Genotyp und Ph{\"a}notyp sowie neue Kandidatengene identifiziert werden. Das beste Beispiel daf{\"u}r ist eine trunkierende Variante im STK38-Gen, das an der Phosphorylierung eines Regulators der Expression kardialer Gene beteiligt ist. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass, obwohl die Detektionsrate von Genpanels f{\"u}r die Routine-Diagnostik akzeptabel ist, die Anwendung von Exom-Diagnostik einen diagnostischen Zugewinn, die Entdeckung von interessanten Genotyp-Ph{\"a}notyp-Korrelationen sowie die Identifizierung von Kandidatengenen erm{\"o}glicht.}, subject = {Herzmuskelkrankheit}, language = {de} } @phdthesis{Loewe2011, author = {L{\"o}we, Julia Irmgard}, title = {Genetische Erkrankungen bei Figuren in der M{\"a}rchensammlung der Br{\"u}der Grimm}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-69774}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Wissenschaftliche Untersuchung {\"u}ber einzelne humangenetische Erkrankungsbilder, welche mit bestimmten M{\"a}rchenfiguren korreliert werden k{\"o}nnen.}, subject = {Br{\"u}der Grimm}, language = {de} } @phdthesis{Gauss2009, author = {Gauß, Frieder}, title = {Genetische Diagnostik bei H{\"a}mophilie A und Heredit{\"a}rem Angio{\"o}dem: eine retrospektive Studie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-45995}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Im F{\"u}nfjahreszeitraum der Jahre 2000 bis 2004 wurden am Institut f{\"u}r Humangenetik der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg mehr als 2300 Untersuchungen zur molekulargenetischen Best{\"a}tigung bzw. Ausschluss eines Betroffenen-Status bzw. eines {\"U}bertr{\"a}ger-Status f{\"u}r die H{\"a}mophilie A durchgef{\"u}hrt. Dies waren 20\% aller in dieser Arbeit erfassten molekulargenetischen Untersuchungen des Instituts. Die Zahl der Untersuchungen stieg von knapp {\"u}ber 400 im Jahre 2000 auf 550 im Jahre 2003, fiel aber im Jahr 2004 wieder auf den Ausgangswert zur{\"u}ck. Anforderungen f{\"u}r F8-Mutationsanalysen kamen schwerpunktm{\"a}ßig aus Bonn, Frankfurt, M{\"u}nchen und den neuen Bundesl{\"a}ndern. 55\% der untersuchten Patienten waren m{\"a}nnlich, 39\% weiblich, wobei die Zahl der weiblichen Patienten ({\"U}bertr{\"a}gerdiagnostik) bis zum Jahre 2003 einen deutlichen Anstieg verzeichnete. In 72\% der F{\"a}lle konnte eine Mutation nachgewiesen, in 25\% der F{\"a}lle konnte eine Mutation ausgeschlossen werden. Durchschnittlich 3\% der F{\"a}lle blieben ohne definitives Ergebnis, wobei dieser Wert am Ende des Beobachtungszeitraums mit 1\% deutlich unter den initialen 6\% im Jahre 2000 lag. Die prim{\"a}re Untersuchungsrate auf die Intron 22 Inversion sank von initial 40\% (im Jahre 2000) auf knapp unter 20\% im Jahre 2004. Gleichzeitig stieg die Analytik mittels DGGE und anschließender Sequenzierung von 60\% auf 80\%. Im Gegensatz zur Intron 22 Inversion mit 29\% der positiv-getesteten F{\"a}lle spielte die Intron 1 Inversion mit knapp 1\% der positiven Ergebnisse nur eine geringe Rolle. Im gleichen F{\"u}nfjahreszeitraum wurden 350 Untersuchungen zur Best{\"a}tigung bzw. zum Ausschluss genetischer Ver{\"a}nderungen als Ursache des Heredit{\"a}ren Angio{\"o}dems (HAE) durchgef{\"u}hrt. Die H{\"a}ufigkeit der Mutationsanalysen im SERPING1-Gen ergab eine bimodale Verteilung: W{\"a}hrend im Jahr 2000 knapp {\"u}ber 100 Analysen durchgef{\"u}hrt wurden, sank diese Zahl im Jahr 2001 auf unter 50, um dann bis zum Jahre 2004 auf nahezu 200 F{\"a}lle pro Jahr anzusteigen. 62\% der untersuchten Patienten waren weiblich, 38\% m{\"a}nnlich, was der klinischen Pr{\"a}sentation der Erkrankung entspricht. Das Durchschnittsalter lag zwischen 30 und 40 Jahren. In 52\% der Untersuchungen gelang der Nachweis einer Mutation, in 34\% der F{\"a}lle war das Ergebnis negativ. In durchschnittlich 14\% der F{\"a}lle konnte kein definitives Ergebnis erzielt werden. W{\"a}hrend dieser Wert initial (im Jahre 2000) bei 30\% lag, konnte er durch die Verbesserung der molekulargenetischen Analytik bis zum Jahre 2004 auf unter 2\% gesenkt werden. Unter den Einsendern dominierten die Großr{\"a}ume Frankfurt und Mainz, w{\"a}hrend nur jeweils 1\% der Anforderungen auf die Großr{\"a}ume M{\"u}nchen, Gera und Belgien entfielen. Lt. G{\"o}ßwein et al. (2008) [C1CYG08] fanden sich in der W{\"u}rzburger Kohorte mit jeweils 33\% bis 34\% am h{\"a}ufigsten Missense-Mutationen sowie kleinere Deletionen und Insertionen. Große Deletionen, Splice-site-Mutationen und Nonsense-Mutationen waren mit jeweils ca. 10\% sehr viel seltener. Zusammenfassend ergeben sich aus der retrospektiven Auswertung der Daten zur molekulargenetischen Analytik von H{\"a}mophilie A und Heredit{\"a}rem Angio{\"o}dem wichtige Hinweise auf zeitlich und technisch bedingte Fluktuationen, welche als Grundlage zuk{\"u}nftiger analytischer Strategien dienen k{\"o}nnen.}, subject = {W{\"u}rzburg / Institut f{\"u}r Humangenetik}, language = {de} } @phdthesis{Rost2003, author = {Rost, Michael}, title = {Genetisch bedingte und genetisch mitbedingte Erkrankungen im Krankengut einer Allgemeinarztpraxis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-8906}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Statistische Erfassung von genetisch bedingten und genetisch mitbedingten Erkrankungen einer Allgemeinarztpraxis. Es soll verdeutlicht werden, dass die Allgemeinmedizin und die Humangenetik im Rahmen der drastischen genetischen Entwicklung der Forschung enger zusammenarbeiten und die Lehre in der Ausbildung der Allgemeinmediziner intensivierte werden sollte.}, language = {de} } @phdthesis{Muench2010, author = {M{\"u}nch, Andrea}, title = {Funktionsst{\"o}rungen von DNA-Reparaturgenen als Risikofaktor f{\"u}r die Entwicklung von heredit{\"a}ren kolorektalen Karzinomen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-50072}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {5 bis 10 \% aller kolorektalen Karzinome entstehen auf dem Boden einer erblichen Disposition. Bei der Tumorgenese dieser heredit{\"a}ren kolorektalen Karzinome spielen pathogenetisch vor allem Mutationen in DNA-Reparaturgenen eine wichtige Rolle. Ziel dieser Arbeit war es, anhand neuester Literatur darzustellen, welche Bedeutung Funktionsst{\"o}rungen in DNA-Reparaturgenen als Risikofaktoren bei der Entstehung von erblichen kolorektalen Karzinomen haben.Die meisten Mutationen unter den DNA-Reparaturgenen finden sich in Genen des Mismatch-Reparatursystems. Genetische Keimbahnmutationen in MMR-Genen sind an der Pathogenese von vier verschiedenen Krebssyndromen beteiligt, die zu kolorektalen Karzinomen f{\"u}hren k{\"o}nnen. Es sind das autosomal-dominant vererbte HNPCC-Syndrom mit Mutationen im hMLH1-, hMSH2-, hMSH6-, hMLH3-, hPMS2- und hPMS1-Gen, das autosomal-dominant vererbte Muir-Torre-Syndrom dessen Grundlage Mutationen im hMSH2-, hMLH1- und hMSH6-Gen sind, das autosomal-dominant oder autosomal-rezessiv vererbte Turcot-Syndrom mit Mutationen im hMLH1-, hPMS2-, hMSH2- und hMSH6-Gen sowie das autosomal-rezessiv vererbte Mismatch-Repair-Deficiency-Syndrom mit Mutationen im hMLH1-, hMSH2-, hMSH6- und hPMS2-Gen. Neben genetischen Mutationen werden auch zunehmend epigenetische Modifikationen entdeckt, die DNA-Reparaturgene durch Promotorhypermethylierung inaktivieren und so an der Pathogenese erblicher kolorektaler Karzinome mitwirken. Bis jetzt sind Epimutationen in den MMR-Genen hMLH1 und hMSH2 in der Literatur beschrieben worden. Auch im DNA-Reparaturgen MGMT, einem Gen aus dem Reversions-Reparatursystem, konnten Epimutationen nachgewiesen werden, die die Entstehung von kolorektalen Tumoren f{\"o}rdern.Funktionsst{\"o}rungen in DNA-Reparaturgenen des Basen-Exzisions-Reparatursystems sind ebenso an der Tumorgenese des kolorektalen Karzinoms beteiligt. Genetische Keimbahnmutationen im DNA-Reparaturgen MUTYH f{\"u}hren zur MUTYH-assoziierten Polyposis (MAP), einem erblichen Krebssyndrom, mit einem autosomal-rezessiven Erbgang. Genetische Mutationen konnten auch im MBD4-Gen, einem weiteren BER-Gen, in kolorektalen Karzinomen nachgewiesen werden.}, subject = {Dickdarmkrebs}, language = {de} } @phdthesis{Bechtold2005, author = {Bechtold, Astrid}, title = {Funktionelle und molekulare Pr{\"a}nataldiagnostik der Fanconi-An{\"a}mie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14663}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Die Zellzyklusanalyse an kultivierten Fruchtwasserzellen zur pr{\"a}natalen Diagnostik der Fanconi-An{\"a}mie ist nicht hinreichend zuverl{\"a}ssig und sollte aufgrund der teilweisen Verf{\"a}lschung des Ergebnisses durch tetraploide Zellen und unzureichende Mitogenantwort sowie eventuell einen hohen Anteil nichtstimulierbarer Zellen (sog. noncycling fraction) stets mit einer weiteren Untersuchung an Nabelschnurblutzellen best{\"a}tigt werden. Durch eine Kombination von Amnionzelll- und NS-Blut- Untersuchung mit Hilfe der Durchflußzytometrie kann die Diagnose FA dann in der Mehrzahl der F{\"a}lle sicher ausgeschlossen oder best{\"a}tigt werden. Diese funktionelle Testung ist insbesondere f{\"u}r das Screening von Niedrig-Risiko-Schwangerschaften geeignet, bei denen eine pr{\"a}natale Diagnostik auf Grund eines auff{\"a}lligen Ultraschallbefundes bei sonst leerer Familienanamnese durchgef{\"u}hrt wird. Indirekte und direkte Gendiagnostik setzen die Kenntnis des betroffenen Gens bzw. beider krankheitsverursachender Mutationen voraus. Im engen zeitlichen Fenster der pr{\"a}natalen Diagnostik k{\"o}nnen diese nicht immer rechtzeitig bestimmt werden. In den F{\"a}llen, in welchen sowohl funktionelle als auch Gendiagnostik durchgef{\"u}hrt wurde, konnte das Ergebnis der funktionellen Diagnostik stets best{\"a}tigt werden. Die einzige Fehldiagnose unter den hier vorgestellten Familien beruhte auf der Tatsache, dass in diesem Fall das Ergebnis der Zellzyklustestung an kultivierten Fruchtwasserzellen nicht durch eine Untersuchung von Nabelschnurblut kontrolliert wurde. Werden sowohl Amnionzellen als auch Nabelschnurblut untersucht und wird die Untersuchung der Amnionzellen durch eine einfache Sensitivit{\"a}tsmessung gegen{\"u}ber MMC erg{\"a}nzt, so ist die funktionelle pr{\"a}natale Diagnostik eine verl{\"a}ssliche Methode zur Best{\"a}tigung oder zum Ausschluß der Diagnose Fanconi-An{\"a}mie. Die gr{\"o}ßtm{\"o}gliche Sicherheit der pr{\"a}natalen Diagnostik wird jedoch mit molekulargenetischen Methoden erreicht. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn Komplementationsgruppenzugeh{\"o}rigkeit und die Art der krankheitsverursachenden Mutationen vor Beginn der Schwangerschaft bekannt sind.}, language = {de} } @phdthesis{HildebrandtKunz2000, author = {Hildebrandt-Kunz, Jeanette Annabelle}, title = {Fanconi-An{\"a}mie : eine unverstandene Krankheit auf dem Weg zur Gentherapie ; am Beispiel einer jungen Patientin}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1181039}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2000}, abstract = {Ziel dieser Arbeit war aufgrund eines sehr gut dokumentierten Krankheitsverlaufes einer jetzt 20-jaehrigen Patientin die Darstellung der Interaktion zwischen therapeutischen Massnahmen und dem tatsaechlichen Verlauf und der Entwicklung der Erkrankung, sowie aufgrund persoenlicher Gespraeche mit der betroffenen Patientin und ihrer Familie die Dokumentation einer Beeinflussung der Lebensweise und -qualitaet. Die Ergebnisse brachten bezueglich der Blutwerte im Verlaufe der Jahre 1985-1996 ein zwar stetes Absinken des Haemoglobins, allerdings mit Stabilisierung auf niedrige Durchschnittswerte unter maximaler Therapie. Gleiches zeigte sich bei den Thrombozyten, bei den Leukozytenzahlen war sogar ein leichter Anstieg zu verzeichnen. Grundlage hierfuer ist ein ausgekluegeltes Therapieschema, das zum Teil von den in Eigeninitiative zu Experten herangereiften Eltern mit initiiert und aufrecht erhalten wird. Auffaellig war die lange Zeit bis zur Diagnosestellung. Besonders im Hinblick auf die noch nicht abgeschlossene Familienplanung bei einer so jungen Familie und den bestehenden Behandlungsmoeglichkeiten der Krankheit, im weiteren Sinne auch die Prognose betreffend, waere heutzutage eine rasche Diagnosestellung ueberaus wichtig und wuenschens-wert. Fuer beide Parteien, Eltern und medizinisches Personal, sollte im Mittelpunkt des Interesses die optimale Behandlung und Therapie des Patienten stehen. Um dieses zu erreichen, ist eine Zusammenarbeit auf allen Ebenen erforderlich.}, language = {de} } @phdthesis{Hohnbaum2009, author = {Hohnbaum, Grit}, title = {Fanconi An{\"a}mie im Erwachsenenalter}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-38124}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Die Fanconi An{\"a}mie (FA) ist eine seltene autosomal und X-chromosomal rezessiv vererbte Krankheit, die zur Gruppe der Chromosomeninstabilit{\"a}ts-Syndrome geh{\"o}rt. Klinisch manifestiert sich die FA durch kongenitale Fehlbildungen, progressives Knochenmarkversagen und eine Pr{\"a}disposition f{\"u}r die Entwicklung von malignen Neoplasien in fr{\"u}hen Jahren. Am h{\"a}ufigsten ist unter FA-Patienten die Entstehung einer aplastischen An{\"a}mie zu beobachten mit einer kumulativen Inzidenz von 90\% im Alter von 40 Jahren (Huck et al., 2006). Vom fr{\"u}hen Erwachsenenalter an stellen solide Tumoren, vornehmlich Plattenepithel-Karzinome des Oropharygeal- und Genitaltraktes, das Hauptproblem dar. Auf zellul{\"a}rer Ebene ist die FA durch eine hohe spontane Chromosomenbr{\"u}chigkeit verbunden mit einer erh{\"o}hten chromosomalen Sensibilit{\"a}t gegen{\"u}ber genotoxischen Substanzen und reaktiven Sauerstoffspezies gekennzeichnet. Seit einer stetigen Verbesserung der h{\"a}matopoietischen Stammzelltransplantation durch spezifische Konditionierungsprotokolle erreichen immer mehr FA-Patienten das Erwachsenenalter. In der Literatur h{\"a}ufen sich Berichte von FA-Patienten, die erstmalig im Erwachsenenalter durch ein fr{\"u}hes Auftreten von Malignomen oder Komplikationen in der Behandlung von Neoplasien diagnostiziert werden. Neben einer erfolgreichen HSZT k{\"o}nnen auch „ milde" Mutationen oder die Bildung eines somatischen Mosaiks f{\"u}r das {\"U}berleben der FA Patienten in das Erwachsenenalter verantwortlich sein. Dies bedeutet, dass sich die FA als bisher rein p{\"a}diatrisch angesehenes Krankheitsbild mehr und mehr zu einer auch das Erwachsenenalter betreffenden Entit{\"a}t entwickelt. In der vorliegenden Arbeit wurden 131 FA-Patienten mit einem Alter von {\"u}ber 20 Jahren identifiziert und in verschiedene Gruppen eingeteilt. Damit wurde es m{\"o}glich, die Verteilung der Patienten hinsichtlich ihres Geschlechts, der Komplementationsgruppe sowie der vermutlichen Ursachen f{\"u}r ein verl{\"a}ngertes {\"U}berleben dokumentieren zu k{\"o}nnen. 42 Patientenbeispiele stammen aus Literaturberichten von 1964 bis 2008, Informationen {\"u}ber 36 Patienten wurden dem US-amerikanischen Fanconi Anemia Research Fund („FARF") entnommen und f{\"u}r 53 Patienten dienten die Krankenunterlagen des Instituts f{\"u}r Humangenetik an der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg als Grundlage. Es konnte gezeigt werden, dass etwa doppelt soviel Frauen wie M{\"a}nner mit FA ein Alter jenseits des 20. Lebensjahres erreichten. Eine Zuordnung zu einer Komplementationsgruppe war bei 66 Patienten m{\"o}glich. Diese ließ erkennen, dass im erwachsenen Patientenkollektiv die Komplementationsgruppen FA-A, FA-C, FA-D2, FA-G, FA-I und FA-J, jedoch keine der Gruppen FA-B, FA-D1, FA-E, FA-F, FA-L, FA-M und FA-N vertreten sind. Weiterhin wurden die erwachsenen FA-Patienten in vier verschiedene Gruppen nach der wahrscheinlichen Ursache ihres {\"U}berlebens eingeteilt werden: 26\% erhielten eine erfolgreiche h{\"a}matopoietische Stammzelltransplantation, 17\% entwickelten im Verlauf ein Mosaik, 4\% konnten als Tr{\"a}ger einer milden Mutation identifiziert werden. Die genaue Ursache f{\"u}r ein verl{\"a}ngertes {\"U}berleben bleibt jedoch bei 53\% der FA-Patienten unbekannt, da Informationen bez{\"u}glich fr{\"u}herer Therapien und vor allem die Ergebnisse molekulargenetischer Untersuchungen fehlen. Bemerkenswert ist, dass der Großteil der {\"u}ber 50J{\"a}hrigen ein Mosaik aufwies, w{\"a}hrend in dieser Altersgruppe Patienten mit erfolgreicher HSZT oder einer milden Mutation nur zu einem geringen Teil vertreten sind. Die f{\"u}r die FA charakteristische genetische Instabilit{\"a}t spiegelt sich in der hohen Anzahl (64\%) von FA-Patienten wider, die auch ohne vorhergehende HSZT ein Plattenepithel-Karzinom (SCC) entwickelten. Nach HSZT manifestierte sich bei 25\% der erwachsenen FA-Patienten ein SCC. Die Beachtung der medizinischen Besonderheiten des Erwachsenenalters ist von großer Bedeutung in der Pr{\"a}vention und Therapie von Komplikationen der FA und erfordert modifizierte Behandlungsstrategien f{\"u}r erwachsene FA-Patienten. Sorgf{\"a}ltig dokumentierte Langzeitbeobachtungen sowie die Identifizierung von Komplementationsgruppen und Mutationen bei jedem einzelnen FA-Patienten bilden die Grundlage f{\"u}r prognostische Aussagen, die derzeit nur beschr{\"a}nkt m{\"o}glich sind. In zuk{\"u}nftigen Untersuchungen werden eine Reihe bisher ungel{\"o}ster Fragen zu beantworten sein. Hierzu geh{\"o}ren die m{\"o}gliche Rolle der Androgentherapie hinsichtlich der F{\"o}rderung einer Mosaikbildung, die Faktoren, welche zu der auff{\"a}lligen Geschlechterverteilung im Erwachsenenalter beitragen, sowie die Erforschung der Bedeutung „milder" Mutationen und somatischer Reversionen. Die insgesamt sehr beeindruckenden Langzeitverl{\"a}ufe sowie die hohe Inzidenz von nicht-h{\"a}matologischen Komplikationen/Malignomen zeigen deutlich, dass sich die Fanconi An{\"a}mie zunehmend auch zu einer internistisch/onkologischen Krankheit entwickelt.}, subject = {Fanconi-An{\"a}mie}, language = {de} } @phdthesis{Endt2015, author = {Endt, Daniela}, title = {Fanconi An{\"a}mie : Entwicklung von h{\"a}matopoetischen Mosaiken sowie funktionelle Studien von FANCO (RAD51C) und FANCN (PALB2)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-127836}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2015}, abstract = {Zur Wahrung der Genomstabilit{\"a}t entwickelten sich verschiedene Reparaturmechanismen, deren Defekte zu diversen Erkrankungen f{\"u}hren. Der 1927 erstmals beschriebenen Fanconi An{\"a}mie (FA) (Fanconi 1927) liegt eine fehlerhafte Reparatur der DNA-Doppelstrang-Quervernetzung zugrunde. Als Ursache wurden Defekte innerhalb des FA/BRCA-Weges lokalisiert, welche zur Chromosomeninstabilit{\"a}t f{\"u}hren. Das Krankheitsbild der autosomal rezessiven oder X-chromosomalen Erkrankung wird meist von kongenitalen Fehlbildungen, progressivem Knochenmarkversagen sowie bereits im jugendlichen Alter erh{\"o}hten Tumor-raten und An{\"a}mien gepr{\"a}gt. Bisher wurden Defekte in 19 verschiedenen Genen als urs{\"a}chlich f{\"u}r diese Erkrankung diskutiert. Anhand des betroffenen Gens k{\"o}nnen nur begrenzt R{\"u}ckschl{\"u}sse auf die Auspr{\"a}-gung des Ph{\"a}notyps geschlossen werden, vielmehr scheinen die Art der Mutation und deren Position im Gen mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren. Im Laufe der Zeit wurden immer mehr Patienten mit mild ausgepr{\"a}gtem Erkrankungsbild beobachtet. Eine m{\"o}gliche Erkl{\"a}rung hierf{\"u}r liefern milde Mutationen, eine weitere das Vorhandensein von Mosaiken blutbildender Zellen. Zu letzterem f{\"u}hrt die Reversion einer der beiden Mutationen. Diese Art der „nat{\"u}rlichen Gentherapie" wurde bei 10-30\% der FA-Patienten beobachtet. Um die Entwicklung von Reversionen besser zu verstehen, erfolgte im Rahmen dieser Arbeit die Untersuchung verschiedener Zelllinien von 5 Patienten im Alter von 11 (Pat. 5) bis 33 (Pat. 4) Jahren. Die FA-A-Patienten 1 und 2 wurden bereits von Gross et al. 2002 als Mosaikpatienten beschrieben. F{\"u}r die weiteren Patienten f{\"u}hrten unterschiedliche Aspekte, wie normale Blutwerte, MMC-tolerante lympho-blastoide Zelllinien und gDNA-Analysen des Blutes zum Mosaikverdacht. N{\"a}here Analysen best{\"a}tigten f{\"u}r die FA-D2-Patienten (Pat. 4, 5) ebenfalls das Vorliegen einer Reversion in den Blutzellen. Allen Patienten gemein war die Reversion in Form einer R{\"u}ckmutation (Pat. 1: c.971T>G, Pat. 2: c.856 C>T, Pat. 4: c.3467-2A>G, Pat. 5: c.3707G>A), welche meist in einem oder in der N{\"a}he eines Mutationsmotives vorlag. Zur Einsch{\"a}tzung des Mosaikstatus in den Patientenblutzellen wurden, neben der meist mehrj{\"a}hrigen Be-obachtung der Blutwerte (Thrombo-, Mono-, Granulo-, Lymphozyten, H{\"a}moglobin), gDNA-, Chromoso-menbruch- und Zellzyklusanalysen durchgef{\"u}hrt. Chromosomenbruchanalysen von Metaphasen der T-Lymphozyten der Patienten 4 und 5 zeigten nach MMC-Behandlung die mosaik-typische bimodale Vertei-lung der Chromosomenbruchraten. Die nur moderat erh{\"o}hten Bruchraten in Metaphasen des Patienten 1 sprachen f{\"u}r eine starke Reversion. Zur besseren Absch{\"a}tzung des Mosaikstatus wurden Zellzyklusanaly-sen an Mischungsreihen aus FA- und nicht FA- Blut durchgef{\"u}hrt. Die Detektionsgrenze f{\"u}r FA-Mosaike lag bei einem Anteil von 30\% Zellen mit spontanem/MMC-induziertem G2-Phasen-Arrest. In Anlehnung an Mischungskurven wurden f{\"u}r die vier Patienten Reversionen von 0\% (Pat. 4) bis 90-95\% (Pat. 2) ange-nommen. Die gDNA-Analyse MACS-sortierter T-/B-Lympho-, Mono- und Granulozyten sowie von Fib-roblasten und lymphoblastoiden Zelllinien erm{\"o}glichte einen detaillierten Einblick in die Mosaikstatus auf molekularer Ebene. Wir fanden bei allen Patienten einen unterschiedlich stark ausgepr{\"a}gten Mosaikstatus ihrer Blutzellreihen. Tendenziell scheinen die Reversionsgrade mit der Zell-Lebensdauer korrelieren, hier-bei zeigen kurzlebige Zellen (Mono-, Granulo-, B-Lymphozyten) h{\"o}here Reversionsgrade als langlebige T-Lymphozyten. Das Auftreten von gleichen Reversionen in allen Zelllinien l{\"a}sst eine Reversion in einer gemeinsamen Vorl{\"a}uferzelle vermuten. Als Besonderheit fanden wir, unseren Erachtens erstmalig, eine komplette Reversion einer Knochenmark-Fibroblastenzelllinie (Pat. 1). H{\"a}ufig in Kultur stattfindende Re-versionen in lymphoblastoiden Zelllinien beobachteten wir f{\"u}r alle vier Patienten. Die Mosaikentstehung im Patientenblut konnte mit allen Methoden best{\"a}tigt werden. Jede Methode wies Vor- und Nachteile auf. Zur Absch{\"a}tzung der Mosaikstatus empfiehlt sich deshalb eine Kombination der Methoden. Ein weiteres Projekt besch{\"a}ftigte sich mit Interaktionen des FANCO (RAD51C) innerhalb der RAD51 Paraloge (RAD51B, -C, -D, XRCC2, XRCC3) und mit RAD51. Die Analysen erfolgten im Mammalian Two- und Three-Hybrid (M2H/M3H) System. Die Untersuchungen best{\"a}tigten die meisten der bisher detektierten Interaktionen, welche zur Ausbildung des RAD51C-XRCC3 Komplexes und des, aus den Subkomplexen RAD51B-RAD51C (BC) und RAD51D-XRCC2 (DX2) bestehenden, BCDX2-Komplex f{\"u}hren. Die M3H-Analysen weisen auf eine wichtige Rolle des RAD51B-Proteins bei der Auspr{\"a}gung dieses Komplexes hin. Es scheint die Ausbildung der RAD51C-RAD51D-Interaktion erst zu erm{\"o}glichen und zus{\"a}tzlich, anders als bisher beobachtet, auch mit XRCC2 zu interagieren. Diese Interaktion wiederum wird durch die Anwesenheit von RAD51D stark gef{\"o}rdert. Unsere M2H-/M3H-Beobachtungen weisen darauf hin, dass die Ausbildung der Subkomplexe f{\"u}r die Entstehung des BDCX2-Komplexes wichtig ist und dieser vermutlich als Ringstruktur vorliegt. Zus{\"a}tzlich fanden wir Hinweise auf m{\"o}gliche Wechselwir-kungen zwischen den BCDX2- und den XRCC3-Komplexproteinen. Aufgrund der Beteiligung der Protei-ne an der Doppelstrangl{\"a}sionsreparatur wurde die Auswirkung von MMC-induzierten DNA-Sch{\"a}den un-tersucht. Diese f{\"u}hrten innerhalb der Subkomplexe zu gegens{\"a}tzlichen {\"A}nderungen der Interaktionsinten-sit{\"a}t. W{\"a}hrend die Substanz im DX2-Komplex zum Sinken der Interaktionsst{\"a}rke f{\"u}hrte, erh{\"o}hte sich diese im BC-Komplex. Die in der Literatur beschriebene und charakterisierte RAD51C-FANCN-Interation war im M2H-Test nicht darstellbar. M{\"o}glicherweise w{\"u}rde diese jedoch durch die Anwesenheit eines drit-ten Proteins gef{\"o}rdert werden. Zus{\"a}tzlich wurde ein RAD51C-Protein, welches die Patientenmutation R258H enthielt, {\"u}berpr{\"u}ft. Es zeigte nur in der M3H-Analyse, mit pMRAD51D und nativem RAD51B, nach Behandlung mit MMC eine reduzierte Interaktionsst{\"a}rke im Vergleich zum Wildtyp. Dies unter-streicht einmal mehr die als hypomorph beschriebene Mutation des Proteins. Das dritte Projekt, die angestrebte Strukturaufkl{\"a}rung des RAD51C-Proteins erwies sich als schwierig. Eine f{\"u}r eine Kristallisation ausreichende Proteinmenge konnte, weder im E. coli-System noch in Insektenzellen oder in Co-Expression mit seinem Interaktionspartner XRCC3, isoliert und aufgereinigt werden. Elektro-phoretische Mobility Shift Assays des CX3-Proteinkomplexes mit DNA-Strukturen (ssDNA, Open Fork, 3'-/ 5'-{\"U}berhang-Struktur), zeigten eine Bevorzugung des 3'-{\"U}berhang-DNA-Substrates. Diese Art der Analyse k{\"o}nnte in weiterf{\"u}hrenden Analysen zur Absch{\"a}tzung der Auswirkung von Patientenmutationen herangezogen werden. bb}, subject = {Fanconi An{\"a}mie}, language = {de} } @phdthesis{Kalb2006, author = {Kalb, Reinhard}, title = {Fanconi anemia and RAD50 deficiency : genetic and functional analysis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25823}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Human caretaker genes play a central role in the DNA damage response. Their defects cause a number of rare diseases which show genetic instability and increased propensity to malignant cell growth. The first of these diseases to be described in this thesis is Fanconi anemia (FA), a rare chromosome instability disorder with recessive inheritance characterized by progressive bone marrow failure, variable congenital malformations, and cancer predisposition. There are at least 13 FA complementation groups (FA-A, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M and N), each representing mutations in a distinct gene. To date, except FANCI all the corresponding genes have been identified, denoted as FANC-A, B, C, D1/BRCA2, D2, E, F, G, J/BRIP1/BACH1, L/PHF9, M/Hef and N/PALB2.Further information is provided in chapters 1 and 2. FA cells are characterized by high sensitivity to DNA crosslinking agents and to elevated oxygen tension, but it is controversial whether they are also radiosensitive. Systematic testing (chapter 3) of primary skin fibroblast cultures from all currently known FA complementation groups revealed no increased sensitivity towards ionizing radiation (IR) and ultra-violet light (UV) when growing cells at physiological (5\% v/v) oxygen levels. Despite considerable interstrain variations FA cells showed no systematic differences to cell cultures derived from healthy controls, whereas positive controls (Ataxia telangiectasia and Cockayne syndrome) proved highly sensitive to IR or UV. Lack of radiosensitivity was also shown for the FANCD2 gene, a central gene in the FA/BRCA pathway whose mutational inactivation was studied in a large patient cohort. FA patients excluded previously from complementation groups FA-A, -C, E, F, G or L were screened for mutations in FANCD2. Even though mutation analysis of FANCD2 is complicated by the presence of pseudogene regions, biallelic FANCD2 mutations were identified in a series of 32 patients (chapter 4). The predominant types of mutations result in aberrant splicing causing exon skipping, exonisation of intronic sequence, activation of cryptic and creation of new 3´ splice sites. Many alleles were recurrent and could be associated with ethnicity. Interestingly, residual FANCD2 protein was observed in all available patient cell lines, and functionality was indicated by the presence of the monoubiquitinated FANCD2 isoform. This suggests that viability of FA-D2 patients depends on the presence of hypomorphic or leaky mutations. In chapter 5 the worldwide second FA patient belonging to complementation group FA-L is reported. Genetic analysis of patient derived fibroblasts revealed heterozygosity for a 5-bp deletion (exon 7) and a missense substitution (exon 11). In contrast to the tested fibroblasts two independent lymphoid cell lines proved resistant to the DNA crosslinking agent mitomycin C and showed proficient FANCD2 monoubiquitination. The functional reversion due to a compensating mutation in the splice acceptor site results in aberrant splicing and the restoration of the open reading frame. However, the revertant mosaicsm was restricted to the lymphatic cell lines such that there was no clinical improvement involving the other hematopoietic cell lineages, and bone marrow transplantation was required to treat the patients bone marrow failure. A direct link of Fanconi anemia to other DNA repair processes was provided by the identification of the BRCA1 interacting protein 1, BRIP1/BACH1, as a genuine FA gene (chapter 6). Genetic mapping of consanguineous Inuit families resulted in the identification of truncating mutations in BRIP1. In contrast to most of the other FA patients FANCD2 monoubiquitination was intact, linking these patients to complementation group FA-J. Biallelic mutations in BRIP1 were found in eight additional patients, one of whom was assigned previously to FA-J by somatic cell fusion. Therefore it could be shown that the postulated FANCJ gene is identical with BRIP1. This finding emphasizes the close connection between the BRCA- and the FA-family of genes, both involved in the DNA damage response. Biallelic mutations in BRCA2/FANCD1 cause a severe form of Fanconi anemia with childhood malignancies. Recently, a BRCA2 interacting protein was identified as a "partner and localizer of BRCA2" (PALB2) which confers cellular MMC resistance. A candidate gene approach revealed biallelic mutations in seven FA patients that developed solid tumors in early childhood (chapter 7). Patient cells show no or little PALB2 protein, lack of MMC induced RAD51 foci formation, and high chromosomal instability. Transduction of PALB2 cDNA complemented the MMC sensitive phenotype. Therefore, biallelic mutations in PALB2 cause a new subtype of FA, denoted as FA-N, which is connected with a high and early cancer risk. With respect to one of the most prominent but least understood caretaker gene syndromes, Fanconi anemia, this thesis has expanded our knowledge as follows: 1. refutation of major cellular radiosensitivity of FA cell lines regardless of complementation group, 2. detection of hypomorphic mutations and residual protein levels as a prerequisite for viability of the FANCD2 gene, 3. description of the worldwide second patient belonging to complementation group FA-L whose lymphocytes exhibit a novel type of somatic reversion, 4. participation in the discovery and functional characterization of two novel FA genes (FANCJ and FANCN). The last chapter of the thesis deals with a DNA repair pathway that is activated following exposure to ionizing radation. One of the central proteins responding to radiation-induced DNA damage is the product of the ATM gene which signals to a myriad of other proteins in response to DNA double strand breaks, including the NMR complex. This complex formed by the NBS1/MRE11/RAD50 proteins is thought to act as a specifi c sensor of DNA double-strand breaks. Mutations of MRE11 and NBS1 are associated with the radiation sensitivity syndromes Ataxia-telangiectasia-like disorder (AT-LD) and Nijmegen breakage syndrome (NBS), respectively. Chapter 8 presents the first ever identified patient with RAD50 deficiency due to biallelic germline mutations in the RAD50 gene. An 18-year-old German girl who has a variant form of NBS without immunodeficiency was found to be compound heterozygous for a nonsense mutation and the loss of the natural termination signal in the RAD50 gene. RAD50 protein expression was reduced to less than one tenth of normal in her fibroblasts and lymphoblastoid cells. At the nuclear level, RAD50 deficiency was associated with a high frequency of spontaneous chromatid exchanges and with the failure to form MRE11 and NBS1 nuclear foci in response to irradiation. ATM autophosphorylation, phosphorylation of p53 at serine 15 and the transcriptional induction of p21/WAF1 mRNA were reduced, and there was no evidence for Ser343 phosphorylation of NBS1 in RAD50 defi cient cells following irradiation. These defects could be complemented by expression of wildtype RAD50 cDNA. Our data shows that RAD50 modulates, like NBS1 and MRE11, the ATM-mediated DNA damage response and the G1/S cell cycle checkpoint. In addition, RAD50 appears to be required for nuclear localization of MRE11, and for NBS1 focus formation, underlining its importance for the proper function of the NMR complex. Owing to the studies performed within the framework of this thesis, RAD50 deficiency can now be added to the growing list of human caretaker gene syndromes with pronounced radiosensitivity that is distinctive at both the cellular and the clinical level from deficiencies involving the other members of the NMR complex.}, subject = {DNS-Reparatur}, language = {en} } @phdthesis{Gramer2006, author = {Gramer, Gwendolyn Christine}, title = {Familienanamnese, genetisches Risikoprofil und Risikofaktoren der Glaukome - Eine Untersuchung von 2170 Patienten mit Glaukom oder Okul{\"a}rer Hypertension}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19979}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Bei 2170 Patienten mit Glaukom oder Okul{\"a}rer Hypertension wurden die H{\"a}ufigkeit eines Glaukoms in der Familienanamnese, das genetische Risikoprofil, sowie okul{\"a}re und allgemeine Risikofaktoren untersucht, um aus der Korrelation dieser Faktoren mit dem Schweregrad des Gesichtsfeldausfalls und dem Alter bei Diagnosesstellung R{\"u}ckschl{\"u}sse auf die Bedeutung dieser Faktoren f{\"u}r die Pathogenese und Prognose der Glaukome ziehen zu k{\"o}nnen. Um zu untersuchen, bei welchen Verwandten die h{\"o}chste Findungswahrscheinlichkeit einer Glaukomerkrankung besteht, haben z. B. 1335 Patienten mit GCS 5312 Verwandte mit einem standardisierten Fragebogen befragt. Die 10 wichtigsten neuen Erkenntnisse aus dieser Untersuchung sind: 1. Es besteht verglichen zum GCS, bei dem 40 \% aller Patienten ein Glaukom in der Familienanamnese haben, kein signifikanter Unterschied in der H{\"a}ufigkeit eines Glaukoms in der Familienanamnese bei Patienten mit NTG, OH, GCS mit engem KW und PG. Alle Glaukomformen haben somit eine genetische Disposition. 2. Patienten mit Glaukom in der Familienanamnese sind zum Zeitpunkt der Diagnosestellung signifikant j{\"u}nger als Patienten ohne Glaukom in der Familienanamnese. Kenntnisse {\"u}ber die genetische Disposition der Glaukome f{\"u}hrten somit fr{\"u}her zu Screeninguntersuchungen. 3. Patienten mit Glaukom in der Familienanamnese haben keine schlechtere Prognose f{\"u}r den Erhalt des Gesichtsfeldes als Patienten ohne Glaukom in der Familienanamnese. 4. Bei allen Glaukomformen besteht bei Untersuchung von Geschwistern und M{\"u}ttern von Glaukompatienten die h{\"o}chste Findungswahrscheinlichkeit einer Glaukomerkrankung. 5. Verglichen zum GCS besteht ein signifikanter Unterschied im Alter bei Diagnosestellung und damit im Erkrankungsbeginn bei unterschiedlichen Glaukomformen, was f{\"u}r die Wahl des ersten Untersuchungszeitpunkts bedeutend ist. 6. Eine rein altersabh{\"a}ngige Wahl des Screeningzeitpunkts bei GCS zwischen 51. und 60. Lebensjahr f{\"u}hrte nicht zur Fr{\"u}hdiagnostik, da in diesem Diagnosezeitraum gleich h{\"a}ufig Patienten mit beginnendem, fortgeschrittenem und schwerem Gesichtsfeldausfall diagnostiziert wurden. 7. Die zeitliche Dynamik des Gesichtsfeldverfalls ist bei unterschiedlichen Glaukomformen unterschiedlich und abh{\"a}ngig von der H{\"o}he des unbehandelten IOD max. Bei 20\% der GCS und 40\% der NTG Patienten liegen so schwere beidseitige Gesichtsfeldausf{\"a}lle vor, dass sie kein Fahrzeug steuern k{\"o}nnen. 8. Die Untersuchung des Alters bei Diagnosestellung in Korrelation zum Stadium der Erkrankung ergibt, dass das NTG verglichen zum GCS nicht wie bisher angenommen eine Erkrankung des {\"a}lteren Menschen ist, sondern eine Erkrankung ist, die h{\"a}ufiger als das GCS erst im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert wird. 9. Patienten mit NTG haben entgegen der bisherigen Annahme nicht h{\"a}ufiger Herzerkrankungen als Patienten mit GCS oder Patienten mit anderen Glaukomformen. Die H{\"a}ufigkeit von Herzerkrankungen ist sowohl bei GCS als auch bei NTG rein altersabh{\"a}ngig. 10. Patienten mit NTG haben alterskorrigiert verglichen zu Patienten mit GCS eine um 63,5\% h{\"o}here Wahrscheinlichkeit an Migr{\"a}ne zu leiden, wobei Frauen h{\"a}ufiger an Migr{\"a}ne erkrankt sind als M{\"a}nner. Dies kann erkl{\"a}ren, warum bei NTG Frauen h{\"a}ufiger erkrankt sind. Eine vaskul{\"a}re Dysregulation ist ein Risikofaktor f{\"u}r NTG. Durch humangenetische Untersuchungen k{\"o}nnte die Risikogruppe der Patienten mit Glaukom in der Familienanamnese m{\"o}glicherweise auf eine Hochrisikogruppe von Personen mit Mutationen in Glaukomgenen eingegrenzt werden. Da Mutationen in den drei bisher bekannten Glaukomgenen jedoch nur bei 10\% aller Glaukompatienten gefunden werden, ein GL in der FA hingegen bei 40\% der Patienten vorliegt, definiert das Vorliegen eines Glaukoms in der Familienanamnese die Zielgruppe f{\"u}r ein effektives Glaukomscreening. Eine bessere Information der Bev{\"o}lkerung, dass bei Vorliegen eines Glaukoms in der Familienanamnese Screeninguntersuchungen, besonders bei den Geschwistern der Patienten, erforderlich sind, kann zur Verbesserung der Fr{\"u}hdiagnose und damit der Prognose der Glaukomerkrankung beitragen.}, language = {de} } @phdthesis{Kuehl2022, author = {K{\"u}hl, Julia}, title = {FAAP100, der FA/BRCA-Signalweg f{\"u}r genomische Stabilit{\"a}t und das DNA-Reparatur-Netzwerk}, doi = {10.25972/OPUS-17166}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-171669}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2022}, abstract = {Die Fanconi-An{\"a}mie (FA) ist eine seltene, heterogene Erbkrankheit. Sie weist ein sehr variables klinisches Erscheinungsbild auf, das sich aus angeborenen Fehlbildungen, h{\"a}matologischen Funktionsst{\"o}rungen, einem erh{\"o}hten Risiko f{\"u}r Tumorentwicklung und endokrinen Pathologien zusammensetzt. Die Erkrankung z{\"a}hlt zu den genomischen Instabilit{\"a}tssyndromen, welche durch eine fehlerhafte DNA-Schadensreparatur gekennzeichnet sind. Bei der FA zeigt sich dies vor allem in einer charakteristischen Hypersensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber DNA-quervernetzenden Substanzen (z. B. Mitomycin C, Cisplatin). Der zellul{\"a}re FA-Ph{\"a}notyp zeichnet sich durch eine erh{\"o}hte Chromosomenbr{\"u}chigkeit und einen Zellzyklusarrest in der G2-Phase aus. Diese Charakteristika sind bereits spontan vorhanden und werden durch Induktion mit DNA-quervernetzenden Substanzen verst{\"a}rkt. Der Gendefekt ist dabei in einem der 22 bekannten FA-Gene (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U, -V, -W) oder in noch unbekannten FA-Genen zu finden. Die FA-Gendefekte werden mit Ausnahme von FANCR (dominant-negative de novo Mutationen) und FANCB (X-chromosomal) autosomal rezessiv vererbt. Die FA-Genprodukte bilden zusammen mit weiteren Proteinen den FA/BRCA-Signalweg. Das Schl{\"u}sselereignis dieses Signalwegs stellt die Monoubiquitinierung von FANCD2 und FANCI (ID2-Komplex) dar. Ausgehend davon l{\"a}sst sich zwischen upstream- und downstream-gelegenen FA-Proteinen unterscheiden. Letztere sind direkt an der DNA-Schadensreparatur beteiligt. Zu den upstream-gelegenen Proteinen z{\"a}hlt der FA-Kernkomplex, der sich aus bekannten FA-Proteinen und aus FA-assoziierten-Proteinen (FAAPs) zusammensetzt und f{\"u}r die Monoubiquitinierung des ID2-Komplexes verantwortlich ist. F{\"u}r FAAPs wurden bisher keine pathogenen humanen Mutationen beschrieben. Zu diesen Proteinen geh{\"o}rt auch FAAP100, das mit FANCB und FANCL innerhalb des FA-Kernkomplexes den Subkomplex LBP100 bildet. Durch die vorliegende Arbeit wurde eine n{\"a}here Charakterisierung dieses Proteins erreicht. In einer Amnion-Zelllinie konnte eine homozygote Missense-Mutation identifiziert werden. Der Fetus zeigte einen typischen FA-Ph{\"a}notyp und auch seine Zellen wiesen charakteristische FA-Merkmale auf. Der zellul{\"a}re Ph{\"a}notyp ließ sich durch FAAP100WT komplementieren, sodass die Pathogenit{\"a}t der Mutation bewiesen war. Unterst{\"u}tzend dazu wurden mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems weitere FAAP100-defiziente Zelllinien generiert. Diese zeigten ebenfalls einen typischen FA-Ph{\"a}notyp, welcher sich durch FAAP100WT komplementieren ließ. Die in vitro-Modelle dienten als Grundlage daf{\"u}r, die Funktion des FA-Kernkomplexes im Allgemeinen und die des Subkomplexes LBP100 im Besonderen besser zu verstehen. Dabei kann nur durch intaktes FAAP100 das LBP100-Modul gebildet und dieses an die DNA-Schadensstelle transportiert werden. Dort leistet FAAP100 einen essentiellen Beitrag f{\"u}r den FANCD2-Monoubiquitinierungsprozess und somit f{\"u}r die Aktivierung der FA-abh{\"a}ngigen DNA-Schadensreparatur. Um die Funktion von FAAP100 auch in vivo zu untersuchen, wurde ein Faap100-/--Mausmodell generiert, das einen mit anderen FA-Mausmodellen vergleichbaren, relativ schweren FA-Ph{\"a}notyp aufwies. Aufgrund der Ergebnisse l{\"a}sst sich FAAP100 als neues FA-Gen klassifizieren. Zudem wurde die Rolle des Subkomplexes LBP100 innerhalb des FA-Kernkomplexes weiter aufgekl{\"a}rt. Beides tr{\"a}gt zu einem besseren Verst{\"a}ndnis des FA/BRCA-Signalweges bei. Ein weiterer Teil der vorliegenden Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der Charakterisierung von FAAP100138, einer bisher nicht validierten Isoform von FAAP100. Durch dieses Protein konnte der zellul{\"a}re FA-Ph{\"a}notyp von FAAP100-defizienten Zelllinien nicht komplementiert werden, jedoch wurden Hinweise auf einen dominant-negativen Effekt von FAAP100138 auf den FA/BRCA-Signalweg gefunden. Dies k{\"o}nnte zu der Erkl{\"a}rung beitragen, warum und wie der Signalweg, beispielsweise in bestimmtem Gewebearten, herunterreguliert wird. Zudem w{\"a}re eine Verwendung in der Krebstherapie denkbar.}, subject = {Fanconi-An{\"a}mie}, language = {de} } @phdthesis{Dellinger2007, author = {Dellinger, Eva}, title = {Expression von Myotubularin und seiner Mutanten im bakteriellen System}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25366}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Die X-gebundene Myotubul{\"a}re Myopathie (XLMTM) ist eine sehr seltene und schwere angeborene Muskelschw{\"a}che, die durch Mutationen im MTM 1 Gen verursacht wird. In der histopathologischen Untersuchung ist auff{\"a}llig, dass die Muskelfasern fetalen Myotuben {\"a}hneln. Das Gen MTM 1 wurde auf Xq28 lokalisiert und kodiert f{\"u}r das Protein Myotubularin. Die Myotubularine stellen eine große Familie eukaryotischer Lipid-Phosphatasen und Anti-Phosphatasen dar. Da der direkte Nachweis von Myotubularin in Muskelbiopsien von Patienten aufgrund der sehr niedrigen Expression nicht gelingt, weder durch immunhistochemische Methoden noch im Western-Blot oder durch einen spezifischen Enzymtest, steht ein funktioneller Test f{\"u}r die gefundenen Genmutationen nicht unmittelbar zur Verf{\"u}gung. In der Arbeit sollte versucht werden, zun{\"a}chst Wildtyp-Myotubularin im bakteriel-len System zu exprimieren, im Western-Blot nachzuweisen und die Phosphatase-Enzymaktivit{\"a}t in vitro zu messen. Als Substrat f{\"u}r Myotubularin wurde p-Nitrophenolphosphat verwendet. In der Durchf{\"u}h-rung des experimentellen Teils zeigten sich verschiedene Probleme, aus denen sich jedoch interessante Schl{\"u}sse ziehen liessen. Zum ei-nen konnte der Verdacht bekr{\"a}ftigt werden, dass Myotubularin keine Dual-spezifische Phosphatase ist, wie zun{\"a}chst angenommen wurde. Problematisch war auch, dass der E.coli M15 Bakterienstamm an-scheindend selbst so viele eigene Phosphatasen produzierte, die das Substrat p-Nitrophenolphosphat dephosphorylierten. Diese Hintergrundgrundaktivit{\"a}t st{\"o}rte die eigentliche Aktivit{\"a}tsmessung des Myotubularins und machte diese kaum verwertbar. Ebenso zeigte sich, dass das Myotubularin in dem untersuchten bakteriellen System nicht in gr{\"o}ßeren Mengen exprimiert wurde. Letzendlich ergab dies die Schlussfolgerung, dass zuk{\"u}nftige Untersuchungen ber{\"u}cksichtigen sollten, dass eukaryontische Expressionssysteme sich offensichtlich besser f{\"u}r die Mitglieder der Genfamilie der Myotubularine eigenen und dass Myotubularine Lipidphopshatasen sind mit in vivo sehr spe-zifischen Substraten (Phopshatidyl-Inositolphosphate). Jedes artifizielle Substrat sollte diese nat{\"u}rlichen Strukturen m{\"o}glichst nachahmen.}, subject = {Molekulargenetik}, language = {de} } @phdthesis{Lekszas2020, author = {Lekszas, Caroline}, title = {Erweiterung des genetischen Mutationsspektrums verschiedener Krankheitsbilder und Identifizierung neuer krankheitsrelevanter Gene im Menschen mittels Whole Exome Sequenzierung}, doi = {10.25972/OPUS-20880}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-208807}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2020}, abstract = {Trotz der rasanten Entwicklung molekulargenetischer Analysemethoden sind die Ausl{\"o}ser vieler Erbrankheiten bislang ungekl{\"a}rt. Eine Identifikation der genetischen Ursache einer Erkrankung ist jedoch essenziell, um zus{\"a}tzliche invasive Tests vermeiden, ad{\"a}quate Therapiemaßnahmen in die Wege leiten, akkurate Prognosen stellen und eine entsprechende genetische Beratung anbieten zu k{\"o}nnen. Next Generation Sequencing (NGS)-basierte Techniken wie die Whole Exome Sequenzierung (WES) haben die humangenetische Forschung und Diagnostik in den letzten Jahren revolutioniert. Die WES erm{\"o}glicht die Sequenzierung der Exons aller proteincodierenden Gene von mehreren Individuen gleichzeitig und stellt ein hilfreiches Werkzeug bei der Suche nach neuen kranheitsrelevanten Genen im Menschen dar. Die vorliegende Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der Aufkl{\"a}rung genetischer Ursachen verschiedenster Erkrankungen in konsanguinen Familien aus dem nahen und mittleren Osten mittels WES. Insgesamt wurden 43 Patienten mit unterschiedlichen Krankheitsbildern untersucht, darunter viele mit Skelettdysplasien oder Neuropathien. In 22 F{\"a}llen (51\%) konnte die entsprechende krankheitsverursachende Mutation ausfindig gemacht werden. In 21\% der aufgekl{\"a}rten F{\"a}lle wurden Sequenzvarianten detektiert, die in der Literatur bereits als pathogen beschrieben wurden, w{\"a}hrend 63\% bisher noch unbekannte Mutationen in bereits als krankheitsrelevant beschriebenen Genen darstellten. Zudem konnten im Rahmen dieser Arbeit drei neue, f{\"u}r den Menschen krankheitsrelevante Gene identifiziert werden, solute carrier family 10 member 7 (SLC10A7), T-box 4 (TBX4) und MIA SH3 domain ER export factor 3 (MIA3). SLC10A7 codiert f{\"u}r einen Transporter aus der Familie der solute carrier, der in der Plasmamembran verankert ist. In dieser Arbeit geleistete Analyseergebnisse konnten zu der Erstbeschreibung von homozygoten pathogenen SLC10A7-Mutationen als Ursache f{\"u}r eine Skelettdysplasie mit Amelogenesis imperfecta beitragen. Bei TBX4 handelt es sich um einen hochkonservierten Transkriptionsfaktor, der w{\"a}hrend der embryonalen Entwicklung an der Ausbildung der unteren Extremit{\"a}ten beteiligt ist. Homozygote pathogene TBX4-Mutationen wurden im Kontext dieser Arbeit erstmalig mit einer posterioren Amelie mit Becken- und Lungenhypoplasie in Verbindung gebracht. MIA3 ist ein Transmembranprotein des endoplasmatischen Retikulums, das eine essenzielle Rolle bei der Proteinsekretion spielt. Die hier vorgestellten Patienten mit homozygoten pathogenen MIA3-Mutationen zeigen eine komplexe syndromale Erkrankung, die sich haupts{\"a}chlich in einer Kollagenopathie, Diabetes mellitus und milder mentaler Retardierung manifestiert und ein neues Krankheitsbild darstellt. Die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse erweitern somit zum einen das Mutationsspektrum verschiedener bekannter Krankheitsbilder und offenbaren zum anderen neue krankheitsrelevante Gene im Menschen.}, subject = {Verwandtenehe}, language = {de} } @phdthesis{Zaum2019, author = {Zaum, Ann-Kathrin}, title = {Erweiterte Diagnostik bei neuromuskul{\"a}ren Erkrankungen: vom Genpanel zum Whole Genome Sequencing}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-176314}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2019}, abstract = {Muskeln und Nerven bilden eine essentielle funktionelle Einheit f{\"u}r den Bewegungsapparat. Neuromuskul{\"a}re Erkrankungen lassen sich unterteilen in Krankheiten, denen ein muskul{\"a}res Problem zu Grunde liegt, wie zum Beispiel Muskeldystrophien (Muskeldystrophie Duchenne, DMD) und Myopathien (Myofibrill{\"a}re Myopathie, MFM), und in Erkrankungen aufgrund von Nervensch{\"a}digungen, wie zum Beispiel Neuropathien und spastische Paraplegien (SPG). In den vier Teilen der vorliegenden Arbeit konnte sowohl das genetische wie auch das ph{\"a}notypische Spektrum von neuromuskul{\"a}ren Krankheiten erweitert werden. Die daf{\"u}r verwendeten Methoden reichen von der Sanger-Sequenzierung einzelner Gene {\"u}ber Next-Generation Sequencing (NGS)-Panel-Diagnostik, zu Whole Exome Sequencing (WES) und schließlich zu Whole Genome Sequencing (WGS). Zus{\"a}tzlich wurde cDNA zur Detektion von Ver{\"a}nderungen im Transkriptom sequenziert. Im ersten Teil wurde der klinische Ph{\"a}notyp der Seipinopathien erweitert, der jetzt auch amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und multifokale motorische Neuropathie (MMN) beinhaltet. Daf{\"u}r wurde eine Panel-Analyse durchgef{\"u}hrt, die eine bekannte Mutation in BSCL2 aufdeckte. Aufgrund des hiermit erweiterten Ph{\"a}notyps der Seipinopathien sollten Mutationen in BSCL2 auch bei anderen Verdachtsdiagnosen, wie ALS oder MMN, ber{\"u}cksichtigt werden. Außerdem wurde gezeigt, dass in der Diagnostik SPGs und Charcot-Marie-Tooth Erkrankungen (CMTs) eine {\"U}berlappung zeigen und bei der Diagnose von Verdachtsf{\"a}llen Gene aus beiden Krankheitsbereichen ber{\"u}cksichtigt werden sollten. Die Suche mit Hilfe eines Ph{\"a}notyp-Filters hat sich dabei als erfolgreich erwiesen. Ungel{\"o}ste F{\"a}lle sollten aber in regelm{\"a}ßigen Abst{\"a}nden neu analysiert werden, da immer neue Gene mit den Ph{\"a}notypen assoziiert werden. Der zweite Teil befasst sich mit der Untersuchung von DMD-Patienten mit bisher ungekl{\"a}rtem Genotyp. Durch eine RNA-Analyse des gesamten DMD-Transkripts wurden tief-intronische Mutationen aufgedeckt, die Einfluss auf das Spleißen haben. Durch diese Mutationen wurden intronische Sequenzen als Pseudoexons in die mRNA eingef{\"u}gt. Diese Mutationsart scheint h{\"a}ufig unter ungekl{\"a}rten DMD-F{\"a}llen zu sein, in unserer Kohorte von 5 DMD-Patienten wurden in zwei F{\"a}llen Pseudoexons entdeckt. Eine Besonderheit besteht darin, dass in der RNA-Analyse immer noch ein Rest Wildtyp-Transkript vorhanden war, wodurch die Patienten vermutlich einen milderen Becker-Ph{\"a}notyp aufweisen. Ein weiterer ungekl{\"a}rter DMD-Fall konnte durch die Sequenzierung der gesamten genomischen Sequenz aufgekl{\"a}rt werden. Es wurde eine perizentrische Inversion entdeckt (46,Y,inv(X)(p21.1q13.3). Dies zeigt, dass WGS auch zur Detektion von großen Strukturvariationen geeignet ist. Im dritten Teil wurden Spleißmutationen untersucht. Spleißmutationen wurden bisher nicht in TMEM5-assoziierter alpha-Dystroglykanopathie beschrieben und somit als neue Mutationsart f{\"u}r diese Erkrankung nachgewiesen. Dabei wurde auch die funktionelle Exostosin-Dom{\"a}ne in TMEM5 best{\"a}tigt. Eine RNA-Untersuchung verschiedener Spleißmutationen zeigte, dass Spleißmutationen h{\"a}ufig zu einem ver{\"a}nderten Transkript f{\"u}hren, auch wenn diese Mutationen weiter von der Konsensussequenz entfernt sind. Spleißmutation sollten daher h{\"a}ufiger in der Diagnostik ber{\"u}cksichtig und {\"u}berpr{\"u}ft werden. Im letzten Teil wurde eine strukturierte Diagnostik von MFM-Patienten beschrieben und neue Kandidaten-Gene f{\"u}r MFM vorgestellt. Es ist zu vermuten, dass auch Mutationen in Genen, die bisher f{\"u}r Kardiomyopathien, Kollagen Typ VI-Myopathien und Neuropathien beschrieben sind, einen MFM-Ph{\"a}notyp verursachen k{\"o}nnen. Diese Ergebnisse erweitern das genetische Spektrum der MFM, was sich auf die Diagnostik dieser Erkrankungen auswirken sollte. Im Laufe dieser Arbeit konnten damit die neuromuskul{\"a}ren Erkrankungen vieler Patienten genetisch gekl{\"a}rt werden. Neue Ph{\"a}notypen und genetische Ursachen wurden beschrieben und es wurde gezeigt, dass sich WGS technisch f{\"u}r die Diagnostik, auch zur Detektion von großen Strukturvarianten, eignet.}, subject = {Neuromuskul{\"a}re Krankheit}, language = {de} } @phdthesis{Huenerberg2009, author = {H{\"u}nerberg, Mirja Maaret}, title = {Erstcharakterisierung des Vitamin K-Epoxid-Reduktase Komplex 1-like 1 Proteins}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-36166}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Im Jahre 2004 wurden in unserem Labor zwei Gene einer neuen Proteinfamilie kloniert, deren Charakterisierung seither im Gange ist. Das eine Protein, VKORC1, konnte durch Mutationsanalysen und biochemische Untersuchungen als eine zentrale Komponente des so genannten Vitamin K-Zyklus identifiziert werden. Vitamin K wird f{\"u}r die \&\#947;-Carboxylierung der Vitamin K-abh{\"a}ngigen Proteine wie z.B. der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X als Cofaktor der \&\#947;-Glutamyl-Carboxylase ben{\"o}tigt. Da Vitamin K essentiell ist, wird seine Epoxidform vom Organismus wieder in eine physiologisch aktive Hydrochinon-Form {\"u}berf{\"u}hrt. F{\"u}r diese Reaktion wird die Vitamin K-Epoxid-Reduktase (VKORC1) ben{\"o}tigt. Mutationen in VKORC1 f{\"u}hren einerseits zu einem erblich bedingten Mangel an Vitamin K-abh{\"a}ngigen Gerinnungsfaktoren vom Typ 2 (VKCFD2) mit starken Blutungen durch eine nicht oder nur unvollst{\"a}ndig ablaufende Blutgerinnung. Das VKORC1 ist andererseits auch das Ziel von Medikamenten der Coumaringruppe, der sog. Vitamin K-Antagonisten, die zur Verhinderung einer unzeitigen Gerinnung eingesetzt werden. In h{\"o}heren Dosen wird diese Substanzklasse als Rattenbek{\"a}mpfungsmittel eingesetzt. Bei manchen Rattenpopulationen, aber auch bei einigen Patienten, ist die Wirksamkeit der Coumarine durch bestimmte Mutationen im VKORC1-Protein, welche eine Warfarinresistenz hervorrufen, erheblich eingeschr{\"a}nkt. Zu diesem VKORC1 existiert ein paraloges Protein, das Vitamin K-Epoxid-Reduktase Komplex 1-like 1 Protein (VKORC1L1), dessen Funktion bislang unbekannt ist und welches Gegenstand der vorliegenden Arbeit war. Es wurden unterschiedliche Methoden angewandt, um das VKORC1L1-Protein zu charakterisieren und seine m{\"o}gliche Funktion(en) aufzukl{\"a}ren. Zum einen sollte die Herstellung einer Knockout-Maus dazu dienen, durch den erhaltenen Ph{\"a}notyp Hinweise auf die m{\"o}gliche physiologische Aufgabe zu erhalten. Allerdings gelangten die Versuche nur bis zur Generierung der Chim{\"a}ren, so dass dieses Teilprojekt nicht zum Abschluss gebracht werden konnte. Die biochemische Charakterisierung des Proteins zeigte eine Expression des VKORC1L1-Gens in allen untersuchten Geweben, wobei keine starke Expression f{\"u}r ein bestimmtes Gewebe ermittelt werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass das Protein Vitamin K-Epoxid auf gleiche Weise wie das VKORC1 recyceln kann und durch Warfarin gehemmt wird. Einige der in eingef{\"u}hrten VKORC1L1 Mutationen vermitteln dar{\"u}ber hinaus eine Warfarinresistenz. Des Weiteren wurden Enzymkinetiken f{\"u}r die Spezies Maus und Ratte sowie f{\"u}r die Stachelmaus erstellt. Die erhaltenen Werte f{\"u}r die Michaelis-Menten-Konstante und die Maximalgeschwindigkeit sind untereinander sehr {\"a}hnlich und sprechen f{\"u}r eine Oxido-Reduktase-Aktivit{\"a}t des VKORC1L1-Proteins. Bioinformatische Analysen konzentrierten sich auf die Aufkl{\"a}rung von konservierten Aminos{\"a}ureresten im VKORC1L1. Dadurch konnten funktionell wichtige Positionen des Proteins ermittelt werden. Ein evolutiver Stammbaum konnte weiterhin zeigen, dass die paralogen Proteine VKORC1 und VKORC1L1 sehr wahrscheinlich aus einem gemeinsamen Vorl{\"a}uferprotein bei der Entwicklung der Wirbeltiere aus einer Duplikation entstanden sind und nach der Entstehung der Landwirbeltiere ihre spezifischen Funktionen ausgebildet haben. Ein Homologievergleich zwischen den humanen Chromosomen 7 und 16 und den jeweiligen Chromosomen verschiedener Spezies zeigte, dass sich nach der Duplikation die Gene f{\"u}r das VKORC1 und das VKORC1L1 bei fast allen betrachteten Spezies unabh{\"a}ngig voneinander auf verschiedenen Chromosomen evolutiv entwickelt haben. Dies ist ein weiteres Indiz daf{\"u}r, dass die Duplikation schon sehr lange zur{\"u}ck liegt.}, subject = {Vitamin-K-Epoxid-Reduktase}, language = {de} } @phdthesis{Sanftl2006, author = {Sanftl, Petra}, title = {Erkl{\"a}rungsversuche der Ursachen des Down-Syndroms nach der Erstbeschreibung im Jahre 1866 bis zur Entdeckung der Trisomie 21 im Jahre 1959}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22470}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Die vorliegende Arbeit liefert einen historischen Abriss {\"u}ber Erkl{\"a}rungsmodelle des Down- Syndroms im Zeitraum von 1866 bis 1959. Es wird dargestellt, wie ausgehend von Einzelsymptomen das Syndrom Down definiert wurde und welche Thesen in Bezug auf {\"A}tiologie und Pathogenese aufgestellt werden. Dem Down-Syndrom liegt nach heutigem Wissen eine autosomale Chromosomenaberration zugrunde. Statt einer zweifachen Ausf{\"u}hrung des Autosoms 21 liegt ein weiteres Chromosom 21 vor, man spricht von einer Trisomie 21. Der Ph{\"a}notyp des Down-Syndroms ist schon seit mindestens 150 Jahren bekannt, m{\"o}glicherweise existierten sogar bereits im Zeitalter der Jungsteinzeit die ersten Krankheitsf{\"a}lle. Der Erstbeschreiber J. L. H. Down war medizinischer Leiter eines Heimes f{\"u}r geistig Behinderte und stellte eine scheinbare {\"A}hnlichkeit zwischen seinen Patienten und bestimmten Menschenrassen fest. In den folgenden Jahrzehnten wurden verschiedenste Theorien zur {\"A}tiopathogenese der Trisomie 21 aufgestellt. 1959, mehr als 20 Jahren nachdem Waardenburg (1932) auf die M{\"o}glichkeit einer Chromosomenaberration hinwies, entdecken Lejeune und seine Mitarbeiter ein zus{\"a}tzliches Chromosom im Karyogramm von Down-Patienten: 47 Chromosomen anstelle von 46 Chromosomen, Trisomie.}, language = {de} } @phdthesis{ElHajj2011, author = {El Hajj, Nady}, title = {Epimutations in Germ-Cell and Embryo Development: Possible Consequences for Assisted Reproduction}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65995}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Assisted reproductive technologies (ART) emerged in the late 1970's as a therapy for human infertility. Up till now more than 3 million babies have been conceived through ART, demonstrating the safety and efficiency of the technique. Published reports showed an increase in the rate of imprinting disorders (Beckwith Wiedemann Syndrome, Angelman Syndrome, etc.) in babies born after ART. What are the effects imposed through ART and should researchers reassess its safety and implications on the future offspring? Throughout this thesis, I analyzed the methylation patterns of germ cells and embryos to determine whether in vitro maturation and in vitro fertilization have a negative impact on the epigenetic patterns. Furthermore, DNA methylation was compared between sperm of infertile and presumably fertile controls in order to understand whether epigenetic disturbances lead to infertility at the first place. The occurrence of methylation aberrations in germ cells of infertile patients could be transmitted to new-borns and then cause epigenetic disorders. In order to elucidate the imprinting status within single cells, I developed a new technique based on limiting dilution where bisulfite treated DNA is distributed across several wells before amplification. This allowed methylation measurement at the single allele level as well parent of origin detection. In a total of 141 sperm samples from couples undergoing in vitro fertilization (IVF) or intracytoplasmic sperm injection (ICSI) including 106 with male factor or combined infertility and 28 with female infertility, I detected a significant correlation between lower quality of semen parameters (sperm count, percentage of abnormal sperm, and percentage of motile sperm) and the rate of imprinting errors. ALU repeats displayed a higher methylation in sperm DNA of patients leading to a pregnancy and live birth, compared to patients in which pregnancy was not achieved or a spontaneous abortion occurred. A discriminant analysis based on ALU methylation allowed correct classification of >70\% of cases. Preliminary data from illumina methylation arrays where more than 27,000 CpGs were analyzed determined that only a single CpG site from the open reading frame C14orf93 was significantly different between the infertile and presumably fertile control group. However, further improvements on data normalization might permit detection of other differentially methylated regions. Comparison of embryos after natural conception, in vitro fertilized embryos from superovulated oocytes, and embryos achieved through fertilization of in vitro cultured oocytes revealed no dramatic effect on the imprinting patterns of Igf2r, H19, and Snrpn. Oocyte cryotop vitrification did not result in a dramatic increase of imprinting mutations in oocytes even though the rate of sporadic methylation errors in single Snrpn CpGs were higher within the in-vitrified group. Collectively, the results I will present within this thesis suggest an increase in the rate of imprinting errors within the germ cells of infertile patients, in addition to a decrease in genome wide methylation of ALU repetitive elements. I did not observe a detrimental effect on the methylation patterns of oocytes and the resulting embryos using in vitro maturation of oocytes and/or standard IVF with in vivo grown superovulated oocytes.}, subject = {Reproduktionsmedizin}, language = {en} } @phdthesis{Kuhtz2015, author = {Kuhtz, Juliane}, title = {Epimutationen humaner Keimzellen und Infertilit{\"a}t}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-108248}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2015}, abstract = {Infertilit{\"a}t stellt in unserer heutigen Gesellschaft ein zunehmendes Problem dar. Bei der Suche nach den der Infertilit{\"a}t zugrunde liegenden Ursachen ger{\"a}t immer mehr die Epigenetik in den Fokus. Epigenetische Prozesse sind nicht nur in die Embryo-nalentwicklung und Wachstumsprozesse des Kindes involviert, sondern auch in korrekte Funktionsweisen von Gameten. St{\"o}rungen k{\"o}nnen die Fertilit{\"a}t beeintr{\"a}ch-tigen. Eine besondere Rolle spielen gepr{\"a}gte Gene, die auf einem ihrer Allele, je nach parentaler Herkunft, ein Imprint in Form von DNA-Methylierung tragen. Fehl-regulationen solcher gepr{\"a}gter Gene k{\"o}nnen zu Imprinting-Erkrankungen f{\"u}hren. Seit Einf{\"u}hrung der In-vitro-Fertilisation (IVF) wurden verschiedene assistierte Re-produktionstechniken (ART) entwickelt, um infertilen Paaren zu helfen. Die Sicher-heit dieser Techniken ist nicht abschließend gekl{\"a}rt. Immer wieder wird von nach ART-Behandlung geh{\"a}uft auftretenden Imprinting-Erkrankungen berichtet. Diese Erkrankungen stehen jedoch eher in Zusammenhang mit der zugrunde liegenden Infertilit{\"a}t, als mit ART selbst. Dennoch ist es notwendig zu untersuchen inwieweit sich ART eventuell auf den Gesundheitszustand dieser Kinder auswirken k{\"o}nnte. In der hier vorgelegten Arbeit wurde der Zusammenhang von Epigenetik, Infertilit{\"a}t und ART von verschiedenen Standpunkten aus beleuchtet. In humanen Spermien wurde die DNA-Methylierung verschiedener gepr{\"a}gter Gene hinsichtlich Epimutationen untersucht. ICSI (intracytoplasmatic sperm injection) und IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) sind verschiedene Techniken zur Selektion von Spermien f{\"u}r eine ART-Behandlung. Hier wurde un-tersucht, ob IMSI epigenetisch bessere Spermien selektiert als die konventionelle ICSI-Methode. Außerdem ist bekannt, dass in Spermienk{\"o}pfen fertiler und infertiler M{\"a}nner Vakuolen vorkommen k{\"o}nnen, deren epigenetische Bedeutung jedoch un-bekannt ist. Ob diese Vakuolen in Zusammenhang mit Epimutationen stehen k{\"o}nn-ten, wurde ebenfalls {\"u}berpr{\"u}ft. Dazu wurde bisulfitkonvertierte DNA weniger Sper-mien (11 je Probe) mithilfe der Limiting Dilution (LD)-Technik und Pyrosequenzie-rung analysiert. Insgesamt standen 880 Spermien f{\"u}r diese Untersuchung zur Ver-f{\"u}gung. Es konnte kein Unterschied zwischen IMSI- und ICSI-selektierten Spermien gefunden werden. Vorhandene Vakuolen im Spermienkopf beeintr{\"a}chtigten nicht die DNA-Methylierung der Gene hGTL2, hLIT1 und hPEG3. Ein weiteres Projekt befasste sich mit der Frage, inwieweit die Technik der In-vitro-Maturation (IVM) DNA-Methylierung in humanen Oocyten beeinflussen k{\"o}nnte. Bisulfitkonvertierte DNA einzelner humaner Oocyten wurde mit LD und Pyrose-quenzierung analysiert. Verglichen wurden IVM und in vivo gereifte Oocyten. Hier-f{\"u}r standen 139 Oocyten zur Verf{\"u}gung, wovon 90 mittels IVM und 49 in vivo gereift waren. Untersucht wurden vier gepr{\"a}gte Gene (hGTL2, hLIT1, hPEG3 und hSNRPN) und drei nicht gepr{\"a}gte Gene (hDNMT3Lo, hNANOG und hOCT4). Es konnten keine IVM-bedingten Epimutationen gefunden werden. Im dritten Projekt wurde untersucht, ob sich die DNA-Methylierung normaler Sper-mien von Spermien aus Oligozoospermie-Asthenozoospermie-Teratozoospermie (OAT)-Syndrom-Patienten unterscheidet. Eine weitere Frage war, ob Epimutationen einen Einfluss auf den ART-Ausgang haben. Untersucht wurden 54 Spermienpro-ben von Paaren in ART-Behandlung. Zur Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster der gepr{\"a}gten Gene hGTL2 und hPEG3 sowie der beiden nicht gepr{\"a}gten Pluripotenzgene hNANOG und hOCT4 wurde die Methode Deep Bisulfite Sequencing (DBS) verwendet. Dies ist eine Next Generation Sequencing (NGS)-Technik, angewandt an bisulfitkonvertierter DNA. Diese Technik erm{\"o}glicht es mehrere Proben sowie Gene gleichzeitig zu analysieren. Es zeigte sich, dass OAT-Spermien, die zu einer Lebendgeburt gef{\"u}hrt hatten, sich epigenetisch nicht von normalen Spermien unterschieden. Besonders viele Epimutationen konnten hingegen in OAT-Spermien gefunden werden, die zu keiner Schwangerschaft ge-f{\"u}hrt hatten. Zwischen Spermien die zu einer Lebendgeburt oder keiner Schwan-gerschaft gef{\"u}hrt hatten, zeigten sich Unterschiede in der H{\"a}ufigkeit von hGTL2-Epimutationen. {\"U}ber die H{\"a}ufigkeit von Epimutationen konnte eine pr{\"a}diktive Aus-sage zum ART-Ausgang getroffen werden. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit festgestellt werden, dass sich eine H{\"a}u-fung von Epimutationen darauf auswirkt, ob eine Schwangerschaft erreicht werden kann oder nicht. Diese Epimutationen liegen bereits im parentalen Genom vor. Sie werden nicht durch ART verursacht. Allerdings muss man Techniken finden, mit denen man Gameten mit m{\"o}glichst wenig Epimutationen selektiert, um eine {\"U}ber-tragung solcher auf das Kind zu verhindern.}, subject = {Epigenetik}, language = {de} } @phdthesis{Wuttke2004, author = {Wuttke, Bettina}, title = {Einfluß von Alter und Genotyp auf die Zellzyklusverteilung mononukle{\"a}rer Zellen des peripheren Blutes nach Kurzzeitkultur und bivariater Durchflußzytometrie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9177}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Anhand konsekutiver Zellzyklen wird das Proliferationsmuster PHA-stimulierter Lymphozyten bei Fanconi An{\"a}mie (FA), Ataxia teleangiectasia (AT), AT-verwandter Syndrome und Aplastischer An{\"a}mie untersucht und die Zellzyklusdaten als Funktion von Probandenalter und klinischer Diagnose dargestellt. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, dass die Alterseinfl{\"u}sse auf die Zellkinetik sehr viel geringer sind als die Einfl{\"u}sse von Genotyp und Krankheitstyp. Die Methode der mehrparametrigen Duchflußzytometrie konnte in der Differentialdiagnostik der aplastischen An{\"a}mien des Kindesalters sowie in der Erfassung der Genotypen mit erh{\"o}hter Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber ionisierender Strahlung validiert werden.}, language = {de} } @phdthesis{Luber2010, author = {Luber, Verena}, title = {Einfluss des Keimzellmosaiks auf die Segregation bei den Muskeldystrophien Duchenne und Becker}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65866}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Sch{\"a}tzung der Segregation beim Keimzellmosaik in Familien mit DMD/BMD anhand ausgew{\"a}hlter Stammb{\"a}ume zur Verbesserung der Situation in der genetischen Beratung}, subject = {Duchenne-Syndrom}, language = {de} } @phdthesis{Geier2008, author = {Geier, Katja}, title = {Durchflusszytometrische Diagnostik bei Verdacht auf Nijmegen Breakage Syndrom}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27695}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Das Nijmegen Breakage Syndrom ist eine seltene autosomal- rezessive Erkrankung, die durch ein typisches Erscheinungsbild mit Mikrozephalie, Wachstumsretardierung, Immundefizienz sowie durch eine erh{\"o}hte Empfindlichkeit gegen{\"u}ber ionisierender Strahlung und eine erh{\"o}hte Pr{\"a}disposition gegen{\"u}ber malignen Tumoren charakterisiert wird. Die Erkrankung wird durch Mutationen im NBS1-Gen verursacht, welches auf Chromosom 8q21 lokalisiert werden konnte. Das NBS1-Gen Produkt, Nibrin, ist Teil des MRE11-RAD50-Nibrin Proteinkomplexes, welcher eine zentrale Rolle bei der Erkennung und der Reparatur von DNA-Doppelstrangbr{\"u}chen spielt. Das Fehlen von Nibrin f{\"u}hrt zu einer fehlerhaften DNA-Reparatur und erkl{\"a}rt die verschiedenen klinischen und zellul{\"a}ren Symptome bei NBS-Patienten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Daten von 40 Patienten ausgewertet, die im Rahmen der Verdachtsdiagnose eines Nijmegen Breakage Syndroms mit der Durchflusszytometrie untersucht wurden. F{\"u}r die Unterscheidung zwischen NBS-positiven und NBS-negativen F{\"a}llen sind folgende Parameter von diagnostischer Relevanz: 1) der Anteil nichtproliferierender Zellen (G0/G1-Phase-Zelle), welcher bei NBS-Patienten meist deutlich h{\"o}her sind als bei gesunden Kontrollen. Sie spiegeln bei erh{\"o}hten Werten die herabgesetzte Mitogenantwort wider. 2) die G2/GF-Ratio als Maß f{\"u}r Strahlensensitivit{\"a}t, welche bei NBS-Patienten charakteristischerweise erh{\"o}ht ist. Die Auswertung der Daten erlaubte es in 22 F{\"a}llen die Verdachtsdiagnose NBS auszuschließen, da diese f{\"u}r beide Parameter Werte im Normalbereich zeigten. In 16 F{\"a}llen ergab sich ein positives Ergebnis mit erh{\"o}htem Anteil nichtproliferierender Zellen und erh{\"o}hter Strahlensensitivit{\"a}t. Unter den positiven F{\"a}llen konnte bei 9 Patienten die Diagnose des Nijmegen Breakage Syndroms mittels Mutationsanalyse best{\"a}tigt werden. Bei 7 Patienten konnte jedoch trotz erh{\"o}hter Strahlensensitivit{\"a}t keine Mutation im NBS1-Gen nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Durchflusszytometrie das Vorliegen einer erh{\"o}hten Strahlensensitivit{\"a}t eindeutig nachweisen kann. Eine erh{\"o}hte Strahlensensitivit{\"a}t ist wiederum ein charakteristisches Merkmal des Nijmegen Breakage Syndroms, da es in direkten Zusammenhang mit dem verursachenden Gendefekt steht. Die Durchflusszytometrie kann daher als ein sinnvolles diagnostisches Verfahren von hoher Sensitivit{\"a}t bei Patienten mit der Verdachtsdiagnose NBS angesehen und erfolgreich eingesetzt werden. Allerdings ist die Spezifit{\"a}t des Verfahrens sehr viel geringer. Die Methode der Wahl f{\"u}r die Prim{\"a}rdiagnostik des Nijmegen Breakage Syndroms wird in Zukunft daher die Mutationsanalyse sein.}, subject = {Durchflusscytometrie}, language = {de} } @phdthesis{Gerlinger2010, author = {Gerlinger, Simone}, title = {DNA-Reparaturgene als Risikofaktoren f{\"u}r famili{\"a}ren Brustkrebs}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-50087}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Die Voraussetzung f{\"u}r die genomische Integrit{\"a}t einer Zelle ist eine funktionierende DNA-Reparatur. Bei deren Zusammenbruch kommt es zur Tumorgenese. In dieser Arbeit wurde literarisch untersucht, welchen Einfluss DNA-Reparaturgene auf das Risiko f{\"u}r die Entwicklung von famili{\"a}rem Brustkrebs nehmen. Basis f{\"u}r die Brusttumorgenese ist eine defekte Rekombinations-Reparatur. Zunehmend treten auch andere, teilweise weniger erforschte, Reparaturwege in den Vordergrund. Diese k{\"o}nnten miteinander sogar ein komplexes DNA-Reparatur-Netzwerk bilden. Sind deren Komponenten defekt, kommt es zur Brusttumorgenese. Heterozygote Tr{\"a}ger einer Mutation in den zentralen Genen haben dabei ein erh{\"o}htes Risiko f{\"u}r famili{\"a}re Mammakarzinome. Biallele Tr{\"a}ger entwickeln teilweise sehr spezifische heredit{\"a}re Brustkrebssyndrome oder Brustkrebs-assoziierte heredit{\"a}re Krebssyndrome. Tr{\"a}gerinnen von Mutationen in den DNA-Reparaturgenen mit hoher Penetranz, BRCA1, BRCA2 und TP53, haben ein zwischen 3- und 22-fach erh{\"o}htes Brustkrebsrisiko. Mutationstr{\"a}gerinnen von Genen mit niedriger Penetranz wie CHEK2, ATM, NBS1 und die FA-Gene BRIP1 und PALB2 haben ein etwa 2- bis 5-faches Risiko. Normvarianten der DNA-Reparaturgene k{\"o}nnen sogar f{\"u}r ein noch h{\"o}heres Risiko pr{\"a}disponieren. Die Polymorphismen {\"u}ben einen additiven oder dominant negativen Effekt aus und modifizieren so das famili{\"a}re Brustkrebsrisiko kumulativ. Weiterhin wird dieses polygene Modell durch Umweltfaktoren moduliert, die das Risiko zus{\"a}tzlich erh{\"o}hen k{\"o}nnen. Die modulierenden Einfl{\"u}sse aller bislang detektierten Risikofaktoren m{\"u}ssen jedoch immer wieder durch neue genetische Modelle evaluiert werden. Die DNA-Reparaturgene sind f{\"u}r etwa 30\% aller famili{\"a}ren Brustkrebsf{\"a}lle verantwortlich, der große Rest ist weiterhin unerforscht. Viele, bislang noch wenig beachtete oder unbekannte DNA-Reparaturgene und Gene, die nicht als solche klassifiziert sind, haben das Potential zum Risikogen f{\"u}r Brustkrebs. Nach heutigem Kenntnisstand handelt es sich bei der Entstehung von famili{\"a}rem Brustkrebs um ein multifaktorielles Geschehen auf der Basis polygenetischer Ver{\"a}nderungen in den DNA-Reparaturgenen.}, subject = {Brustkrebs}, language = {de} } @phdthesis{Gahn2010, author = {Gahn, Carolin}, title = {Die H{\"a}ufigkeiten der Mutationstypen und deren Verteilung im Dystrophin-Gen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-56490}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Die progressiven Muskeldystrophien Duchenne (DMD) und Becker (BMD) entstehen durch verschiedene Mutationstypen (Deletionen, Duplikationen, Punktmutationen) im Dystrophin-Gen, welches als gr{\"o}ßtes Gen des Menschen 79 Exons aufweist und sich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms befindet. Es wurden Daten von 1365 Personen bez{\"u}glich der H{\"a}ufigkeit der Mutationstypen sowie der Verteilung der einzelnen Mutationen auf die Exons des Dystrophin-Gens ausgewertet. Hieraus konnte ermittelt werden, dass sich bei 780 m{\"a}nnlichen Patienten mit gesicherter Diagnose zu 65 Prozent Deletionen, 9 Prozent Duplikationen und 26 Prozent Punktmutationen nachweisen ließen. Desweiteren wurde gezeigt, dass sich bei der Verteilung der Deletionen auf das Dystrophin-Gen zwei hot spot Regionen finden, eine gr{\"o}ßere im Bereich der Exons 45 - 54 und eine kleinere im Bereich 11 - 20. Die Duplikationen weisen eine H{\"a}ufung der betroffenen Exons am Anfang des Gens auf, wobei Exon 2 am h{\"a}ufigsten das erste betroffene Exon darstellt. Die Punktmutationen dagegen verteilen sich zuf{\"a}llig {\"u}ber das Gen. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass hinsichtlich der Verteilung der gleichen Mutationen auf das Dystrophin-Gen zwischen einer Gruppe von m{\"a}nnlichen Patienten und der Gesamtheit aller Probanden einschließlich Konduktorinnen keine Unterschiede bestehen. Dagegen unterschieden sich die verschiedenen Mutationstypen im Vergleich miteinander hinsichtlich ihrer Verteilung auf das Dystrophin-Gen. Bei der Untersuchung der geographischen Verteilung der DMD und BMD konnte lediglich bei den Duplikationen eine Gleichverteilung in Deutschland best{\"a}tigt werden.}, subject = {Muskeldystrophie}, language = {de} } @phdthesis{Ziegler2003, author = {Ziegler, Christian G.}, title = {Die B-Chromosomen der Ukelei (Alburnus alburnus)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-4702}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Im Karpfenfisch Alburnus alburnus wurden die bisher gr{\"o}ßten {\"u}berz{\"a}hligen Chromosomen bei Wirbeltieren entdeckt. Dies erm{\"o}glichte eine umfangreiche zytogenetische und molekulare Studie dieser außergew{\"o}hnlichen Genomelemente. Aus Populationsstudien, die mehrere Fundorte in Deutschland einschlossen, konnten Informationen {\"u}ber die Verteilung der B Chromosomen in Fischen verschiedener Herkunftsorte ermittelt werden. Eine derartige Studie k{\"o}nnte zuk{\"u}nftig auch auf andere L{\"a}nder ausgedehnt werden. Eine detaillierte, zytogenetische Analyse mit allen konventionellen Hellfeld- und Fluoreszenzb{\"a}nderungen sowie Fluoreszenz in situ Hybridisierungen mit den ribosomalen 5S, 18S/28S rDNA-Proben und der Telomerprobe (TTAGGG)n, zeigte, dass die außergew{\"o}hnlich großen B Chromosomen von A. alburnus heterochromatisch, GC-reich und sp{\"a}t replizierend sind. Es wurden bei Alburnus alburnus keinerlei Hinweise auf heteromorphe Geschlechtschromosomen gefunden. Die molekularen Untersuchungen basierten haupts{\"a}chlich auf AFLP-Analysen, mit denen eine B Chromosomen-spezifische Bande entdeckt und isoliert werden konnte. Nach Klonierung und Sequenzierung sowie dem Durchsuchen einer Fischspezifischen Datenbank konnte eine retrotransposable Sequenz (Gypsy/Ty3 LTRRetrotranpson) gefunden werden. Ferner konnte eine deutliche Homologie zu dem Nterminalen Teil der reversen Transkriptase von Medaka, Oryzias latipes, dokumentiert werden. Die Southern blot-Untersuchungen und der PCR-Test zeigten, dass es sich bei der entdeckten 203 bp-Sequenz um eine B Chromosomen- und Alburnus alburnus-spezifische Sequenz handelt, welche hochrepetitiv {\"u}ber die beiden Arme der {\"u}berz{\"a}hligen Chromosomen verteilt ist. Der Ursprung und die Funktion der massiven {\"u}berz{\"a}hligen Chromosomen blieb offen. Da es aber nach wie vor wenig Information {\"u}ber B Chromosomensequenzen und DNA-Organisation im Allgemeinen und besonders bei Fischen gibt (Mestriner et al., 2000), sind die Ergebnisse dieser Studie f{\"u}r die Aufdeckung des Ursprungs und der Evolution {\"u}berz{\"a}hliger Chromosomen von allgemeiner Bedeutung, da sie wohl den Hauptanteil der DNA-Zusammensetzung des gr{\"o}ßten, bisher unter den Wirbeltieren entdeckten {\"u}berz{\"a}hligen Chromosoms darstellen. Die Analyse meiotischer Chromosomen zeigte, dass das B Chromosom in der Diakinese als selbstpaarendes Ringchromosom vorliegt. Zusammenfassung und Ausblick 101 Mittels durchflußzytophotometrischer DNA-Messungen konnte der Beitrag des außerordentlich großen B Chromosoms zum Gesamt-DNA-Gehalt von A. alburnus bestimmt werden und Fische auf das Vorhandensein des {\"u}berz{\"a}hligen Chromosoms, allerdings unter T{\"o}tung, analysiert werden. Dies kann in Zukunft durch Ausnutzung von Sequenzinformation {\"u}ber das B Chromosom und der damit einhergehenden Konstruktion spezifischer PCR-Primer („minimal-invasiver Flossentest") vermieden werden. Fische aus unterschiedlichen Populationen, eventuell auch europaweit, k{\"o}nnen so schnell und zuverl{\"a}ssig auf das Vorhandensein des {\"u}berz{\"a}hligen Chromosoms hin untersucht werden, mit dem Zweck, durch k{\"u}nftige Verpaarung der Tiere mit 0, 1 oder 2 B Chromosomen den Vererbungs- bzw. Weitergabemechanismus der {\"u}berz{\"a}hligen Chromosomen auf die n{\"a}chste Generation zu studieren.}, subject = {Ukelei}, language = {de} } @phdthesis{Wagenhaeuser2023, author = {Wagenh{\"a}user, Laura Maria}, title = {Die Auswirkungen der X-Inaktivierung auf den klinischen Ph{\"a}notyp bei Patientinnen mit Morbus Fabry}, doi = {10.25972/OPUS-31153}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-311530}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2023}, abstract = {M. Fabry ist eine X-chromosomal vererbte Stoffwechselerkrankung. Die Mutation im α-Galactosidase A Gen f{\"u}hrt zur reduzierten Aktivit{\"a}t des Enzyms und zur Akkumulation der Stoffwechselprodukte im gesamten K{\"o}rper. Von der daraus resultierenden Multiorganerkrankung sind sowohl M{\"a}nner, als auch Frauen betroffen. Als Grund hierf{\"u}r steht eine verschobene X-Inaktivierung zur Diskussion. In der vorliegenden Arbeit wurden 104 Frauen rekrutiert und die X-Inaktivierungsmuster in Mundschleimhautepithel, Blut und Hautfibroblasten untersucht. Es wurden umfangreiche klinische und laborchemische Untersuchungen durchgef{\"u}hrt, sodass von jeder Patientin ein klinischer Ph{\"a}notyp vorlag, der mit Hilfe eines numerischen Scores klassifiziert wurde. Es zeigte sich, dass Blut ein leicht zu asservierendes Biomaterial mit einer hohen Pr{\"a}valenz an verschobenen X-Inaktivierungsmustern darstellt. Eine signifikante Korrelation mit dem klinischen Ph{\"a}notyp konnte in keinem der drei untersuchten Gewebe nachgewiesen werden.}, subject = {Fabry-Krankheit}, language = {de} } @phdthesis{Ziegler2004, author = {Ziegler, Susanne}, title = {Die altersabh{\"a}ngige Makuladegeneration : Untersuchung zur genetischen Assoziation des Apolipoproteins E und des Alpha-2-Makroglobulins}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15472}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Die Arbeit dient der Aufkl{\"a}rung genetischer Ursachen der altersabh{\"a}ngigen Makuladegeneration (AMD) - einer komplexen Erkrankung mit bisher unklarer {\"A}tiologie. Ziel der Arbeit war die Untersuchung einer m{\"o}glichen Assoziation der AMD mit Polymorphismen in den Genen f{\"u}r Apolipoprotein E (ApoE) und Alpha-2-Makroglobulin. Voraussetzung f{\"u}r diese Arbeit waren Studien von Klaver et al. (1998) und Souied et al. (1998). Beide Studien belegen die Assoziation eines ApoE-Polymorphismus, dem ApoE-4-Allel, mit der AMD im Sinne eines protektiven Faktors: Bei den untersuchten AMD-Patienten war die H{\"a}ufigkeit des ApoE-4-Allels signifikant geringer als in den Kontrollgruppen. Diese Assoziation sollte in der vorliegenden Arbeit an einem neuen und gr{\"o}ßeren Patientenkollektiv untersucht werden. Das ApoE-4-Allel ist ein Risikofaktor f{\"u}r Morbus Alzheimer (Corder et al, 1993). Wie AMD ist die Alzheimer Erkrankung eine neurodegenerative Erkrankung des Alters mit komplexer {\"A}tiologie und Pathogenese. Deshalb wurde folgende Hypothese aufgestellt: Wenn das ApoE-4-Allel sowohl mit Morbus Alzheimer als auch mit der AMD assoziiert ist, sind m{\"o}glicherweise auch andere, mit Morbus Alzheimer assoziierte Polymorphismen an den pathogenetischen Vorg{\"a}ngen der AMD beteiligt. Ausgehend von dieser {\"U}berlegung wurden neben den ApoE-Polymorphismen zwei h{\"a}ufige Polymorphismen eines weiteren Risikofaktors f{\"u}r Alzheimer untersucht: das Alpha-2-Makroglobulin (A2M). Die in den Studien vorbeschriebene, signifikant geringere H{\"a}ufigkeit des ApoE-4-Allels bei AMD-Patienten konnte am vorliegenden Patientenkollektiv nicht nachvollzogen werden. Die ApoE-4-Allelfrequenz betrug in der Gruppe der AMD-Patienten 9,5\% und in der Gruppe der altersgem{\"a}ßen Kontrollpersonen ebenfalls 9,5\% (p=0,998). Ein signifikantes Ergebnis brachte der Vergleich der ApoE-4-Allelh{\"a}ufigkeit bei AMD-Patienten mit der H{\"a}ufigkeit in der Gruppe „Normalbev{\"o}lkerung", die sich durch ein geringeres Durchschnittsalter auszeichnet (p= 0,001; Altersdurchschnitt 82,3 vs. 39,8 Jahre). Hier liegt aber vermutlich ein „selection bias" zugrunde. Eine von Schachter et al. (1994) ver{\"o}ffentlichte Studie belegt die generelle Abnahme der H{\"a}ufigkeit des ApoE-4-Allels in h{\"o}heren Altersgruppen. Die Untersuchung der beiden A2M-Polymorphismen ergab keinen Hinweis auf eine m{\"o}gliche Assoziation mit der AMD. Weder die A2M-Allelverteilung (p=0,649) noch die Verteilung der Genotypen (p=0,1) zeigte signifikante Unterschiede. Der Vergleich der Ergebnisse mit den bisher publizierten Studien zur Assoziation des ApoE-4-Allels mit der AMD ergibt ein widerspr{\"u}chliches Bild. Obwohl die Studien von Klaver et al. (1998) und Souied et al. (1998) eine Assoziation des ApoE-4-Allels mit der AMD nachweisen, ist die H{\"a}ufigkeitsverteilung des Allels in vier nachfolgenden Assoziationsstudien (Schmidt et al., 2000; Pang et al., 2000; Simonelli et al., 2001; Schultz et al. 2003) sowie in der vorliegenden Arbeit nicht signifikant. Allerdings belegen auch neuere Studien eindeutig eine Assoziation des Allels mit der AMD (Baird et al., 2004; Zareparsi et al., 2004). M{\"o}glicherweise stellt das ApoE-4-Allel einen protektiven Faktor dar, der Effekt ist aber in verschiedenen Populationen unterschiedlich stark ausgepr{\"a}gt. F{\"u}r Populationen mit schw{\"a}cherer Auspr{\"a}gung sind vermutlich große Studien¬gruppen notwendig, um bei einer Assoziationsstudie signifikante Frequenzunterschiede zu erhalten. Weiterhin k{\"o}nnte die Heterogenit{\"a}t der AMD ein Problem bei Assoziationsstudien darstellen. Denkbar w{\"a}re, dass unterschiedliche Formen der AMD auch mit unterschiedlichen genetischen Risikokonstellationen assoziiert sind. Eine m{\"o}gliche Assoziation mit einem Polymorphismus w{\"u}rde in einem großen Patientenkollektiv, das unterschiedliche Formen der AMD enth{\"a}lt, statistisch nicht auffallen. Erst Untersuchungen an ausgew{\"a}hlten Patientengruppen, die nur einen streng definierten Ph{\"a}notyp enthalten, w{\"u}rden den Effekt sichtbar machen. Einen Beleg hierf{\"u}r bietet die Studie von Souied et al. (1998), die sich auf die exsudative Form der AMD beschr{\"a}nkt und eine deutlich signifikante Assoziation dieses Ph{\"a}notyps mit dem ApoE-4-Allel nachweist. Der Aussagewert der bisher durchgef{\"u}hrten Studien zur Assoziation des ApoE-4-Allels mit der AMD ist noch begrenzt. Dennoch k{\"o}nnen Assoziationsstudien dazu beitragen, die genetischen Ursachen der AMD zu entschl{\"u}sseln und damit die Grundlage f{\"u}r neue Therapieans{\"a}tze schaffen. Eine erfolgversprechende Strategie f{\"u}r zuk{\"u}nftige Assoziationsstudien ist sicherlich die Untersuchung an zahlenm{\"a}ßig ad{\"a}quaten und klinisch klar definierten Patientengruppen sowie einwandfreien, altersgem{\"a}ßen Kontrollpersonen.}, language = {de} } @phdthesis{KuhngebBach2015, author = {Kuhn [geb. Bach], Julia Elisa}, title = {Design und Etablierung von Next Generation Sequencing-Methoden zur Diagnostik verschiedener Erbkrankheiten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-116854}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2015}, abstract = {Innerhalb des letzten Jahrzehnts entstanden zahlreiche neue Anreicherungs- und Sequenzier-technologien der zweiten (und dritten) Generation, die in rasantem Tempo weiterentwickelt und schon jetzt in vielen Bereichen als neuer Goldstandard f{\"u}r molekulargenetische For-schung und Diagnostik angesehen werden. Als Hochdurchsatz-Verfahren erm{\"o}glichen diese Next Generation Sequencing-Methoden (NGS) in immer k{\"u}rzerer Zeit die parallele Analyse zahlreicher Proben und immer gr{\"o}ßerer Zielregionen bis hin zum ganzen Genom und f{\"u}hrten in der Humangenetik dadurch zu Forschungsans{\"a}tzen in neuen Dimensionen. In dieser Doktorarbeit, die im molekulargenetischen Diagnostik-Labor der Humangenetik W{\"u}rzburg durchgef{\"u}hrt wurde, wurden in f{\"u}nf Projekten NGS-Ans{\"a}tze unterschiedlicher Stufen bzw. Gr{\"o}ßenordnungen f{\"u}r verschiedene erblich bedingte Erkrankungen konzipiert und etabliert und in Forschungsprojekten sowie der Routinediagnostik eingesetzt. Dabei wurden verschiedene Methoden zur Anreicherung der Zielsequenzen und zur NGS-Sequenzierung erprobt und auf ihre Effizienz beurteilt. Die Ergebnisse des NGS und darauf basierender Nachweis-Experimente wurden in sieben Ver{\"o}ffentlichungen dokumentiert, auf denen diese Dissertation aufbaut. In den drei ersten Projekten wurden das Access Array-System (Fluidigm) zur Anreicherung der Zielsequenzen und der GS Junior (Roche) zur Erzeugung der Sequenzen verwendet. In Projekt 1 wurde COL4A6 als neues Kandidatengen f{\"u}r nicht-syndromale H{\"o}rst{\"o}rungen identifiziert. Um m{\"o}gliche weitere Mutationstr{\"a}ger zu detektieren, wurde erfolgreich ein kleiner NGS-Ansatz f{\"u}r das z{\"u}gige Screening dieses Gens bei knapp 100 weiteren Patienten etabliert. Diese und weitere Ergebnisse best{\"a}tigten die Kausalit{\"a}t der COL4A6-Mutation eines Index-Patienten mit schwerer, X-chromosomal-rezessiver H{\"o}rst{\"o}rung. Ein geeigneter NGS-Ansatz f{\"u}r die Analyse des großen RYR1-Gens wurde in Projekt 2 ge-sucht. Der erste Ansatz mit Access Array-System und GS Junior f{\"u}hrte zwar bei 39 von 87 Patienten mit Maligner Hyperthermie und/oder Central Core Disease zu dem Auffinden einer (potentiell) pathogenen Variante, allerdings mit hohen Ausfallquoten. Mit der zweiten Methode (Anreicherung: SureSelect-System custom design, Agilent; Sequenzierung: HiSeq, Illumina) wurden neben RYR1 noch 63 weitere Gene analysiert, was zu deutlich besseren Ergebnissen und vier Mutationsfunden f{\"u}hrte. Projekt 3 beinhaltete die Etablierung zwei kleiner Panels f{\"u}r Muskelkrankheiten. Ein Panel f{\"u}r drei Gene f{\"u}r Gliederg{\"u}rteldystrophien wurde sogar erfolgreich in die akkreditierte Rou-tinediagnostik {\"u}bernommen. Mit dem zweiten Panel f{\"u}r acht Kandidatengene myofibrill{\"a}rer Myopathien (MFM) wurde u.a. eine neue Mutation im BAG3-Gen identifiziert. Das Exom eines MFM-Patienten wurde in Projekt 4 nach Anreicherung mit dem SureSelect-System (Agilent) auf dem HiSeq (Illumina) sequenziert. Nach Auswertung und Beurteilung der identifizierten Varianten wurde ein neuer Erbgang f{\"u}r Myotilinopathien entdeckt. Verschiedene Nachweisexperimente best{\"a}tigten die Kausalit{\"a}t der Mutation im Myotilin-Gen. In Projekt 5 wurde die komplette genomische Sequenz des F8-Gens nach tiefen intronischen Mutationen bei H{\"a}mophilie-Patienten abgesucht (Anreicherung SureSelect custom design, Agilent; Sequenzierung MiSeq, Illumina). Bei jedem der analysierten Patienten konnte min-destens eine verd{\"a}chtige Variante identifiziert werden, die zu ver{\"a}ndertem Spleißverhalten f{\"u}hren k{\"o}nnte. Drei Mutationen waren schon durch Publikationen bekannt, bei einer weite-ren konnten in vitro-Spleißanalysen die Kausalit{\"a}t best{\"a}tigen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die zur Verf{\"u}gung stehenden Methoden zur An-reicherung von Zielsequenzen aus dem menschlichen Genom und zu deren Sequenzierung je nach Komplexit{\"a}t der Fragestellung, d.h. der Anzahl und Gr{\"o}ße der Gene sowie der Anzahl der zu untersuchenden Proben, sinnvoll und effizient kombiniert werden k{\"o}nnen. Im Verlauf der Arbeit haben sich die NGS-Techniken rasant weiterentwickelt. So sind PCR-basierte Ans{\"a}tze zur Anreicherung der Zielsequenzen f{\"u}r die meisten Anwendungen von hybridisierungs-basierten Methoden verdr{\"a}ngt worden. Von den urspr{\"u}nglich drei konkur-rierenden Verfahren zur Hochdurchsatzsequenzierung hat sich die Methode des „sequen-cing-by-synthesis" (Illumina) weitgehend durchgesetzt. Diese Entwicklung spiegelt sich auch in den w{\"a}hrend dieser Arbeit erhobenen Daten wider.}, subject = {Diagnostik}, language = {de} } @phdthesis{Kochler2012, author = {Kochler, Yvonne}, title = {Der zeitliche Verlauf von Parametern des Zellzyklus bei Patienten mit Fanconi An{\"a}mie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67204}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Es werden die Parameter Summe-G2/GF und G0/G1 der hochaufl{\"o}senden, zweiparametrigen Zellzyklusanalyse von Lymphozyten bei Fanconi-An{\"a}mie-Patienten, bei denen mehrere Meßwerte vorliegen, im Hinblick auf Schwankungen untersucht. Nach Auswertung der Daten stellen die Werte keine konstanten Parameter f{\"u}r den einzelnen Patienten dar. Die Langzeitanalyse des Zellzyklusverhaltens peripherer Blutlymphozyten reflektiert jedoch weitgehend die klinische Situation der Patienten.}, subject = {Fanconi-An{\"a}mie}, language = {de} } @phdthesis{Riekert2022, author = {Riekert, Elisa}, title = {Der Einfluss von Tnap auf die Zahnentwicklung im Zebrafisch (Danio rerio)}, doi = {10.25972/OPUS-28740}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-287406}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2022}, abstract = {Aufgrund mangelnder Aktivit{\"a}t der Gewebe-unspezifischen Phosphatase (tissue-nonspecific alkaline phosphatase, TNAP) kommt es zum Krankheitsbild der Hypophosphatasie (HPP). Neben skelettalen und neuronalen Symptomen leiden Patienten mit HPP h{\"a}ufig an einem vorzeitigen Verlust der Milchz{\"a}hne und weiteren dentalen Manifestationen, wie Zahnhartsubstanzdefekten, Eruptionsst{\"o}rungen, erweiterte Pulpenkammern oder einer verringerten alveol{\"a}ren Knochenh{\"o}he. Ziel der Arbeit war es, den Einfluss der TNAP auf die Zahnentwicklung von Zebrafischlarven zu untersuchen, um ein neues in-vivo Modell f{\"u}r die dentalen Auswirkungen bei Hypophosphatasie etablieren zu k{\"o}nnen. Um die sehr kleinen Z{\"a}hne der Zebrafischlarven auch in fr{\"u}hen Entwicklungsstadien darzustellen, wurden mittels verschiedener histologischer F{\"a}rbungen die Zahnstrukturen angef{\"a}rbt und die Larven danach in JB4®, einen polymeren Kunststoff, eingebettet. Im Anschluss wurden histologische Schnitte angefertigt und am Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Einerseits konnte durch In-situ-Hybridisierung die Expression verschiedener Gene, wie z.B. alpl (welches f{\"u}r die Tnap im Zebrafisch kodiert), im Bereich von dentalen Strukturen in verschiedenen Entwicklungsstadien nachgewiesen werden. Außerdem zeigte die Analyse der dentalen Strukturen nach Inhibition der Tnap mittels Levamisol bei f{\"u}nf Tage alten Zebrafischlarven eine Ver{\"a}nderung von Form, Gr{\"o}ße und Struktur der ersten Z{\"a}hne. Die TNAP-Inhibition f{\"u}hrte auch zur quantitativ nachweisbaren Steigerung des Fluoreszenzsignals von ß-Catenin, welches eine zentrale Funktion im Wnt/ß-Catenin-Signalweg besitzt und essenziell in verschiedenen zellul{\"a}ren Prozessen w{\"a}hrend der Embryogenese ist. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der Arbeit, dass der Zebrafisch großes Potenzial als in-vivo Modell f{\"u}r die dentalen Symptome bei HPP bietet. Außerdem er{\"o}ffnen sich neue interessante Fragen in Bezug auf den Einfluss von ß-Catenin bei den fr{\"u}hen pathophysiologischen Prozessen der Erkrankung.}, subject = {Zebrab{\"a}rbling}, language = {de} } @phdthesis{Klein2001, author = {Klein, Andreas}, title = {Der altersabh{\"a}ngige Verlust der Geschlechtschromosomen beim Menschen unter Einwirkung von 5-Azadeoxycytidin}, doi = {10.25972/OPUS-32771}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-327714}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Die vorliegende Arbeit untersucht, ob mit zunehmendem Alter w{\"a}hrend der Mitose h{\"a}ufiger Geschlechtschromsomen verlorengehen. Die Beobachtungen erfolgten an Lymphozytenkulturen gesunder weiblicher und m{\"a}nnlicher Probanden aus drei verschiedenen Altersgruppen. Unter Zugabe von 5-Azadeoxycytidin, einem Nukleosidanalogon, ergab sich in den h{\"o}heren Altersgruppen ein verst{\"a}rktes Auftreten von Mikronuklei. Mikronuklei enthalten Chromosomen oder -bruchst{\"u}cke, die w{\"a}hrend der Mitose nicht in die Tochterzellkerne integriert wurden. Mittels in situ Hybridisierung konnte in den Mikronuklei der Frauen zu 5,5 Prozent ein X-Chromosom, bei den M{\"a}nnern mit 10,7 Prozent {\"u}berzuf{\"a}llig h{\"a}ufig ein Y-Chromosom nachgewiesen werden. Zwischen den einzelnen Altersstufen {\"a}nderte sich dieser Anteil nicht wesentlich. 5-Azadeoxycytidin wird als Nukleosidanalogon w{\"a}hrend der Replikation in die DNA eingebaut und verhindert die Methylierung des Tochterstrangs, da ein Kohlenstoffatom im Pyrimidinrings durch ein Stickstoffatom substituiert ist. Wahrscheinlich resultiert aus der Hyomethylierung eine falsche "Verpackung" des Gonosoms w{\"a}hrend der Mitose, dadurch erfolgt eine fehlerhafte Aufteilung des Chromosoms mit Bildung eines Mikronukleus.}, language = {de} } @phdthesis{Klein2001, author = {Klein, Andreas}, title = {Der altersabh{\"a}ngige Verlust der Geschlechtschromosomen beim Menschen unter Einwirkung von 5-Azadeoxycytidin}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1181416}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Die vorliegende Arbeit untersucht, ob mit zunehmendem Alter w{\"a}hrend der Mitose h{\"a}ufiger Geschlechtschromsomen verlorengehen. Die Beobachtungen erfolgten an Lymphozytenkulturen gesunder weiblicher und m{\"a}nnlicher Probanden aus drei verschiedenen Altersgruppen. Unter Zugabe von 5-Azadeoxycytidin, einem Nukleosidanalogon, ergab sich in den h{\"o}heren Altersgruppen ein verst{\"a}rktes Auftreten von Mikronuklei. Mikronuklei enthalten Chromosomen oder -bruchst{\"u}cke, die w{\"a}hrend der Mitose nicht in die Tochterzellkerne integriert wurden. Mittels in situ Hybridisierung konnte in den Mikronuklei der Frauen zu 5,5 Prozent ein X-Chromosom, bei den M{\"a}nnern mit 10,7 Prozent {\"u}berzuf{\"a}llig h{\"a}ufig ein Y-Chromosom nachgewiesen werden. Zwischen den einzelnen Altersstufen {\"a}nderte sich dieser Anteil nicht wesentlich. 5-Azadeoxycytidin wird als Nukleosidanalogon w{\"a}hrend der Replikation in die DNA eingebaut und verhindert die Methylierung des Tochterstrangs, da ein Kohlenstoffatom im Pyrimidinrings durch ein Stickstoffatom substituiert ist. Wahrscheinlich resultiert aus der Hyomethylierung eine falsche "Verpackung" des Gonosoms w{\"a}hrend der Mitose, dadurch erfolgt eine fehlerhafte Aufteilung des Chromosoms mit Bildung eines Mikronukleus.}, language = {de} } @phdthesis{vonBaumgarten2009, author = {von Baumgarten, Sophia}, title = {Das genetische Modell der heredit{\"a}ren H{\"a}mochromatose}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-39316}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Das genetische Modell der heredit{\"a}ren H{\"a}mochromatose soll Aufschluss {\"u}ber die ungef{\"a}hre Gr{\"o}ßenordnung schlecht untersuchter Parameter geben. Hierzu geh{\"o}ren die Allelfrequenz der zusammengefassten restlichen Mutationen des HFE-Gens, sowie die Penetranzen der verschiedenen Genotypen. Durch die Analyse des Krankenkollektivs und die Berechnung der H{\"a}ufigkeiten der verschiedenen Genotypen aus den Allelfrequenzen ist es mit Hilfe des genetischen Modells m{\"o}glich, die Penetranzen der einzelnen Genotypen zu berechnen. Das Modell fasst die restlichen Mutationen des HFE-Gens als RM zusammen. In Europa und Nordamerika zusammengefasst ist so eine Allelfrequenz von 0,0153 mit einer Penetranz von 0,373 f{\"u}r RM-RM anzunehmen. In Italien allein betrachtet, ist die Allelfrequenz von RM etwa 0,098 mit einer Penetranz von 0,491 f{\"u}r RM-RM. F{\"u}r Mitteleuropa errechnet sich eine Allelfrequenz von 0,0155 mit einer Penetranz von 0,482 f{\"u}r RM-RM, f{\"u}r S{\"u}deuropa ist es 0,0119 bzw. 0,482. Vergleiche von zusammengefassten Daten aus Mittel- und S{\"u}deuropa ergaben Unterschiede in der Verteilung der Genotypen, sowie der Penetranzen. So scheinen besonders in S{\"u}deuropa neben den Hauptmutationen im HFE-Gen, C282Y und H63D, andere Mutationen, RM, eine gr{\"o}ßere Rolle der Krankheitsmanifestation zu spielen als in Mitteleuropa. Das genetische Modell der H{\"a}mochromatose erm{\"o}glicht eine Risikoabsch{\"a}tzung bei Ratsuchenden mit an HH erkrankten Angeh{\"o}rigen. Auch bei Personen, die heterozygot f{\"u}r C282Y oder H63D sind, l{\"a}sst sich nun ein Erkrankungsrisiko absch{\"a}tzen. Das Erkrankungsrisiko variiert je nach Herkunftsland. Die Erhebung verschiedener Daten und die weitere Untersuchung anderer Mutationen im HFE-Gen sind abzuwarten, um das Modell komplettieren zu k{\"o}nnen. Bis dahin stellt es jedoch einen guten Anhaltspunkt f{\"u}r eben diese schlecht untersuchten Gr{\"o}ßen dar, und bietet daher die M{\"o}glichkeit, die Krankheit in ihrer Heterogenit{\"a}t und Komplexit{\"a}t vereinfacht darzustellen, und so Wahrscheinlichkeiten absch{\"a}tzen zu k{\"o}nnen.}, subject = {H{\"a}mochromatose}, language = {de} } @phdthesis{Golitschek2007, author = {Golitschek, Robert von}, title = {Charakterisierung von genomischer Instabilit{\"a}t mit Hilfe der Spektralen Karyotypisierung beim Werner-Syndrom}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-24957}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals Metaphasen von Fibroblastenkulturen (AA, WL, SCH, H-51) von Patienten mit der klinischen Verdachtsdiagnose Werner Syndrom (WS) mit der Spektralen Karyotypisierung (SKY) analysiert. Die Auswertung best{\"a}tigte in allen vier Zelllinien (ZLL) die zuvor mit konventionellen Methoden (z.B. mit G- und R-B{\"a}nderung) etablierten zytogenetischen Charakteristika des WS in Form des „Variegated Translocation Mosaicism" (VTM) und der im zeitlichen Verlauf einer Zellkultur vorherrschenden zytogenetischen, dominanten Klone, deren Eigenschaften mit den drei Schlagw{\"o}rtern „clonal attenuation", „clonal succession" und „clonal expansion" bereits durch Salk et al. [28] treffend umschrieben wurden. Alle ZLL wurden nach 7 oder 8 Passagen seneszent, einer f{\"u}r WS-Fibroblasten typischen, reduzierten Lebensspanne. In der genaueren Analyse der aberranten Metaphasen war SKY den konventionellen Methoden deutlich {\"u}berlegen. W{\"a}hrend bei Salk et al. in 1005 Metaphasen 271 Br{\"u}che entdeckt wurden, wurden mit SKY in 69 Metaphasen 108 Br{\"u}che eindeutig klassifiziert, was außerdem eine detailliertere Einteilung der Klone in unterschiedliche, teilweise singul{\"a}re Subklone erforderlich machte. Die bisher noch nie in WS-Zellen festgestellten trizyklischen Chromosomenaustausche und dreifach-rekombinanten Chromosomen zeigten die F{\"a}higkeit der SKY-Methode, komplexe genomische Ver{\"a}nderungen genau darzustellen. Zudem wurde erstmals ein pseudotetraploider Subklon T mit 87-90 Chromosomen entdeckt, der aus der Mutterkultur WL stammte und ein ungew{\"o}hnliches Wachstumspotential von etwa 45 Populationsverdoppelungen (PD) erreichte und die durchschnittlichen 20 PD von WS-Fibroblasten um mehr als das Doppelte {\"u}berschritt, aber unter den 54 PD von Kontrollfibroblasten lag. Eine Tetrasomie wurde f{\"u}r alle autosomalen Chromosomen außer den Chromosomen 4 und 6 festgestellt, die jeweils dreimal, die Geschlechtschromosomen X und Y jeweils zweimal vertreten waren. Die Translokationen waren identisch mit denen von Klon a aus WL, allerdings in jeweils zweifacher Ausf{\"u}hrung. 77 der 10 Chromosomen beinhalteten in den 69 Metaphasen \&\#8805;6 Br{\"u}che und waren in jeweils mindestens 3 der 4 ZLL an Chromosomenaberrationen beteiligt. V.a. Chromosom 16 war mit 17 Bruchpunkten bzw. in 23 von 78 aberranten Chromosomen am h{\"a}ufigsten involviert. Zudem war es an zwei der drei dreifach-rekombinierten Chromosomen und bei einem der zwei trizyklischen Chromosomenaustausche beteiligt. Dies weist auf eine m{\"o}glicherweise große Bedeutung von Chromosom 16 in Rekombinationsprozessen hin. Auff{\"a}llig war eine nicht-zuf{\"a}llige Bruchpunktverteilung. Die Bruchpunkte 3q11\&\#8594;q12, 9q13, 15q15, 16q12\&\#8594;q13 und 16q22 waren m{\"o}gliche hot spots f{\"u}r Bruchereignisse und trugen Rechnung f{\"u}r \&\#8776;21\% der Bruchereignisse. V.a. 16q22 brach am h{\"a}ufigsten (11mal), war als einziger Bruchpunkt in allen 4 Zelllinien vorhanden und maßgeblich f{\"u}r die hohe Beteiligung des Chromosoms 16 an strukturellen Aberrationen verantwortlich. 16q22 wurde in vorherigen Untersuchungen bisher noch nicht als einer der bevorzugten Bruchpunkte in WS festgestellt. Einige der bei Salk et al. genannten hot spots wurden in dieser Arbeit best{\"a}tigt, jedoch mit unterschiedlichem Verteilungsmuster. Dies h{\"a}ngt m{\"o}glicherweise mit der h{\"o}heren Sensitivit{\"a}t von SKY, aber auch mit der in dieser Arbeit relativ niedrigen Anzahl an Metaphasen zusammen. F{\"u}r SKY bestehen weitere mannigfaltige Anwendungsm{\"o}glichkeiten , die in der zytogenetischen Forschung nicht nur auf dem Gebiet des WS Fortschritte erzielen k{\"o}nnen. SKY ist zudem eine sichere Methode, erfordert jedoch einen hohen zeitlichen und materiellen Aufwand, die die Anwendungsm{\"o}glichkeiten wiederum limitieren. Als diagnostisches Instrument erscheint SKY daher nur in F{\"a}llen sinnvoll, in denen nach der Anwendung konventioneller Methoden weiterhin Unsicherheiten bez{\"u}glich der Diagnose bestehen. Mit der Eigenschaft komplexe Rearrangements mit hoher Sensitivit{\"a}t zweifelsfrei nachzuweisen, kann es jedoch als der Gold-Standard bei unklaren F{\"a}llen gelten.}, subject = {Progeria adultorum}, language = {de} } @phdthesis{Zimmermann2012, author = {Zimmermann, Melanie Andrea}, title = {Charakterisierung und Expressionsanalysen von H{\"a}mophilie-A-Mutationen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85747}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Bei einem kleinen Prozentsatz (2-3 \%) aller molekulargenetisch untersuchten H{\"a}-mophilie-A-F{\"a}lle konnte bislang keine kausale Mutation innerhalb der F8-Gen-Region aufgedeckt werden. Die molekularen Ursachen der H{\"a}mophilie dieser Patienten sollten im ersten Teil der vorliegenden Doktorarbeit mittels zus{\"a}tzlicher Methoden aufgekl{\"a}rt werden. Bei zwei Patienten mit milder H{\"a}mophilie A konnte je ein Basenaustausch im Promotorbereich des F8-Gens identifiziert werden. Um die Kausalit{\"a}t dieser Austausche zu {\"u}berpr{\"u}fen, wurden f{\"u}r diese und zwei weitere bereits publizierte Promotor-Mutationen Luciferase-Assays durchgef{\"u}hrt. Diese Ergebnisse machten deutlich, dass die nachgewiesenen Promotor-Mutationen die Aktivit{\"a}t des Promotors deutlich herabsetzen und daher als urs{\"a}chlich einzustufen sind. Weiterhin wurden die {\"u}brigen Patienten auf epigenetische Ver{\"a}nderungen in f{\"u}nf CpG-Inseln im 5'UTR und Intron 1 des F8-Gens untersucht. Hierbei konnten bei drei Patienten auff{\"a}llige Methylierungsmuster nachgewiesen werden, wobei diese auf ein Klinefelter-Syndrom und genomische Ver{\"a}nderungen im Intron 1 zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind, nicht jedoch auf einen aberranten Methylierungsstatus, der die FVIII-Expression beeinflussen k{\"o}nnte. Mit Hilfe von mRNA-Untersuchungen konnten bei vier Patienten mit mutmaßlichen F8-Spleißmutationen aberrante F8-Transkripte nachgewiesen werden und somit die Kausalit{\"a}t der Mutationen gekl{\"a}rt werden. Des Weiteren wurden aus der Literatur alle bisher als kausal identifizierten stillen Mutationen und Spleißmutationen zusammengestellt, um mit diesen Ergebnissen die Spleißvorhersage-Software Alamut zu validieren. Die große Mehrzahl (78 \%) der Spleißvorhersagen stimmte mit den Resultaten der mRNA-Untersuchungen (zumindest im Trend) {\"u}berein, w{\"a}hrend es bei 22 \% der Vorhersagen und mRNA-Analysen zu unterschiedlichen Resultaten kam. Innerhalb einer vorangegangenen Diplomarbeit konnten zehn Duplikationsbruch-punkte im F8-Gen von nicht verwandten H{\"a}mophilie-A-Patienten aufgekl{\"a}rt werden. Diese wurden nun mit verschiedenen in-silico-Programmen analysiert, um die Sequenzumgebung der Bruchpunkt genauer zu beschreiben. Die Untersuchung ergab, dass verschiedene Mechanismen zur Entstehung von Duplikationen f{\"u}hren k{\"o}nnen und vermutlich mehrere Sequenzmotive in direkter N{\"a}he der Bruchpunkte hierzu beitragen. Im Rahmen der molekulargenetischen H{\"a}mophilie-A-Diagnostik zum Nachweis von Intron-1- bzw. Intron-22-Inversionen sind einige Patienten mit schwerer H{\"a}mophilie A aufgefallen, welche ungew{\"o}hnliche Bandenmuster in den analytischen PCRs bzw. Southern-Blots aufwiesen. Mittels MLPA-Analysen wurden bei diesen Patienten Deletionen oder Duplikationen (CNVs) aufgedeckt, die meist allein die auff{\"a}lligen Bandenmuster nicht erkl{\"a}ren konnten. Weitere Long-Range-PCR-Untersuchungen belegten dagegen, dass f{\"u}nf der untersuchten F{\"a}lle auf ein kombiniertes Inversions- und Duplikations- bzw. Deletionsereignis zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind. Als zweiter Teil der Arbeit wurden Transkriptions- und Translationsuntersuchungen von Nonsense-Mutationen des F8-Gens in einem zellul{\"a}ren Expressionssystem durchgef{\"u}hrt. Es konnte nachgewiesen werden, dass trotz Nonsense-Mutation eine komplette F8-Tran¬skrip¬tion stattfindet. Antigenanalysen konnten die Expression von trunkierten Proteinen nachweisen, wenn die Nonsense-Mutationen in der leichten Kette, d.h. den distalen Dom{\"a}nen A3, C1 oder C2, lag. Bei Nonsense-Mutationen in der schweren Kette (den proximalen Dom{\"a}nen A1, A2 oder B) war keine Proteinexpression nachweisbar. Diese Daten konnte durch intrazellul{\"a}re Immunlokalisation der trunkierten Proteine best{\"a}tigt werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die B-Dom{\"a}ne eine wichtige Rolle bei der Proteinprozessierung spielt, vermutlich indem sie die Bindung von Chaperonen erm{\"o}glicht und das FVIII-Protein vor Degradation sch{\"u}tzt.}, subject = {H{\"a}mophilie}, language = {de} } @phdthesis{Hoevel2001, author = {H{\"o}vel, Thorsten}, title = {Charakterisierung der Funktion des Tight Junction Proteins hu-CLDN1 und seine Bedeutung bei der Tumorgenese}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1409}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Vor 2 Jahren wurden erstmals die wahrscheinlich wichtigsten Tight Junction Proteine, Claudin-1 und -2 in der Maus beschrieben. An Hand von Sequenzhomologien konnten bis heute dieser 4 Transmembrandom{\"a}nen Proteinfamilie 18 Mitglieder mit unterschiedlichen Gewebeverteilungen zugeordnet werden. Parallel zum murinen Claudin-1 wurde von (Swisshelm et al. 1999) das humane Claudin-1 mit einer 91 prozentigen Sequenzhomologie zum murinen Protein isoliert und molekulargenetisch beschrieben. In der {\"u}berwiegenden Mehrzahl von Brusttumorzellinien ist die Expression von hu-CLDN1 verloren gegangen. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb die biologische Funktion des humanen Claudin-1 (hu-CLDN1) und dessen Relevanz w{\"a}hrend der Tumorgenese untersucht werden. F{\"u}r diese Aufgabenstellung mußten monoklonale Antik{\"o}rper mittels DNA Vakzinierung und hu-CLDN1 Retroviren zur effektiven Transduktion von Tumorzellen entwickelt werden. Die Antik{\"o}rper wurden in ELISA, kompetitiven hu-CLDN1 Peptid ELISA und Western Blot auf ihre hu-CLDN1 Spezifit{\"a}t und Epitoperkennungsstelle {\"u}berpr{\"u}ft. F{\"u}r biologische Untersuchungen wurden f{\"u}r die neuen Antik{\"o}rper optimale immunzytochemische und immunhistochemische Methoden etabliert. Mit Hilfe der monoklonalen Antik{\"o}rper wurde die zellul{\"a}re Proteinexpression und die Lokalisation, als auch die Expression von hu-CLDN1 in Gewebeschnitten von Tumoren- und Normalgewebe untersucht. Vor 2 Jahren wurden erstmals die wahrscheinlich wichtigsten Tight Junction Proteine, Claudin-1 und -2 in der Maus beschrieben. An Hand von Sequenzhomologien konnten bis heute dieser 4 Transmembrandom{\"a}nen Proteinfamilie 18 Mitglieder mit unterschiedlichen Gewebeverteilungen zugeordnet werden. Parallel zum murinen Claudin-1 wurde von (Swisshelm et al. 1999) das humane Claudin-1 mit einer 91 prozentigen Sequenzhomologie zum murinen Protein isoliert und molekulargenetisch beschrieben. In der {\"u}berwiegenden Mehrzahl von Brusttumorzellinien ist die Expression von hu-CLDN1 verloren gegangen. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb die biologische Funktion des humanen Claudin-1 (hu-CLDN1) und dessen Relevanz w{\"a}hrend der Tumorgenese untersucht werden. F{\"u}r diese Aufgabenstellung mußten monoklonale Antik{\"o}rper mittels DNA Vakzinierung und hu-CLDN1 Retroviren zur effektiven Transduktion von Tumorzellen entwickelt werden. Die Antik{\"o}rper wurden in ELISA, kompetitiven hu-CLDN1 Peptid ELISA und Western Blot auf ihre hu-CLDN1 Spezifit{\"a}t und Epitoperkennungsstelle {\"u}berpr{\"u}ft. F{\"u}r biologische Untersuchungen wurden f{\"u}r die neuen Antik{\"o}rper optimale immunzytochemische und immunhistochemische Methoden etabliert. Mit Hilfe der monoklonalen Antik{\"o}rper wurde die zellul{\"a}re Proteinexpression und die Lokalisation, als auch die Expression von hu-CLDN1 in Gewebeschnitten von Tumoren- und Normalgewebe untersucht. F{\"u}r die Reexpression von hu-CLDN1 in Brusttumorzellen wurden retrovirale Genshuttlesysteme hergestellt. Die retroviralen Genshuttlesysteme basieren auf dem MoMuLV Grundger{\"u}st und als Besonderheit wurde der l-NGFR Rezeptor zur schnellen und sicheren Identifkation transduzierter Zellen einkloniert. Hergestellt wurde ein Mock Kontrollvektor (nur l-NGFR) und der hu-CLDN1 Vektor mit l-NGFR. Die hu-CLDN1 retroviralen {\"U}berst{\"a}nde wurden verwendet, um verschiedene Brusttumorzellinien zu transduzieren. Die Expression von hu-CLDN1 wurde mittels eigens entwickelter quantitativer gekoppelter Reverser Transkription Polymerase Ketten Reaktion (qRT PCR) in verschiedenen Brusttumorzellinien untersucht. Wie aus der vorliegenden Arbeit ersichtlich, konnten erstmalig monoklonale Antik{\"o}rper gegen hu-CLDN1 entwickelt werden. Diese sind spezifisch und haben eine hohe Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber hu-CLDN1. Desweiteren gelang es erstmals Antik{\"o}rper gegen alle 4 extra- und intrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen zu gewinnen. Mit diesen Antik{\"o}rpern gelang es nachzuweisen, daß es sich bei hu-CLDN1 um ein ausschließlich membranst{\"a}ndiges Protein handelt. Die Expression des Proteins findet sich nur in konfluenten Zellkulturen von nat{\"u}rlicherweise hu-CLDN1 exprimierenden Brusttumorzellen (T47D, MCF7), wobei die Lokalisation ausschließlich auf die Zell-Zell Kontaktstelle beschr{\"a}nkt ist. Bei der hu-CLDN1 Transduktion in hu-CLDN1 negativen Brusttumorzellinen zeigte sich eine konstitutive mRNA Expression in subkonfluenten und konfluenten Zellkulturen. Allerdings ist fluoreszenzmikroskopisch hu-CLDN1 Protein nur in konfluenten Zellkulturen nachweisbar, wobei diese Tumorzellen das Protein korrekt nur an der Zell-Zell Kontaktstelle einbauen. Offensichtlich haben die hu-CLDN1 negativen Brusttumorzellen noch den intakten Signalweg zur korrekten Expression mit einer noch unbekannten posttranskriptionellen Kontrolle. Bemerkenswert ist in diesem Zusammenhang, daß in Brusttumorzellen, die weder Occludin noch ZO-1 exprimieren (MDA-MB-435) die physiologisch korrekte Expression von hu-CLDN1 existiert. Offensichtlich ist die Lokalisation von hu-CLDN1 von beiden Proteinen unabh{\"a}ngig. Die Analyse von unterschiedlichen hu-CLDN1 positiven und negativen Brusttumorzellen zeigte, daß der Verlust der hu-CLDN1 Expression besser zur in vitro Invasivit{\"a}t von Brusttumorzellen korreliert als der Expressionsverlust von Occludin und ZO-1. Die klinische Relevanz des Verlustes von hu-CLDN1 w{\"a}hrend der Tumorgenese wurde bei den Expressionsanalysen auf normalen Brust- und Darmgewebe gegen{\"u}ber transformierten Brust- und Darmgewebe untersucht. Bei der Analyse von normalem Brustgewebe konnte festgestellt werden, daß hu-CLDN1 ein rein epthelial/endotheliales Protein mit eindeutiger Membranlokalisation darstellt. In den untersuchten transformierten Geweben zeigte keines der transformierten Gewebe mehr die membranst{\"a}ndige F{\"a}rbung, sondern nur noch zytoplasmatische F{\"a}rbung. Desweiteren war eine signifikant reduzierte oder nicht vorhandene hu-CLDN1 F{\"a}rbung in einer gr{\"o}ßeren Anzahl von Tumoren zu beobachten. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Verlust der Expression zumindest bei der Brust- und Darmtumorentwicklung offensichtlich mit der in vivo Tumorprogression korreliert. Um die Bedeutung der hu-CLDN1 Relokalisation bzw. verringerten Expression w{\"a}hrend der Tumorgenese zellphysiologisch zu verstehen, wurden in vitro Zellkulturstudien mit hu-CLDN1 negativen Zellinien und ihren hu-CLDN1 transduzierten Tochterpopulationen durchgef{\"u}hrt. In den adh{\"a}renten Zellkulturen hat die hu-CLDN1 Expression keinen Einfluß auf Zellwachstum und Apoptose. Allerdings zeigte sich in drei dimensional wachsenden Tumorzellaggregaten, daß die Reexpression von hu-CLDN1 zu einer drastischen Erh{\"o}hung der Apoptose f{\"u}hrt. Die parazellul{\"a}ren Fluxstudien ergaben, daß bei der Reexpression von hu-CLDN1 in Brusttumorzellen der parazellul{\"a}re Flux zwischen den Zellen deutlich zur{\"u}ckgeht. Somit k{\"o}nnte die reduzierte Wachstumskapazit{\"a}t bzw. erh{\"o}hte Apoptose in 3 D Kulturen mit einer reduzierten Zug{\"a}nglichkeit von N{\"a}hrstoffen und Wachstumsfaktoren in hu-CLDN1 transduzierten Zellen verursacht sein. Dies w{\"u}rde auch erkl{\"a}ren, warum bei den untersuchten transformierten noch hu-CLDN1 positiven Brust- und Darmtumorgeweben sich ausschließlich eine zytoplasmatische Lokalisation in den Tumorzellen findet. W{\"a}hrend in Organen und Dr{\"u}sengeweben Epithelien einschichtig vorkommen und die Versorgung der Zellen mit Wachstumsfaktoren basolateral oder apikal durch Diffusion und Mikro-/Makropinozytose erfolgen kann, wachsen Tumorepithelzellen mehrschichtig. W{\"a}ren die Tight Junctions im Tumor noch intakt, so k{\"o}nnte es zu einer Mangelversorgung und somit zur Apoptose kommen. F{\"u}r das in vivo Wachstum eines Tumors ist es also notwendig, Membranproteine, die den parazellul{\"a}ren Flux inhibieren, zu verringern. Wie die zellphysiologischen in vitro Studien der vorliegenden Arbeit zeigen, ist es aber m{\"o}glich, einen tumorinhibierenden Effekt allein durch die Reexpression von hu-CLDN1 unabh{\"a}ngig von Occludin und ZO-1 zu erreichen. In diesem Sinne kann zumindest zellphysiologisch hu-CLDN1 als Tumorsuppressorprotein betrachtet werden.}, subject = {Proteine}, language = {de} }