@phdthesis{Brand2005,
  author    = {Brand, Normen},
  title     = {Lokalisation, Regulation und Interaktionen muriner DNA-Replikationsproteine},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14057},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Die DNA-Replikation ist ein entscheidendes Ereignis im eukaryontischen Zellzyklus, das die exakte Duplizierung des Genoms gew{\"a}hrleistet und das geordnete Zusammenspiel einer Vielzahl von Proteinen erfordert. Um diese enorme logistische Herausforderung zu bewerkstelligen ist die DNA-Replikation in mehrere Schritte organisiert, die Initiationsprozesse, Elongation und DNA-Reparatur umfassen. Der Initiationsschritt ist gekennzeichnet durch die Chromatin-Assoziation des hexameren ORC (origin recognition complex), der kontrovers diskutierte DNA-Sequenzen als Origins erkennt und bindet sowie als Landeplattform f{\"u}r weitere Proteinkomponenten dient. Der MCM-Komplex aus den sechs Untereinheiten Mcm2 7 komplettiert in Abh{\"a}ngigkeit von Cdc6 und Cdt1 den pr{\"a}-replikativen Komplex (pre-RC) und wird vermutlich nach der Initiation vom Origin entfernt, um als DNA-Helikase f{\"u}r die Entwindung der DNA-Doppelhelix zu sorgen. Dies erm{\"o}glicht den Proteinen der Elongations-Maschinerie DNA an mikroskopisch sichtbaren Orten, die als Replikationsfoci bezeichnet werden, korrekt zu synthetisieren. PCNA (proliferating cell nuclear antigen) ist eine Hauptkomponente der Replikationsfoci und fungiert als Ringklemme, die die DNA-Polymerasen und weitere Replikationsfaktoren an die DNA bindet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Verteilung von ORC- MCM- und PCNA-Proteinen in murinen L-Fibroblasten durch Dual-Color-Immunfluoreszenz- (IF-) Studien untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteine des ORC, des MCM-Komplexes und der Elongations-Maschinerie Positionen f{\"u}r drei verschiedene mechanistische Teil-Prozesse markieren, die an der DNA-Replikation beteiligt sind und an distinkten und r{\"a}umlich getrennten Orten stattfinden: Initiation, Helikase-Aktivit{\"a}t und Elongation. IF-Studien weisen außerdem darauf hin, dass die Acetylierung von Histonen im Zusammenhang mit der Auswahl der Origins steht. Die Assemblierung des pre-RC steht unter der Kontrolle mehrerer Protein-Kinasen. Um zu untersuchen, ob Protein-Komponenten des pre-RC auch vom Hauptregulator von mitotischen Ereignissen, der POLO-like kinase1 (Plk1), phosphoryliert werden, wurden in vitro-Kinase-Assays mit Wildtyp-Plk1 bzw. der Kinase-defizienten Mutante Plk1 (K82M) als Negativ-Kontrolle und potentiellen Targetproteinen durchgef{\"u}hrt. Orc2, Cdc7 und Cdc45 konnten als in vitro-Substrate f{\"u}r die Plk1-Kinase identifiziert werden. Diese Proteine sind außerdem in der Mitose an den Centrosomen, Cdc7 und Cdc45 an den Mikrotubuli und Orc2 und Cdc45 am Midbody lokalisiert. Diese mitotischen Lokalisations-Muster korrelieren mit denen von Plk1. Die Aufkl{\"a}rung von Protein-Protein-Interaktionen ist f{\"u}r das Verst{\"a}ndnis der Vorg{\"a}nge bei der DNA-Replikation essentiell. Mit der BRET (Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer)-Technik konnten direkte Interaktionen zwischen Orc2 \& Orc3, Orc2 \& Orc4, Orc2 \& Orc5, Orc4 \& Orc6, Plk1 \& Orc2 und Plk1 \& Dbf4 gezeigt werden. Zus{\"a}tzlich wurden die Auswirkungen von Histon-Hyperacetylierung und der Depletion von Cyclin-abh{\"a}ngigen Kinasen (CDKs) auf die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 untersucht. Orc2 und Orc3 sind sowohl endogen als auch {\"u}berexprimiert im Zellkern und im Cytoplasma lokalisiert. Um herauszufinden, ob die Kernlokalisation von Orc3 Voraussetzung f{\"u}r die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 ist, wurde ein putatives Kernlokalisationssignal (NLS) in der aminoterminalen Region von Orc3 in einem EGFP-ORC3-Fusionsplasmid deletiert. Die Expression dieser Mutante resultierte in L-Fibroblasten und HEK293T-Zellen in ausschließlich cytoplasmatischer Lokalisation. BRET-Assays, bei denen ORC2-Rluc und die NLS-defiziente EGFP-ORC3-Mutante eingesetzt wurden, lieferten ein BRET ratio, das ununterscheidbar von dem mit Wildtyp EGFP-ORC3 erhaltenen Signal war. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 nicht auf den Zellkern beschr{\"a}nkt ist. Mit der erst k{\"u}rzlich entwickelten BiFC- (bimolecular fluorescence complementation) Technik konnte sowohl die cytoplasmatische als auch die nukle{\"a}re Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 gezeigt werden. FLIP- (fluorescence loss in photobleaching-) Studien mit BiFC-positiven Zellen, die eine ausschließlich nukle{\"a}re Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 aufwiesen, zeigten eine verringerte Mobilit{\"a}t des bin{\"a}ren Komplexes Orc2/Orc3 (t ½ = 10 s) im Vergleich zu EGFP-Fusionsproteinen von Orc2 (t ½ = 8 s) und Orc3 (t ½ = 6 s) auf. Dies deutet darauf hin, dass die Assoziation mit dem Bindungspartner zu einer erh{\"o}hten Chromatin-Bindung von Orc2 und Orc3 f{\"u}hrt. Zus{\"a}tzlich wurden die Auswirkungen von Punktmutationen auf die subzellul{\"a}re Lokalisation und die intranukle{\"a}re Dynamik des in Replikationsfoci lokalisierten Cdc6-EGFP-Fusionsproteins untersucht und die Mobilit{\"a}t von promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML NBs) und der darin enthaltenen Proteinkomponenten analysiert.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Englert2005,
  author    = {Englert, Markus},
  title     = {Mechanismus des pre-tRNA-Spleißens : Struktur und Funktion pflanzlicher und animaler RNA-Ligasen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14420},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Transfer Ribonukleins{\"a}uren werden von der RNA Polymerase III als Vorl{\"a}ufer tRNA transkribiert und durchlaufen eine Vielzahl von Reifungsschritten hin zur maturen tRNA. Neben der Hydrolyse der 5´- und 3´-Flanke durch die RNase P und die tRNase Z, sowie einer Vielzahl von Basenmodifizierungen, wird bei einigen pre-tRNAs das Intron herausgespleißt. Die ersten intronhaltigen tRNA Gene wurden in der Hefe Saccharomyces cerevisiae nachgewiesen und folglich wurde der Spleißmechanismus in diesem Organismus als erstes untersucht. Eine tetramere tRNA Spleißendonuklease spaltet das Intron an den Exongrenzen heraus und eine tRNA Ligase ligiert die entstandenen tRNA H{\"a}lften zur gespleißten tRNA. Einzig in der Hefe und anderen Pilzen konnten bisher die Gene f{\"u}r die tRNA Ligase identifiziert werden. Weder molekularbiologische Ans{\"a}tze - wie z.B. DNA Hybridisierung, Expressions-"Screening" und funktionelle Komplementationsstudien mit einem tRNA Ligase-defizienten Hefestamm - noch Datenbanksuchen mit der bekannten Hefe tRNA Ligasesequenz haben in den vergangenen Jahren zur Identifizierung eines pflanzlichen oder animalen tRNA Ligase Gens gef{\"u}hrt. In dieser Arbeit ist es erstmals gelungen, das tRNA Ligase Protein aus Weizenkeimen bis zur Homogenit{\"a}t zu isolieren und mit Hilfe erhaltener Peptidsequenzen die entsprechenden Kern-codierten Gene in h{\"o}heren und niederer Pflanzen zu identifizieren. Die Ligaseaktivit{\"a}t wurde f{\"u}r das klonierte, rekombinant {\"u}berexprimierte tRNA Ligaseprotein best{\"a}tigt. Weiterhin wurde zum ersten Mal das Ligaseprotein aus Schweineleber aufgereinigt und das zugeh{\"o}rige Gen im humanen Genom identifiziert.},
  subject      = {Pflanzen},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Mueller2006,
  author    = {M{\"u}ller, Nora},
  title     = {Masern Virus Interferenz mit T-Zell-Aktivierung : Einfluß auf Zytoskelettdynamik, Mobilit{\"a}t und Interaktion mit Dendritischen Zellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17953},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Der Kontakt humaner T-Zellen mit dem MV Glykoproteinkomplex interferiert mit der CD3/CD28 stimulierten Aktivierung von PI3/Akt-Kinase Signalwegen. Damit verbunden ist der ineffiziente Transport PH-Dom{\"a}nen-enthaltender Proteine in Membran-rafts, wie der Akt-Kinase und Vav, den Guaninnukleotid-Austauschfaktor von Rho GTPasen. Es konnte gezeigt werden, dass infolge des MV-Kontaktes die CD3/CD28 stimulierte Aktivit{\"a}t der Rho GTPasen Cdc42 und Rac1 inhibiert ist. Dagegen war in MV-behandelten Zellen eine leichte RhoA Aktivierung festzustellen. Rho GTPasen spielen eine kritische Rolle in der Regulation von Zytoskelettorganisation von T-Lymphozyten. {\"U}bereinstimmend damit wurde gezeigt, dass der Kontakt mit MV die CD3/CD28 costimulierte Aktivierung und Polymerisation des F-Aktins inhibiert. Damit verbunden ist die reduzierte F{\"a}higkeit MV-behandelter T-Zellen auf Fibronektin- und mit CD3/CD28 Antik{\"o}rpern-beschichteten Objekttr{\"a}gern zu polarisieren. Die Ausbildung F-Aktin-getriebener morphologischer Ver{\"a}nderungen, wie Filopodien, Lamellipodien und Uropodien, ist drastisch reduziert. Rasterelektronenmikroskopische Auf-nahmen zeigten in nicht-stimulierten und CD3/CD28 costimulierten MV-behandelten T-Zellen einen nahezu kompletten Verlust an Mikrovilli und Lamellipodien. Die Bindung von MV induziert die Dephosphorylierung des F-Aktin-bindenden Proteins Cofilin und der ERM-Proteine. Es konnte demonstriert werden, dass der MV-Kontakt die Ausbildung einer reifen immunologischen Synapse st{\"o}rt. Trotz der morphologischen Ver{\"a}nderungen konjugieren MV-behandelte T-Zellen mit DCs. Die Anzahl MV-behandelter T-Zellen, die mit DCs inter-agieren, ist vergleichbar mit der mock-behandelter T-Zellen. Allerdings zeigt die 3-dimensionale Rekonstruktion der DC/T-Zell-Kontaktzone, dass in MV-behandelten T-Zellen die zentrale Akkumulation und Clusterbildung des CD3-Molek{\"u}ls gest{\"o}rt ist und keine monozentrische Synapse ausbildet wird. Desweiteren erfolgt die Relokalisation des MTOC in T-Zellen in Richtung der DC unvollst{\"a}ndig. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der MV Glykoproteinkomplex mit essentiellen Schritten einer erfolgreichen T-Zell-Aktivierung w{\"a}hrend der APC/T-Zell-Interaktion interferiert.},
  subject      = {Masernvirus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Christenn2005,
  author    = {Christenn, Marcus},
  title     = {Charakterisierung von Somatostatinrezeptor-Subtyp 4 interagierenden Proteinen in der Ratte (Rattus norvegicus)},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14253},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Somatostatin ist ein regulatorisches Peptid, das eine Vielzahl von biologischen Prozessen innerhalb des K{\"o}rpers beeinflußt. Die Wirkung von Somatostatin wird auf zellul{\"a}rer Ebene {\"u}ber eine Familie von f{\"u}nf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren vermittelt, die entweder in G Protein-abh{\"a}ngiger Weise oder vermutlich auch {\"u}ber andere interagierende intrazellul{\"a}re Proteine auf nachgeschaltete Signaltransduktionswege wirken. Der Somatostatinrezeptor Subtyp 4 (SSTR4) wird haupts{\"a}chlich im Gehirn exprimiert und wirkt dort inhibierend auf die exzitatorische Signalweiterleitung. Es sind aber auch stimulierende Effekte des SSTR4 bekannt. Um das subtypspezifische Signalverhalten des SSTR4 weiter zu untersuchen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Proteine gesucht, die intrazellul{\"a}r mit dem SSTR4 interagieren und so seine physiologischen Effekte beeinflussen. In einem ersten Ansatz konnten drei m{\"o}gli-che Interaktionspartner mit Hilfe des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems identifiziert werden, die aber in nachfolgenden Untersuchungen als unpezifisch eingestuft wurden. Mit Hilfe einer Affinit{\"a}tschromatografie wurden dann zwei Proteine identifiziert, die spezifisch mit dem SSTR4 interagieren. Sowohl PSD-95 als auch PSD-93 (Postsynaptic density protein of 95 kDa bzw. 93kDa) wurden mit einem immobilisierten Peptid pr{\"a}zipitiert, das die neun C-terminalen Aminos{\"a}uren des SSTR4 enth{\"a}lt. Die Interaktion des SSTR4 mit PSD 95 wurde im Weiteren n{\"a}her charakterisiert. In einem Bindungsexperiment mit rekombinaten Proteinen konnte gezeigt werden, dass die Interaktion durch die 1. und 2. PDZ-Dom{\"a}ne von PSD-95 vermittelt wird. In humanen embryonalen Nieren-Zellen (HEK293), die den SSTR4 stabil exprimieren, konnte PSD-95 mit dem Rezeptor koimmunpr{\"a}zipitiert werden. Nach Koexpression von PSD-95 und SSTR4 findet man eine partielle Kolokalisierung beider Proteine an der Zellmembran, wobei aber der Großteil des PSD-95 weiterhin eine diffuse zytoplasmatische Verteilung zeigt. Die Interaktion wurde in vivo sowohl immunhistochemisch in kultivierten Hippocampus-Neuronen als auch durch Koimmunpr{\"a}zipitation beider Proteine aus Rattengehirn-Lysaten nachgewiesen. Die Interaktion von PSD-95 mit dem SSTR4 beeinflußt weder die Agonisten-induzierte Internalisierung des Rezeptors in HEK293-Zellen, noch die Kopplung des Rezeptors an einen G-Protein-gekoppelten einw{\"a}rtsgleichrichtenden Kaliumkanal in Oozyten des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis. Durch die Interaktion mit PSD-95 wird der SSTR4 in physikalische N{\"a}he zu bestimmten Zielproteinen gebracht, {\"u}ber die nachfolgend die Somatostatineffekte weitervermittelt werden. So erm{\"o}glicht die Interaktion vermutlich eine Integration des SSTR4 in den postsynaptischen Komplex aus PSD-95 und Glutamatrezeptoren, wo der SSTR4 die bereits beschrieben regulatorischen Effekte auf die Glutamat-vermittelte exzitatorische Signaltransduktion aus{\"u}ben kann.},
  subject      = {Ratte},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hoehn2007,
  author    = {H{\"o}hn, Karsten P.},
  title     = {Funktionsanalyse des murinen Replikationsfaktors ORC2},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23488},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {F{\"u}r Studien an murinen Initiationsfaktoren wurden in dieser Arbeit die Gene mcm2, orc3, cdc6, cdc7, dbf4 sowie das Gen ttf1 in ihrem chromosomalen Kontext mit Hilfe einer genomischen Bibliothek identifiziert und isoliert. Diese Gene sollen als Ausgang f{\"u}r Zielvektoren von transgenen M{\"a}usen dienen oder f{\"u}r chromosomale Lokalisationsstudien verwendet werden. Weiterhin wurde in dieser Arbeit ein Zielvektor f{\"u}r eine orc2-„knock out"-Maus konstruiert. F{\"u}r den „knock out" wurde eine konditionale Strategie mit dem Cre/loxP-System gew{\"a}hlt, wobei Exon 2-5 von loxP-Stellen flankiert sein sollten. Als Ausgangsmaterial stand ein BAC-Vektor mit einem ca. 200 kb großen genomischen Insert, der das orc2-Gen enth{\"a}lt, zur Verf{\"u}gung. Die erforderlichen Subklonierungen wurden durch die Gr{\"o}ße des Inserts bzw. der daraus gewonnenen orc2-Subfragmente und durch die unbekannten Intronsequenzen negativ beeintr{\"a}chtigt, da sich dadurch die Anzahl an verwendbaren Schnittstellen erheblich reduzierte. Nachdem es letztendlich nicht m{\"o}glich war den vorletzten Schritt der Klonierung abzuschließen, wurde das Projekt aus Zeitgr{\"u}nden eingestellt. Ein weiterer Teil diese Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit der Lokalisation des murinen Orc2-Proteins am Centrosom. Bei Studien mit EGFP-gekoppelten murinen Replikationsproteinen zeigten Mcm4p-7p und Orc2p-5p eine Lokalisation am Centrosom. F{\"u}r endogenes Orc2p sollte diese ebenfalls {\"u}berpr{\"u}ft werden. {\"U}ber Immunfluoreszenz-Doppelf{\"a}rbungen mit Antik{\"o}rpern sowohl gegen Orc2p als auch gegen das centrosomale Protein \&\#947;-Tubulin konnte in NIH/3T3-Zellen eine centrosomale Orc2p-Lokalisation best{\"a}tigt werden. Diese trat sowohl in Interphase- als auch in Mitose-Zellen auf. Dar{\"u}ber hinaus wurde von anti-Orc2-Antik{\"o}rpern in Telophase-Zellen eine punktf{\"o}rmige Struktur in der {\"a}quatorialen Ringfurche angef{\"a}rbt. Diese Region entspricht vermutlich der des „midbodys". Zus{\"a}tzlich zu den Immunfluoreszenz-Analysen wurden Immunpr{\"a}zipitationen durchgef{\"u}hrt. Durch diese konnte gezeigt werden, dass Orc2p durch \&\#947;-Tubulin pr{\"a}zipitierbar ist. Solch eine Lokalisation und Interaktion von Orc2p am Centrosom legt eine von der Replikation unabh{\"a}ngige Funktion nahe, wie sie bereits f{\"u}r andere Initiationsfaktoren beschrieben wurde. Um die Funktion von Orc2p genauer untersuchen zu k{\"o}nnen, wurden in einem weiteren Teil dieser Arbeit die Auswirkungen eines Orc2p-"knock downs" auf NIH/3T3-Zellen untersucht. Das dabei verwendete RNAi-System basiert auf einem induzierbaren Expressionssystem, wobei die Orc2-siRNA aus der exprimierten „small hairpin RNA" prozessiert wird. Um eine zeitliche Regulation zu erm{\"o}glichen, wurde das Tet-on-System verwendet. Auf Basis dieser beiden Systeme wurde eine stabile NIH/3T3-TetOn-Orc2siRNA-Zelllinie hergestellt. Zur Vereinfachung zuk{\"u}nftiger Arbeiten mit regulierbaren Expressionssystemen, wurde parallel dazu eine NIH/3T3-Tet-on-Zelllinie, mit Neomycin als Selektionsmarker, hergestellt, in die nur noch der gew{\"u}nschte shRNA-Expressionsvektor transfiziert werden muss. Durch Zugabe von Doxycyclin zum N{\"a}hrmedium wird in den NIH/3T3-TetOn-Orc2siRNA-Zellen die Expression der Orc2-shRNA induziert. Dies l{\"o}st anschließend den RNAi-Mechanismus aus. Es konnte bei diesen Zellen unter Einfluss von Doxycyclin eine deutliche Abnahme der Orc2-Proteinmenge festgestellt werden. Eine Analyse der Proliferationsrate von Zellen unter Doxycyclin-Einfluss ergab schon nach zwei Tagen eine deutliche Verlangsamung der Wachstumsrate. In Dox-behandelten Zellen f{\"u}hrte die Orc2-shRNA-Expression zu einer ver{\"a}nderten Verteilung der Zellen auf die Zellzyklus-Phasen. Es konnte nach sieben Tagen eine Akkumulation der Zellen in der G2/M-Phase, nach 14 Tagen aber in der G1-Phase gezeigt werden. Diese Auswirkungen des Orc2p"knock downs" stehen im Einklang mit dessen Funktion als Initiationsprotein. Weiterhin konnten w{\"a}hrend der Doxycyclin-Behandlung von NIH/3T3-TetOn-Orc2siRNA-Zellen auff{\"a}llig viele multinukle{\"a}re Zellen, bzw. Zellen die {\"u}ber Zytoplasmabr{\"u}cken verbunden waren, beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass bei Zellen mit einer reduzierten Orc2-Proteinmenge die Cytokinese beeintr{\"a}chtigt ist. Des weiteren zeigten sich auch Zellen mit einer ungeraden Anzahl von Kernen sowie Kerne verschiedener Gr{\"o}ße. Eine F{\"a}rbung dieser Zellen mit Propidiumiodid ergab, dass alle Tochterkerne Nukleins{\"a}uren enthalten. Dies deutet darauf hin, dass nicht in allen Zellen die DNA in gleichen Teilen auf die Tochterkerne verteilt wird. Eine ungerade Anzahl an Kernen weist darauf hin, dass diese sich in unterschiedlichen Zellzyklus-Phasen befinden k{\"o}nnen. Da vielkernige Zellen auch bei Beeintr{\"a}chtigung des Spindelfaserapparates auftreten k{\"o}nnen, wurden bei Doxycyclin-behandelten NIH/3T3-TetOn-Orc2siRNA-Zellen Immunfluoreszenzf{\"a}rbungen mit anti-\&\#946;-Tubulin-Antik{\"o}rpern durchgef{\"u}hrt. Es konnte gezeigt werden, dass Zellen, die Orc2-siRNA exprimieren, diffus verteilte, unregelm{\"a}ßig organisierte Mikrotubuli aufweisen. Dies spricht daf{\"u}r, dass Orc2p neben seiner Funktion als Replikationsprotein noch weitere Aufgaben in der Mitose bzw. Cytokinese besitzt.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{JurakBegonja2007,
  author    = {Jurak Begonja, Antonija},
  title     = {NO/cGMP and ROS Pathways in Regulation of Platelet Function and Megakaryocyte Maturation},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21954},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Blutpl{\"a}ttchen spielen unter physiologischen Bedingungen eine wichtige Rolle bei der Erhaltung der H{\"a}mostase. So verhindern sie ein andauerndes Bluten von Wunden, indem sie in Blutgef{\"a}ssen zwischen normalen Zellen des Endothels und besch{\"a}digten Bereichen unterscheiden und sich dort gezielt anheften k{\"o}nnen. Das Zusammenspiel der Pl{\"a}ttchenagonisten und den dazugeh{\"o}rigen Rezeptoren wird durch intrazellul{\"a}re Signalmolek{\"u}le kontrolliert, die die Aktivierung der Blutpl{\"a}ttchen regulieren. {\"A}usserst wichtige intrazellulare Signalmolek{\"u}le stellen dabei die zyklischen Nukleotide cGMP und cAMP dar, die bei der Hemmung der Pl{\"a}ttchen beteiligt sind. Die Bildung von cGMP und cAMP in den Blutpl{\"a}ttchen wird durch die aus dem Endothel freigesetzten Molek{\"u}le NO und Prostacyclin (PGI2) stimuliert, die ihrerseits Blutpl{\"a}ttchen hemmen, indem sie Proteinkinase G (PKG) und Proteinkinase A (PKA) aktivieren. Neuerdings wird vorgeschlagen, dass es sich bei ROS („reactive oxygen species") um einen neuen Modulator bei der Signaltransduktion zwischen verschiedenen Zelltypen handelt. Die hier zusammengefasste Arbeit beschreibt die Rolle der ROS-Produktion bei der Aktivierung von Blutpl{\"a}ttchen, die Beziehung zwischen dem NO/cGMP/PKG I Signalweg und der ROS bzw. MAP-Kinase Signaltransduktion, und die Rolle von zyklischen Nukleotiden bei der Entwicklung von Megakaryozyten und Blutpl{\"a}ttchen. Werden Blutpl{\"a}ttchen durch unterschiedliche Einfl{\"u}sse aktiviert, so produzieren sie {\"u}ber die Aktivierung von NAD(P)H-Oxidase nur intrazellul{\"a}res aber nicht extrazellul{\"a}res ROS. Dabei beinflusst das in den Blutpl{\"a}ttchen produzierte ROS signifikant die Aktivierung von \&\#945;IIb\&\#946;3 Integrin, nicht jedoch die Sekretion von alpha- bzw. dichten Granula oder die Gestalt der Blutpl{\"a}ttchen. Die Thrombin-induzierte Integrin \&\#945;IIb\&\#946;3-Aktivierung ist nach Behandlung der Blutpl{\"a}ttchen mit Hemmstoffen der NAD(P)H-Oxidase oder Superoxid-F{\"a}ngern signifikant reduziert. Diese Inhibitoren reduzieren auch die Aggregation der Blutpl{\"a}ttchen bzw. die Thrombusbildung auf Kollagen, wobei diese Effekte unabh{\"a}ngig vom NO/cGMP Signalweg vermittelt werden. Sowohl ADP, das von dichten Granula der Blutpl{\"a}ttchen sezerniert wird und zur Aktivierung von P2Y12-Rezeptoren f{\"u}hrt, als auch die Freigabe von Thromboxan A2 stellen wichtige, vorgeschaltete Vermittler bei der p38 MAP Kinase-Aktivierung durch Thrombin dar. Jedoch spielt die p38 MAP-Kinase-Aktivierung keine signifikante Rolle bei der Thrombin-induzierten Kalzium-Mobilisierung, P-Selektin Exprimierung, \&\#945;IIb\&\#946;3 Integrin Aktivierung oder Aggregation der Blutpl{\"a}ttchen. Abschliessend kann festgestellt werden, dass sich die Aktivierung der PKG insgesamt klar hemmend auf die p38 and ERK MAP-Kinasen in menschlichen Blutpl{\"a}ttchen auswirkt. Desweiteren zeigt diese Studie, dass zyklische Nukleotide nicht nur die Blutpl{\"a}ttchen hemmen, sondern auch einen Einfluss auf die Entwicklung der Megakaryozyten und Blutpl{\"a}ttchen haben, aber auf unterschiedliche Weise. cAMP ist an der Differenzierung von embryonalen h{\"a}matopoietischen Zellen zu Megakaryozyten beteiligt, wobei cGMP keine Rolle bei diesem Prozess spielt. W{\"a}hrend PKA in embryonalen Zellen schon vertreten ist, steigt beim Reifungsprozess der Megakaryozyten die Expression von Proteinen, die bei der cGMP Signalverbreitung („soluble guanylyl cyclase", sGC; PKG) mitwirken, stetig an. In der letzten Phase der Reifung von Megakaryozyten, die durch die Freisetzung der Blutpl{\"a}ttchen charakterisiert ist, zeigen cGMP und cAMP leicht divergierende Effekte: cGMP verst{\"a}rkt die Bildung von Blutpl{\"a}ttchen, w{\"a}hrend cAMP dieselbe reduziert. Dies deutet auf einen fein abgestimmten Prozess hin, abh{\"a}ngig von einem Stimulus, der von den benachbarten Zellen des Sinusoid-Endothels stammen k{\"o}nnte. Die Ergebnisse dieser Dissertation tragen zu einen besseren Verst{\"a}ndnis der Regulation von Blutpl{\"a}ttchen sowie der m{\"o}glichen molekularen Mechanismen bei, die eine Rolle bei der Reifung von Megakaryozyten im vaskularen Mikroumfeld des Knochenmarks innehaben.},
  subject      = {Thrombozyt},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Schust2006,
  author    = {Schust, Jochen},
  title     = {Neue Ans{\"a}tze zur Identifizierung niedermolekularer Inhibitoren der STAT3-Aktivierung und -Homodimerisierung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19952},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Die STATs (signal transducers and activators of transcription) sind eine Familie latent zytoplasmatischer Transkriptionsfaktoren, die Signale von der Zellmembran in den Zellkern weiterleiten. Ein Mitglied der Proteinfamilie, STAT3, ist aufgrund {\"u}berm{\"a}ßiger Tyrosinkinase-Aktivit{\"a}t in einer breiten Vielzahl von Krebszelllinien und menschlichen Tumoren konstitutiv-aktiv. Um kleine organische Molek{\"u}le zu identifizieren, die die Funktion der SH2-Dom{\"a}ne von STAT3 blockieren und dadurch die Aktivit{\"a}t und die Dimerisierung des Proteins inhibieren, wurde ein Hochdurchsatz-Verfahren entwickelt, welches auf Fluoreszenzpolarisation beruht. Das Prinzip dieses Verfahrens war die Bindung eines Fluorescein-markierten Phosphotyrosin-Peptids, welches von gp130, einer Untereinheit des Interleukin-6-Rezeptors, abgeleitet war, an nicht phosphoryliertes STAT3-Protein. Der Kd Wert dieser Bindung betrug 150 nM und der Assay war stabil im Hinblick auf die Salzkonzentration, der Konzentration an Dimethylsulfoxid und der Zeit. Der Assay wurde auf ein 384-Lochplattenformat angepasst und wies einen Z'-Wert von 0,87 auf. Das Fluorscein-markierte Phosphotyrosin-Peptid band spezifisch an die SH2-Dom{\"a}ne von STAT3 und die Bindung konnte durch Phosphotyrosin-Peptide unterschiedlich stark inhibiert werden. Die Hochdurchsatz-Analyse mehrerer Substanzbibliotheken f{\"u}hrte schließlich zur Identifikation eines spezifischen STAT3-Inhibitors, Stattic (STAT three inhibitory compound). Stattic ist das erste nicht-peptidische kleine Molek{\"u}l, welches selektiv die Funktion der STAT3-SH2-Dom{\"a}ne beeintr{\"a}chtigte. Dabei spielte der Aktivierungszustand von STAT3 in vitro keine Rolle. Die gleichzeitige Inkubation mit Stattic f{\"u}hrte im Fluoreszenzpolarisations-Assay zur Inhibition der Bindung des Fluorescein-markierten Phosphotyrosin-Peptids an die SH2-Dom{\"a}ne von STAT3. Diese antagonistische Reaktion stellte sich als stark temperaturabh{\"a}ngig heraus und hatte in vitro bei der physiologisch relevanten Temperatur von 37°C nach 60 Minuten einen IC50 Wert von 5,1 µM. Zusammen mit einer Abh{\"a}ngigkeit von der Zeit wiesen die Ergebnisse auf eine irreversibel ablaufende Reaktion unter Kn{\"u}pfung einer kovalenten Bindung zwischen Stattic und STAT3 hin. Die Inhibition war spezifisch gegen{\"u}ber der Bindung verschiedener Fluorescein-markierten Phosphotyrosin-Peptide an die jeweiligen Proteine STAT1, STAT5b und Lck und Stattic hatte ebenfalls nur einen sehr geringen Effekt auf die Proteindimerisierung von c-Myc/Max und Jun/Jun. Die genauere Betrachtung der Kinetik der antagonistischen Reaktion zeigte eine signifikante Verlangsamung der Reaktionsgeschwindigkeit beim Vergleich zwischen STAT3 und STAT1 bzw. STAT3 und STAT5b. Die Inhibierung der Bindung des entsprechenden Fluorescein-markierten Phosphotyrosin-Peptids an das Protein Lck durch Stattic war hingegen nicht zeitabh{\"a}ngig. Diese Versuche zeigten eine deutliche Pr{\"a}ferenz der Bindung von Stattic an das Protein STAT3. Die Verdr{\"a}ngung des Fluorescein-markierten Phosphoytrosin-Peptids von der STAT3-SH2-Dom{\"a}ne durch Stattic verlief kompetitiv zur Inhibition mit einem Phophotyrosin-Peptid, welches an die SH2-Dom{\"a}ne von STAT3 bindet. In Verbindung mit den vorherigen Experimenten wies dies auf eine kovalente Bindung von Stattic innerhalb des STAT3-Proteins hin. Eine abschließende Struktur-Wirkungs-Beziehung in vitro zeigte die Notwendigkeit sowohl von der Nitrogruppe als auch von der Doppelbindung der Vinylsulfongruppe in Stattic f{\"u}r die Bindung an STAT3 und untermauerte die These, dass Stattic kovalent innerhalb des STAT3-Proteins bindet. In zellbiologischen Systemen wurde die Wirksamkeit von Stattic anhand verschiedener molekularbiologischer Assays best{\"a}tigt. Stattic inhibierte selektiv die Tyrosinphosphorylierung von STAT3 in HepG2 Zellen, in NIH3T3/v-Src Zellen und in den Brustkrebszelllinien MDA-MB-231 und MDA-MB-435S. Aber auch bereits phosphorylierte STAT3-Proteine wurden durch Stattic in vitro an der Homodimerisierung gehindert, was in einer EMSA-Analyse gezeigt wurde. Somit inhibierte Stattic in vitro selektiv die Signalkette von STAT3 unabh{\"a}ngig von dessen Aktivierungszustand. Andere Signalketten oder die Funktion der in der Signalkette {\"u}ber STAT3 liegenden Tyrosinkinasen wurden in Zellen nicht beeinflusst. Im Folgenden konnte demonstriert werden, dass Stattic als direkter STAT3-Inhibitor dessen Lokalisierung in den Zellkern inhibierte, nicht jedoch die Lokalisierung des Gegenspielers STAT1. Weiterhin reduzierte der Einsatz von Stattic selektiv das von v-Src in NIH3T3 Zellen induzierte und von STAT3-abh{\"a}ngige Wachstum von Kolonien in Weichagar. Dass Stattic schließlich selektiv die Apoptoserate in Zellen mit konstitutiver STAT3-Aktivt{\"a}t erh{\"o}hte, best{\"a}tigte die bisherigen Daten. Mit Stattic konnte daher ein neues biologisches Werkzeug generiert werden, um selektiv STAT3 in Zelllinien oder Tumoren in Tiermodellen auszuschalten, die eine konstitutive STAT3-Aktivit{\"a}t aufweisen.},
  subject      = {STAT},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kuespert2014,
  author    = {K{\"u}spert, Maritta},
  title     = {Untersuchung zur Rolle des La-verwandten Proteins LARP4B im mRNA-Metabolismus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-107490},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Eukaryotische messenger-RNAs (mRNAs) m{\"u}ssen diverse Prozessierungsreaktionen durchlaufen, bevor sie der Translationsmaschinerie als Template f{\"u}r die Proteinbiosynthese dienen k{\"o}nnen. Diese Reaktionen beginnen bereits kotranskriptionell und schließen das Capping, das Spleißen und die Polyadenylierung ein. Erst nach dem die Prozessierung abschlossen ist, kann die reife mRNA ins Zytoplasma transportiert und translatiert werden. mRNAs interagieren in jeder Phase ihres Metabolismus mit verschiedenen trans-agierenden Faktoren und bilden mRNA-Ribonukleoproteinkomplexe (mRNPs) aus. Dieser „mRNP-Code" bestimmt das Schicksal jeder mRNA und reguliert dadurch die Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene. F{\"u}r das La-verwandte Protein LARP4B (La-related protein 4B) wurde k{\"u}rzlich eine direkte Interaktion mit den Translationsfaktoren PABPC1 (poly(A) binding protein, cytoplasmic 1) und RACK1 (receptor for activated C kinase) gefunden. Diese Befunde sowie die Assoziation mit aktiv translatierenden Ribosomen l{\"a}sst vermuten, dass LARP4B zum mRNP-Code beitr{\"a}gt. Die Dom{\"a}nenstruktur des Proteins legt dar{\"u}ber hinaus nahe, dass LARP4B direkt mRNAs bindet. Um einen Einblick in die Funktion von LARP4B und seiner in vivo RNA-Bindungspartner zu erhalten, wurde die mRNA-Assoziation transkriptomweit mit Hilfe von PAR-CLIP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation)-Experimenten bestimmt. Diese Daten zeigten, dass LARP4B ein spezifisches Set an zellul{\"a}ren mRNAs {\"u}ber Sequenzbereiche in deren 3'-untranslatierten Regionen bindet. Die bioinformatische Auswertung der PAR-CLIP-Daten identifizierte ein LARP4B-Bindemotiv, welches durch in vitro Bindungsstudien validiert werden konnte. Dar{\"u}ber hinaus belegten pSILAC (pulsed stable isotope labeling with amino acids in cell culture)-Experimente und eine transkriptomweite Analyse der mRNA-Level, dass LARP4B die Expression der Ziel-mRNAs beeinflusst, indem es die Stabilit{\"a}t der gebundenen Transkripte erh{\"o}ht. LARP4B konnte somit als positiver Faktor der eukaryotischen Genexpression identifiziert werden.},
  subject      = {Messenger-RNS},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Stuermer2004,
  author    = {St{\"u}rmer, Andrea},
  title     = {Interaktionen und Lokalisationen der Replikationsproteine der Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9563},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Die Initiation der DNA-Replikation in Eukaryonten ist ein hochkonservierter Prozess, der in drei Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Schritt bindet der „origin recognition complex" (ORC) an Replikationsorigins innerhalb chromosomaler DNA, wodurch eine Assemblierung des pr{\"a}replikativen Komplexes an diesen Startpunkten ausgel{\"o}st wird. An den ORC lagern sich anschließend die Proteine CDC6 und RLF-B/CDT1 an, die beide schließlich f{\"u}r die Rekrutierung des heterohexameren MCM-Komplexes verantwortlich sind. Durch die Aktivit{\"a}t der Kinase CDC7/DBF4 wird der Origin f{\"u}r den Start der DNA-Replikation lizenziert, sobald die finale Anlagerung des Initiationsfaktors CDC45 den pr{\"a}replikativen Komplex vervollst{\"a}ndigt hat. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das komplexe Netzwerk von Protein-Protein-Interaktionen zwischen den verschiedenen Initiationsfaktoren durch FRET-Studien aufzukl{\"a}ren. Es konnten Interaktionen zwischen MCM5 und MCM3, MCM5 und MCM7, ORC5 und MCM7, sowie CDT1 und MCM6 in vivo nachgewiesen werden. Die vorliegende Arbeit hatte weiterhin die Untersuchung der intrazellul{\"a}ren Lokalisation der sechs murinen MCM-Proteine in Fibroblasten-Zellen der Maus zum Ziel.Lokalisationsstudien der EGFP-gekoppelten MCM-Proteine zeigten, dass die Proteine EGFP-MCM4, MCM4-EGFP, MCM4-NLS-EGFP, EGFP-MCM5, MCM5-EGFP, MCM5-NLS-EGFP, und EGFP-MCM7 u.a. am Centrosom lokalisiert sind. Durch Immunfluoreszenz-F{\"a}rbung mit Antik{\"o}rpern gegen eine konservierte Dom{\"a}ne aller sechs MCM-Untereinheiten sowie mit spezifischen MCM3- und MCM6-Antik{\"o}rpern konnte eine centrosomale Lokalisation auch f{\"u}r die endogenen Proteine nachgewiesen werden. Zus{\"a}tzlich zu den Lokalisationsanalysen konnte {\"u}ber Immunpr{\"a}zipitationsstudien gezeigt werden, dass MCM3 und MCM6 mit dem centrosomalen Protein g-Tubulin pr{\"a}zipitierbar sind. Die Tatsache, dass alle Untereinheiten des MCM-Komplexes mit dem Centrosom assoziiert sind, deutet darauf hin, dass die MCM-Proteine am Centrosom als Multiproteinkomplex gebunden sind. Da MCM3 und MCM6 auch in allen Mitose-Stadien an das Centrosom gebunden sind, kann von einer funktionellen Aufgabe dieser Proteine w{\"a}hrend der Zellteilung ausgegangen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit sollte die Funktion der MCM-Proteine am Centrosom durch „knock-down" des Proteins MCM3 mittels RNA-Interferenz-Studien untersucht werden. Ziel war, ein induzierbares MCM3-siRNA-exprimierendes System zu etablieren. Das gezielte An- und Abschalten der MCM3siRNA-Transkription sollte durch das TetOn-System erm{\"o}glicht werden. Bei diesem System wird durch Zugabe von Doxycyclin die Transkription aktiviert, bei Abwesenheit von Doxycyclin wird sie abgeschaltet. Auf dieser Basis wurde der Einfluss von Doxycyclin auf das Wachstumsverhalten der MCM3siRNA-exprimierenden Zelllinie untersucht. Im Vergleich zu NIH/3T3-Zellen und NIH/3T3-TetOn-Zellen konnte eine deutlich reduzierte Proliferation bei Behandlung der Zellen mit Doxycyclin beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine durch Produktion von MCM3siRNA verursachte St{\"o}rung des Zellwachstums hin. Zus{\"a}tzlich beeinflusst die durch Doxycyclin induzierte Synthese von MCM3siRNA die Zellzyklusverteilung. So befinden sich nach Doxycyclinbehandlung mehr Zellen in der G2/M-Phase als in unbehandelten, asynchronen NIH/3T3-Zellen. Die MCM3-Proteinmenge wurde nach 19 Tagen Doxycyclinbehandlung fast vollst{\"a}ndig durch die produzierte MCM3siRNA herunterreguliert. Um einen m{\"o}glichen Einfluss der MCM3siRNA auf andere MCM-Proteine zu untersuchen, wurde der Protein-Level von MCM6 analysiert. Dabei wurde eine vermehrte MCM6-Expression nachgewiesen. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass durch Bildung von MCM3siRNA der Expressions-Level von MCM6 beeinflusst wird. Auff{\"a}llig h{\"a}ufig lagen in MCM3-„knock-down"-Zellen mehrere Zellkerne vor. Neben Zellen mit zwei Zellkernen finden sich auch Zellen mit einer ungeraden Anzahl an Zellkernen. Demnach durchlaufen die Zellkerne in einer Zelle unterschiedliche Zellzyklusstadien. Die Ph{\"a}notypen, die nach Transkription der MCM3siRNA beobachtet wurden, sind komplex und zeigen Defekte in zahlreichen Mitose-Stadien. Das Auftreten multinukle{\"a}rer Zellen ist auf eine fehlende Cytokinese zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Die Mikrotubuli waren in den MCM3-„knock-down"-Zellen nur unzureichend organisiert, wobei sie kaum mit der Zellperipherie verankert waren. Diese Resultate weisen darauf hin, dass die MCM-Proteine neben ihrer essentiellen Rolle in der Ausbildung des pr{\"a}replikativen Komplexes eine zus{\"a}tzliche Funktion in der Mitose aus{\"u}ben.},
  subject      = {Replikation},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Syagaylo2002,
  author    = {Syagaylo, Yana},
  title     = {Strukturelle und funktionelle Untersuchung der Promotorregionen der menschlichen PAX3-, PAX6- und PAX7-Gene: Bedeutung von Polymorphismen f{\"u}r schizophrene Erkrankungen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5459},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {Das Ziel dieser Arbeit war die Kl{\"a}rung der ph{\"a}notypischen Konsequenzen struktureller Variationen in den regulatorischen Regionen einiger f{\"u}r psychische Erkrankungen potentiell relevanter Entwicklungsgene. Die Pax-Gene sind Mitglieder einer Familie der Transkriptionsfaktoren, die sowohl mehrere Schritte in der Embryogenese als auch Aufrechterhaltung des Differenzierungszustandes der Zellen einiger adulten Gewebe kontrollieren. Im Rahmen dieser Fragestellung wurden die Promotorregionen der menschlichen PAX3-, PAX6- und PAX7-Gene charakterisiert. Weiterhin wurden funktionelle Folgen der mit diesen Promotoren assoziierten Repeat-Polymorphismen auf die Expression dieser Gene untersucht. Schliesslich wurde die Relevanz f{\"u}r die psychischen Erkrankungen wie die Schizophrenie getestet.},
  subject      = {Schizophrenie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Jehle2002,
  author    = {Jehle, Margot},
  title     = {Interaktionen der Replikationsproteine der Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-4068},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {Zusammenfassung Die Initiation der DNA-Replikation in Eukaryonten ist ein hochkonservierter Prozeß, der in drei Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Schritt bindet der ORC-Komplex an Replikationsorigins in chromosomaler DNA, wodurch die Assemblierung des pr{\"a}replikativen Komplexes an den Origins ausgel{\"o}st wird. Anschließend lagern sich CDC6- und RLF-B/CDT1-Protein an den ORC an, die beide schließlich f{\"u}r die Rekrutierung des heterohexameren MCM-Komplexes verantwortlich sind. Durch die Aktivit{\"a}t der CDC7/DBF4-Kinase wird der Origin lizensiert, nachdem der letzte Initiationsfaktor CDC45 die Assemblierung des pre-RC vervollst{\"a}ndigt hat. Ein Ziel dieser Arbeit war es, das komplexe Netzwerk von Protein-Proteininteraktionen zwischen den verschiedenen Initiationsproteinen durch Two-Hybrid-Studien aufzukl{\"a}ren. Dazu wurden die cDNAs aller bisher in Mus musculus charakterisierten Initiationsproteine, wie ORC1-6, CDC6, MCM2-7, CDC7, DBF4, CDC45, der "polo like kinase" CDC5/PLK, des DNA-Einzelstrang-bindenden Replikationsproteins RPA mit seinen Untereinheiten RPA14, RPA32, RPA70 und schließlich des heterodimeren Proteins Ku mit den Untereinheiten Ku80 und Ku70 jeweils in zwei verschiedene Hefevektoren inseriert. Zum einen handelt es sich dabei um den K{\"o}dervektor pEG202 und andererseits um den Beutevektor pJG4-5 des Two-Hybrid-Systems. Dabei wurden alle m{\"o}glichen K{\"o}der-/Beute-Proteinkonstellationen auf eine Aktivierung des Reportergens LacZ hin untersucht und so zahlreiche Protein-Proteininteraktionen identifiziert. Einige der hier beschriebenen Wechselwirkungen waren auch in anderen Spezies identifiziert worden und konnten somit f{\"u}r Maus best{\"a}tigt werden. Im Rahmen dieser Two-Hybrid-Untersuchungen wurden allerdings auch erstmals neue Protein-Proteininteraktionen nachgewiesen, wie beispielsweise CDC5/PLK mit MCM2 oder Ku80 mit ORC1, -2, -4 und -5. Sowohl von CDC5/PLK- als auch von Ku80-Protein wurde vermutet, daß sie im Zusammenhang mit der Initiation der DNA-Replikation stehen k{\"o}nnten. Die Two-Hybrid-Interaktionen hier vermittelten neue Indizien, die diese Vermutung untermauern. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden f{\"u}nf CDC7-Deletionsmutanten konstruiert, um die Interaktionsdom{\"a}nen des CDC7-Proteins mit anderen Proteinen im Rahmen des Two-Hybrid-Systems bestimmen zu k{\"o}nnen. Die Mutanten wurden dazu jeweils in den pEG202- und den pJG4-5-Hefevektor inseriert. Die Hefe-Studien wurden nur mit denjenigen Proteinen durchgef{\"u}hrt, mit denen das CDC7-Wildtyp-Protein im ersten Teil der Arbeit positive Interaktionen eingegangen war. Auffallend bei den Untersuchungen mit den Deletionsmutanten war, daß sie in der K{\"o}derposition mehr Interaktionen eingingen als in der Beuteposition. Nur die C1-, C2- und N2-Mutante gingen noch Wechselwirkungen mit einigen Initiatorproteinen ein, w{\"a}hrend weder die C2- noch die N1-Mutante dazu in der Lage waren. Als Resultat dieser CDC7-Interaktionsdom{\"a}nenkartierung stellte sich das Kinase-Insert II als ein f{\"u}r die Mehrheit der Protein-Proteininteraktionen des CDC7-Proteins zentrales Element heraus. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war es, paradigmatisch einzelne Protein-Proteininteraktionen, die in den Two-Hybrid-Studien aufgefunden worden waren, mittels einer zweiten Methode zu analysieren. Zus{\"a}tzlich sollte die Zellzyklusabh{\"a}ngigkeit einzelner Interaktionen der an der Initiation der DNA-Replikation beteiligten Proteine untersucht werden. Dazu wurden Immunpr{\"a}zipitationsversuche mit synchronisierten FM3A-Mauszellen durchgef{\"u}hrt. Die in Suspensionskultur kultivierten Mauszellen wurden mit Mevastatin in fr{\"u}her G1-, mit Mimosin in G1/S-, mit Hydroxyharnstoff in der S- und mit Nocodazol in der Mitose arretiert. Ausgangsbasis f{\"u}r die weiteren IP-Experimente waren aus den FM3A-Zellen pr{\"a}parierte Kernextrakte. Folgende Antik{\"o}rper wurden zur Inkubation mit Kernextrakten verwendet: gegen ORC1-, ORC2-, ORC3-, ORC5-, ORC6-, CDC6-, MCM2-, MCM7- und DBF4 gerichtete Antik{\"o}rper. Mit allen genannten Antik{\"o}rpern konnten Immunpr{\"a}zipitationen zwischen einzelnen ORC-Untereinheiten, CDC6- und ORC-Proteinen, einzelnen MCM-Untereinheiten und ORC2- bzw. CDC6-Protein und zwischen der regulatorischen Untereinheit der DDK-Kinase DBF4 und einigen ORC-Untereinheiten nachgewiesen werden. Ein großer Teil der IPs trat in zellzyklusunabh{\"a}ngiger Weise auf, w{\"a}hrend ein kleinerer Anteil Zellzyklusabh{\"a}ngigkeit zeigte, wie beispielsweise die CDC6-ORC2-Wechselwirkung, die nur von der fr{\"u}hen bis zur sp{\"a}ten G1-Phase beobachtet werden konnte. Im vierten und letzten Abschnitt dieser Arbeit ging es um die Identifizierung eines Maus-EST-Klones f{\"u}r das CDT1-Gen. Das CDT1-Protein ist essentieller Bestandteil der Initiation der DNA-Replikation und sorgt gemeinsam mit dem CDC6-Protein f{\"u}r die Rekrutierung des MCM-Komplexes an den Origin, wodurch der pr{\"a}replikative Komplex f{\"u}r die anstehende Initiation der DNA-Replikation lizensiert wird. Der vollst{\"a}ndige Maus-EST-Klon wurde mittels einer Sonde durch radioaktive Hybridisierung einer cDNA-Bibliothek von 9 Tage alten Mausembryonen identifiziert und charakterisiert. Die vollst{\"a}ndige Sequenz von MmCDT1 ergab einen offenen Leserahmen von 1673bp und kodiert f{\"u}r ein Protein mit 557 Aminos{\"a}uren und einer Molmasse von 61.5 kDa.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Faul2004,
  author    = {Faul, Thomas},
  title     = {Lokalisation und Dynamik der Replikationsproteine des murinen pr{\"a}-replikativen Komplexes},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-10473},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Lokalisation und der Dynamik der Replikationsproteine des murinen pr{\"a}-replikativen Komplexes in vivo. Dazu wurden die zu untersuchenden Replikationsproteine als EGFP-Fusionsproteine in LTK--Zellen exprimiert und am konfokalen Laserscanning-Mikroskop untersucht. CDC6-EGFP war in der G1-Phase diffus in Zellkern und Cytoplasma verteilt, am G1/S-{\"U}bergang ausschließlich im Zellkern lokalisiert und w{\"a}hrend der S-Phase in zahlreichen Foci im Kern akkumuliert. CDC6-EGFP war mit Replikationsfoci colokalisiert. Endogenes Cdc6p wies dieselbe subzellul{\"a}re Verteilung wie CDC6-EGFP auf. Auch Fusionsproteine des humanen Proteins Cdc6p waren in HEK-293T-Zellen in Replikationsfoci lokalisiert. FRAP-Studien ergaben, dass 80-90 \% von CDC6-EGFP w{\"a}hrend der gesamten S-Phase stabil mit der Replikationsmaschinerie assoziiert sind. Durch Mutation der Phosphoryliersstellen f{\"u}r Cyclin-abh{\"a}ngige Proteinkinasen wurde der Einfluss des Phosphorylierungsstatus der konservierten Serinreste der Cdk-Phosphorylierungsstellen auf die Lokalisation von CDC6-EGFP in vivo untersucht. Alle Mutanten bei denen die Cdk-Serinreste zu nicht-phosphorylierbaren Alaninresten mutiert wurden waren in Replikationsfoci lokalisiert. Dies zeigt, dass die Phosphorylierung dieser Serinreste f{\"u}r die Lokalisation von CDC6-EGFP an Stellen aktiver DNA-Replikation nicht essentiell ist. Durch Mutation der Serinreste zu Phosphatreste-simulierenden Aspartatresten konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung des Serinrests S102 zum Export von CDC6-EGFP aus dem Zellkern f{\"u}hrt. FRAP-Studien ergaben, dass CDC6-EGFP in Replikationsfoci an Serinrest 82 phosphoryliert und an Serinrest 102 dephosphoryliert vorliegt. Mit Immunfluoreszenz-Analysen konnte gezeigt werden, dass Chromatin in Replikationsfoci nicht acetyliert ist. Dies deutet darauf hin, dass die Elongation der DNA-Replikation an nicht-acetyliertem Chromatin erfolgt. Trichostatin A-induzierte Hyperacetylierung des Chromatins hatte keinen Einfluss auf Lokalisation und Mobilit{\"a}t von CDC6-EGFP in Replikationsfoci. Die Mobilit{\"a}t des nucleoplasmatischen CDC6-EGFP-Pools wurde dadurch erh{\"o}ht. In der G1-Phase wurde die Mobilit{\"a}t von CDC6-EGFP durch TSA verringert, woraus gefolgert werden kann, dass der Acetylierungsstatus des Chromatins in der G1-Phase die Mobilit{\"a}t von CDC6-EGFP beeinflusst. ORC1-EGFP war im Zellkern in großen kugelf{\"o}rmigen Strukturen lokalisiert, ORC2-EGFP war diffus in Cytoplasma und Zellkern verteilt. ORC3-EGFP akkumulierte in PML nuclear bodies. W{\"a}hrend ORC4-EGFP und ORC5-EGFP am Centrosom lokalisiert waren konnte ORC6-EGFP in Nucleoli nachgewiesen werden. Die EGFP-Fusionsproteine von Cdc45p, PCNA und DNA-Ligase-I waren im Zellkern lokalisiert, die Nucleoli waren ausgespart. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Untersuchung der Substratspezifit{\"a}t der murinen Cdc7p/Dbf4p-Proteinkinase. Die in Sf9-Zellen exprimierte und aufgereinigte Kinase phosphorylierte Orc2p, Orc6p, Cdc45p und Mcm6p. Mit Phosphopeptidkartierungen konnte gezeigt werden, dass Cdc7p von CylinE/Cdk2 an zwei Stellen und von CyclinA/Cdk2 an einer Stelle in vitro phosphoryliert wird. CDC7-EGFP war in der G1-Phase, am G1/S-{\"U}bergang und in der S-Phase im Kern lokalisiert. Durch FISH-Experimente konnte der genomische Locus des murinen Cdc7-Gens der Bande E von Chromosom 5 zugeordnet werden. Mit Kinase-Assays wurde untersucht, ob die murine Plk1p-Kinase Initiationsfaktoren der DNA-Replikation in vitro phosphoryliert. Die in Sf9-Zellen exprimierte Plk1p phosphorylierte Cdc7p, Orc2p und Orc6p. Cdc7p und Orc6p sind mit Plk1p am Midbody w{\"a}hrend der Telophase in vivo colokalisiert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Messung der Mobilit{\"a}t des murinen Transkriptions-Terminationsfaktors TTF-I mittels FRAP. EGFP-TTF-I und EGFP-NRD waren diffus in den Nucleoli verteilt, einzelne Areale waren ausgespart. EGFP-TTFdeltaN185 war hingegen in distinkten nucleol{\"a}ren Stellen akkumuliert. Mit FRAP-Studien konnte gezeigt werden, dass EGFP-TTFdeltaN185 in einer 10 \%igen immobilen Fraktion vorlag w{\"a}hrend das Gesamtprotein EGFP-TTF-I zu 100\% mobil war. Das Protein TIP5 interagiert mit TTF-I. EGFP-TIP5 war diffus im Nucleoplasma verteilt, die Ncleoli waren ausgespart. Durch Cotransfektionen verschiedener EYFP-TTF-I-Konstrukte mit EGFP-TIP5 konnte gezeigt werden, dass EGFP-TIP5 von EYFP-TTFdeltaN185 nicht in Nucleoli cotransportiert wird. Mit BRET-Studien ergaben, dass Orc6p mit TTF-I in vivo interagiert. Eine Interaktion mit TTFdeltaN185 war nicht nachweisbar.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Philipp2013,
  author    = {Philipp, Carolin},
  title     = {Talglipide als Wirtsfaktoren f{\"u}r Mycobacterium leprae : Literaturrecherche und Entwicklung einer Methode zur Talganalyse},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85028},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Trotz weltweiter kostenlos zur Verf{\"u}gung stehender multi drug therapy und Eradikationsbem{\"u}hungen der WHO liegt die Leprainzidenz seit f{\"u}nf Jahren bei etwa 250 000 Neuerkrankungen pro Jahr. Der massive Abfall der Pr{\"a}valenz seit 1985 ist zum einen rechnerisch und durch die Art der Datenerhebung bedingt (s. 5.1.1), zum anderen l{\"a}sst sie keine R{\"u}ckschl{\"u}sse auf die Transmissionsereignisse, also die Aktivit{\"a}t der Krankheit zu. Dazu dient die Inzidenz, die nur unverh{\"a}ltnism{\"a}ßig gesunken ist (s. 2.4.1). F{\"u}r eine effektive Bek{\"a}mpfung der Lepra muss jedoch eine Reduktion der Neuerkrankungen erreicht werden. Bekannt ist, dass nur ein Bruchteil der mit M.leprae exponierten Individuen eine manifeste Krankheit entwickelt. Die Suche nach Wirtsfaktoren f{\"u}r eine Lepraerkrankung ist f{\"u}r gezielte Pr{\"a}ventions- und Prophylaxe-Maßnahmen, die Neuerkrankungen verhindern sollen, demnach von großer Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit werden die Ergebnisse einer Literaturrecherche zum Thema "Talglipide als Wirtsfaktoren f{\"u}r M.leprae" pr{\"a}sentiert und eine Methode zur Talganalyse entwickelt. Anhand wissenschaftlicher Publikationen wurde der aktuelle Stand der Forschung in den verschiedenen Bereichen dieser Hypothese reviewartig dargestellt. Der aktuelle Erkenntnisstand hinsichtlich der Lepra{\"u}bertragung ist vereinbar mit mehreren {\"U}bertragungswegen, wobei die Tr{\"o}pfchen- und die Haut{\"u}bertragung favorisiert werden (s. 2.5.1). Die Interpretation der Genomanalysen von M.leprae hat in Kombination mit fr{\"u}heren biochemischen Erkenntnissen Aufschluss {\"u}ber die metabolischen F{\"a}higkeiten von M.leprae gegeben. M.leprae besitzt ein reduktives "Minimalgenom", das sich an die intrazellul{\"a}re Nische, in der es lebt, außerordentlich adaptiert hat. Der Verlust wichtiger Kohlenstoffquellen und eine stark eingeschr{\"a}nkte Atmungskette stehen im Gegensatz zu den fast vollst{\"a}ndig erhaltenen anabolen und katabolen Stoffwechselwegen der Lipide. Sowohl f{\"u}r die Zellwandsynthese als auch zur Energieproduktion ist M.leprae auf wirtsbezogene Lipide angewiesen. Freie Fetts{\"a}uren werden dabei veresterten Fetts{\"a}uren vorgezogen (s. 5.2.1.1). Epidemiologische Erkenntnisse stehen ebenfalls in Einklang mit unserer Lipidhypothese. Als Ursache f{\"u}r das Clustering von Lepraf{\"a}llen in Haushalten kommen sowohl genetische als auch zuf{\"a}llig verteilte Faktoren sowie ein auf den gesamten Haushalt wirkender "Haushaltsfaktor" in Frage. Als genetischer Faktor, der die Talglipidzusammensetzung beeinflusst, w{\"a}ren Enzymaktivit{\"a}ten f{\"u}r die Squalen- bzw. Sapiens{\"a}uresynthese denkbar (vgl. 5.2.1.3). Einen in der Bev{\"o}lkerung zuf{\"a}llig verteilten Suszeptibilit{\"a}tsfaktor k{\"o}nnte die residente Keimflora der Haut darstellen, die f{\"u}r die Menge der im Talg vorkommenden freien Fetts{\"a}uren verantwortlich ist (s. 5.2.1.2). Als m{\"o}glicher Haushaltsfaktor kommt "Armut" in Betracht, der nachgewiesenermaßen mit schlechter K{\"o}rper- und Kleidungshygiene einhergeht (s. 5.2.2.3). In Kombination mit einer vermutlich ebenfalls mit Armut assoziierten h{\"a}ufigeren kutanen Verletzung durch Parasiten und M{\"u}cken k{\"o}nnte dies eine kutane Schmierinfektion mit M.leprae beg{\"u}nstigen. F{\"u}r eine Schmierinfektion {\"u}ber kontaminierte Gegenst{\"a}nde spricht auch die gute extrakorporale {\"U}berlebensf{\"a}higkeit des Erregers und der Nachweis von M.leprae in Bodenproben (s. 5.2.2.2). Die epidemiologischen Daten zu Geschlechterverh{\"a}ltnis und Infektionszeitpunkt lassen ebenfalls eine Rolle der Talglipide als Wirtsfaktoren f{\"u}r eine Lepraerkrankung vermuten (s. 5.2.1.2). Auf Basis der Erkenntnis, dass Lipide und insbesondere Talglipide als Wirtsfaktoren f{\"u}r M.leprae in Betracht kommen, wurde zu diesbez{\"u}glich relevanten Talgkomponenten recherchiert. Als trophischer Wirtsfakor kommen die individuell in unterschiedlichen Mengen vorliegenden freien Fetts{\"a}uren des Sebums in Betracht. Die Menge an Squalen und Sapiens{\"a}ure im Talg hat nachgewiesenermaßen erheblichen Einfluss auf die Barrierefunktion der Haut gegen bakterielle Erreger (s. 5.2.1.3). Es wurde folglich eine auf D{\"u}nnschicht- und Gaschromatografie beruhende Methode zur Quantifizierung dieser Talgbestandteile entwickelt (s. 4.6). Die Probenentnahme erfolgt mittels Sebutape, was eine bew{\"a}hrte, reproduzierbare und auch unter tropischen Bedingungen leicht anwendbare Methode darstellt.},
  subject      = {Mycobacterium leprae},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Buckel2012,
  author    = {Buckel, Lisa},
  title     = {Evaluating the combination of oncolytic vaccinia virus and ionizing radiation in therapy of preclinical glioma models},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85309},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Glioblastoma multiforme (GBM) represents the most aggressive form of malignant brain tumors and remains a therapeutically challenge. Intense research in the field has lead to the testing of oncolytic viruses to improve tumor control. Currently, a variety of different oncolytic viruses are being evaluated for their ability to be used in anti-cancer therapy and a few have entered clinical trials. Vaccinia virus, is one of the viruses being studied. GLV-1h68, an oncolytic vaccinia virus engineered by Genelux Corporation, was constructed by insertion of three gene cassettes, RUC-GFP fusion, β-galactosidase and β- glucuronidase into the genome of the LIVP strain. Since focal tumor radiotherapy is a mainstay for cancer treatment, including glioma therapy, it is of clinical relevance to assess how systemically administered oncolytic vaccinia virus could be combined with targeted ionizing radiation for therapeutic gain. In this work we show how focal ionizing radiation (IR) can be combined with multiple systemically delivered oncolytic vaccinia virus strains in murine models of human U-87 glioma. After initial experiments which confirmed that ionizing radiation does not damage viral DNA or alter viral tropism, animal studies were carried out to analyze the interaction of vaccinia virus and ionizing radiation in the in vivo setting. We found that irradiation of the tumor target, prior to systemic administration of oncolytic vaccinia virus GLV-1h68, increased viral replication within the U-87 xenografts as measured by viral reporter gene expression and viral titers. Importantly, while GLV-1h68 alone had minimal effect on U-87 tumor growth delay, IR enhanced GLV-1h68 replication, which translated to increased tumor growth delay and mouse survival in subcutaneous and orthotopic U-87 glioma murine models compared to monotherapy with IR or GLV-1h68. The ability of IR to enhance vaccinia replication was not restricted to the multi-mutated GLV-1h68, but was also seen with the less attenuated oncolytic vaccinia, LIVP 1.1.1. We have demonstrated that in animals treated with combination of ionizing radiation and LIVP 1.1.1 a strong pro-inflammatory tissue response was induced. When IR was given in a more clinically relevant fractionated scheme, we found oncolytic vaccinia virus replication also increased. This indicates that vaccinia virus could be incorporated into either larger hypo-fraction or more conventionally fractionated radiotherapy schemes. The ability of focal IR to mediate selective replication of systemically injected oncolytic vaccinia was demonstrated in a bilateral glioma model. In mice with bilateral U-87 tumors in both hindlimbs, systemically administered oncolytic vaccinia replicated preferentially in the focally irradiated tumor compared to the shielded non- irradiated tumor in the same mouse We demonstrated that tumor control could be further improved when fractionated focal ionizing radiation was combined with a vaccinia virus caring an anti-angiogenic payload targeting vascular endothelial growth factor (VEGF). Our studies showed that following ionizing radiation expression of VEGF is upregulated in U-87 glioma cells in culture. We further showed a concentration dependent increase in radioresistance of human endothelial cells in presence of VEGF. Interestingly, we found effects of vascular endothelial growth factor on endothelial cells were reversible by adding purified GLAF-1 to the cells. GLAF-1 is a single- chain antibody targeting human and murine VEGF and is expressed by oncolytic vaccinia virus GLV-109. In U-87 glioma xenograft murine models the combination of fractionated ionizing radiation with GLV-1h164, a vaccinia virus also targeting VEGF, resulted in the best volumetric tumor response and a drastic decrease in vascular endothelial growth factor. Histological analysis of embedded tumor sections 14 days after viral administration confirmed that blocking VEGF translated into a decrease in vessel number to 30\% of vessel number found in control tumors in animals treated with GLV-164 and fractionated IR which was lower than for all other treatment groups. Our experiments with GLV-1h164 and fractionated radiotherapy have shown that in addition to ionizing radiation and viral induced tumor cell destruction we were able to effectively target the tumor vasculature. This was achieved by enhanced viral replication translating in increased levels of GLAF-2 disrupting tumor vessels as well as the radiosensitization of tumor vasculature to IR by blocking VEGF. Our preclinical results have important clinical implications of how focal radiotherapy can be combined with systemic oncolytic viral administration for highly aggressive, locally advanced tumors with the potential, by using a vaccinia virus targeting human vascular endothelial growth factor, to further increase tumor radiation sensitivity by engaging the vascular component in addition to cancer cells.},
  subject      = {Gliom},
  language  = {en}
}
@article{BuchbergerBoehm2013,
  author    = {Buchberger, Alexander and B{\"o}hm, Stephanie},
  title     = {The Budding Yeast Cdc48Shp1 Complex Promotes Cell Cycle Progression by Positive Regulation of Protein Phosphatase 1 (Glc7)},
  series = {PLoS One},
  journal   = {PLoS One},
  doi       = {10.1371/journal.pone.0056486},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-96073},
  year      = {2013},
  abstract  = {The conserved, ubiquitin-selective AAA ATPase Cdc48 regulates numerous cellular processes including protein quality control, DNA repair and the cell cycle. Cdc48 function is tightly controlled by a multitude of cofactors mediating substrate specificity and processing. The UBX domain protein Shp1 is a bona fide substrate-recruiting cofactor of Cdc48 in the budding yeast S. cerevisiae. Even though Shp1 has been proposed to be a positive regulator of Glc7, the catalytic subunit of protein phosphatase 1 in S. cerevisiae, its cellular functions in complex with Cdc48 remain largely unknown. Here we show that deletion of the SHP1 gene results in severe growth defects and a cell cycle delay at the metaphase to anaphase transition caused by reduced Glc7 activity. Using an engineered Cdc48 binding-deficient variant of Shp1, we establish the Cdc48Shp1 complex as a critical regulator of mitotic Glc7 activity. We demonstrate that shp1 mutants possess a perturbed balance of Glc7 phosphatase and Ipl1 (Aurora B) kinase activities and show that hyper-phosphorylation of the kinetochore protein Dam1, a key mitotic substrate of Glc7 and Ipl1, is a critical defect in shp1. We also show for the first time a physical interaction between Glc7 and Shp1 in vivo. Whereas loss of Shp1 does not significantly affect Glc7 protein levels or localization, it causes reduced binding of the activator protein Glc8 to Glc7. Our data suggest that the Cdc48Shp1 complex controls Glc7 activity by regulating its interaction with Glc8 and possibly further regulatory subunits.},
  language  = {en}
}
@article{SzalayWeibelHofmannetal.2013,
  author    = {Szalay, Aladar A and Weibel, Stephanie and Hofmann, Elisabeth and Basse-Luesebrink, Thomas Christian and Donat, Ulrike and Seubert, Carolin and Adelfinger, Marion and Gnamlin, Prisca and Kober, Christina and Frentzen, Alexa and Gentschev, Ivaylo and Jakob, Peter Michael},
  title     = {Treatment of malignant effusion by oncolytic virotherapy in an experimental subcutaneous xenograft model of lung cancer},
  series = {Journal of Translational Medicine},
  journal   = {Journal of Translational Medicine},
  doi       = {doi:10.1186/1479-5876-11-106},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-96016},
  year      = {2013},
  abstract  = {Background Malignant pleural effusion (MPE) is associated with advanced stages of lung cancer and is mainly dependent on invasion of the pleura and expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) by cancer cells. As MPE indicates an incurable disease with limited palliative treatment options and poor outcome, there is an urgent need for new and efficient treatment options. Methods In this study, we used subcutaneously generated PC14PE6 lung adenocarcinoma xenografts in athymic mice that developed subcutaneous malignant effusions (ME) which mimic pleural effusions of the orthotopic model. Using this approach monitoring of therapeutic intervention was facilitated by direct observation of subcutaneous ME formation without the need of sacrificing mice or special imaging equipment as in case of MPE. Further, we tested oncolytic virotherapy using Vaccinia virus as a novel treatment modality against ME in this subcutaneous PC14PE6 xenograft model of advanced lung adenocarcinoma. Results We demonstrated significant therapeutic efficacy of Vaccinia virus treatment of both advanced lung adenocarcinoma and tumor-associated ME. We attribute the efficacy to the virus-mediated reduction of tumor cell-derived VEGF levels in tumors, decreased invasion of tumor cells into the peritumoral tissue, and to viral infection of the blood vessel-invading tumor cells. Moreover, we showed that the use of oncolytic Vaccinia virus encoding for a single-chain antibody (scAb) against VEGF (GLAF-1) significantly enhanced mono-therapy of oncolytic treatment. Conclusions Here, we demonstrate for the first time that oncolytic virotherapy using tumor-specific Vaccinia virus represents a novel and promising treatment modality for therapy of ME associated with advanced lung cancer.},
  subject      = {Lungenkrebs},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Nube2013,
  author    = {Nube, Jacqueline Sui Lin},
  title     = {Comparative Analysis of Vaccinia Virus-Encoded Markers Reflecting Actual Viral Titres in Oncolytic Virotherapy},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85689},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Using viruses to treat cancer is a novel approach to an age-old disease. Oncolytic viruses are native or recombinant viruses that have the innate or enhanced capability to infect tumour cells, replicate within the tumour microenvironment and subsequently lyse those cells. One representative, the vaccinia virus (VACV), belongs to the orthopoxvirus genus of the Poxviridae family. GLV-1h68, a recombinant and attenuated vaccinia virus devel- oped by the Genelux Corporation, is a member of this family currently being tested in various phase I/II clinical trials under the name GL-ONC1. It has been shown to specif- ically replicate in tumour cells while sparing healthy tissue and to metabolise prodrug at or transport immunological payloads to the site of affliction. Since imaging modalities offer little insight into viral replication deep within the body, and because oncolytic virotherapy is dependent on replication within the target tissue, the need for a monitoring system is evident. Pharmacokinetic analysis of this oncolytic agent was to give insight into the dynamics present in tumours during treatment. This, in turn, would give clinicians the opportunity to monitor the efficacy as early as possible after the onset of treatment, to observe treatment progression and possibly to gauge prognosis, without resorting to invasive procedures, e.g. biopsies. A criteria for viable biomarkers was that it had to be directly dependent on viral replica- tion. Ideally, a marker for treatment efficacy would be specific to the treatment modality, not necessarily the treatment type. Such a marker would be highly detectable (high sen- sitivity), specific for the treatment (high specificity), and present in an easily obtained specimen (blood). Taking this into consideration, the biomarkers were chosen for their potential to be indicators of viral replication. Thus, the biomarkers analysed in this thesis are: the native proteins expressed by the viral genes A27L and B5R, the virally encoded recombinant proteins β-galactosidase, β-glucuronidase, green fluorescent protein (GFP), carboxypeptidase G2 (CPG2) and carcinoembryonic antigen (CEA). Each marker is under the control of one of five different promoters present. All recombinant viruses used in this thesis express A27L, B5R, GFP and β-glucuronidase and all are derived from the parental virus GLV-1h68. In addition to these markers, GLV-1h68 expresses β-galactosidase; GLV-1h181 expresses CPG2. [...]},
  subject      = {Onkolyse},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Ehrig2012,
  author    = {Ehrig, Klaas},
  title     = {Effects of stem cell transcription factor-expressing vaccinia viruses in oncolytic virotherapy},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85139},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Krebserkrankungen bleiben auch im Jahr 2012 die zweith{\"a}uftigste Todesursache in der industralisierten Welt. Zus{\"a}tzlich hat die Etablierung der Krebsstammzell-Hypothese grunds{\"a}tzliche Auswirkungen auf die Erfolgsaussichten konventioneller Krebstherapie, wie Chemotherapie oder Strahlentherapie. Deswegen ist es von gr{\"o}βter Notwendigkeit, dass neue Ans{\"a}tze zur Krebstherapie entwickelt werden, die den Ausgang der Behandlung verbessern und zu weniger Nebenwirkungen f{\"u}hren. Diverse vorklinische Studien haben gezeigt, dass die onkolytische Virotherapie mit Vaccinia-Viren ein potentes und gut tolerierbares neues Werkzeug in der Krebstherapie darstellt. Die Effizienz des Vaccinia-Virus als Therapeutikum allein oder in Kombination mit Strahlen- oder Chemotherapie wird aktuell in mehreren klinischen Studien der Phasen I \& II getestet. Krebsstammzellen und Stammzellen teilen eine Vielzahl von Eigenschaften, wie die F{\"a}higkeit zur Selbst-Erneuerung und Pluripotenz, Stilllegung der Zellproliferation, Resistenz gegen Medikamente oder Bestrahlung, die Expression von diversen Zelloberfl{\"a}chen-molek{\"u}len, die Aktivierung und Hemmung spezifischer Signaltransduktionswege oder die Expression von Stammzell-spezifischen Genen. In dieser Arbeit wurden zwei neue rekombinante Vaccinia-Viren entwickelt, welche die Stammzell-Transkriptionsfaktoren Nanog (GLV-1h205) und Oct4 (GLV-1h208) exprimieren, um tiefere Einblicke in die Rolle dieser Masterregulatoren in der Entstehung von Krebs und ihrem Einfluss auf die onkolytische Virotherapie zu gewinnen. Das Replikationspotential beider Virusst{\"a}mme in menschlichen A549-Zellen und PC-3-Zellen wurde anhand von Replikations-Assays bestimmt. Die Expression der Virus-spezifischen Markergene Ruc-GFP und beta-Galaktosidase, wie auch die Expression der Transkriptionsfaktoren Nanog und Oct4 wurde mit Hilfe von RT-PCR, SDS-PAGE und Western blotting, sowie immunozytochemischen Experimenten nachgewiesen. Des Weiteren wurde der Einfluss einer GLV-1h205-Infektion von A549-Zellen auf den Zellzyklus untersucht. Zudem wurde die Bedeutung der Virus-vermittelten Transkriptionsfaktor-Expression auf die Behandlung von subkutanen A549-Tumoren in einem Xenograft-Modell untersucht. Zur Untersuchung, ob die beobachteten Vorteile in der Behandlung von Lungenadenokarzinomen in M{\"a}usen mit GLV-1h205 Promoter- oder Transkriptionsfaktor-abh{\"a}ngig sind, wurde ein Kontroll-Virus (GLV-1h321) hergestellt, dass f{\"u}r eine unfunktionale Nanog-Mutante codiert. Mittels SDS-PAGE und Western blotting sowie Immunozytochemie wurde die Transgen-Expression analysiert. Ein weitere Aspekt dieser Arbeit war die Fragestellung, ob sich das onkolyische Vaccinia-Virus GLV-1h68 eignet, als neues und weniger invasives Therapeutikum effizient Darmkrebszellen zu infizieren um sich in ihnen zu replizieren und diese anschlieβend zu lysieren. Ein derartiger Therapieansatz w{\"u}rde besonders im Hinblick auf sp{\"a}t diagnostizierten, metastasierenden Darmkrebs eine interessante Behandlungsalternative darstellen. Virale Markergen-expression wurde anhand von Fluoreszenzmikroskopie und FACS-Analyse untersucht. Desweiteren wurde gezeigt, dass die einmalige Administration von GLV-1h68 in mindestens zwei verschiedenen Darmkrebszelllinien zu einer signifikanten Inhibierung des Tumorwachstums in vivo und zu signifikant verbessertem {\"U}berleben f{\"u}hrt. Der Transkriptionsfaktor Klf4 wird zwar stark in ruhenden, ausdifferenzierten Zellen des Darmepithels exprimiert, ist hingegen bei Darmkrebs generell dramatisch herabreguliert. Die Expression von Klf4 f{\"u}hrt zu einem Stop der Zellproliferation und inhibiert die Aktivit{\"a}t des Wnt-Signalweges, indem es im Zellkern an die Transaktivierungsdom{\"a}ne von beta-Catenin bindet. Um die Behandlung von Darmkrebs mit Hilfe onkolytischer Virotherapie weiter zu verbessern, wurden verschiedene Vaccinia-Viren (GLV-1h290-292) erzeugt, die durch verschiedene Promoterst{\"a}rken die Expression unterschiedlicher Mengen an Tumorsuppressor Klf4 vermitteln. Die anf{\"a}ngliche Charakterisierung der drei Virusst{\"a}mme mittels Replikations-Assay, Zytotoxizit{\"a}tstudien, SDS-PAGE und Western blotting, Immunozytochemie sowie die Analyse der Proteinfunktion mit Hilfe von qPCR- und ELISA-Analysen zur Bestimmung von zellul{\"a}rem beta-Catenin, zeigten eine Promoter-abh{\"a}ngige Expression und Wirkung von Klf4. F{\"u}r weitere Analysen wurde das Virus GLV-1h291 gew{\"a}hlt, welches nach Infektion die gr{\"o}βte Menge an Klf4 produziert und zus{\"a}tzlich durch die C-terminale Fusion einer TAT Transduktionsdom{\"a}ne Membran-g{\"a}ngig gemacht (GLV-1h391). Die erhaltenen Befunde machen das Klf4-TAT-kodierende Vaccinia-Virus GLV-1h391 zu einem vielversprechenden Kandidaten f{\"u}r eine Behandlung von Darmkrebs beim Menschen.},
  subject      = {Lungenkrebs},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Flegler2022,
  author    = {Flegler, Vanessa Judith},
  title     = {Application of electron cryomicroscopy for structural and functional studies on the mechanosensitive channels of small conductance},
  doi       = {10.25972/OPUS-26897},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-268979},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2022},
  abstract  = {Bacteria thrive and survive in many different environments, and as a result, they have developed robust mechanisms to adapt rapidly to alterations in their surroundings. The protection against osmotic forces is provided by mechanosensitive channels: their primary function is to maintain the integrity of the cell upon a hypoosmotic shock. The mechanosensitive channel of small conductance (MscS) is not only the smallest common structural unit of a diverse family that allows for a tailored response in osmoregulation; it is also the most intensively studied homologue. Mechanosensitive channels directly sense elevated membrane tension levels generated by increased pressure within the cell and open transiently. Escherichia coli has six paralogues that differ in their gating properties and the number of additional transmembrane (TM) helices. These TM helices, termed sensor paddles, are essential for sensing, as they directly contact the surrounding membrane; however, the role of the additional TM helices is still unclear. Furthermore, lipids occupy hydrophobic pockets far away from the membrane plane. A recent gating model for MscS states that increased membrane tension triggers the expulsion of lipids out of those pockets, modulating different conformational states of MscS. This model focuses on bound lipids, but it is still unclear to what extent the direct interaction with the membrane influences sensing and how relevant it is for the larger paralogues. In the herein described work, structural studies on two larger paralogues, the medium-sized channel YnaI and the large channel YbiO were realised using electron cryomicroscopy (cryo-EM). Lipids were identified in YnaI in the pockets in a similar position and orientation as in MscS, suggesting a conserved sensing mechanism. Moreover, the copolymer diisobutylene/maleic acid (DIBMA) allowed the extraction of artificially activated YnaI from plasma membranes, leading to an open-like form of this channel. This novel conformation indicated that the pore helices bend at a GGxGG motif during gating, which is unique among the Escherichia coli paralogues, concomitant with a structural reorganisation of the sensor paddles. Thus, despite a high similarity of their closed states, the gating mechanisms of MscS and YnaI are surprisingly different. Furthermore, the comparison of MscS, YnaI, and YbiO accentuates variations and similarities between the differently sized family members, implying fine-tuning of channel properties in the pore regions and the cytosolic lateral entry sides into the channel. Structural analyses of MscS reconstituted into different systems showed the advantages and disadvantages of certain polymers and detergents. The novel DIBMA copolymer and the more conventional amphiphilic polymers, so-called Amphipols, perturb contacting transmembrane helices or lead to their denaturation. Due to this observation, the obtained structures of YnaI must also be cautiously considered. The structures obtained in detergents resulted in unaffected channels; however, the applicability of detergents for MscS-like channels is limited by the increased required sample concentration. The role of lipids for gating MscS in the absence of a membrane was examined by deliberately removing coordinated lipid molecules from MscS using different amounts and kinds of detergent. The effects on the channel were inspected by cryo-EM. These experiments showed that closed MscS adopts the open conformation when it is enough delipidated by incubation with the detergent n-dodecyl-β-D-maltoside, and adding lipids to the open channel reverses this process. The results agree with the state-of-the-art model that the amount of lipid molecules in the pockets and grooves is responsible for the conformational state of MscS. Furthermore, incubation with the detergent lauryl maltose neopentyl glycol, which has stabilising and delipidating characteristics, resulted in a high-resolution structure of open MscS exhibiting an intricate network of ligands. Based on this structure, an updated gating model is proposed, which states that upon opening, lipids from the pockets migrate into the cytosolic membrane leaflet, while lipids from the periplasmic leaflet enter the grooves that arise between the sensor paddles.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Schwarz2022,
  author    = {Schwarz, Gisela Maria},
  title     = {Regulation von c-MYC durch CIP2A im kolorektalen Karzinom},
  doi       = {10.25972/OPUS-27618},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-276181},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2022},
  abstract  = {Das kolorektale Karzinom ist eines der h{\"a}ufigsten beim Menschen vorkommenden Karzinome [2]. Diesem liegen unterschiedliche Mutationen zugrunde, die in knapp 100\% der kolorektalen Karzinome zu einer {\"U}berexpression von MYC f{\"u}hren, welches als Transkriptionsfaktor maßgeblich den Zellzyklus, Proliferation und Vaskularisierung beeinflusst [10,16]. Damit stellt MYC ein potenzielles Therapieziel in der Behandlung des Kolorektalen Karzinoms dar. Zus{\"a}tzlich konnte in den letzten Jahren ein Onkoprotein namens CIP2A identifiziert werden, welches nach Depletion mit einem Verlust von MYC Protein einhergeht [69]. Zus{\"a}tzlich ist CIP2A ein unabh{\"a}ngiger prognostischer Faktor im Kolorektalen Karzinom [70]. Diese Arbeit konnte zeigen, dass CIP2A-depletierte Zellen einen deutlichen Wachstumsnachteil gegen{\"u}ber unbehandelten Zellen zeigen. Dieser Unterschied kann nicht durch eine gesteigerte Apoptose, sondern vielmehr durch einen verl{\"a}ngerten Zellzyklus erkl{\"a}rt werden. Weiterhin konnte eine neue Zelllinie mit DOX-induzierbarer shCIP2A hergestellt werden, die f{\"u}r weitere Experimente genutzt werden kann. Entgegen der Wirkweise im Zervixkarzinom [69], konnte im kolorektalen Karzinom kein Einfluss auf die Stabilit{\"a}t von MYC Protein durch CIP2A nachgewiesen werden. Auch konnte der Verlust von MYC nach CIP2A Knockdown nicht durch gleichzeitige Inhibierung des Abbaus, durch Okadas{\"a}ure, MG132 oder in den FBWX7-defizienten Zellen, verhindert werden. Stattdessen resultiert die Herunterregulation von CIP2A in einem leichten R{\"u}ckgang der MYC-mRNA Menge und einem deutlichen Verlust an MYC-Protein. In Zellen mit verschiedenen Konstrukten der MYC Transkripte kann dieser Verlust an MYC Protein auf eine translationelle Regulation in der 5'UTR zur{\"u}ckgef{\"u}hrt werden, was eine bisher nicht beschriebene Wirkweise von CIP2A darstellt. Da CIP2A in normalen Zellen praktisch nicht exprimiert ist [78], k{\"o}nnte dies ein m{\"o}gliches Ziel in der Tumortherapie darstellen. Dieses gilt es in weiteren Experimenten noch genauer zu untersuchen.},
  subject      = {Myc},
  language  = {de}
}