@phdthesis{Dill2012,
  author    = {Dill, Holger},
  title     = {Functional characterization of the microRNA-26 family in zebrafish neurogenesis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-70757},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Formation oft the central nervous system (CNS) from multipotent neuronal stem cells (NSCs) requires a tightly controlled, step-wise activation of the neuronal gene expression program. Expression of neuronal genes at the transition from neural stem cell to mature neuron (i. e. neuronal cell differentiation) is controlled by the Repressor element 1 (RE1) silencing transcription factor (REST) complex. As a master transcriptional regulator, the REST-complex specifically inhibits expression of neuronal genes in non-neuronal tissues and neuronal progenitor cells. Differentiation of NSCs to mature neurons requires the activation of genes controlled by the REST-complex, but how abrogation of REST-complex mediated repression is achieved during neurogenesis is only poorly understood. MicroRNAs (miRNAs) are a class of small regulatory RNAs that posttranscriptionally control target gene expression. Binding of miRNAs to target sequences in the 3'UTR of mRNAs, leads either to degradation or translational inhibition of the mRNA. Distinct neuronal miRNAs (e.g. miR-124) were shown to modulate REST-complex activity by silencing expression of REST-complex components. Interestingly, these miRNAs are also under transcriptional control of the REST-complex and inactivation of the REST-complex precedes their expression. Hence, additional factors are required for derepression of neuronal genes at the onset of neurogenesis. In this study function of the miR-26 family during neurogenesis of the zebrafish (Danio rerio) was analyzed. Computational target prediction revealed a number of REST-complex components as putative miR-26 targets. One of these predicted target genes, the C-terminal domain small phosphatase 2 (Ctdsp2) was validated as an in vivo target for miR-26b. Ctdsps are important cofactors of REST and suppress neuronal gene expression by dephosphorylating the C-terminal domain (CTD) of RNA polymerase II (Pol II). Interestingly, miR-26b is encoded in an intron of the ctdsp2 primary transcript and is cotranscribed together with its host gene. Hence, miR-26b modulates expression of its host gene ctdsp2 in an intrinsic negative autoregulatory loop. This negative autoregulatory loop is inactive in NSCs because miR-26b biogenesis is inhibited at the precursor level. Generation of mature miR-26b is activated during neurogenesis, where it suppresses Ctdsp2 protein expression and is required for neuronal cell differentiation in vivo. Strikingly, miR-26b is expressed prior to miR-124 during neuronal cell differentiation. Thus, it is reasonable to speculate about a function of miR-26b in early events of neurogenesis. In line with this assumption, knockdown of miR-26b in zebrafish embryos results in downregulation of REST-complex controlled neuronal genes and a block in neuronal cell differentiation, most likely due to aberrant regulation of Ctdsp2 expression. This is evident by reduced numbers of secondary motor neurons compared to control siblings. In contrast, motor neuron progenitor cells and glia cells were not affected by depletion of miR-26b.This study identifies the ctdsp2/miR-26b autoregulatory loop as the first experimentally validated interaction between an intronic miRNA and its host gene transcript. Silencing of ctdsp2 by miR-26b in neurons is possible because biogenesis of the ctdsp2 mRNA and mature mir-26b is uncoupled at the posttranscriptional level. Furthermore the obtained data indicate a cell type specific role for miR-26b in vertebrate neurogenesis and CNS development.},
  subject      = {Zebrab{\"a}rbling},
  language  = {en}
}
@article{DonatRotherSchaeferetal.2014,
  author    = {Donat, Ulrike and Rother, Juliane and Sch{\"a}fer, Simon and Hess, Michael and H{\"a}rtl, Barbara and Kober, Christina and Langbein-Laugwitz, Johanna and Stritzker, Jochen and Chen, Nanhai G. and Aguilar, Richard J. and Weibel, Stephanie and Szalay, Alandar A.},
  title     = {Characterization of Metastasis Formation and Virotherapy in the Human C33A Cervical Cancer Model},
  series = {PLoS ONE},
  volume    = {9},
  journal   = {PLoS ONE},
  number    = {6},
  issn      = {1932-6203},
  doi       = {10.1371/journal.pone.0098533},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-119674},
  pages     = {e98533},
  year      = {2014},
  abstract  = {More than 90\% of cancer mortalities are due to cancer that has metastasized. Therefore, it is crucial to intensify research on metastasis formation and therapy. Here, we describe for the first time the metastasizing ability of the human cervical cancer cell line C33A in athymic nude mice after subcutaneous implantation of tumor cells. In this model, we demonstrated a steady progression of lumbar and renal lymph node metastases during tumor development. Besides predominantly occurring lymphatic metastases, we visualized the formation of hematogenous metastases utilizing red fluorescent protein (RFP) expressing C33A-RFP cells. RFP positive cancer cells were found migrating in blood vessels and forming micrometastases in lungs of tumor-bearing mice. Next, we set out to analyze the influence of oncolytic virotherapy in the C33A-RFP model and demonstrated an efficient virus-mediated reduction of tumor size and metastatic burden. These results suggest the C33A-RFP cervical cancer model as a new platform to analyze cancer metastases as well as to test novel treatment options to combat metastases.},
  language  = {en}
}
@article{DraganovSantidrianMinevetal.2019,
  author    = {Draganov, Dobrin D. and Santidrian, Antonio F. and Minev, Ivelina and Duong, Nguyen and Kilinc, Mehmet Okyay and Petrov, Ivan and Vyalkova, Anna and Lander, Elliot and Berman, Mark and Minev, Boris and Szalay, Aladar A.},
  title     = {Delivery of oncolytic vaccinia virus by matched allogeneic stem cells overcomes critical innate and adaptive immune barriers},
  series = {Journal of Translational Medicine},
  volume    = {17},
  journal   = {Journal of Translational Medicine},
  issn      = {100},
  doi       = {10.1186/s12967-019-1829-z},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-226312},
  year      = {2019},
  abstract  = {Background Previous studies have identified IFNγ as an important early barrier to oncolytic viruses including vaccinia. The existing innate and adaptive immune barriers restricting oncolytic virotherapy, however, can be overcome using autologous or allogeneic mesenchymal stem cells as carrier cells with unique immunosuppressive properties. Methods To test the ability of mesenchymal stem cells to overcome innate and adaptive immune barriers and to successfully deliver oncolytic vaccinia virus to tumor cells, we performed flow cytometry and virus plaque assay analysis of ex vivo co-cultures of stem cells infected with vaccinia virus in the presence of peripheral blood mononuclear cells from healthy donors. Comparative analysis was performed to establish statistically significant correlations and to evaluate the effect of stem cells on the activity of key immune cell populations. Results Here, we demonstrate that adipose-derived stem cells (ADSCs) have the potential to eradicate resistant tumor cells through a combination of potent virus amplification and sensitization of the tumor cells to virus infection. Moreover, the ADSCs demonstrate ability to function as a virus-amplifying Trojan horse in the presence of both autologous and allogeneic human PBMCs, which can be linked to the intrinsic immunosuppressive properties of stem cells and their unique potential to overcome innate and adaptive immune barriers. The clinical application of ready-to-use ex vivo expanded allogeneic stem cell lines, however, appears significantly restricted by patient-specific allogeneic differences associated with the induction of potent anti-stem cell cytotoxic and IFNγ responses. These allogeneic responses originate from both innate (NK)- and adaptive (T)- immune cells and might compromise therapeutic efficacy through direct elimination of the stem cells or the induction of an anti-viral state, which can block the potential of the Trojan horse to amplify and deliver vaccinia virus to the tumor. Conclusions Overall, our findings and data indicate the feasibility to establish simple and informative assays that capture critically important patient-specific differences in the immune responses to the virus and stem cells, which allows for proper patient-stem cell matching and enables the effective use of off-the-shelf allogeneic cell-based delivery platforms, thus providing a more practical and commercially viable alternative to the autologous stem cell approach.},
  language  = {en}
}
@article{DuggalGeissingerZhangetal.2013,
  author    = {Duggal, Rohit and Geissinger, Ulrike and Zhang, Qian and Aguilar, Jason and Chen, Nanhai G. and Binda, Elena and Vescovi, Angelo L. and Szalay, Aladar A.},
  title     = {Vaccinia virus expressing bone morphogenetic protein-4 in novel glioblastoma orthotopic models facilitates enhanced tumor regression and long-term survival},
  series = {Journal of Translational Medicine},
  volume    = {11},
  journal   = {Journal of Translational Medicine},
  number    = {155},
  doi       = {10.1186/1479-5876-11-155},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-129626},
  year      = {2013},
  abstract  = {No abstract availableBackground: Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most aggressive forms of cancer with a high rate of recurrence. We propose a novel oncolytic vaccinia virus (VACV)-based therapy using expression of the bone morphogenetic protein (BMP)-4 for treating GBM and preventing recurrence. Methods: We have utilized clinically relevant, orthotopic xenograft models of GBM based on tumor-biopsy derived, primary cancer stem cell (CSC) lines. One of the cell lines, after being transduced with a cDNA encoding firefly luciferase, could be used for real time tumor imaging. A VACV that expresses BMP-4 was constructed and utilized for infecting several primary glioma cultures besides conventional serum-grown glioma cell lines. This virus was also delivered intracranially upon implantation of the GBM CSCs in mice to determine effects on tumor growth. Results: We found that the VACV that overexpresses BMP-4 demonstrated heightened replication and cytotoxic activity in GBM CSC cultures with a broad spectrum of activity across several different patient-biopsy cultures. Intracranial inoculation of mice with this virus resulted in a tumor size equal to or below that at the time of injection. This resulted in survival of 100\% of the treated mice up to 84 days post inoculation, significantly superior to that of a VACV lacking BMP-4 expression. When mice with a higher tumor burden were injected with the VACV lacking BMP-4, 80\% of the mice showed tumor recurrence. In contrast, no recurrence was seen when mice were injected with the VACV expressing BMP-4, possibly due to induction of differentiation in the CSC population and subsequently serving as a better host for VACV infection and oncolysis. This lack of recurrence resulted in superior survival in the BMP-4 VACV treated group. Conclusions: Based on these findings we propose a novel VACV therapy for treating GBM, which would allow tumor specific production of drugs in the future in combination with BMPs which would simultaneously control tumor maintenance and facilitate CSC differentiation, respectively, thereby causing sustained tumor regression without recurrence.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Eggert2005,
  author    = {Eggert, Christian},
  title     = {Untersuchungen zur Biogenese spleißosomaler UsnRNPs und ihrer Bedeutung f{\"u}r die Pathogenese der SMA},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15334},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Die neurodegenerative Krankheit Spinale Muskelatrophie (SMA) wird durch den Mangel an funktionellem Survival Motor Neuron Protein (SMN) verursacht. Eine Funktion von SMN liegt in der Biogenese spleißosomaler UsnRNPs (U-rich small nuclear ribonucleoprotein particles). Diese Arbeit zeigt in einem SMA-Modell in Hela-Zellkultur, dass der SMN-Mangel zu einer reduzierten de novo-Produktion der spleißosomalen UsnRNPs f{\"u}hrt. In einem Zebrafisch-Modell f{\"u}r SMA wurde nachgewiesen, dass die reduzierte UsnRNP-Produktion die Degenerationen von Axonen der Motoneuronen verursacht, einen Ph{\"a}notyp wie er bei SMA auftritt. Damit konnte erstmals eine direkte Verbindung zwischen einer zellul{\"a}ren Funktion von SMN und der Entstehung von SMA hergestellt werden.},
  subject      = {Spinale Muskelatrophie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Ehrig2012,
  author    = {Ehrig, Klaas},
  title     = {Effects of stem cell transcription factor-expressing vaccinia viruses in oncolytic virotherapy},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85139},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Krebserkrankungen bleiben auch im Jahr 2012 die zweith{\"a}uftigste Todesursache in der industralisierten Welt. Zus{\"a}tzlich hat die Etablierung der Krebsstammzell-Hypothese grunds{\"a}tzliche Auswirkungen auf die Erfolgsaussichten konventioneller Krebstherapie, wie Chemotherapie oder Strahlentherapie. Deswegen ist es von gr{\"o}βter Notwendigkeit, dass neue Ans{\"a}tze zur Krebstherapie entwickelt werden, die den Ausgang der Behandlung verbessern und zu weniger Nebenwirkungen f{\"u}hren. Diverse vorklinische Studien haben gezeigt, dass die onkolytische Virotherapie mit Vaccinia-Viren ein potentes und gut tolerierbares neues Werkzeug in der Krebstherapie darstellt. Die Effizienz des Vaccinia-Virus als Therapeutikum allein oder in Kombination mit Strahlen- oder Chemotherapie wird aktuell in mehreren klinischen Studien der Phasen I \& II getestet. Krebsstammzellen und Stammzellen teilen eine Vielzahl von Eigenschaften, wie die F{\"a}higkeit zur Selbst-Erneuerung und Pluripotenz, Stilllegung der Zellproliferation, Resistenz gegen Medikamente oder Bestrahlung, die Expression von diversen Zelloberfl{\"a}chen-molek{\"u}len, die Aktivierung und Hemmung spezifischer Signaltransduktionswege oder die Expression von Stammzell-spezifischen Genen. In dieser Arbeit wurden zwei neue rekombinante Vaccinia-Viren entwickelt, welche die Stammzell-Transkriptionsfaktoren Nanog (GLV-1h205) und Oct4 (GLV-1h208) exprimieren, um tiefere Einblicke in die Rolle dieser Masterregulatoren in der Entstehung von Krebs und ihrem Einfluss auf die onkolytische Virotherapie zu gewinnen. Das Replikationspotential beider Virusst{\"a}mme in menschlichen A549-Zellen und PC-3-Zellen wurde anhand von Replikations-Assays bestimmt. Die Expression der Virus-spezifischen Markergene Ruc-GFP und beta-Galaktosidase, wie auch die Expression der Transkriptionsfaktoren Nanog und Oct4 wurde mit Hilfe von RT-PCR, SDS-PAGE und Western blotting, sowie immunozytochemischen Experimenten nachgewiesen. Des Weiteren wurde der Einfluss einer GLV-1h205-Infektion von A549-Zellen auf den Zellzyklus untersucht. Zudem wurde die Bedeutung der Virus-vermittelten Transkriptionsfaktor-Expression auf die Behandlung von subkutanen A549-Tumoren in einem Xenograft-Modell untersucht. Zur Untersuchung, ob die beobachteten Vorteile in der Behandlung von Lungenadenokarzinomen in M{\"a}usen mit GLV-1h205 Promoter- oder Transkriptionsfaktor-abh{\"a}ngig sind, wurde ein Kontroll-Virus (GLV-1h321) hergestellt, dass f{\"u}r eine unfunktionale Nanog-Mutante codiert. Mittels SDS-PAGE und Western blotting sowie Immunozytochemie wurde die Transgen-Expression analysiert. Ein weitere Aspekt dieser Arbeit war die Fragestellung, ob sich das onkolyische Vaccinia-Virus GLV-1h68 eignet, als neues und weniger invasives Therapeutikum effizient Darmkrebszellen zu infizieren um sich in ihnen zu replizieren und diese anschlieβend zu lysieren. Ein derartiger Therapieansatz w{\"u}rde besonders im Hinblick auf sp{\"a}t diagnostizierten, metastasierenden Darmkrebs eine interessante Behandlungsalternative darstellen. Virale Markergen-expression wurde anhand von Fluoreszenzmikroskopie und FACS-Analyse untersucht. Desweiteren wurde gezeigt, dass die einmalige Administration von GLV-1h68 in mindestens zwei verschiedenen Darmkrebszelllinien zu einer signifikanten Inhibierung des Tumorwachstums in vivo und zu signifikant verbessertem {\"U}berleben f{\"u}hrt. Der Transkriptionsfaktor Klf4 wird zwar stark in ruhenden, ausdifferenzierten Zellen des Darmepithels exprimiert, ist hingegen bei Darmkrebs generell dramatisch herabreguliert. Die Expression von Klf4 f{\"u}hrt zu einem Stop der Zellproliferation und inhibiert die Aktivit{\"a}t des Wnt-Signalweges, indem es im Zellkern an die Transaktivierungsdom{\"a}ne von beta-Catenin bindet. Um die Behandlung von Darmkrebs mit Hilfe onkolytischer Virotherapie weiter zu verbessern, wurden verschiedene Vaccinia-Viren (GLV-1h290-292) erzeugt, die durch verschiedene Promoterst{\"a}rken die Expression unterschiedlicher Mengen an Tumorsuppressor Klf4 vermitteln. Die anf{\"a}ngliche Charakterisierung der drei Virusst{\"a}mme mittels Replikations-Assay, Zytotoxizit{\"a}tstudien, SDS-PAGE und Western blotting, Immunozytochemie sowie die Analyse der Proteinfunktion mit Hilfe von qPCR- und ELISA-Analysen zur Bestimmung von zellul{\"a}rem beta-Catenin, zeigten eine Promoter-abh{\"a}ngige Expression und Wirkung von Klf4. F{\"u}r weitere Analysen wurde das Virus GLV-1h291 gew{\"a}hlt, welches nach Infektion die gr{\"o}βte Menge an Klf4 produziert und zus{\"a}tzlich durch die C-terminale Fusion einer TAT Transduktionsdom{\"a}ne Membran-g{\"a}ngig gemacht (GLV-1h391). Die erhaltenen Befunde machen das Klf4-TAT-kodierende Vaccinia-Virus GLV-1h391 zu einem vielversprechenden Kandidaten f{\"u}r eine Behandlung von Darmkrebs beim Menschen.},
  subject      = {Lungenkrebs},
  language  = {en}
}
@article{EhrigKilincChenetal.2013,
  author    = {Ehrig, Klaas and Kilinc, Mehmet O. and Chen, Nanhai G. and Stritzker, Jochen and Buckel, Lisa and Zhang, Qian and Szalay, Aladar A.},
  title     = {Growth inhibition of different human colorectal cancer xenografts after a single intravenous injection of oncolytic vaccinia virus GLV-1h68},
  series = {Journal of Translational Medicine},
  volume    = {11},
  journal   = {Journal of Translational Medicine},
  number    = {79},
  doi       = {10.1186/1479-5876-11-79},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-129619},
  year      = {2013},
  abstract  = {Background: Despite availability of efficient treatment regimens for early stage colorectal cancer, treatment regimens for late stage colorectal cancer are generally not effective and thus need improvement. Oncolytic virotherapy using replication-competent vaccinia virus (VACV) strains is a promising new strategy for therapy of a variety of human cancers. Methods: Oncolytic efficacy of replication-competent vaccinia virus GLV-1h68 was analyzed in both, cell cultures and subcutaneous xenograft tumor models. Results: In this study we demonstrated for the first time that the replication-competent recombinant VACV GLV-1h68 efficiently infected, replicated in, and subsequently lysed various human colorectal cancer lines (Colo 205, HCT-15, HCT-116, HT-29, and SW-620) derived from patients at all four stages of disease. Additionally, in tumor xenograft models in athymic nude mice, a single injection of intravenously administered GLV-1h68 significantly inhibited tumor growth of two different human colorectal cell line tumors (Duke's type A-stage HCT-116 and Duke's type C-stage SW-620), significantly improving survival compared to untreated mice. Expression of the viral marker gene ruc-gfp allowed for real-time analysis of the virus infection in cell cultures and in mice. GLV-1h68 treatment was well-tolerated in all animals and viral replication was confined to the tumor. GLV-1h68 treatment elicited a significant up-regulation of murine immune-related antigens like IFN-γ, IP-10, MCP-1, MCP-3, MCP-5, RANTES and TNF-γ and a greater infiltration of macrophages and NK cells in tumors as compared to untreated controls. Conclusion: The anti-tumor activity observed against colorectal cancer cells in these studies was a result of direct viral oncolysis by GLV-1h68 and inflammation-mediated innate immune responses. The therapeutic effects occurred in tumors regardless of the stage of disease from which the cells were derived. Thus, the recombinant vaccinia virus GLV-1h68 has the potential to treat colorectal cancers independently of the stage of progression.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Englert2005,
  author    = {Englert, Markus},
  title     = {Mechanismus des pre-tRNA-Spleißens : Struktur und Funktion pflanzlicher und animaler RNA-Ligasen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14420},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Transfer Ribonukleins{\"a}uren werden von der RNA Polymerase III als Vorl{\"a}ufer tRNA transkribiert und durchlaufen eine Vielzahl von Reifungsschritten hin zur maturen tRNA. Neben der Hydrolyse der 5´- und 3´-Flanke durch die RNase P und die tRNase Z, sowie einer Vielzahl von Basenmodifizierungen, wird bei einigen pre-tRNAs das Intron herausgespleißt. Die ersten intronhaltigen tRNA Gene wurden in der Hefe Saccharomyces cerevisiae nachgewiesen und folglich wurde der Spleißmechanismus in diesem Organismus als erstes untersucht. Eine tetramere tRNA Spleißendonuklease spaltet das Intron an den Exongrenzen heraus und eine tRNA Ligase ligiert die entstandenen tRNA H{\"a}lften zur gespleißten tRNA. Einzig in der Hefe und anderen Pilzen konnten bisher die Gene f{\"u}r die tRNA Ligase identifiziert werden. Weder molekularbiologische Ans{\"a}tze - wie z.B. DNA Hybridisierung, Expressions-"Screening" und funktionelle Komplementationsstudien mit einem tRNA Ligase-defizienten Hefestamm - noch Datenbanksuchen mit der bekannten Hefe tRNA Ligasesequenz haben in den vergangenen Jahren zur Identifizierung eines pflanzlichen oder animalen tRNA Ligase Gens gef{\"u}hrt. In dieser Arbeit ist es erstmals gelungen, das tRNA Ligase Protein aus Weizenkeimen bis zur Homogenit{\"a}t zu isolieren und mit Hilfe erhaltener Peptidsequenzen die entsprechenden Kern-codierten Gene in h{\"o}heren und niederer Pflanzen zu identifizieren. Die Ligaseaktivit{\"a}t wurde f{\"u}r das klonierte, rekombinant {\"u}berexprimierte tRNA Ligaseprotein best{\"a}tigt. Weiterhin wurde zum ersten Mal das Ligaseprotein aus Schweineleber aufgereinigt und das zugeh{\"o}rige Gen im humanen Genom identifiziert.},
  subject      = {Pflanzen},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Faul2004,
  author    = {Faul, Thomas},
  title     = {Lokalisation und Dynamik der Replikationsproteine des murinen pr{\"a}-replikativen Komplexes},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-10473},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Lokalisation und der Dynamik der Replikationsproteine des murinen pr{\"a}-replikativen Komplexes in vivo. Dazu wurden die zu untersuchenden Replikationsproteine als EGFP-Fusionsproteine in LTK--Zellen exprimiert und am konfokalen Laserscanning-Mikroskop untersucht. CDC6-EGFP war in der G1-Phase diffus in Zellkern und Cytoplasma verteilt, am G1/S-{\"U}bergang ausschließlich im Zellkern lokalisiert und w{\"a}hrend der S-Phase in zahlreichen Foci im Kern akkumuliert. CDC6-EGFP war mit Replikationsfoci colokalisiert. Endogenes Cdc6p wies dieselbe subzellul{\"a}re Verteilung wie CDC6-EGFP auf. Auch Fusionsproteine des humanen Proteins Cdc6p waren in HEK-293T-Zellen in Replikationsfoci lokalisiert. FRAP-Studien ergaben, dass 80-90 \% von CDC6-EGFP w{\"a}hrend der gesamten S-Phase stabil mit der Replikationsmaschinerie assoziiert sind. Durch Mutation der Phosphoryliersstellen f{\"u}r Cyclin-abh{\"a}ngige Proteinkinasen wurde der Einfluss des Phosphorylierungsstatus der konservierten Serinreste der Cdk-Phosphorylierungsstellen auf die Lokalisation von CDC6-EGFP in vivo untersucht. Alle Mutanten bei denen die Cdk-Serinreste zu nicht-phosphorylierbaren Alaninresten mutiert wurden waren in Replikationsfoci lokalisiert. Dies zeigt, dass die Phosphorylierung dieser Serinreste f{\"u}r die Lokalisation von CDC6-EGFP an Stellen aktiver DNA-Replikation nicht essentiell ist. Durch Mutation der Serinreste zu Phosphatreste-simulierenden Aspartatresten konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung des Serinrests S102 zum Export von CDC6-EGFP aus dem Zellkern f{\"u}hrt. FRAP-Studien ergaben, dass CDC6-EGFP in Replikationsfoci an Serinrest 82 phosphoryliert und an Serinrest 102 dephosphoryliert vorliegt. Mit Immunfluoreszenz-Analysen konnte gezeigt werden, dass Chromatin in Replikationsfoci nicht acetyliert ist. Dies deutet darauf hin, dass die Elongation der DNA-Replikation an nicht-acetyliertem Chromatin erfolgt. Trichostatin A-induzierte Hyperacetylierung des Chromatins hatte keinen Einfluss auf Lokalisation und Mobilit{\"a}t von CDC6-EGFP in Replikationsfoci. Die Mobilit{\"a}t des nucleoplasmatischen CDC6-EGFP-Pools wurde dadurch erh{\"o}ht. In der G1-Phase wurde die Mobilit{\"a}t von CDC6-EGFP durch TSA verringert, woraus gefolgert werden kann, dass der Acetylierungsstatus des Chromatins in der G1-Phase die Mobilit{\"a}t von CDC6-EGFP beeinflusst. ORC1-EGFP war im Zellkern in großen kugelf{\"o}rmigen Strukturen lokalisiert, ORC2-EGFP war diffus in Cytoplasma und Zellkern verteilt. ORC3-EGFP akkumulierte in PML nuclear bodies. W{\"a}hrend ORC4-EGFP und ORC5-EGFP am Centrosom lokalisiert waren konnte ORC6-EGFP in Nucleoli nachgewiesen werden. Die EGFP-Fusionsproteine von Cdc45p, PCNA und DNA-Ligase-I waren im Zellkern lokalisiert, die Nucleoli waren ausgespart. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Untersuchung der Substratspezifit{\"a}t der murinen Cdc7p/Dbf4p-Proteinkinase. Die in Sf9-Zellen exprimierte und aufgereinigte Kinase phosphorylierte Orc2p, Orc6p, Cdc45p und Mcm6p. Mit Phosphopeptidkartierungen konnte gezeigt werden, dass Cdc7p von CylinE/Cdk2 an zwei Stellen und von CyclinA/Cdk2 an einer Stelle in vitro phosphoryliert wird. CDC7-EGFP war in der G1-Phase, am G1/S-{\"U}bergang und in der S-Phase im Kern lokalisiert. Durch FISH-Experimente konnte der genomische Locus des murinen Cdc7-Gens der Bande E von Chromosom 5 zugeordnet werden. Mit Kinase-Assays wurde untersucht, ob die murine Plk1p-Kinase Initiationsfaktoren der DNA-Replikation in vitro phosphoryliert. Die in Sf9-Zellen exprimierte Plk1p phosphorylierte Cdc7p, Orc2p und Orc6p. Cdc7p und Orc6p sind mit Plk1p am Midbody w{\"a}hrend der Telophase in vivo colokalisiert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Messung der Mobilit{\"a}t des murinen Transkriptions-Terminationsfaktors TTF-I mittels FRAP. EGFP-TTF-I und EGFP-NRD waren diffus in den Nucleoli verteilt, einzelne Areale waren ausgespart. EGFP-TTFdeltaN185 war hingegen in distinkten nucleol{\"a}ren Stellen akkumuliert. Mit FRAP-Studien konnte gezeigt werden, dass EGFP-TTFdeltaN185 in einer 10 \%igen immobilen Fraktion vorlag w{\"a}hrend das Gesamtprotein EGFP-TTF-I zu 100\% mobil war. Das Protein TIP5 interagiert mit TTF-I. EGFP-TIP5 war diffus im Nucleoplasma verteilt, die Ncleoli waren ausgespart. Durch Cotransfektionen verschiedener EYFP-TTF-I-Konstrukte mit EGFP-TIP5 konnte gezeigt werden, dass EGFP-TIP5 von EYFP-TTFdeltaN185 nicht in Nucleoli cotransportiert wird. Mit BRET-Studien ergaben, dass Orc6p mit TTF-I in vivo interagiert. Eine Interaktion mit TTFdeltaN185 war nicht nachweisbar.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@article{FetivaLissGertzmannetal.2023,
  author    = {Fetiva, Maria Camila and Liss, Franziska and Gertzmann, D{\"o}rthe and Thomas, Julius and Gantert, Benedikt and Vogl, Magdalena and Sira, Nataliia and Weinstock, Grit and Kneitz, Susanne and Ade, Carsten P. and Gaubatz, Stefan},
  title     = {Oncogenic YAP mediates changes in chromatin accessibility and activity that drive cell cycle gene expression and cell migration},
  series = {Nucleic Acids Research},
  volume    = {51},
  journal   = {Nucleic Acids Research},
  number    = {9},
  doi       = {10.1093/nar/gkad107},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-350218},
  pages     = {4266-4283},
  year      = {2023},
  abstract  = {YAP, the key protein effector of the Hippo pathway, is a transcriptional co-activator that controls the expression of cell cycle genes, promotes cell growth and proliferation and regulates organ size. YAP modulates gene transcription by binding to distal enhancers, but the mechanisms of gene regulation by YAP-bound enhancers remain poorly understood. Here we show that constitutive active YAP5SA leads to widespread changes in chromatin accessibility in untransformed MCF10A cells. Newly accessible regions include YAP-bound enhancers that mediate activation of cycle genes regulated by the Myb-MuvB (MMB) complex. By CRISPR-interference we identify a role for YAP-bound enhancers in phosphorylation of Pol II at Ser5 at MMB-regulated promoters, extending previously published studies that suggested YAP primarily regulates the pause-release step and transcriptional elongation. YAP5SA also leads to less accessible 'closed' chromatin regions, which are not directly YAP-bound but which contain binding motifs for the p53 family of transcription factors. Diminished accessibility at these regions is, at least in part, a consequence of reduced expression and chromatin-binding of the p53 family member ΔNp63 resulting in downregulation of ΔNp63-target genes and promoting YAP-mediated cell migration. In summary, our studies uncover changes in chromatin accessibility and activity that contribute to the oncogenic activities of YAP.},
  language  = {en}
}