@phdthesis{Goetz2010,
  author    = {G{\"o}tz, Andreas},
  title     = {Replikation von enteroinvasiven Escherichia coli und Salmonella enterica Serovar Typhimurium St{\"a}mmen in Epithelzellen unter besonderer Betrachtung des Kohlenstoffmetabolismus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-57292},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Schlagw{\"o}rter: Salmonella , Salmonella enterica , Salmonella typhimurium , Salmonellose , Escherichia coli , Shigella , Infektion , Bakterielle Infektion , Zellkultur , HeLa-Zelle , Apoptosis , Metabolismus , Stoffwechsel , Glucose , Glucosetransport , Glucosestoffwechsel , Katabolismus , Kohlenstoff , Kohlenstoffbedarf , Kohlenstoffhaushalt , Kohlenstoffstoffwechsel , Kohlenstoff-13 , Kohlenstoffisotop Salmonella Typhimurium und enteroinvasive E. coli (EIEC) sind fakultativ intrazellul{\"a}re Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. W{\"a}hrend erstere sich nach der Internalisierung durch eukaryotische Zellen normalerweise in einem spezialisierten Phagosom, der Salmonella-enthaltenden Vakuole (SCV), vermehren, replizieren EIEC im Zytoplasma der Wirtszellen. In der vorliegenden Arbeit wurde zun{\"a}chst durch Mikroinjektion die F{\"a}higkeit von S. Typhimurium 14028s untersucht, ebenfalls im Zytoplasma von Caco-2-Zellen replizieren zu k{\"o}nnen. Dabei wurde festgestellt, daß ein fr{\"u}her als S. Typhimurium 14028s WT bezeichneter Stamm eine Insertion eines Desoxythymidins an Position 76 des offenen Leserasters von rfbP tr{\"a}gt, einem Gen, dessen Protein an der LPS-Synthese beteiligt ist. Weiterhin synthetisierte dieser Stamm ein rauhes LPS. Aufgrund von Agglutination konnte der Rauh-Stamm nur mit geringem Erfolg mikroinjiziert werden. Hingegen lag 5 h nach der Mikroinjektion einer nicht invasiven Mutante von Salmonella mit vollst{\"a}ndigem LPS der Anteil an Caco-2-Zellen, die mehr als 32 Bakterien enthielten, bei etwa 30 \%. Der Anteil war 2-3 mal h{\"o}her als bei fr{\"u}heren Mikroinjektionen in HeLa-Zellen. Daher wurde das Verhalten von HeLa-Zellen nach einer Infektion durch S. Typhimurium ΔsifA - einer Mutante, die aus der SCV ins Zytoplasma entkommt - untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß die sifA-Mutante 10 h nach der Infektion die Aktivit{\"a}t der Caspasen 9 und 3 in HeLa-Zellen, aber nicht in Caco-2-Zellen induziert. In weiteren Versuchen wurde die Bedeutung von Glukose, Glukose-6-phosphat und Mannose als Kohlenstoffquellen f{\"u}r die extra- und intrazellul{\"a}re Replikation zweier Isolate enteroinvasiver E. coli und eines S. Typhimurium Stammes analysiert. Zu diesem Zweck wurden zun{\"a}chst definierte Mutanten in den beiden wichtigsten Phosphoenolpyruvat-abh{\"a}ngigen Phosphotransferasesystemen (PTS) f{\"u}r die Aufnahme von Glukose und Mannose, ptsG und manXYZ, sowie im Antiporter f{\"u}r die Aufnahme von Glukose-6-phosphat, uhpT, konstruiert. Bei Wachstum im Minimalmedium mit Glukose als einziger C-Quelle waren die Generationszeiten aller ΔptsG- und ΔptsG, manXYZ-Mutanten im Vergleich zu den Wildst{\"a}mmen deutlich verl{\"a}ngert. Ebenso wuchsen ΔmanXYZ-Mutanten bzw. ΔuhpT-Mutanten deutlich langsamer auf Mannose bzw. Glukose-6-phosphat. Jedoch ergaben sich hierbei Stamm-spezifische Unterschiede. So erreichte EIEC 4608-58 ΔuhpT in der station{\"a}ren Phase eine {\"a}hnliche Zelldichte wie der Wildstamm in Gegenwart von Glukose-6-phosphat und eine ΔptsG, manXYZ-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnte immer noch effizient mit Glukose wachsen. Infektionsversuche mit Caco-2-Zellen zeigten weiterhin, daß die Deletion von ptsG zu einer signifikanten Erh{\"o}hung der Adh{\"a}renz und Invasivit{\"a}t von EIEC 4608-58 f{\"u}hrt, w{\"a}hrend sich die intrazellul{\"a}ren Generationszeiten aller hier untersuchten Mutanten kaum ver{\"a}nderten. Selbst die ΔptsG, manXYZ, uhpT-Dreifachmutanten der drei hier verwendeten Enterobakterien und die ΔptsG, manXYZ, glk-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnten immer noch in Caco-2-Zellen replizieren, wenn auch mit Stamm-spezifisch verringerten Geschwindigkeiten. 13C-Markierungsexperimente mit [U-13C6]-Glukose als Substrat ergaben jedoch, daß in der Tat alle hier untersuchten enterobakteriellen Wildst{\"a}mme Glukose w{\"a}hrend der Replikation in Caco-2-Zellen unter Zellkulturbedingungen verwerten. Glukose-6-phosphat, Glukonat oder Fetts{\"a}uren konnten dagegen als wichtigste Kohlenstoffquellen f{\"u}r das intrazellul{\"a}re Wachstum ausgeschlossen werden. EIEC 4608-58 metabolisierte Glukose jedoch weniger effizient als EIEC HN280 und schien zudem noch zus{\"a}tzlich C3-Substrate aus der Wirtszelle aufzunehmen. Das Markierungsmuster zeigte einen Stamm-spezifischen Kohlenstofffluß durch Glykolyse und/oder Entner-Doudoroff-Weg, Pentosephosphatzyklus, Citratzyklus und den anaplerotischen Reaktionen zwischen PEP und Oxalacetat. Mutanten mit Deletionen in ptsG und manXYZ konnten auf alternative C3-Substrate wechseln und glichen dies durch eine erh{\"o}hte Aufnahme von Aminos{\"a}uren aus den Wirtszellen aus.},
  subject      = {Escherichia coli},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Obier2010,
  author    = {Obier, Nadine},
  title     = {Defining the end of pluripotency in mouse embryonic stem cells},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-53722},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Stammzellen mit ihrer besonderen F{\"a}higkeit sich selbst zu erneuern und zu differenzieren stellen einen faszinierenden Zelltyp f{\"u}r Grundlagenforschung und angewandte Wissenschaften dar. Pluripotente embryonale Stammzellen (ES Zellen), die aus Zellen der inneren Zellmasse von Pr{\"a}implantationsembryonen etabliert werden, k{\"o}nnen ekto-, meso- und endodermale Zelltypen sowie Keimzellen hervorbringen. Im Gegensatz dazu sind multipotente adulte Stammzellen in ihrem Entwicklungspotential eingeschr{\"a}nkt, sie differenzieren sich zu allen Zelltypen ihres Gewebes. Zum Beispiel h{\"a}matopoetische Stammzellen (HSZs), die sich in Blut-bildenden Geweben wie dem Knochenmark befinden, verm{\"o}gen sich in alle Blutzellen zu differenzieren. W{\"a}hrend der Differenzierung von Stammzellen {\"a}ndert sich nicht deren Genom, sondern ihre epigenetische Regulation. Durch epigenetische Mechanismen werden Zelltypen mit verschiedensten Ph{\"a}notypen und Funktionen generiert. F{\"u}r Stammzelltherapien ist ein tieferes Verst{\"a}ndnis des Zusammenhangs von Epigenom und zellul{\"a}rer Funktion wichtig. Im Rahmen dieser Dissertation war es mein Ziel, differenzierende Stammzellkulturen auf ihre Genexpression, ihre Chromatinregulation und ihr Differenzierungspotiential hin zu analysieren. Um Histonmodifikationen, die einen m{\"o}glichen Mechanismus epigenetischer Regulation darstellen, global untersuchen zu k{\"o}nnen, sind zun{\"a}chst, durchusszytometrische Protokolle etabliert worden, die die Analyse einzelner Zellen erm{\"o}glichen sollten. Mit dieser Methode konnten reduzierte Levels von Histonazetylierung in differenzierten ES Zellen gezeigt werden. Im Gegensatz dazu beobachtete ich vergleichbare Levels von Histonazetylierung in unreifen und reifen Knochenmarkzellen. Zus{\"a}tzlich untersuchte ich die Wirkung des Histondeazetylase-Inhibitors (HDI) Trichostatin A (TSA) auf Knochenmarkzellkulturen, in denen auch HSZs enhalten sind. Nach Behandlung mit TSA erh{\"o}hte sich der Anteil von Zellen mit in vitro und in vivo h{\"a}matopoetischer Aktivit{\"a}t, w{\"a}hrend vor allem differenzierte Zellen in Apoptose gingen. Außerdem wurde der Verlust der Pluripotenz in differenzierenden ES Zellkulturen untersucht. Marker-basierte Analysen und funktionelle Tests wurden mit ES Zellen durchgef{\"u}hrt, die kurzfristig in vitro differenziert wurden. Es stellte sich heraus, dass nach funktionellen Gesichtspunkten die Pluripotenz bereits nach 2 Tagen Differenzierung deutlich reduziert war, beurteilt anhand der F{\"a}higkeit Kolonien zu bilden, embryoide K{\"o}rperchen (EK) zu formieren und zu kontrahierenden Herzmuskelzelltypen zu differenzieren. Im Gegensatz dazu verringerte sich die Expression von Pluripotenzmarkern erst zu sp{\"a}teren Zeitpunkten. Ich habe weiterhin beobachten k{\"o}nnen, dass die Wahl des Differenzierungssystems (Aggregations-EK, klonale EKs oder als adh{\"a}rente Einzelzellschicht) einen Einfluss auf den Fortschritt und die Homogenit{\"a}t der Differenzierung hatte. Um das Ende der Pluripotenz genauer zu untersuchen, wurden differenzierte ES Zellen zur{\"u}ck in ES Zellkulturbedingungen gebracht. Die Ergebnisse deuten an, dass 3 Tage differenzierte ES Zellen einen Punkt {\"u}berschritten haben, an dem eine R{\"u}ckkehr zur Pluripotenz allein durch Kulturbedingungen noch m{\"o}glich ist. Durch die Behandlung mit HDIs starben selektiv differenzierte ES Zellen. Des Weiteren war es Ziel dieser Arbeit, den Einuss von EED - einer essentiellen Untereinheit des Histon-methylierenden Polycomb repressive complex 2 (PRC2) - auf das Chromatin und die Funktion von ES Zellen hin zu analysieren. ES Zellen ohne EED wiesen neben dem bereits bekannten Verlust der Trimethylierung von Histon 3 an Lysin 27 (H3K27me3), global reduzierte H3K9me3 Levels sowie erh{\"o}hte Histonazetylierung auf. Trotz typischer ES Zell-Morphologie und normaler Expression von Pluripotenzgenen, besaßen EED knockout (KO)ES Zellen eine ver{\"a}nderte Organisation der Heterochromatinstruktur im Zellkern, eine verlangsamte Chromatinmobilit{\"a}t und Probleme bei der Differenzierung. Zusammenfassend gew{\"a}hren meine Daten Einblick in die epigenetische Regulation von Stammzellen. Im Besonderen konnte ich zeigen, dass die Behandlung mit HDIs f{\"u}r differenzierende Knochenmarkzellen und differenzierende ES Zellen nachteilig war und zu deren selektivem Zelltod f{\"u}hrte. Die hier durchgef{\"u}hrten Analysen ergaben, dass ES Zellen nach 3 Tagen Differenzierung das Ende der Pluripotenz erreicht hatten. Schließlich zeigten die Versuche mit EED KO ES Zellen, dass sie sich zwar selbst erneuerten und morphologisch identisch mit wildtypischen ES Zellen waren, jedoch Defekte bei der Differenzierung besaßen. Dies deutet darauf hin, dass EED nicht nur f{\"u}r undifferenzierte ES Zellen wichtig ist, sondern auch w{\"a}hrend der Differenzierung von Bedeutung ist.},
  subject      = {Stammzelle},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Heinze2010,
  author    = {Heinze, Britta},
  title     = {Charakterisierung der angeborenen Immunantwort gegen Pneumoviren in einem in vivo Modell},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-56454},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {In dieser Arbeit wurde das PVM-Mausmodell verwendet, um die Bedeutung der Typ I und Typ III Interferonantwort f{\"u}r die Pathogenese einer pneumoviralen Infektion zu analysieren. Hierzu wurden zun{\"a}chst mit Hilfe der reversen Genetik rekombinante PVM-Mutanten hergestellt, bei denen die Gene f{\"u}r die NS-Proteine, welche vermutlich als Interferonantagonisten fungieren, deletiert sind. Die Charakterisierung der Replikationsf{\"a}higkeit der rPVM dNS-Mutanten erfolgte in vitro in Interferon-kompetenten und Interferon-inkompetenten Zelllinien. Ein zentraler Schritt innerhalb dieser Charakterisierung war die Untersuchung der Induktion von Interferonen in vivo und in vitro nach Infektion mit den rPVM dNSMutanten, wobei nachgewiesen wurde, dass die NS-Proteine von PVM als Interferonantagonisten fungieren. In allen Interferon-kompetenten Zellkulturen wurde eine Attenuierung von rPVM dNS1, rPVM dNS2 und rPVM dNS1dNS2 bezogen auf rPVM beobachtet. In allen Interferon-inkompetenten Zellkulturen konnte die Attenuierung der rPVM dNS-Mutanten nahezu vollst{\"a}ndig revertiert werden. Nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten wurde in verschiedenen Zelllinien eine Induktion von Typ I und Typ III Interferonen betrachtet, wobei Unterschiede in der St{\"a}rke der Interferon-Induktion nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten vorhanden waren. Zusammenfassend war es m{\"o}glich, die NS1- und NS2-Proteine von PVM in Analogie zu RSV eindeutig als Antagonisten der Interferonantwort zu identifizieren. Die Untersuchung der protektiven Rolle von Typ I und Typ III Interferonen f{\"u}r die Replikation und Pathogenit{\"a}t von PVM bildete den zweiten Teil dieser Arbeit. Hierzu wurde die Replikationsf{\"a}higkeit und Pathogenit{\"a}t der rPVM dNS-Mutanten in verschiedenen Interferon-defizienten Mausst{\"a}mmen getestet. Die Untersuchungen ergaben eine protektive Rolle von Typ I und Typ III Interferonen bei einer Infektion mit PVM, wobei den Typ I Interferonen ein effektiverer Einfluss zugeordnet werden konnte. Ein Vergleich von Replikation und Virulenz zwischen den verschiedenen Typ I oder Typ III oder Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mausst{\"a}mmen belegte eine erh{\"o}hte Suszeptibilit{\"a}t der Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten M{\"a}use gegen{\"u}ber einer Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten. Eine vollst{\"a}ndige Aufhebung der Attenuierung wurde auch in den Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten M{\"a}usen nicht erlangt. Eine anti-apoptotische Funktion der NS-Proteine zus{\"a}tzlich zu ihrer Wirkungsweise als Interferonantagonisten wurde aufgrund der unvollst{\"a}ndigen Revertierung der Pathogenit{\"a}t der rPVM dNS-Mutanten in Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten M{\"a}usen vermutet. Der abschließende Teil dieser Dissertation befasste sich mit der Frage, welche Zellen bei einer nat{\"u}rlichen pulmonalen Infektion Interferone in vivo produzieren. In vitro wurde beobachtet, dass {\"u}berraschenderweise nur sehr wenige virusinfizierte oder uninfizierte Zellen Typ I Interferone bilden. Der Nachweis dar{\"u}ber, welche Zellen w{\"a}hrend einer pulmonalen Infektion haupts{\"a}chlich Interferone in vivo produzieren, war aufgrund der fehlenden Eignung der kommerziell erh{\"a}ltlichen Interferon-Antik{\"o}rper f{\"u}r intrazellul{\"a}re Gewebef{\"a}rbungen nicht m{\"o}glich. Dennoch gelang es abschließend durch eine neue Nachweismethode erstmals Zellen mit rezeptorgebundenen Interferon zu identifizieren, wobei es sich um ziliierte Epithelzellen, Alveolarmakrophagen und vermutlich Clarazellen sowie Typ I und Typ II Pneumozyten handelte.},
  subject      = {Interferon},
  language  = {de}
}
@phdthesis{MonzonCasanova2010,
  author    = {Monz{\´o}n Casanova, Elisa},
  title     = {Rat iNKT Cells: Phenotype and Function},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-56526},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {iNKT cells are a population of T cells with unique characteristics. In contrast to most αβ T cells which recognize peptides presented by highly polymorphic MHC molecules, iNKT cells are reactive to glycolipids presented by CD1d, a non-polymorphic MHC-I like molecule. Moreover, whereas MHC-restricted αβ T cells bear highly variable receptors (TCRs) formed after somatic recombination of the V(D)J gene segments, the TCR of iNKT cells is formed by an invariant α chain, which always contains the same gene segments: AV14 and AJ18; and a β chain of limited BV gene usage: BV8S2, BV7 or BV2, in the mouse. This invariant α chain is the reason for which these cells are named "i" and the NK part of their name refers to the expression of receptors typical of natural killer (NK) cells. iNKT cells recognize glycolipids of endogenous and microbial origin. After activation they secrete large amounts of very different cytokines such as IFN-γ and IL-4 and thus influence immune responses and pathological conditions. One of the most potent iNKT cell agonists, recognized by the semi-invariant TCR, is the synthetic glycolipid α-Galactosylceramide (α-Gal). iNKT cells can be visualized using CD1d-multimeric complexes loaded with α-Gal and flow cytometry, since this reagent has enough avidity to stain these cells. Interestingly, mouse iNKT cells can be stained with human α-Gal-loaded CD1d oligomers and human iNKT cells can also be visualized with mouse α-Gal-loaded CD1d oligomers, indicating a high degree of conservation of the recognition of α-Gal presented by CD1d through evolution. Previous studies showed that rats have the genes necessary to build semi-invariant TCRs: They have a CD1d homologue; one or two BV8S2 homologues and interestingly, up to ten AV14 gene segments, which are highly conserved when compared to the mouse genes. Importantly, it has been shown at least for two of these AV14 gene segments that they can produce invariant TCRα chains which, when coexpressed with BV8-containing β chains, react to α-Gal presented by rat CD1d. Furthermore, ex vivo stimulation of primary splenocytes with α-Gal results in the secretion of IL-4 and IFN-γ. Surprisingly, rat semi-invariant TCRs do not recognize α-Gal presented by mouse CD1d and accordingly, mouse α-Gal-loaded CD1d tetramers failed to stain a discrete population of rat iNKT cells. Taking all together, despite that strong evidence suggested that iNKT cells are present in the rat, the direct identification of such population and the analysis of CD1d-restricted immune responses were still pending for this species. Hence the work presented in this doctoral thesis was aimed to identify iNKT cells, to analyze their phenotype and also to study the distribution and function of CD1d in the rat. For these purposes, we produced essential reagents which were still lacking such as rat specific anti-CD1d monoclonal antibodies and rat CD1d oligomers. Importantly, two of three anti-rat CD1d monoclonal antibodies (all of them generated in our laboratory before this thesis was initiated) also recognized mouse CD1d and therefore allowed a direct comparison of CD1d expression between rat and mouse. Whereas CD1d distribution in the hematopoietic system was found to be extremely similar between these two species; in non-lymphatic tissues important differences were observed. Interestingly, CD1d protein was detected at not yet described sites such as the rat exocrine pancreas and rat and mouse Paneth cells. These monoclonal antibodies did not only allowed the analysis of CD1d expression, but also the first demonstration of the function of rat CD1d as an antigen presenting molecule, since cytokine release in response to α-Gal was blocked when they were added to ex vivo cultures of rat primary cells. Staining of primary rat iNKT cells (possible now with the newly generated rat CD1d oligomers) revealed interesting similarities with human iNKT cells. First, we observed that rat iNKT cells are only a minority among all NKR-P1A/B positive T cells. Human iNKT cells constitute also a very small proportion of NKR-P1A (CD161) expressing T cells, whereas in mice inbred strains which express NKR-P1C (NK1.1), most of NKRP1C expressing T cells are iNKT cells. Second, the majority of rat iNKT cells are either CD4 or DN and only a small proportion expresses CD8β. These findings are similar to humans and different to mice which lack CD8+ iNKT cells. Third, analysis of various inbred rat strains demonstrated different iNKT cell frequencies which correlated with cytokine secretion after α-Gal stimulation of primary cells. In comparison to mice, iNKT cell numbers are markedly reduced in rats. In F344 rats, inbred rat strain which released the highest cytokine amounts after α-Gal stimulation, approximately 0.25\% and 0.1\% of total liver and spleen lymphocytes, respectively, are iNKT cells. In contrast, in LEW rats iNKT cells were practically absent and neither IL-4 nor IFN-γ were detected after stimulation of primary cells with α-Gal. Once more, these frequencies are very close to those observed in humans. Last, as reported for human peripheral blood cells, rat iNKT cells could be easily expanded in vitro by adding α-Gal to cultures of intrahepatic lymphocytes, whereas the expansion of mouse iNKT cells was not possible using the same protocol. The presence of a multimember AV14 gene segment family in the rat is an intriguing characteristic. These AV14 gene segments are extremely homologous except in the CDR2α region. Based on the amino acid sequence of this region they have been divided into two different types: Type I and II. A specific tissue distribution of the different types was proposed in the first study where the presence of several AV14 gene segments was described. We also analyzed the AV14 gene segment usage in F344 and LEW inbred rat strains. In F344 rats we found no preferential usage of either AV14 gene segment type in the spleen and the liver but type II AV14 gene segments appeared more frequently in the thymus. In contrast, LEW rats show a preferential usage of type I AV14 gene segments in all three compartments analyzed: Thymus, spleen and liver. Taken all together, the usage of newly generated reagents allowed to gain novel insights into CD1d expression in the rat and in the mouse and to directly identify rat iNKT cells for the first time. The phenotypic and functional analysis of rat iNKT cells revealed numerous similarities with human iNKT cells. These are of special interest, since rats serve to investigate several pathological conditions including models for autoimmune diseases. The possibility now to analyze iNKT cells and CD1d-restricted T cell responses in the rat might help to understand the pathogenesis of such diseases. In addition, the uncomplicated in vitro expansion and culture of rat iNKT cells should facilitate the analysis of the immunomoldulatory capacities of these cells.},
  subject      = {Ratte},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Heisig2010,
  author    = {Heisig, Martin},
  title     = {Development of novel Listeria monocytogenes strains as therapeutic agents for targeted tumor therapy},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48628},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Despite marked progress in development and improvement of cancer therapies the rate of cancer related death remained stable over the last years. Especially in treating metastases alternative approaches supporting current therapies are required. Bacterial and viral vectors have been advanced from crude tools into highly sophisticated therapeutic agents detecting and treating neoplastic leasions. They might be potent enough to fill in this therapeutic demand. In this thesis Listeria monocytogenes was investigated as carrier for targeted bacterial cancer therapy. One part of the study focussed on modification of a functional bacterial mRNA delivery system. Genomic integration of T7 RNA polymerase driving mRNA production allowed reduction to an one-plasmid-system and thereby partially relieved the growth retardation exerted by mRNA delivery. Importantly the integration allowed metabolic attenuation of the mRNA delivery mutant potentially enabling in vivo applications. Further expansion of the bacterial RNA delivery system for transfer of shRNAs was examined. Bacterial mutants producing high amounts of RNA containing shRNA sequences were constructed, however a functional proof of gene silencing on delivery in eukaryotic cell lines was not achieved. The second part of this thesis focussed on increasing tumor colonization by Listeria monocytogenes in vivo. Coating bacteria with antibodies against receptors overexpressed on distinct tumor cell lines enabled specific bacterial internalization into these cells in vitro. Optimization of the bacterial antibody coating process resulted in an up to 104-fold increase of intracellular bacteria. Combination of this antibody-mediated targeting with the delivery of prodrug-converting enzymes showed a cytotoxic effect in cell lines treated with the corresponding prodrug. Since incubation in murine serum completely abrogated antibodymediated bacterial internalization the antibodies were covalently linked to the bacteria for application in xenografted tumor mice. Bacteria coated and crosslinked in this manner showed enhanced tumor targeting in a murine tumor model demonstrating antibodymediated bacterial tumor targeting in vivo. Independent of antibody-mediated tumor targeting the intrinsic tumor colonization of different Listeria monocytogenes mutants was examined. Listeria monocytogenes \&\#916;aroA \&\#916;inlGHE colonized murine melanoma xenografts highly efficient, reaching up to 108 CFU per gram of tumor mass 7 days post infection. Taken together the presented data shows highly promising aspects for potential bacterial application in future tumor therapies. Combination of the delivery systems with antibodymediated- and intrinsic bacterial tumor targeting might open novel dimensions utilizing Listeria monocytogenes as therapeutic vector in targeted tumor therapy.},
  subject      = {Krebs <Medizin>},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Hartmann2010,
  author    = {Hartmann, Thomas},
  title     = {Nitrogen metabolism in Aspergillus fumigatus with emphasis on the oligopeptide transporter (OPT) gene family},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-54027},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {The saprophytic filamentous fungus Aspergillus fumigatus has been gaining importance as an opportunistic human pathogen over the past decades. Advances in modern medicine have created a growing group of patients susceptible to infection with A. fumigatus, often contracting potentially deadly invasive aspergillosis. The virulence of this pathogen appears to be a multifactorial trait, a combination of physiological characteristics that enables the fungus to infect immunocompromised humans. This work concentrates on the nitrogen metabolism of A. fumigatus, which is essential for meeting the nutritional needs inside the human host. Using DNA microarrays, the transcriptional response during growth on three different secondary nitrogen sources was examined, which revealed the metabolic versatility of A. fumigatus, especially when challenged with proteins as the sole source of nitrogen. In-depth transcriptional profiling of the eight-member oligopeptide transporter (OPT) gene family underlined the importance of oligopeptide transport for growth on complex nitrogen sources like BSA or collagen. Heterologous expression of the opt genes in Saccharomyces cerevisiae showed their functionality as oligopeptide transporters, and characterized their substrate specificity. Using a Cre/loxP based genetic tool, a complete deletion of all opt genes in A. fumigatus was achieved. The resultant strain exhibited diminished growth on medium where the oligopeptide GPGG was the sole nitrogen source, but did not show any other in vitro phenotype. The opt deletion strain was not attenuated in virulence in a murine model of pulmonary aspergillosis, suggesting that the OPT gene family is not necessary for successful infection. The connection of oligopeptide transport and extracellular proteolytic activity was investigated by deleting the genes encoding Dpp4 and Dpp5, two dipeptidyl peptidases, or PrtT, the transcriptional regulator of major secreted proteases, in the complete opt deletion background. In contrast to the deletion of dpp4 and dpp5, which did not result in any additional phenotype, the absence of prtT led to a drastic growth defect on porcine lung agar. This suggests a synergistic action of extracellular proteolytic digest of proteins and transport of oligopeptide degradation products into the cell. Finally, this work established the bacterial β-Rec/six site-specific recombination system as a novel genetic tool for targeted gene deletion in A. fumigatus.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Boerner2010,
  author    = {B{\"o}rner, Juliane},
  title     = {Charakterisierung der Phosphorylierungsstellen der Guanylyl Cyklase A, dem Rezeptor f{\"u}r das atriale natriuretische Peptid, mittels Massenspektrometrie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51914},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Das ANP/GC-A-System spielt durch die Produktion des sekund{\"a}ren Botenstoffs cGMP eine wichtige Rolle bei der Regulation des Blutdruckes und des Blutvolumens. Bei Patienten mit Herzhypertrophie oder Herzinsuffizienz sind die ANP-Plasmakonzentrationen erh{\"o}ht, aber die GC-A-vermittelten Effekte stark reduziert, was auf einen Defekt des Signalsystems hinweist. Studien an metabolisch markierten GC-A-{\"u}berexprimierenden HEK 293-Zellen zeigten, dass der GC-A-Rezeptor im basalen Zustand stark phosphoryliert und die homologe bzw. heterologe Desensitisierung wahrscheinlich mit einer Dephosphorylierung verbunden ist. Die Desensitisierung stellt einen Mechanismus dar, der in vivo zu einem Funktionsverlust des Rezeptors beitragen k{\"o}nnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mittels Massenspektrometrie sieben Phosphorylierungsstellen in der Kinasehomologen Dom{\"a}ne aus FLAG-GC-A exprimierenden HEK 293-Zellen detektiert werden: Ser487, Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 und Thr513. Die massenspektrometrische relative Quantifizierung basierend auf der Multiple-Reaction-Monitoring (MRM)-Methode zeigte bei ANP-induzierter, homologer Desensitisierung eine Dephosphorylierung der Phosphorylierungsstellen Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 und Thr513, was mit bereits publizierten Daten {\"u}bereinstimmt, und einen starken Anstieg der Phosphorylierung an Ser487. Nach Inkubation mit Angiotensin II, welches eine heterologe Desensitisierung hervorruft, wurde eine Reduzierung aller Phosphorylierungen verzeichnet, die zudem st{\"a}rker ausgepr{\"a}gt war als bei der ANP-abh{\"a}ngigen Desensitisierung. Die Funktion der neu identifizierten Phosphorylierung an Ser487 wurde mittels Mutagenese analysiert. Die Substitution des Serins durch Alanin, welche den unphosphorylierten Zustand nachstellt, resultierte in einer Rezeptoraktivit{\"a}t und desensitisierung vergleichbar zum GC-A Wildtyp-Rezeptor. Wurde hingegen Serin gegen Glutamat getauscht, um den phosphorylierten Zustand zu imitieren, konnte der Rezeptor weder aktiviert noch desensitisiert werden. Diese Ergebnisse best{\"a}tigen vorherige Studien, dass die GC-A-Rezeptorantwort auf ANP durch die Phosphorylierungen reguliert wird. Allerdings scheint bei der homologen Desensitisierung die Phosphorylierung an der Position Ser487 eine Rolle zu spielen, da sie die Aktivit{\"a}t des Rezeptors inhibiert. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Phosphorylierungsstelle tr{\"a}gt zum Verst{\"a}ndnis des Mechanismus der homologen Desensitierung bei. Zus{\"a}tzlich konnten einige der beschriebenen Phosphorylierungen in Zellsystemen detektiert werden, die die GC-A endogen exprimieren. Dadurch sind unter physiologischen Bedingungen Analysen der Mechanismen m{\"o}glich, die bei der Aktivierung und Deaktivierung der GC-A involviert sind und somit wichtige pathophysiologische Konsequenzen haben k{\"o}nnen.},
  subject      = {Guanylatcyclase},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Mueller2010,
  author    = {Mueller, Felicitas},
  title     = {Analysis of the factor XII-driven contact system activation in vivo},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-46071},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Platelets play a central role in thrombosis, hemostasis, and inflammation. Here, we show that activated platelets release inorganic polyphosphate (polyP), a polymer of 60- 100 phosphate residues that directly bound to and activated the plasma protease factor XII. PolyP-driven factor XII-activation triggered release of the inflammatory mediator bradykinin by plasma kallikrein-mediated kininogen processing. PolyP increased vascular permeability and induced fluid extravasation in skin microvessels of mice. Mice deficient in factor XII or bradykinin receptors were resistant to polyP-induced leakage. PolyP initiated clotting of plasma via the contact pathway. Ablation of intrinsic coagulation pathway proteases factor XII and factor XI protected mice from polyPtriggered lethal pulmonary embolism. Targeting polyP with phosphatases interfered with procoagulant activity of activated platelets and blocked platelet-induced thrombosis in mice. Infusion of polyP restored defective plasma clotting of Hermansky- Pudlak Syndrome patients, which lack platelet polyP. The data identify polyP as a new class of mediator having fundamental roles in platelet-driven proinflammatory and procoagulant disorders.},
  subject      = {Blutstillung},
  language  = {en}
}
@phdthesis{vonHayn2010,
  author    = {von Hayn, Kathrin},
  title     = {Untersuchungen zur Ca2+-abh{\"a}ngigen Regulation von cAMP in intakten vaskul{\"a}ren Myocyten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-47709},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Die Regulation des Tonus glatter Muskelzellen wird entscheidend von den beiden antagonistisch wirkenden second messengern cAMP und Ca2+ beeinflusst. Ein Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob diese beiden Botenstoffe auch direkten Einfluss aufeinander haben k{\"o}nnen und welche Enzyme in diesem Fall an den Prozessen beteiligt sind. cAMP-Signale in intakten Zellen konnten wir in Echtzeit mit Hilfe des FRET-basierten cAMP-Sensors Epac1-camps beobachten; Ca2+-Signale durch Markieren der Zellen mit Fura-2. Anstiege der intrazellul{\"a}ren Ca2+-Konzentration in VSMCs wurden durch Aktivierung von endogen exprimierten, Gq-gekoppelten P2Y6-Rezeptoren mit Uridindiphosphat (UDP) ausgel{\"o}st. Durch eine zus{\"a}tzliche in-vitro Kalibrierung des Epac1-camps konnten dar{\"u}ber hinaus absolute cAMP-Konzentrationen in einzelnen lebenden Zellen berechnet werden. W{\"a}hrend ein Anstieg der Ca2+-Konzentration auf nicht vorstimulierte VSMCs keinen signifikante Einfluss auf die intrazellul{\"a}ren cAMP-Konzentrationen hatte, bewirkte die Aktivierung der purinergen Rezeptoren einen deutlichen R{\"u}ckgang der intrazellul{\"a}ren cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs. Dieser Effekt konnte sowohl durch die Komplexierung von Ca2+ mit BAPTA-AM als auch durch die {\"U}berexpression der Ca2+-insensitiven AC4 antagonisiert werden. Adenylatcyclase-Aktivit{\"a}ts-Assays in VSMC-Membranen zeigten ebenfalls einen R{\"u}ckgang der Cyclaseaktivit{\"a}t nach Zugabe von 2 und 5 \&\#956;M freiem Ca2+. Die Hemmung der einzigen Ca2+-regulierbaren PDE1 mit dem selektiven PDE1-Inhibitor 8-Methoxymethyl-IBMX (8-MM-IBMX) hatte im Gegensatz dazu keinen Einfluss auf die durch UDP verursachte {\"A}nderung der cAMP-Konzentration in vorstimulierten VSMCs. Schließlich bewirkte die Herunterregulation der Ca2+-inhibierbaren AC5 und 6 mit siRNA einen signifikante Hemmung des durch UDP verursachten Effekts. Fasst man alle diese Ergebnisse zusammen, so l{\"a}sst sich folgende Schlussfolgerung ziehen: Der durch purinerge Stimulation verursachte R{\"u}ckgang der cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs wird durch eine Hemmung der Ca2+-hemmbaren AC5 und 6 vermittelt. Dadurch sind zwei f{\"u}r die Regulation des Tonus wichtige Signalwege in VSMCs miteinander verbunden, die sich somit gegenseitig entscheidend beeinflussen k{\"o}nnen. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Entwicklung eines transgenen Mausmodells, das glattmuskelspezifisch den cAMP-Sensor Epac1-camps exprimiert. Mit Hilfe eines solchen Tiermodells k{\"o}nnten in Zukunft cAMP-{\"A}nderungen in intakten Geweben und vielleicht sogar in lebenden Tieren beobachtet werden. Durch Anwendung des Cre-loxP-Rekombinationssystems gelang es eine glatt¬muskelspezifische, f{\"u}r den Epac1-camps transgene Mauslinie zu generieren. Mit isolierten VSMCs dieser Tiere konnten bereits erste FRET-Messungen durchgef{\"u}hrt und agonistinduzierte cAMP-{\"A}nderungen beobachtet werden.},
  subject      = {Glatte Muskulatur},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Leonhardt2010,
  author    = {Leonhardt, Sara Diana},
  title     = {Resin collection and use in stingless bees},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51588},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Harz ist ein klebriges Pflanzenprodukt mit einem oft intensiven aromatischen Geruch. Es wird von B{\"a}umen produziert, um Wunden zu verschließen und sch{\"a}dliche Besucher abzuwehren. Einige Insektenarten haben jedoch die erstaunliche F{\"a}higkeit entwickelt, mit der klebrigen Substanz umzugehen und sie sich gar zu Nutzen zu machen. So verwenden Bienen Harz beispielsweise zum Nestbau und zur Verteidigung ihrer Kolonien. W{\"a}hrend allgemein bekannt ist, dass Bienen Pollen und Nektar sammeln, wird der Tatsache, dass sie auch Harz sammlen, allerdings sehr viel weniger Beachtung geschenkt. Ziel meiner Dissertation war es daher, herauszufinden, warum, wie und wo stachellose Bienen in Borneo (sieben untersuchte Bienenarten), Australien (acht Arten) und Costa Rica (27 Arten) Pflanzenharze sammeln und verwerten. Diese Arbeit behandelt somit die enge Beziehung zwischen einer eusozialen Insektengattung und einem chemisch und physiologisch hoch komplexen Pflanzenprodukt, das Bienen nicht nur als Nestmaterial und zur Verteidigung dient, sondern auch eine wesentliche Bedeutung f{\"u}r deren chemische Diversit{\"a}t hat. Stachellose Bienen verhalten sich hochgradig opportunistisch, wenn sie Harz sammeln, d.h. verschiedene Bienenarten sammeln Harz von denselben Baumarten, wobei sie nahezu jede verf{\"u}gbare Harzquelle nutzen. Dabei finden und erkennen sie Harzquellen anhand einiger charakteristischer Mono- und Sesquiterpene, nutzen jedoch nicht das gesamte Harz-Bouquet. Die Menge an eingetragenem Harz unterscheidet sich zwischen verschiedenen Bienenarten und kolonien und varriert mit verschiedenen Umweltbedingungen. Insbesondere eine Bedrohung durch Fressfeinde (z. B. Ameisen) f{\"u}hrt zu einer massiven Steigerung des Harzeintrages; eine manuelle Zerst{\"o}rung des Nesteinganges hat dagegen relativ wenig Einfluss. Das eingetragene Harz wird zum Nestbau und zur Verteidigung gegen Fressfeinde und Mikroben genutzt. Dar{\"u}ber hinaus dient es als Quelle f{\"u}r Terpene, die von den Bienen in ihre chemischen Oberfl{\"a}chenprofile eingebaut werden (kutikul{\"a}re Terpene). Dabei {\"u}bertragen sie nur einen Bruchteil (8 \%) der gewaltigen Menge (>> 1000) an Terpenen, die man im Harz von B{\"a}umen findet, auf ihre Oberfl{\"a}che. Die {\"u}bertragenen Terpene bleiben in ihrer Struktur unver{\"a}ndert, allerdings unterscheiden sich die Bienenarten in der Zusammensetzung der Terpenprofile auf ihrer Oberfl{\"a}che, obwohl alle untersuchten Arten Harz von denselben B{\"a}umen sammeln. Die unterschiedlichen Terpenprofile sowie die Tatsache, dass nur wenige Terpene aus dem Harz aufgenommen werden, deuten auf einen artspezifischen und bisher unbekannten Filterungsmechanismus bei stachellosen Bienen hin. Auch {\"u}bersteigt durch die Aufnahme von Terpenen die chemische Diversit{\"a}t der Oberfl{\"a}chenprofile von stachellosen Bienen die zahlreicher anderer Hymenopteren. Da Bienen die Terpene aus dem Harz nur „filtern", sie dabei aber nicht ver{\"a}ndern, sind s{\"a}mtliche Bienenarten aus Borneo, Australien und Costa den charakteristischen Harzprofilen von B{\"a}umen aus ihren Ursprungsgebieten chemisch sehr {\"a}hnlich. Da in jeder tropischen Region andere Baumarten vorkommen, varriert die chemische Zusammensetzung der vorkommenden Harze und damit der kutikul{\"a}ren Terpene von dort vorkommenden Bienen. Die meisten Bienenarten mit kutikul{\"a}ren Terpenen findet man in Borneo, wo nahezu 100 \% der untersuchten Arten aus Baumharzen gewonnene Terpene in ihre chemischen Profilen einbauen. Im Gegensatz dazu sind es in Costa Rica nur 40 \% der untersuchten Arten. Auch sammeln in Borneo gelegentlich 9 von 10 Arbeiterinnen einer Tetragonilla collina Kolonie Harz, wohingegen in Australien maximal 10 \% und in Costa Rica maximal 40 \% der Arbeiterinnen einer Kolonie Harz sammeln. Das Vorherrschen von Harz und aus Harz gewonnenen Terpenen in der chemischen {\"O}kologie von Bienen auf Borneo spiegelt das Vorherrschen einer bestimmten s{\"u}dostasiatischen Baumfamilie wieder: der Dipterocarpaceen, deren Holz ungew{\"o}hnlich harzig ist. Ein solch enger Zusammenhang zwischen der Chemie von Bienen und der von Baumharzen verdeutlicht die enge Beziehung zwischen stachellosen Bienen und den B{\"a}umen in ihrem Habitat. Die kutikul{\"a}ren Terpene sch{\"u}tzen ihre Tr{\"a}ger vor Angreifern (z.B. Ameisen) und Mikrobenbefall. Dabei variiert eine bestimmte Gruppe - Sesquiterpene - am meisten zwischen den Arten. Diese Terpengruppe manipuliert die nat{\"u}rlichweise auftretende zwischen-artliche Aggression, indem sie letztere bei jenen Arten verringert, die selbst keine Sesquiterpene in ihrem Profil haben. Aggressionsminderung durch chemische Komponenten, welche aus der Umwelt aufgenommen werden, stellt somit einen bisher unbekannten Mechanismus dar, um Toleranz zwischen sonst aggressiven Arten zu erreichen. Eine derarte Herabsetzung von aggressiven Verhalten bei stachellosen Bienen kann dar{\"u}ber hinaus ein entscheidender Faktor f{\"u}r das Entstehen sogenannter Nestaggregationen sein. Dabei nisten Kolonien von Bienenarten mit und Bienenarten ohne Sesquiterpene in ihrem chemischen Profil in unmittelbarer Nachbarschaft, ohne gegeneinander aggressiv zu sein. Im Hinblick auf die zahlreichen Funktionen, die Harze und/oder aus dem Harz gewonnene Substanzen f{\"u}r stachellose Bienen haben, stellt Harz zweifelsohne eine bedeutende Ressource in der Welt der Bienen dar - eine Ressource, die einen direkten Einfluss auf deren chemische {\"O}kologie, Verteidigungsmechanismen und zwischen-artliche Kommunikation aus{\"u}bt. Wie genau die Bienen ihre artspezifischen Terpenprofile erzeugen, insbesondere, wie es ihnen gelingt, dabei ganze Terpengruppen auszuschließen, muss in zuk{\"u}nftigen Studien genauer untersucht werden. Auch stellt sich die Frage, wie wichtig eine hohe Diversit{\"a}t an Harzquellen und damit Baumarten f{\"u}r die Bienen ist! Es ist durchaus m{\"o}glich, dass neben einer Vielfalt an Bl{\"u}tenpflanzenarten auch der „Harzreichtum" f{\"u}r das Wohlergehen der Bienen eine entscheidende Rolle spielt.},
  subject      = {stachellose Biene},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Matuschek2010,
  author    = {Matuschek, Anja},
  title     = {Characterization of tolerogenic rat bone marrow-derived dendritic cells and regulatory T cells},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51708},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Tolerogene Dendritische Zellen (DZ) und regulatorische T-Lymphozyten (Treg) verf{\"u}gen {\"u}ber die F{\"a}higkeit, destruktive Immunantworten zu verhindern. Die Hoffnung besteht, solche Zellen in naher Zukunft f{\"u}r therapeutische Zwecke einzusetzen, um z. B. Immunantworten nach Transplantation, aber auch bei Autoimmunit{\"a}t und Allergie antigenspezifisch zu supprimieren. Zum jetzigen Zeitpunkt ist die Generierung solcher Zellen aufwendig und noch nicht f{\"u}r die klinische Routine geeignet. Zudem sind die Mechanismen noch wenig verstanden, wie diese Zellen eine gew{\"u}nschte Immunhemmung in vivo auszul{\"o}sen und wie der m{\"o}glichen Gefahr einer zu starken Immunhemmung zu begegnen ist. Das Kleinnagermodell Ratte ist f{\"u}r die biomedizinische Forschung noch immer von großer Bedeutung, umso {\"u}berraschender ist es, dass insbesondere tolerogene DZ und Treg in diesem Modell bisher nur unzureichend untersucht wurden. Das Ziel der Arbeit war deshalb, diese Immunzellen umfassend zu charakterisieren und ihre Funktion auf das Immunsystem zu untersuchen. Tolerogene DZ wurden mit GM-CSF und IL-4 aus Knochenmarkvorl{\"a}uferzellen generiert (= IL-4 DC). Der Anteil an nat{\"u}rlich vorkommenden Treg mit einem Ph{\"a}notyp CD4posCD25posFoxp3pos umfasst ca. 5-8\% der peripheren naiven CD4pos TLymphozyten. Die Charakterisierung der IL-4 DC zeigte im Vergleich zu reifen DZ der Milz eine bis zu 26-fach geringere Expression von Oberfl{\"a}chenmolek{\"u}len wie MHC-Klasse II Molek{\"u}l, CD80, CD86, ICAM-1 und CD25. Diese geringe Expression {\"a}nderte sich auch nicht, wenn die Zellen verschiedensten Reifungssignalen wie das Replattieren,LPS, TNF-α und CD40L ausgesetzt wurden. IL-4 DC verf{\"u}gen somit {\"u}ber einen robusten und gegen{\"u}ber Reifungssignalen {\"u}beraus resistenten Ph{\"a}notyp. IL-4 DC nehmen Antigene durch Endozytose auf und sind unf{\"a}hig, sowohl naive TLymphozyten zu aktivieren, als auch antigenspezifische T-Lymphozyten zu restimulieren. Zudem sind sie in der Lage, die Aktivierung naiver T-Lymphozyten und die Restimulierung antigenspezifischer T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ zu bzw. zu verz{\"o}gern. Dabei verringerte sich die Proliferation der TLymphozyten um bis zu 95\%. Diese Beeinflussung der Proliferation ist nach Zugabe der IL-4 DC bereits innerhalb von 24 Stunden zu messen. Die verringerte Aktivierung geht zu dem mit einer verringerten Zytokinaussch{\"u}ttung (IL-2 um 49\% und IFN-γ um 92\%) einher. Die inhibitorischen Eigenschaften der IL-4 DC scheinen aber nicht ausschließlich auf der verringerten Expression kostimulatorischer Molek{\"u}le zu beruhen. Der Nachweis der beiden inhibitorischen Oberfl{\"a}chenmolek{\"u}le PD-L1 und PD-L2 auf IL-4 DC l{\"a}sst ebenfalls eine Bedeutung dieser Molek{\"u}le bei der Vermittlung inhibierender Signale vermuten. Auch die suppressive Wirkung l{\"o}slicher Faktoren wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt. {\"U}berst{\"a}nde einer 24-st{\"u}ndigen Kultur mit einer Million IL-4 DC hemmten die Aktivierung naiver T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ um etwa 90\%. F{\"u}r diese Immunhemmung scheint das in diesen {\"U}berst{\"a}nden nachgewiesene Zytokin TGF-β (bis 300 pg/ml) verantwortlich zu sein. Im Vergleich dazu wiesen {\"U}berst{\"a}nde reifer Milz-DZ, die nicht die Aktivierung von T-Lymphozyten hemmten, eine TGF-β Konzentrationen von bis 100 pg/ml auf. Im Gegensatz dazu scheint zelltoxisches Stickstoffmonoxid nur eine geringe Rolle bei der Inhibierung der T-Zellproliferation zu spielen. Die Zugabe des NO Synthase-Inhibitors NMMA verringerte zwar den Anteil an NO um ca. 50\%, doch f{\"u}hrte dies nicht zu einer Steigerung der Proliferation von T-Lymphozyten. IL-4 DC sind zwar nicht in der Lage, T-Lymphozyten zur Proliferation zu bringen, doch bedeutet dies nicht, dass keinerlei Ver{\"a}nderungen auf molekularer Ebene festzustellen w{\"a}ren. So sind T-Lymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC nicht in der Lage, in Gegenwart von reifen Milz-DZ zu proliferieren. Dieser anergische Zustand wurde nach Zugabe von IL-2 aufgehoben. Zudem k{\"o}nnen diese TLymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC die Aktivierung na{\"i}ver TLymphozyten hemmen. Na{\"i}ve und aktivierte T-Lymphozyten k{\"o}nnen dies nicht. Diese Beobachtung, die auf eine Induktion von Treg schließen l{\"a}sst, wurde genauer untersucht. In der Tat zeigten durchflusszytometrische Analysen eine 1,6-fach verst{\"a}rkte Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten aus nat{\"u}rlich vorkommenden Treg in Gegenwart von IL-4 DC. Dabei erfolgte die Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten unabh{\"a}ngig vom Reifegrad der DZ. So waren auch reife Milz-DZ dazu in der Lage, die Zahl der nat{\"u}rlich vorkommenden Treg zu erh{\"o}hen. Doch wiesen diese mit Milz-DZ inkubierten Treg einen verminderten inhibitorischen Effekt auf. Im Gegensatz dazu waren die mit IL-4 DC inkubierten Treg in der Lage die Aktivierung naiver T-Lymphozyten zu hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich das regulatorische Potential von DZ nicht ausschließlich vom Ph{\"a}notyp bzw. ihrem Reifegrad ableiten l{\"a}sst, sondern dass hierzu auch ihre funktionellen Eigenschaften zu untersuchen sind. Die Induktion von Treg mit suppressiven Eigenschaften durch in vitro generierte tolerogene IL-4 DC k{\"o}nnte ein wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz darstellen. Vor einer klinischen Umsetzung sind aber noch weitergehende Untersuchungen notwendig, um das Zusammenspiel zwischen tolerogenen DZ und Treg zu verstehen, aber auch um die Auswirkungen eines Transfers großer Mengen regulatorischer Zellen auf das Immunsystem des Empf{\"a}ngers zu untersuchen.},
  subject      = {Dendritische Zelle},
  language  = {en}
}
@phdthesis{BarcenaUribarri2010,
  author    = {Barcena Uribarri, Ivan},
  title     = {Porins in the genus Borrelia : Characterization of P66 and P13},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55339},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Die Gattung Borrelia geh{\"o}rt zur Familie der Spirochaetes, welche sich den Gram-negativen Bakterien zuordnen lassen. F{\"u}r diese Familie charakteristisch ist eine l{\"a}ngliche, helikale Form, die L{\"a}ngen von 5 - 250 µm erreichen kann. Den Spirochaeten geh{\"o}ren diverse Pathogene an wie Treponema und Leptospira, die Erreger der Syphillis und der Leptospirose. Borrelien verursachen beim Menschen zwei schwere Krankheiten: Die Lyme-Borreliose (LB) und das R{\"u}ckfallfieber (RF). Als Pathogen besitzen Borrelien einen Lebenszyclus, in dem sie zwischen Gliederf{\"u}ßern als Vektoren und S{\"a}ugetieren (oft kleinen Nagetieren) als Wirt wechseln. Um das {\"U}berleben in derart unterschiedlichen Organismen zu sichern und die Immunantwort des Wirtes zu unterdr{\"u}cken, ben{\"o}tigt ein Organismus mit einem solch komplexen Lebenszyklus eine außergew{\"o}hnliche Regulierung der Proteinexpression. Die Lyme-Borelliose stellt eine multisystemische Krankheit dar, die verschiedene Organe, wie Haut, Gelenke und das Nervensystem betreffen kann. H{\"a}ufig kommt es zu einer sich kreisf{\"o}rmig ausbreitenden R{\"o}tung, die erythema migrans genannt wird, die zur klinischen Diagnose genutzt wird. Sie erscheint nach einem Zeckenbiss und kann einen Durchmesser von bis zu 15 cm weit erreichen. R{\"u}ckfallfieber erkennt man an pl{\"o}tzlich auftretenden Fiebersch{\"u}ben, die von weiteren Symptomen wie Sch{\"u}ttelfrost, Kopfschmerzen, Muskel und Gelenkschmerzen oder {\"U}belkeit begleitet werden. Beide Krankheiten k{\"o}nnen in fr{\"u}hen Stadien der Infektion leicht mit der Gabe von Antibiotika behandelt werden. Die verschiedenen Arten der Gattung Borrelia besitzen ein relativ kleines Genom. Da außerdem viele der vorhandenen Gene f{\"u}r Virulenzfaktoren und wirtsspezifische Anpassungen codieren, fehlen den Borrelien wichtige Genen f{\"u}r die Biosynthese von Aminos{\"a}uren, Fetts{\"a}uren oder Nukleotiden. Diese metabolischen Defizite werden durch die Aufnahme von durch den Wirt produzierten N{\"a}hrstoffen ausgeglichen. Den ersten Schritt der N{\"a}hrstoffaufnahme {\"u}bernehmen Porine. Dies sind wassergef{\"u}llte Kan{\"a}le, die die Aufnahme und den Transport von essentiellen Molek{\"u}len {\"u}ber die {\"a}ußere Membran erm{\"o}glichen. P66, P13 und Oms28 wurden bei Borrelia burgdorferi, Oms38 bei R{\"u}ckfallfieber verursachenden Spirochaeten gefunden. P66 ist ein einzelnes Porin mit einer extrem hohen Leitf{\"a}higkeit von 11 nS. P13 ist ein kleines Protein (13kDa) mit einer α helikalen Sekund{\"a}rstruktur, die keinerlei {\"A}hnlichkeit zu den bisherigen Modellen von bekannten Porinen aufweist. Aufgrund seiner Assoziation mit der periplasmatischen Seite der Membran wurde die Funktion als Porin f{\"u}r Oms28 in letzter Zeit stark angezweifelt. Oms38 ist ein Dicarboxylat-spezifisches Porin mit Homologen bei Lyme-Borreliose verursachenden Arten. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war das vorhandene Wissen {\"u}ber P66 und P13 als Porine der Gattung Borrelia zu erweitern. Die beiden Proteine unterscheiden sich strukturell stark von den bisher bekannten Porine Gram-negativer Bakterien und sind daher geeignete Forschungsobjekte, um die speziellen Anforderungen an Borrelienporinen zu erforschen. Das Ziel dieser Arbeit war die Erforschung der beiden in Borrelien beschriebenen Proteine P66 und P13. Gerade weil sich beide in Aufbau und Gr{\"o}ße von bekannten Porinen Gram-negativer Bakterien unterscheiden und somit in spezifische Prozesse bei der Gattung Borrelia involviert sein k{\"o}nnten, ist die Forschung auf diesem Gebiet auch weiterhin von h{\"o}chstem Interesse. Im ersten Projekt dieser Arbeit wurden das Vorkommen und die porenformende Aktivit{\"a}t von P66 in verschiedenen Borrelia-Arten (Lyme-Borreliose und R{\"u}ckfallfieber) untersucht. Bei P66 handelt es sich um das am besten untersuchte Porin der Borrelien, das eine Doppelfunktion als Porin und als Adhesin besitzt. Da sich alle bisherigen Ergebnisse auf B. burgdorferi beziehen, ist wenig bis gar nichts {\"u}ber homologe Proteine in anderen Borrelien-Arten bekannt. Deswegen wurden jeweils drei Arten, die Lyme-Borreliose und R{\"u}ckfallfieber verursachen, ausgew{\"a}hlt und an deren P66-Homologe die porenformende Aktivit{\"a}t {\"u}berpr{\"u}ft. F{\"u}nf von sechs zeigten dabei eine {\"a}hnliche Einzelkanalleitf{\"a}higkeit wie P66, die im Bereich von 9 - 11 nS lagen, bei gleichzeitig kaum vorhandener Selektivit{\"a}t f{\"u}r eine bestimmte Ionensorte. Auch eine Spannungsabh{\"a}ngigkeit, die bei 30 - 70 mV begann, war messbar. Nur im Fall von B. hermsii konnten keine Poren gefunden werden. Dabei ist noch nicht gekl{\"a}rt, ob das Fehlen der porenbildenden Aktivit{\"a}t einem evolution{\"a}ren Verlust der Funktion als Pore oder einer h{\"o}heren Anf{\"a}lligkeit gegen{\"u}ber den verwendeten Detergenzien geschuldet ist. In einem weiteren Projekt wurde der kontrovers diskutierte Porendurchmesser von P66 aus B.burgdorferi mit empirischen Mitteln analysiert. In fr{\"u}heren theoretischen Studien wurde der Kanaldurchmesser auf 2,6 nm gesch{\"a}tzt. Dieser sehr große Durchmesser w{\"u}rde allerdings die Schutzfunktion der Außenmembran verhindern. Mit Hilfe von ungeladenen Substanzen gelang eine Bestimmung des Innendurchmessers von P66 auf 1,8 nm am Eingang und 0,8 nm an der Engstelle der Pore. Zus{\"a}tzlich f{\"u}hrte eine unerwartete Blockierung der Pore durch einige dieser Substanzen zu der Erkenntnis, dass P66 einen oligomeren (wahrscheinlich oktameren) Aufbau besitzt. Ein solcher Aufbau konnte bisher noch nie nachgewiesen werden und k{\"o}nnte von daher ein einzigartiges Merkmal von Borrelien oder Spirochaeten sein. Das dritte Projekt besch{\"a}ftigte sich mit der rekombinanten Produktion eines Proteins von B. burgdorferi mit immunogenen Eigenschaften. Dieses k{\"o}nnte dazu verwendet werden, neue Diagnose Tests und Therapien zu entwickeln. P13 kommt in verschiedenen LB- und RF-Arten vor und besitzt kein bekanntes bakterielles Homolog. Diese Fakten machen aus P13 einen geeigneten Kandidaten als therapeutisches Ziel. Aus diesem Grund wurde das P13-Gen in zwei unterschiedliche Organismen kloniert. Zum einen in E. coli, wo zwei verschiedene Konstrukte zur Kl{\"a}rung der Rolle des periplasmatisch verdauten C-Terminus dienen sollten. Zum anderen in Tabakpflanzen {\"u}ber Agrobacterium tumefaciens, mittels eines Virus. Dabei vermehrt sich der Vektor in den Zellen der Pflanze, breitet sich aus und produziert gleichzeitig das gew{\"u}nschte Protein. Mit Hilfe dieser zweiten Expressionsmethode sollte es m{\"o}glich sein, große Mengen des rekombinanten Proteins zu erzeugen und gleichzeitig die Kosten und den Zeitbedarf zu senken. Das letzte Projekt besch{\"a}ftigte sich mit dem Außenmembran-Komplexom von B. burgdorferi und konzentrierte sich dabei auf die Komplexe von P13 und P66. Blue Native PAGE und 2D-SDS PAGE wurden als Techniken ausgew{\"a}hlt. Es konnte gezeigt werden, dass P66 das einzige Protein ist, das am vermutlich oktameren Aufbau der 11 nS Pore beteiligt ist. Zus{\"a}tzlich gelang es, den Komplex in zwei H{\"a}lften zu spalten, die ungef{\"a}hr das halbe Molekulargewicht bei einer Leif{\"a}higkeit von 5,5 nS zeigten. Im Fall des P13-Komplexes konnte eine m{\"o}gliche Verkn{\"u}pfung mit OspC entdeckt werden. Die Gelelution des Komplexes und anschließende Tests mit Hilfe der Black-Lipid-Bilayer-Methode ergaben eine Aktivit{\"a}t von 0,6 nS. Dies steht im starken Gegensatz zu der vorher f{\"u}r P13beschriebenen Gr{\"o}ße von 3,5 nS. Zusammenfassend l{\"a}sst sich sagen, dass P66 ein in vielen Borrelienarten vorkommendes und damit weit verbreitetes Porin mit Homologen in LB- und RF-Spezies ist, die {\"a}hnliche Charakteristika besitzen. Der Durchmesser dieser Pore konnte unter Ber{\"u}cksichtigung der Eigenschaften eines molekularen Siebes genauer bestimmt werden. Im Fall von P13 k{\"o}nnte dessen rekombinante Produktion es erlauben, dieses Protein als Hilfsmittel zur Diagnose und zur medizinischen Therapie einzusetzen. Zus{\"a}tzlich k{\"o}nnte der gefundene Bezug zu OspC dazu beitragen, in Zukunft mehr {\"u}ber die Funktion dieses interessanten Proteins herauszufinden.},
  subject      = {Porins},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Li2010,
  author    = {Li, Jian-Qiang},
  title     = {Modulating the expression of enzymes of isoprenoid synthesis: effects on Vgamma9Vdelta2 T cell activation and tumor cell growth},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-46388},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {This study focuses on phosphoantigen specific Vg9Vd2 T cells which only exist in human and non-human primates. This population accounts for 1\%-5\% of peripheral blood T-lymphocytes but their frequency can rise to 50\% of total blood T cells upon infection. Vg9Vd2 T cells can be activated by nonpeptide compounds with critical phosphate moieties which are termed as phosphoantigens. These include isopentenyl pyrophosphate (IPP), a key compound of isoprenoid synthesis in all organisms, and (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), a direct precursor of IPP in DOXP pathway which only exist in eubacteria, plants, apicomplexaen parasites. Its activity as phosphoantigen is at least 1000 fold higher than that of IPP. However, direct structural evidence of phosphoantigen binding to the TCR is missing so far. Moreover, Vg9Vd2 T cells have potent anti-tumor activity e.g. against the B-cell lymphoma Daudi, whose Vg9Vd2 T cell activating properties have been suggested to result from sensing of abnormal intracellular IPP levels by the Vg9Vd2 TCR or Vg9Vd2 TCR binding to other postulated ligands such as an ectopically expressed F1-ATPase or UL-16 binding protein 4 (ULBP4). Aminobisphosphonates and alkymines were hypothesized to activate Vg9Vd2 T cells indirectly by inhibiting the IPP consuming enzyme farnysyl pyrophosphates synthesis (FPPS) although off target effects of these drugs or a direct interaction with the Vg9Vd2 TCR could not be excluded. This thesis presents new approaches for the mechanistic analysis of Vg9Vd2 T cell activation. By employing retroviral transduction of FPPS specific shRNA, it shows that specific shRNA reduces expression of FPPS and is sufficient to convert hematopoietic and non-hematopoietic tumor cell lines into Vg9Vd2 T cell activators. FPPS knockdown cells activated Vg9Vd2 T cells as measured by increased levels of CD69 and CD107a, kill of FPPS knockdown cells and induction of IFN-\&\#947; secretion. The IPP-synthesis-inhibiting drug mevastatin reduced Vg9Vd2 T cell activation by FPPS knockdown cells or aminobisphosphonate treated cells but not activation by the phosphoantigen bromohydrin pyrophosphate (BrHPP). A reduced growth of the FPPS knockdown cells has not been observed which is different to what has been reported for aminobisphosphonate treated cells. Finally, the human B-cell lymphoma RAJI has been transduced with Tetracyclin-inducible FPPS specific shRNA and proven to gain and loose the capacity to activate Vg9Vd2 TCR transductants upon doxycylin provision or removal. Another approach for the analysis of Vg9Vd2 T cell activation is Vg9Vd2 TCR transduced mouse cell lines with specificity for phosphoantigens. In contrast to the previously used Vg9Vd2 TCR transduced Jurkat cells, these cells do not present phosphoantigens, and are therefore specially suited for analysis of phosphoantigen presentation. The response of the new TCR transductants to presumed Vg9Vd2 TCR ligands/activators such as phosphoantigens, aminobisphosphonates or FPPS knockdown cells, depended strongly on the expression of a rat/mouse CD28 molecule by the transductants and its ligation by the (CD80) counter receptor on the ligand-presenting cell. The response is likely to reflect recognition of cognate Vg9Vd2 TCR antigens since mutations in the TCR-\&\#948; chain CDR2 and 3 abolished this response but activation by TCR or CD3 specific antibodies. A major difference between TCR transductants and primary gd T cells, was the lacking response of TCR transductants to Daudi or IPP. In addition their sensitivity to other soluble phosphoantigens was about 100 fold weaker than that of primary cells, stimulation of both cell type to CD80 expressing FPPS knock down or aminobisphosphonates was similar. Finally, the transductants have also been used to analyze effects of over-expression or knockdown of enzymes of isoprenoid synthesis such as 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reductase or HMGR), mevalonate-5-pyrophosphate decarboxylase (MVD), isopentenyl pyrophosphate isomerase (IDI), geranyl-geranyl pyrophosphate synthase (GGPPS) but no clear effects have been found. In conclusion, this thesis supports the concept of Vg9Vd2 T cells being sensors of a dysregulated isoprenoid metabolism and established new tools to study ligand recognition and TCR mediated activation of this T cell population. These tools will be most useful to address following questions: 1) How does the dysregulation of isoprenoid metabolism affect tumor growth? 2) What is the correlation between the modulation of IPP levels and the Vg9Vd2 TCR binding or expression of other postulated ligands? 3) Are there any mevalonate pathway enzymes other than FPPS and HMGR, which play an important role in Vg9Vd2 T cells activation? 4) What is/are the putative phosphoantigen-presenting molecule(s)?},
  subject      = {Primaten},
  language  = {en}
}