@phdthesis{Dombrowski2010, author = {Dombrowski, Yvonne}, title = {Charakterisierung von GDF-15 als Immunmodulator im Ovarialkarzinom}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48885}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {GDF-15 ist ein atypisches Mitglied der TGF-b-Superfamilie. Unter physiologischen Bedingungen kommt es nur in der Plazenta in gr{\"o}ßeren Mengen vor, w{\"a}hrend es in zahlreichen Tumoren {\"u}berexprimiert gefunden wurde. Die genaue Funktion von GDF-15 im Tumorkontext ist nicht genau gekl{\"a}rt. Aufgrund der h{\"a}ufigen und hohen Expression in Tumoren scheint GDF-15 eine wesentliche Funktion im Tumorprogress auszu{\"u}ben. Das Ovarialkarzinom (OvCA) nimmt die Stellung als t{\"o}dlichste gyn{\"a}kologische Erkrankung ein. Da der Tumor meist erst in fortgeschrittenen Stadien diagnostiziert wird, sind bis heute die Heilungschancen schlecht. H{\"a}ufig kommt es zum Rezidiv nach zun{\"a}chst erfolgreicher Chemotherapie und mit 30\% ist die 5-Jahres-{\"U}berlebenschance gering. F{\"u}r die chemoresistenten F{\"a}lle gibt es bis zum heutigen Zeitpunkt keine effektive Therapie. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit, neue innovative Therapiestrategien zu entwickeln. G{\"u}nstige immunologische Parameter korrelieren mit der {\"U}berlebensdauer von OvCA-Patientinnen, was die Immuntherapie beim OvCA in den Fokus der experimentellen klinischen Therapie r{\"u}ckt. Doch um neue immuntherapeutische Strategien entwickeln zu k{\"o}nnen, m{\"u}ssen zun{\"a}chst immunologisch relevante Angriffspunkte identifiziert werden. Das in vielen Tumoren exprimierte GDF-15 ist mit einem der st{\"a}rksten immunsuppressiven Faktoren verwandt, was die Vermutung nahe legt, dass auch GDF-15 eine immunologisch relevante Funktion im Tumorkontext aus{\"u}ben k{\"o}nnte. Daher wurden die Expression und die m{\"o}gliche Funktion von GDF-15 als Immunmodulator im Ovarialkarzinom untersucht. Expressionsanalysen von OvCA-Gewebe und prim{\"a}ren OvCA-Zellen zeigten, dass GDF-15 das am st{\"a}rksten {\"u}berexprimierte Gen der untersuchten TGF-b-Familienmitglieder im OvCA ist. Auch als sezerniertes Protein wird GDF-15 in vivo und in vitro im OvCA detektiert, was auf eine funktionale Rolle von GDF-15 im OvCA hindeutet. Normalerweise eliminiert das Immunsystem entartete k{\"o}rpereigene Zellen. Manchmal gelingt es Tumorzellen jedoch, sich dieser Immun{\"u}berwachung zu entziehen und dem Immunsystem zu „entwischen". Inwieweit GDF-15 bei der Koordination des „immune escape" des OvCA eine Rolle spielt, sollte im Fokus dieser Arbeit stehen. Das Hauptaugenmerk lag dabei auf der Wirkung von GDF-15 auf NK-Zellen, da diese als fr{\"u}he Effektoren und wichtige Mediatoren zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem nicht nur eine Schl{\"u}sselrolle bei der immunologische {\"U}berwachung spielen, sondern sich dadurch auch als ideale Werkzeuge f{\"u}r die Tumorimmuntherapie auszeichnen. Exogenes GDF-15 hemmt in vitro die Lyseaktivit{\"a}t von NK-Zellen gegen{\"u}ber OvCA-Zellen. Endogene GDF-15-Defizienz der OvCA-Zellen sensitiviert diese f{\"u}r NK-Zell-Lyse und endogene GDF-15-{\"U}berexpression mindert die NK-Lyseaktivit{\"a}t. Die Hemmung der NK-Lyseaktivit{\"a}t kann durch verschiedene synergistisch wirkende Mechanismen erfolgen: durch Rezeptormodulation, durch direkte Modulation des Lysemechanismus und durch Apoptoseregulation. Wie TGF-b1 reguliert GDF-15 die Expression des aktivierenden NK-Rezeptors NKG2D von der Zelloberfl{\"a}che herunter und induziert zus{\"a}tzlich die Expression des inhibierenden Rezeptors CD305 und die des mit NKG2A- und NKG2C-assoziierten Rezeptors CD94. Daneben greift GDF-15 direkt in den Lysemechanismus der NK-Zellen ein, indem es die Granzym B-Expression beeinflusst. Dar{\"u}ber hinaus sensitiviert GDF-15 Immunzellen f{\"u}r die Apoptose durch die Induktion von Fas/CD95. Signaltransduktionsanalysen zeigen, dass GDF-15 in Immunzellen die SMAD-Proteine zeitverz{\"o}gert zu TGF-b aktiviert, was auf eine indirekte Wirkung schließen l{\"a}sst. Zus{\"a}tzlich kann GDF-15 auch die die p38/MAPK in Immunzellen aktivieren. Die Genregulation von GDF-15 und TGF-b1 in NK-Zellen ist sehr verschieden. Beide Zytokine regulieren {\"u}berwiegend Gene aus gleichen Funktionalit{\"a}tsclustern, allerdings sind die einzelnen von TGF-b1 und GDF-15 regulierten Gene verschieden. Nur drei Gene (CD55, Caspase-8 und Apolipoprotein 6) sind durch GDF-15 und TGF-b1 gleich reguliert. Zusammengefasst zeigt sich eine funktionale Analogie von GDF-15 und TGF-b1 in NK-Zellen. TGF-b1 scheint eine st{\"a}rkere Wirkung zu induzieren, daf{\"u}r zeigt GDF-15 hier ein breiteres Funktionalit{\"a}tsspektrum. Durch die Charakterisierung der funktionalen Rolle von GDF-15 als Immunmodulator in Tumoren ist hier ein neuer potentieller Angriffspunkt identifiziert worden, welcher Grundlage f{\"u}r neue Tumortherapiestrategien, nicht nur f{\"u}r das OvCA, sondern auch f{\"u}r andere GDF-15-exprimierende Tumore sein kann.}, subject = {Immunmodulator}, language = {de} } @phdthesis{Arumugam2010, author = {Arumugam, Manimozhiyan}, title = {Comparative metagenomic analysis of the human intestinal microbiota}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55903}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {The human gut is home for thousands of microbes that are important for human life. As most of these cannot be cultivated, metagenomics is an important means to understand this important community. To perform comparative metagenomic analysis of the human gut microbiome, I have developed SMASH (Simple metagenomic analysis shell), a computational pipeline. SMASH can also be used to assemble and analyze single genomes, and has been successfully applied to the bacterium Mycoplasma pneumoniae and the fungus Chaetomium thermophilum. In the context of the MetaHIT (Metagenomics of the human intestinal tract) consortium our group is participating in, I used SMASH to validate the assembly and to estimate the assembly error rate of 576.7 Gb metagenome sequence obtained using Illumina Solexa technology from fecal DNA of 124 European individuals. I also estimated the completeness of the gene catalogue containing 3.3 million open reading frames obtained from these metagenomes. Finally, I used SMASH to analyze human gut metagenomes of 39 individuals from 6 countries encompassing a wide range of host properties such as age, body mass index and disease states. We find that the variation in the gut microbiome is not continuous but stratified into enterotypes. Enterotypes are complex host-microbial symbiotic states that are not explained by host properties, nutritional habits or possible technical biases. The concept of enterotypes might have far reaching implications, for example, to explain different responses to diet or drug intake. We also find several functional markers in the human gut microbiome that correlate with a number of host properties such as body mass index, highlighting the need for functional analysis and raising hopes for the application of microbial markers as diagnostic or even prognostic tools for microbiota-associated human disorders.}, subject = {Darmflora}, language = {en} } @phdthesis{Schmid2010, author = {Schmid, Benjamin}, title = {Computational tools for the segmentation and registration of confocal brain images of Drosophila melanogaster}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51490}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Neuroanatomical data in fly brain research are mostly available as spatial gene expression patterns of genetically distinct fly strains. The Drosophila standard brain, which was developed in the past to provide a reference coordinate system, can be used to integrate these data. Working with the standard brain requires advanced image processing methods, including visualisation, segmentation and registration. The previously published VIB Protocol addressed the problem of image registration. Unfortunately, its usage was severely limited by the necessity of manually labelling a predefined set of neuropils in the brain images at hand. In this work I present novel tools to facilitate the work with the Drosophila standard brain. These tools are integrated in a well-known open-source image processing framework which can potentially serve as a common platform for image analysis in the neuroanatomical research community: ImageJ. In particular, a hardware-accelerated 3D visualisation framework was developed for ImageJ which extends its limited 3D visualisation capabilities. It is used for the development of a novel semi-automatic segmentation method, which implements automatic surface growing based on user-provided seed points. Template surfaces, incorporated with a modified variant of an active surface model, complement the segmentation. An automatic nonrigid warping algorithm is applied, based on point correspondences established through the extracted surfaces. Finally, I show how the individual steps can be fully automated, and demonstrate its application for the successful registration of fly brain images. The new tools are freely available as ImageJ plugins. I compare the results obtained by the introduced methods with the output of the VIB Protocol and conclude that our methods reduce the required effort five to ten fold. Furthermore, reproducibility and accuracy are enhanced using the proposed tools.}, subject = {Taufliege}, language = {en} } @phdthesis{Konradt2010, author = {Konradt, Christoph}, title = {Cross-talk between Shigella and cells of the adaptive immunity: The TTS effector IpgD inhibits T cell migration}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55397}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Shigellosis, or bacillary dysentery, is a rectocolitis caused by the gram-negative, enteroinvasive bacteria of the genus Shigella. Shigellosis still remains a major public health burden with an estimated 80 million cases of bloody diarrhoea and 700.000 deaths per year, primarily in children under the age of 5. Shigella disrupts, invades, and causes inflammatory destruction of the colonic epithelium in humans through virulence effectors secreted by the type III secretion apparatus (TTSA). In contrast to the Shigella-induced manipulation of the host innate immune response, the impact of Shigella on the adaptive immunity has been poorly studied thus far. In order to understand why the naturally induced protective humoral response requires several infections to be primed and is of short duration, the work presented here investigates if Shigella is able to directly interact with T cells. Indeed, it has been shown that Shigella was able to invade and proliferate inside T cells. Furthermore, Shigella was able to inhibit T cell migration through a TTSA effector. Moreover, the Shigella effector IpgD, a phosphoinositide 4-phosphatase that specifically dephosphorylates phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate (PIP2) into phosphatidylinositol-(5)-monophosphate (PI(5)P), was identified as the effector responsible for the observed inhibition. It could be demonstrated that IpgD was responsible for a reduction of intracellular PIP2 levels in T cells. Further experiments showed a reduced level of phosphorylated ezrin, radixin and moesin (ERM) proteins in infected, as well as with IpgD transfected, T cells. The ERM protein family plays an imported role in signal transduction and motility and their activity is closely related to the binding of PIP2. Therefore, the low level of PIP2 leads to a dephosphorylation of the ERM proteins which inhibits T cells response to chemokine stimulation. Indeed, IpgD transfected T cells show a reduced ability to re-localise the ERM proteins upon chemokine stimulation. Targeting T cell motility, via TTSA effectors, could explain the low level of specific T cell priming during Shigella infection. This is the first report of Shigella induced manipulation of T cell function and on the inhibition of T cell migration by a bacterial effector.}, subject = {Medizinische Mikrobiologie}, language = {en} } @article{AlbrechtSharmaReinhardtetal.2010, author = {Albrecht, Marco and Sharma, Cynthia M. and Reinhardt, Richard and Vogel, Joerg and Rudel, Thomas}, title = {Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-68389}, year = {2010}, abstract = {Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogenic bacterium that has been refractory to genetic manipulations. Although the genomes of several strains have been sequenced, very little information is available on the gene structure of these bacteria. We used deep sequencing to define the transcriptome of purified elementary bodies (EB) and reticulate bodies (RB) of C. trachomatis L2b, respectively. Using an RNAseq approach, we have mapped 363 transcriptional start sites (TSS) of annotated genes. Semiquantitative analysis of mapped cDNA reads revealed differences in the RNA levels of 84 genes isolated from EB and RB, respectively. We have identified and in part confirmed 42 genome- and 1 plasmid-derived novel non-coding RNAs. The genome encoded non-coding RNA, ctrR0332 was one of the most abundantly and differentially expressed RNA in EB and RB, implying an important role in the developmental cycle of C. trachomatis. The detailed map of TSS in a thus far unprecedented resolution as a complement to the genome sequence will help to understand the organization, control and function of genes of this important pathogen.}, subject = {Biologie}, language = {en} } @phdthesis{Obier2010, author = {Obier, Nadine}, title = {Defining the end of pluripotency in mouse embryonic stem cells}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-53722}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Stammzellen mit ihrer besonderen F{\"a}higkeit sich selbst zu erneuern und zu differenzieren stellen einen faszinierenden Zelltyp f{\"u}r Grundlagenforschung und angewandte Wissenschaften dar. Pluripotente embryonale Stammzellen (ES Zellen), die aus Zellen der inneren Zellmasse von Pr{\"a}implantationsembryonen etabliert werden, k{\"o}nnen ekto-, meso- und endodermale Zelltypen sowie Keimzellen hervorbringen. Im Gegensatz dazu sind multipotente adulte Stammzellen in ihrem Entwicklungspotential eingeschr{\"a}nkt, sie differenzieren sich zu allen Zelltypen ihres Gewebes. Zum Beispiel h{\"a}matopoetische Stammzellen (HSZs), die sich in Blut-bildenden Geweben wie dem Knochenmark befinden, verm{\"o}gen sich in alle Blutzellen zu differenzieren. W{\"a}hrend der Differenzierung von Stammzellen {\"a}ndert sich nicht deren Genom, sondern ihre epigenetische Regulation. Durch epigenetische Mechanismen werden Zelltypen mit verschiedensten Ph{\"a}notypen und Funktionen generiert. F{\"u}r Stammzelltherapien ist ein tieferes Verst{\"a}ndnis des Zusammenhangs von Epigenom und zellul{\"a}rer Funktion wichtig. Im Rahmen dieser Dissertation war es mein Ziel, differenzierende Stammzellkulturen auf ihre Genexpression, ihre Chromatinregulation und ihr Differenzierungspotiential hin zu analysieren. Um Histonmodifikationen, die einen m{\"o}glichen Mechanismus epigenetischer Regulation darstellen, global untersuchen zu k{\"o}nnen, sind zun{\"a}chst, durchusszytometrische Protokolle etabliert worden, die die Analyse einzelner Zellen erm{\"o}glichen sollten. Mit dieser Methode konnten reduzierte Levels von Histonazetylierung in differenzierten ES Zellen gezeigt werden. Im Gegensatz dazu beobachtete ich vergleichbare Levels von Histonazetylierung in unreifen und reifen Knochenmarkzellen. Zus{\"a}tzlich untersuchte ich die Wirkung des Histondeazetylase-Inhibitors (HDI) Trichostatin A (TSA) auf Knochenmarkzellkulturen, in denen auch HSZs enhalten sind. Nach Behandlung mit TSA erh{\"o}hte sich der Anteil von Zellen mit in vitro und in vivo h{\"a}matopoetischer Aktivit{\"a}t, w{\"a}hrend vor allem differenzierte Zellen in Apoptose gingen. Außerdem wurde der Verlust der Pluripotenz in differenzierenden ES Zellkulturen untersucht. Marker-basierte Analysen und funktionelle Tests wurden mit ES Zellen durchgef{\"u}hrt, die kurzfristig in vitro differenziert wurden. Es stellte sich heraus, dass nach funktionellen Gesichtspunkten die Pluripotenz bereits nach 2 Tagen Differenzierung deutlich reduziert war, beurteilt anhand der F{\"a}higkeit Kolonien zu bilden, embryoide K{\"o}rperchen (EK) zu formieren und zu kontrahierenden Herzmuskelzelltypen zu differenzieren. Im Gegensatz dazu verringerte sich die Expression von Pluripotenzmarkern erst zu sp{\"a}teren Zeitpunkten. Ich habe weiterhin beobachten k{\"o}nnen, dass die Wahl des Differenzierungssystems (Aggregations-EK, klonale EKs oder als adh{\"a}rente Einzelzellschicht) einen Einfluss auf den Fortschritt und die Homogenit{\"a}t der Differenzierung hatte. Um das Ende der Pluripotenz genauer zu untersuchen, wurden differenzierte ES Zellen zur{\"u}ck in ES Zellkulturbedingungen gebracht. Die Ergebnisse deuten an, dass 3 Tage differenzierte ES Zellen einen Punkt {\"u}berschritten haben, an dem eine R{\"u}ckkehr zur Pluripotenz allein durch Kulturbedingungen noch m{\"o}glich ist. Durch die Behandlung mit HDIs starben selektiv differenzierte ES Zellen. Des Weiteren war es Ziel dieser Arbeit, den Einuss von EED - einer essentiellen Untereinheit des Histon-methylierenden Polycomb repressive complex 2 (PRC2) - auf das Chromatin und die Funktion von ES Zellen hin zu analysieren. ES Zellen ohne EED wiesen neben dem bereits bekannten Verlust der Trimethylierung von Histon 3 an Lysin 27 (H3K27me3), global reduzierte H3K9me3 Levels sowie erh{\"o}hte Histonazetylierung auf. Trotz typischer ES Zell-Morphologie und normaler Expression von Pluripotenzgenen, besaßen EED knockout (KO)ES Zellen eine ver{\"a}nderte Organisation der Heterochromatinstruktur im Zellkern, eine verlangsamte Chromatinmobilit{\"a}t und Probleme bei der Differenzierung. Zusammenfassend gew{\"a}hren meine Daten Einblick in die epigenetische Regulation von Stammzellen. Im Besonderen konnte ich zeigen, dass die Behandlung mit HDIs f{\"u}r differenzierende Knochenmarkzellen und differenzierende ES Zellen nachteilig war und zu deren selektivem Zelltod f{\"u}hrte. Die hier durchgef{\"u}hrten Analysen ergaben, dass ES Zellen nach 3 Tagen Differenzierung das Ende der Pluripotenz erreicht hatten. Schließlich zeigten die Versuche mit EED KO ES Zellen, dass sie sich zwar selbst erneuerten und morphologisch identisch mit wildtypischen ES Zellen waren, jedoch Defekte bei der Differenzierung besaßen. Dies deutet darauf hin, dass EED nicht nur f{\"u}r undifferenzierte ES Zellen wichtig ist, sondern auch w{\"a}hrend der Differenzierung von Bedeutung ist.}, subject = {Stammzelle}, language = {en} } @phdthesis{Fischer2010, author = {Fischer, Matthias}, title = {Der Einfluß der Ribosomale S6 Kinase 2 (RSK2) auf das Neuriten- und Synapsenwachstum in vivo und in Zellkultur}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48341}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {In dieser Arbeit sollte die Funktion der Ribosomalen S6 Kinase 2 (RSK2) auf neuronaler Ebene untersucht werden. Dahingehend gab es, z.B. auf Grund der Ph{\"a}notypen von Fliegen und M{\"a}usen mit Mutationen im entsprechenden Gen oder von Patienten mit Coffin-Lowry-Syndrom (CLS) nur Vermutungen. Es bestand letztlich die Hoffnung, einen Beitrag zur Aufkl{\"a}rung der Pathophysiologie des CLS zu leisten. Es stellte sich auf Grund von Experimenten sowohl in vivo als auch in vitro in verschiedenen Modellsystemen in dieser Arbeit heraus, daß RSK2 einen negativen Einfluß auf das Neuriten- und Synapsenwachstum hat. In kultivierten Motoneuronen f{\"u}hrte der KO von RSK2 zu l{\"a}ngeren Axonen und die {\"U}berexpression eines konstitutiv aktiven RSK2-Konstrukts zu k{\"u}rzeren Axonen. In PC12-Zellen f{\"u}hrte die Expression von konstitutiv aktiven RSK2 Konstrukten zur Verk{\"u}rzung der Neuriten und die Expression eines Kinase-inaktiven RSK2 Konstrukts zu l{\"a}ngeren Neuriten. In vivo war die neuromuskul{\"a}re Synapse bei RSK2-KO M{\"a}usen vergr{\"o}ßert und hatte bei Drosophila rsk Mutanten mehr Boutons. Das RSK2-Protein ist in Motoneuronen der Maus und in {\"u}berexprimierter Form in den Boutons der neuromuskul{\"a}ren Synapse bei Drosophila nachweisbar. Damit wurde zum ersten Mal die Funktion von RSK2 auf neuronaler Ebene beschrieben. Bez{\"u}glich des Mechanismus, wie RSK2 das Nervenwachstum beeinflußt gab es deutliche Hinweise, die daf{\"u}r sprechen, daß RSK2 dies {\"u}ber eine in der Literatur schon h{\"a}ufiger beschriebene Hemmung der MAPK ERK1/2 erreicht. F{\"u}r diese Hypothese spricht die Tatsache, daß die ERK-Phosphorylierung in murinen Motoneuronen und im R{\"u}ckenmark embryonaler M{\"a}use der RSK2-Mutante erh{\"o}ht ist und der Axonwachstumsdefekt durch eine Hemmung von MEK/ERK behoben werden kann. Auch ist die ERK-Phosphorylierung an der murinen Muskel-Endplatte in der Mutante erh{\"o}ht. Zudem zeigen genetische Epistasis-Experimente in Drosophila, daß RSK die Bouton-Zahl {\"u}ber ERK/RL hemmt. RSK scheint also in Drosophila von der Funktion her der RSK2-Isoform in Wirbeltieren sehr {\"a}hnlich zu sein. Ein weiteres wichtiges Ergebnis ist die Beobachtung, daß RSK2 bei Motoneuronen keinen wesentlichen Einfluß auf das {\"U}berleben der Zellen in Gegenwart neurotropher Faktoren hat. M{\"o}glicherweise spielen hier redundante Funktionen der RSK Familienmitglieder eine Rolle. Ein bislang unerkl{\"a}rter Befund ist die reduzierte Frequenz spontaner Depolarisationen bzw. damit einhergehender Ca2+ Einstr{\"o}me bei RSK2-KO Motoneuronen in Zellkultur. Die H{\"a}ufigkeit und Dichte von Ca2+-Kan{\"a}len und aktive Zonen Proteinen war in Motoneuronen nicht von der Anwesenheit des RSK2-Proteins abh{\"a}ngig. Im Hippocampus konnte außerdem das RSK2-Protein pr{\"a}synaptisch in den Moosfaser-Boutons der CA3 Region nachgewiesen werden. Es befindet sich auch in den Pyramidenzellen, aber nicht in den Pyramidenzell-Dendriten in CA3. Bez{\"u}glich der Bedeutung dieser Befunde f{\"u}r die Aufkl{\"a}rung der Pathologie des CLS ist zu folgern, daß der neuro-psychologische Ph{\"a}notyp bei CLS Patienten wahrscheinlich nicht durch reduziertes {\"U}berleben von Neuronen, sondern eher durch disinhibiertes Axonwachstum oder Synapsenwachstum bedingt ist. Dies kann grob sowohl f{\"u}r die peripheren als auch die zentralen Defekte gelten, denn die Synapsen im ZNS und am Muskel sind in ihrer molekularen Ausstattung z.B. im Bereich der Vesikel, der aktiven Zonen oder der Transmitteraussch{\"u}ttung sehr {\"a}hnlich. Weiterhin k{\"o}nnte eine ver{\"a}nderte synaptische Plastizit{\"a}t u.a. an der Moosfaser-Pyramidenzell-Synapse in der CA3 Region des Hippocampus eine Rolle bei den kognitiven und mnestischen Einschr{\"a}nkungen der Patienten spielen. Die Entdeckung, daß aktiviertes ERK bei den beobachteten Effekten eine Rolle spielt kann f{\"u}r die Entwicklung von Therapiestrategien eine wertvolle Erkenntnis sein.}, subject = {Ribosom}, language = {de} } @phdthesis{Ondrusch2010, author = {Ondrusch, Nicolai}, title = {Der Thiol:Disulfid-Redox Metabolismus und der Blaulichtrezeptor Lmo0799 von Listeria monocytogenes}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52612}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Der Thiol-Redox-Metabolismus, der in allen lebenden Zellen zu finden ist, wirkt oxidativem Stress entgegen. Des Weiteren dient er auch der Aufrechterhaltung der intrazellul{\"a}ren Thiol:Disulfid-Balance, die wiederum f{\"u}r die Funktion vieler Proteine essentiell ist. Auch stellt er Reduktions{\"a}quivalente f{\"u}r die Produktion von Desoxyribonucleotiden f{\"u}r die DNA-Synthese bereit und hilft oxidierte Proteine zu reparieren. Der Thiol:Disulfid-Redox-Metabolismus (TDRM) unterscheidet sich von anderen metabolischen Netzwerken dadurch, dass keine Kohlenstoff- oder Stickstoffbindungen ver{\"a}ndert werden. In vielen F{\"a}llen beinhaltet er die reversible Oxidation zweier benachbarter Cysteinreste im entsprechenden Protein, was zur Ausbildung von Disulfidbr{\"u}cken f{\"u}hrt. Da ein totaler Ausfall der GSH-Synthese einen geringeren Effekt zu haben schien als ein teilweiser, wurden DNA-Microarray-Transkriptomanalysen der ΔgshF-Mutante durchgef{\"u}hrt. Es wurden rund 750 Gene als signifikant reguliert (p < 0,05, Fold-change <0,5 bzw. >2) identifiziert. Da die am st{\"a}rksten regulierten Gene von besonderem Interesse waren, wurden die Ausschlussgrenzen auf <0,2 bzw. >5 -fach reguliert heraufgesetzt. Diese Parameter trafen auf 92 Gene zu, davon 41 durch GSH-Mangel herauf-regulierte (d.h. die mRNA-Menge war in der Mutante h{\"o}her als im Wildtyp) und 51 herunter-regulierte. Auff{\"a}llig war, dass die Expression vieler Gene, welche durch den Stress-Sigmafaktor SigB reguliert werden, bei Fehlen von GSH ver{\"a}ndert war. Zu den am st{\"a}rksten (sechs- bis elffach) herauf-regulierten Genen z{\"a}hlen lmo0135-7, sie codieren f{\"u}r einen putativen Oligopeptidtransporter. Die Vermutung lag nahe, dass dieser evtl. GSH aus dem Medium in die Zellen transportieren k{\"o}nnte. Man kann also davon ausgehen, dass GSH von Listeria aktiv aus dem Medium aufgenommen wird und dass die Effekte, die im Versuch ohne zus{\"a}tzliches GSH auftreten, direkt auf das Fehlen von GSH zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind. Zusammengefasst zeigte sich, dass ein Ausfall der GSH-Synthese in Listeria keinen auff{\"a}lligen Ph{\"a}notyp zeigt. Es wurden jedoch sehr umfangreiche Ver{\"a}nderungen des Transkriptionsprofils beobachtet, offenbar konnten die Bakterien dadurch eine neue zellul{\"a}re Hom{\"o}ostase erreichen. Physiologische Mengen von GSH im Medium komplementierten den Ausfall der GSH-Synthese fast vollst{\"a}ndig. Im Laufe dieser Analysen fiel das Augenmerk auf ein Gen mit unbekannter Funktion, lmo0799, das in der ΔgshF-Mutante als deutlich heraufreguliert identifiziert worden war. Eine n{\"a}here in-silico-Analyse ergab deutliche Homologien des Lmo0799 Proteins zu einem Blaulicht-photorezeptor, YtvA, von Bacillus subtilis. Da ein Zusammenhang mit dem TDRM aufgrund der Microarray-Analysen mehr als wahrscheinlich schien, richtete sich das Augenmerk verst{\"a}rkt auf die Charakterisierung des putativen Blaulichtrezeptors Lmo0799. Es wurde eine In-Frame-Deletionsmutante in lmo0799 hergestellt, die mit Δlmo0799-Mutante bezeichnet wurde. Darin ist das urspr{\"u}nglich 253 Aminos{\"a}uren (AS) große Genprodukt von lmo0799 auf sieben AS verk{\"u}rzt, ohne den Promotor- oder Terminatorbereich bzw. umliegende Gene zu ver{\"a}ndern. Parallel wurde begonnen, Versuche zum Einfluss von Licht (blau, λ=455nm bzw. rot, λ=625nm) in vivo und in vitro auf L. monocytogenes durchzuf{\"u}hren. Versuche mittels qRT-PCR wurden durchgef{\"u}hrt um die genaue Wirkweise von Lmo0799 n{\"a}her aufzukl{\"a}ren. Dazu wurden Testgene aus verschiedenen Regulons ausgew{\"a}hlt und deren Transkription in Proben von Wildtyp und Δlmo0799-Mutante mit und ohne blauem bzw. rotem Licht sowie mit und ohne Salzstress gemessen. Dabei zeigte sich, dass vor allem die Transkription von Genen des SigB-Regulons, das f{\"u}r die allgemeine Stressantwort in Listerien zust{\"a}ndig ist, durch Licht moduliert wurde. Die Wirkung von Blaulicht hing in hohem Maße von der Anwesenheit von Lmo0799 ab, welches wahrscheinlich eine Komponente des „Stressosoms" von Listeria darstellt. Die Lichtregulation betraf auch die Internaline A und B, deren Transkription durch Belichtung stark erh{\"o}ht wurde. Infektionsversuche mit blau belichteten bzw. dunkel gehaltenen Wildtyp- bzw. Δlmo0799-Bakterien an humanen Caco-2 Enterozyten zeigten, dass wildtypische Listerien nach Bestrahlung mit blauem Licht ihre Invasionsrate verdoppelten, w{\"a}hrend die Δlmo0799-Listerien auf Niveau der Dunkelkontrolle blieben. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass L. monocytogenes (und wohl auch die anderen Listeria-Arten) in Lmo0799 einen funktionalen Blaulichtrezeptor besitzt, der eine wichtige Rolle in der Vermittlung von Stressreizen via SigB spielt und auch die Motilit{\"a}t und Virulenz moduliert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass auch rotes Licht die Transkription zahlreicher durch Blaulicht regulierter Gene beeinflusst. Der molekulare Mechanismus konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr aufgekl{\"a}rt werden.}, subject = {Listeria monocytogenes}, language = {de} } @phdthesis{Heisig2010, author = {Heisig, Martin}, title = {Development of novel Listeria monocytogenes strains as therapeutic agents for targeted tumor therapy}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48628}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Despite marked progress in development and improvement of cancer therapies the rate of cancer related death remained stable over the last years. Especially in treating metastases alternative approaches supporting current therapies are required. Bacterial and viral vectors have been advanced from crude tools into highly sophisticated therapeutic agents detecting and treating neoplastic leasions. They might be potent enough to fill in this therapeutic demand. In this thesis Listeria monocytogenes was investigated as carrier for targeted bacterial cancer therapy. One part of the study focussed on modification of a functional bacterial mRNA delivery system. Genomic integration of T7 RNA polymerase driving mRNA production allowed reduction to an one-plasmid-system and thereby partially relieved the growth retardation exerted by mRNA delivery. Importantly the integration allowed metabolic attenuation of the mRNA delivery mutant potentially enabling in vivo applications. Further expansion of the bacterial RNA delivery system for transfer of shRNAs was examined. Bacterial mutants producing high amounts of RNA containing shRNA sequences were constructed, however a functional proof of gene silencing on delivery in eukaryotic cell lines was not achieved. The second part of this thesis focussed on increasing tumor colonization by Listeria monocytogenes in vivo. Coating bacteria with antibodies against receptors overexpressed on distinct tumor cell lines enabled specific bacterial internalization into these cells in vitro. Optimization of the bacterial antibody coating process resulted in an up to 104-fold increase of intracellular bacteria. Combination of this antibody-mediated targeting with the delivery of prodrug-converting enzymes showed a cytotoxic effect in cell lines treated with the corresponding prodrug. Since incubation in murine serum completely abrogated antibodymediated bacterial internalization the antibodies were covalently linked to the bacteria for application in xenografted tumor mice. Bacteria coated and crosslinked in this manner showed enhanced tumor targeting in a murine tumor model demonstrating antibodymediated bacterial tumor targeting in vivo. Independent of antibody-mediated tumor targeting the intrinsic tumor colonization of different Listeria monocytogenes mutants was examined. Listeria monocytogenes \&\#916;aroA \&\#916;inlGHE colonized murine melanoma xenografts highly efficient, reaching up to 108 CFU per gram of tumor mass 7 days post infection. Taken together the presented data shows highly promising aspects for potential bacterial application in future tumor therapies. Combination of the delivery systems with antibodymediated- and intrinsic bacterial tumor targeting might open novel dimensions utilizing Listeria monocytogenes as therapeutic vector in targeted tumor therapy.}, subject = {Krebs }, language = {en} } @phdthesis{HaddadWeber2010, author = {Haddad-Weber, Meike}, title = {Development of stem cell-based ACL- and tendon reconstruction}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-66796}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Ruptures of the anterior cruciate ligament (ACL) and defects of the rotator cuff represent the most common ligament and tendon injuries in knee and shoulder. Both injuries represent significant implications for the patients. After an injury, the ACL and the rotator cuff both exhibit poor intrinsic healing capacities. In order to prevent further defects such as arthritis of the knee and fatty infiltration of the rotator cuff, surgical interaction is essential. In both cases, the currently used surgical techniques are far from optimal because even after the therapy many patients report problems ranging from pain and reduced mobility to complete dysfunction of the involved joint and muscles. Tissue engineering may be a possible solution. It is a promising field of regenerative medicine and might be an advantageous alternative for the treatment of musculoskeletal injuries and diseases in the near future. In this thesis, different tissue engineering based approaches were investigated. For the reconstruction of damaged or diseased ligaments and tendons, the use of MSCs and gene therapy with growth factors is especially suitable and possesses a great therapeutic potential. Therefore, the first method studied and tested in this thesis was the development of a biomaterial based construct for the repair of a ruptured ACL. The second approach represents a cell based strategy for the treatment of the fatty infiltration in the rotator cuff. The third approach was a combined cell, biomaterial, and growth factor based strategy for ACL ruptures. Biomaterial based ACL construct The implant is currently tested in a preclinical in vivo study in mini pigs. This proof-of-principle study is performed to validate the functional capability of the collagen fiber based implant under load in vivo and its population with fibroblasts which produce a ligamentogenic matrix. Cell based treatment of the fatty infiltration in the rotator cuff Regarding the treatment of the fatty infiltration of the rotator cuff in a rabbit model, the in vivo results are also promising. The group treated with autologous MSCs (+MSC group) showed a lower fat content than the untreated group (-MSC group) 6 weeks after the treatment. Furthermore, the SSP muscle of the MSC-treated animals revealed macroscopically and microscopically only few differences compared to the healthy control group. The exact underlying mechanisms leading to the positive results of the treatment are not yet fully understood and have therefore to be further investigated in the future. Cell, biomaterial, and growth factor based treatment of ACL ruptures Studies described in current literature show that collagen hydrogel scaffolds are not ideal for a complete ligament or tendon reconstruction, because of their insufficient mechanical stability. Introduced as an alternative and superior therapy, the combined strategy used in this thesis proves that the cultivation of BMP-12, -13, and IGF-1 transduced MSCs and ACL fibroblasts in a collagen hydrogel is successful. The results of the performed in vitro study reveal that the cells exhibit a fibroblastic appearance and produce a ligamentogenic matrix after 3 weeks. Furthermore, the adenoviral transduction of MSCs and ACL fibroblasts showed no negative effects on proliferation or viability of the cells nor was apoptosis caused. Therefore, the application of these cells represents a possible future therapy for a partial ligament and tendon rupture where the mechanical stability of the remaining ligament or tendon is sufficient and the healing can be improved substantially by this therapy. In general, prospective randomized clinical trials still have to prove the postulated positive effect of MSCs for the treatment of various musculoskeletal diseases, but the results obtained here are already very promising. Ideally, the treatment with MSCs is superior compared to the standard surgical procedures. Because of current safety issues the use of genetically modified cells cannot be expected to be applied clinically in the near future. In summary, the different tissue engineering approaches for novel therapies for musculoskeletal injuries and diseases invested in this thesis showed very promising results and will be further developed and tested in preclinical and clinical trials.}, subject = {Kreuzband}, language = {en} } @phdthesis{Heinecke2010, author = {Heinecke, Kai}, title = {Die Dynamik der prim{\"a}ren Erkennungsschritte von BMP-Rezeptoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-49257}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden zusammen mit den Activinen, Growth and Differentiation Factors (GDFs) und Transforming Growth Factor \&\#946; (TGF-\&\#946;) die Transforming Growth Factor \&\#946;-Superfamilie von sekretierten Signalproteinen. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung, Erhaltung und Regeneration von Geweben und Organen. Die Signalvermittlung dieser Proteine erfolgt durch die Bindung von zwei verschiedenen Typen von Serin-/Threonin-Kinaserezeptoren, die als Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren bezeichnet werden. Im ersten Schritt erfolgt die Bindung an den hochaffinen Rezeptor (im Fall von BMP-2 der Typ-I-Rezeptor), im n{\"a}chsten Schritt wird der niederaffine Rezeptor in den Komplex rekrutiert. Bis heute sind lediglich sieben Typ-I- und f{\"u}nf Typ-II-Rezeptoren bekannt, was auf eine Promiskuit{\"a}t in der Liganden-Rezeptor-Interaktion schließen l{\"a}sst. Die Architektur beider Rezeptorsubtypen ist dabei relativ {\"a}hnlich. Beide bestehen aus einer ligandenbindenden extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne, einer Transmembrandom{\"a}ne sowie einer intrazellul{\"a}ren Kinasedom{\"a}ne. Eine nacheinander ablaufende Transphosphorylierung der intrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen f{\"u}hrt zu einer Phosphorylierung von SMAD-Proteinen, die dann als nachgeschaltete Vermittler fungieren und die Transkription regulierter Gene ausl{\"o}sen. Im Hauptteil dieser Arbeit wurden die initialen Schritte der Rezeptorkomplexformierung sowie die Mobilit{\"a}t der Rezeptoren mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass f{\"u}r die Bildung eines Signalkomplexes eine bestimmte Schwellenkonzentration des Liganden n{\"o}tig ist und dass der Mechanismus nach einem Alles-oder-Nichts-Prinzip wie ein Schalter funktioniert. Außerdem konnten Unterschiede in der Nutzung der gleichen Rezeptoren durch verschiedene Liganden festgestellt werden. Die anderen Teile der Arbeit befassen sich mit der Funktionalit{\"a}t der verschiedenen Rezeptordom{\"a}nen in der Signal{\"u}bermittlung, der Analyse von hoch- und niederaffinen Ligandenbindestellen auf ganzen Zellen sowie dem Einfluss des SMAD- und des MAPK-Signalwegs auf die Induktion der Alkalischen Phosphatase. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Art der SMAD-Phosphorylierung allein vom Typ der Kinasedom{\"a}ne abh{\"a}ngig ist, dass auf einer Zelle verschiedene Rezeptorpopulationen existieren, welche von unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen angesprochen werden, und dass die Induktion der Alkalischen Phosphatase stark vom zeitlichen Verlauf der SMAD- und MAPK-Aktivierung abh{\"a}ngig ist.}, subject = {Knochen-Morphogenese-Proteine}, language = {de} } @phdthesis{Mueller2010, author = {M{\"u}ller, Judith}, title = {Die Rolle der HectH9/Mcl1-Interaktion in der Myc-induzierten Apoptose und Auswirkungen der Myc V394D-Mutation auf die von c-Myc gesteuerten Tumorgenese in einem transgenen Mausmodell}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55789}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {W{\"a}hrend der Entstehung von Tumoren k{\"o}nnen zwei Mechanismen auftreten, die beide von der Aktivit{\"a}t der Onkogene abh{\"a}ngig sind und die Tumorgenese einschr{\"a}nken. F{\"u}r das Onkogen Myc ist gezeigt, dass es sowohl Apoptose als auch unter bestimmten Umst{\"a}nden Seneszenz ausl{\"o}sen kann und damit sein eigenes onkogenes Potential limitiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich mich mit diesen Tumor-suppressiven Mechanismen in zwei unabh{\"a}ngigen Teilprojekten besch{\"a}ftigen. Eine erh{\"o}hte Expression von Myc steigert die Proliferation der Zellen, induziert aber gleichzeitig Doppelstrangbr{\"u}che an der DNA. Durch den dadurch entstandenen Schaden wird die DNA-Schadensantwort ausgel{\"o}st, die zum Beispiel zur Phosphorylierung von H2A.X durch die Kinasen Atm und Atr f{\"u}hrt. Ein weiteres putatives Zielprotein dieser Kinasen ist HectH9, das abh{\"a}ngig vom DNA-Schaden das mitochondriale Protein Mcl1 ubiquitiniert und es damit f{\"u}r den proteasomalen Abbau markiert. Im ungestressten Zustand interagiert das in der mitochondrialen Membran lokalisierte Protein Mcl1 mit proapoptotischen Proteinen und h{\"a}lt deren inerten Status aufrecht. Die Reduktion der Mcl1-Mengen ist essentiell, um die proapoptotischen Proteine zu aktivieren, dadurch die Freisetzung von Zytochrom C aus dem Mitochondrium zu veranlassen und damit den Prozess der Apoptose einleiten zu k{\"o}nnen. Anhand der in dieser Arbeit dokumentierten Daten bietet sich Mcl1 als potentielles Zielprotein f{\"u}r pharmazeutisch Strategien zur Therapie Myc-induzierter Tumore an. Im Idealfall erh{\"o}ht eine verst{\"a}rkte Reduktion seiner Proteinmengen die zellul{\"a}re Apoptose und verringert somit das Tumorwachstum. Im murinen T-Zell-Lymphom wird die Myc-abh{\"a}ngige Tumorgenese durch eine Mutation der Proteinsequenz von Myc verlangsamt. Diese Mutation unterbindet die Bindung von Myc zu Miz1 und verhindert dadurch die Repression von Zielgenen. Abh{\"a}ngig von der Interaktion von Myc zu Miz1 gelingt die Inhibition der Transkription des Zellzyklusinhibitors p15Ink4b. Die Interaktion von Myc und Miz1 ist essentiell um die TGFbeta-abh{\"a}ngige Seneszenz zu umgehen. Dar{\"u}ber hinaus ist Myc direkt an der Repression von TGFbeta beteiligt. Entgegen der bisher verwendeten Modelle konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Myc unabh{\"a}ngig von Miz1 zu den Promotoren der reprimierten Zielgene rekrutiert wird und die Bindung der beiden Proteine offensichtlich nur f{\"u}r die Transrepression essentiell ist.}, subject = {Myc}, language = {de} } @phdthesis{Puehringer2010, author = {P{\"u}hringer, Dirk}, title = {Die Transaktivierung des Neurotrophin-Rezeptors TrkB durch EGF w{\"a}hrend der Kortexentwicklung der Maus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-50049}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Die Rolle der Hirnrinde als Zentrum komplexer Funktionen wie Lernen und Ge-d{\"a}chtnis wird nicht zuletzt durch deren komplexe, in Schichten organisierte Architek-tur erm{\"o}glicht. Von entscheidender Bedeutung ist die pr{\"a}zise Positionierung von Nervenzellen, die im Laufe der Embryonalentwicklung in der Ventrikularzone (VZ) geboren werden und anschließend in radialer Richtung zu ihrem Bestimmungsort wandern. Die Funktion des Neurotrophin-Rezeptors TrkB an der Entwicklung des zerebralen Kortex war Gegenstand dieser Arbeit. Am Tag 12,5 der Embryonalentwicklung konnte die Expression von TrkB so-wohl in den Zellen der VZ als auch in neu geborenen Neuronen der Pr{\"a}platte nach-gewiesen werden. Die Phosphorylierung des Rezeptors erfolgte dabei unabh{\"a}ngig von den beiden Liganden BDNF und NT-3. Ebenso f{\"u}hrten BDNF oder NT-3 zu keiner zellul{\"a}ren Antwort in isolierten kortikalen Vorl{\"a}uferzellen, wohingegen die Stimulation mit EGF eine Phosphorylierung von TrkB an der PLC\&\#947;- und der Shc-Bindungsstelle hervorrief. Durch pharmakologische Inhibition und die {\"U}berexpression dominant negativer Src-Mutanten konnte die Beteiligung des EGF-Rezeptors und zweier neuronal exprimierter Src-Kinasen, cSrc und Fyn, an dieser Transaktivierung von TrkB durch EGF gezeigt werden. Durch die Zugabe von EGF kam es im Zuge der Aktivierung von TrkB auch zur Umverteilung des Rezeptors von intrazellul{\"a}ren Kompartimenten zur Zellmem-bran. Die Retention des Rezeptors im Zytoplasma wurde {\"u}ber post-translationelle Modifikation reguliert. Die Verhinderung von N-Glykosylierung durch Tunicamycin-Behandlung kortikaler Vorl{\"a}uferzellen f{\"u}hrte zur Exposition von TrkB an der Zellober-fl{\"a}che und konnte so Responsivit{\"a}t gegen{\"u}ber BDNF herstellen. Die physiologische Bedeutung einer Transaktivierung von TrkB durch EGF wurde durch das Fehlen der TrkB-Aktivierung in EGFR KO-M{\"a}usen am Embryonal-tag 12,5 gezeigt. Dies hatte eine fehlerhafte Positionierung kortikaler Nervenzellen zum Zeitpunkt E15,5 zur Folge. Anhand eines Migrationsassays konnte schließlich gezeigt werden, dass die EGF-induzierte Wanderung kortikaler Vorl{\"a}uferzellen in vitro mit einer asymmetrischen Translokation von TrkB einhergeht. {\"U}ber die Transaktivierung von TrkB in fr{\"u}hen Phasen der Kortexentwicklung spielt EGF eine wichtige Rolle bei der Induktion neuronaler Differenzierung und ist an der Regulation der Wanderung postmitotischer Neurone in der Hirnrinde beteiligt.}, subject = {Großhirnrinde}, language = {de} } @phdthesis{Aso2010, author = {Aso, Yoshinori}, title = {Dissecting the neuronal circuit for olfactory learning in Drosophila}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55483}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {This thesis consists of three major chapters, each of which has been separately published or under the process for publication. The first chapter is about anatomical characterization of the mushroom body of adult Drosophila melanogaster. The mushroom body is the center for olfactory learning and many other functions in the insect brains. The functions of the mushroom body have been studied by utilizing the GAL4/UAS gene expression system. The present study characterized the expression patterns of the commonly used GAL4 drivers for the mushroom body intrinsic neurons, Kenyon cells. Thereby, we revealed the numerical composition of the different types of Kenyon cells and found one subtype of the Kenyon cells that have not been described. The second and third chapters together demonstrate that the multiple types of dopaminergic neurons mediate the aversive reinforcement signals to the mushroom body. They induce the parallel memory traces that constitute the different temporal domains of the aversive odor memory. In prior to these chapters, "General introduction and discussion" section reviews and discuss about the current understanding of neuronal circuit for olfactory learning in Drosophila.}, subject = {Taufliege}, language = {en} } @phdthesis{Reiss2010, author = {Reiß, Cora}, title = {Einfluss von Defekten des Mismatch Reparatur Proteins MLH1 (Mut L Homolog 1) auf Fertilit{\"a}t und Tumorgenese im Mausmodell}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-53626}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Mutationen im humanen DNA Mismatch-Reparatur (MMR) Gens Mlh1 sind mit dem erblichen, nicht-polyp{\"o}sen Kolonkarzinom (Lynch Syndrom, HNPCC) und einem signifikanten Anteil sporadischer kolorektaler Tumore assoziiert. Zudem konnten MMR Defekte in sporadischen und erblichen Lymphom Erkrankungen beschrieben werden. In Zellen resultiert die Inaktivierung des Mlh1 Gens in der Akkumulation von somatischen Mutationen im Genom und einer erh{\"o}hten Resistenz gegen{\"u}ber den genotoxischen Effekten einer Vielzahl von DNA sch{\"a}digenden Agenzien. M{\"a}use, die ein Null Allel f{\"u}r das MMR Gen Mlh1 tragen zeigen einen starken Tumorpr{\"a}dispositions Ph{\"a}notyp. Sie entwickeln vorrangig B- und T-Zell Lymphome und mit geringerer Haufigkeit gastrointestinale Tumore. Zus{\"a}tzlich sind Mlh1-/- M{\"a}use durch einen meiotischen Ph{\"a}notyp charakterisiert, der zu Sterilit{\"a}ten in beiden Geschlechtern f{\"u}hrt. Um die Effekte von Mlh1 missense Mutationen auf die Tumoranf{\"a}lligkeit zu untersuchen, erzeugten wir eine Mauslinie, die die h{\"a}ufig in HNPCC Patienten beschriebene MLH1G67R Mutation tragen, die in einer der ATP Bindungs-Dom{\"a}nen von MLH1 lokalisiert ist. Auch wenn die MLH1G67R Mutation in homozygot mutanten M{\"a}usen in einer DNA Reparatur Defizienz resultierte hatte sie keinen Effekt auf die MMR vermittelte zellul{\"a}re Antwort auf DNA Sch{\"a}den. Hierzu geh{\"o}rte die apoptotische Antwort von Epithelzellen der intestinalen Mucosa auf Cisplatin, die in Mlh1-/- M{\"a}usen defektiv jedoch in Mlh1G67R/G67R M{\"a}usen normal ausfiel. Mlh1G67R/G67R mutante M{\"a}use zeigten wie Mlh1-/- Tiere einen starken Tumorpr{\"a}dispositions Ph{\"a}notyp. Sie entwickelten jedoch im Vergleich zu Mlh1-/- Tieren signifikant weniger gastrointestinale Tumore, was darauf hinweist, dass Mlh1 missense Mutationen die Tumor supprimierende MMR Funktion in einer Gewebs-spezifischen Weise beeinflussen k{\"o}nnen. Dar{\"u}ber hinaus sind Mlh1G67R/G67R M{\"a}use, aufgrund der fehlenden Bindungsf{\"a}higkeit des MLH1G67R Proteins an die meiotischen Chromosomen im Pachyt{\"a}n Stadium, steril. Dies zeigt, dass die ATPase Aktivit{\"a}t von MLH1 f{\"u}r die Fertilit{\"a}t in S{\"a}ugern essentiell ist. Diese Untersuchungen belegen, dass die Mlh1G67R Mutation die biologischen MLH1 Funktionen differentiell mit einem eindeutigen Ph{\"a}notyp beeinflusst. Um die Rolle von MLH1 f{\"u}r die Lymphomagenese detaillierter untersuchen zu k{\"o}nnen, generierten wir ein neues Mausmodell mit einem konditionellen Mlh1 Allel (Mlh1flox/flox). Das Einkreuzen von transgenen EIIa-Cre Mausen in die Mlh1flox/flox Mauslinie f{\"u}hrte zur konstitutiven Inaktivierung von MLH1. Die resultierende Mlh1Δex4/Δex4 Mauslinie zeichnete sich durch MMR Defizienz und einen zu Mlh1-/- Tieren vergleichbaren Tumorpr{\"a}dispositions Ph{\"a}notyp aus. Zur T-Zell spezifischen MMR Inaktivierung kombinierten wir das Mlh1flox/flox Allel mit dem Lck-Cre Transgen. In den resultierenden Mlh1TΔex4/TΔex4 M{\"a}usen ist die MLH1 Inaktivierung auf doppelt positive und einzel positive Thymozyten und na{\"i}ve periphere TZellen beschr{\"a}nkt. Die Entwicklung von T-Zell Lymphomen in Mlh1TΔex4/TΔex4 M{\"a}usen ist im Vergleich zu Mlh1-/- M{\"a}usen signifikant reduziert, was eine wichtige, Lymphom supprimierende MMR Funktion in fr{\"u}hen Stadien der T-Zell Entwicklung oder in lymphoiden Vorl{\"a}uferzellen impliziert.}, subject = {Colonkrebs}, language = {de} } @phdthesis{Mumm2010, author = {Mumm, Patrick}, title = {Elektrophysiologische Untersuchungen der Ionenfl{\"u}sse und ihrer Regulation in Stomakomplex-bildenden Zellen von Zea mays und Schließzellen von Arabidopsis thaliana}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-49267}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {1. Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse hinsichtlich des angenomme-nen gerichteten Ionentransports zwischen Schließ- und Nebenzellen von Zea mays gewonnen werden: a. Mittels der Patch-Clamp-Technik wurden in beiden Zelltypen S-Typ-{\"a}hnliche Anionenkan{\"a}le identifiziert. In Nebenzellen konnten sie durch steigende zytosolische Ca2+-Konzentrationen gehemmt und durch ABA und zytosolische Alkalisierung stimuliert werden. Die S-Typ-Anionenkan{\"a}le der Schließzellen wurden hingegen durch eine Alkalisierung kaum beeinflusst und durch steigende zytosolische Ca2+-Konzentrationen stimuliert. b. Dar{\"u}ber hinaus konnte an intakten Mais-Pflanzen mit der Einstich-Elektroden-Technik gezeigt werden, dass Nebenzellen eine gegenl{\"a}ufige Polarisation des Membranpotentials w{\"a}hrend der Licht-/Dunkel-induzierten Stomabewegung aufweisen. Da das Membranpotential der Nebenzellen von Hordeum vulgare ein zu Mais {\"a}hnliches Verhalten w{\"a}hrend der Stomabewegung zeigte und gegenl{\"a}u-fig zur Membranpolarisation der benachbarten Schließzellen war, ist ein {\"a}hnli-ches Verhalten bei Zea mays Schließzellen naheliegend. c. Zudem wurde in intakten Nebenzellen von Zea mays eine zytosolische Alkali-sierung w{\"a}hrend der Licht-induzierten Stoma{\"o}ffnung beobachtet, die bei Stomaschluss wieder auf den Ursprungswert zur{\"u}ckkehrte. d. Mit Hilfe rekonstruktierter 3D-Modelle von intakten Mais-Stomakomplexen konnte ein Volumenverh{\"a}ltnis zwischen Schließ- und Nebenzellen von 1:6 bzw. 1:4 bei ge{\"o}ffneten und geschlossenen Stomata ermittelt werden. Unter Einbeziehung der Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten die hier gewon-nenen Erkenntnisse schl{\"u}ssig in ein Modell zur Beschreibung des Shuttle-Ionentransports zwischen Neben- und Schließzellen w{\"a}hrend der Licht-induzierten Stomabewegung eingebunden werden. 2. Des Weiteren wurden die S-Typ-Anionenstromantworten von A. thaliana Schließ-zellen in Patch-Clamp-Experimenten n{\"a}her untersucht. Dabei waren die S-Typ-Anionenstr{\"o}me bei Ca2+- bzw. ABA-Stimulation in CPK23- und OST1-Verlustmutanten im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert. Diese in vivo generierten Daten untermauern die in vitro Ergebnisse der Arbeitsgruppe von Prof. R. Hedrich (Universit{\"a}t W{\"u}rzburg), dass OST1 und CPK23 Interaktionspartner des S-Typ-Anionenkanals SLAC1 in A. thaliana sind. Das SLAC1-homologe Gen SLAH3 ko-diert f{\"u}r einen Nitrat-permeablen S-Typ-Anionenkanal in Schließzellen, der zudem durch externes Nitrat aktiviert wird. Da in slac1-3 Verlustmutanten S-Typ-{\"a}hnliche Anionenstr{\"o}me generiert werden konnten, wenn Nitrat das dominierende Anion dar-stellte oder den Chlorid-basierten L{\"o}sungen externes Nitrat zugegeben wurde, scheint SLAH3 unter bestimmten Bedingungen einen alternativen Weg f{\"u}r die Ent-lassung von Anionen aus der Schließzelle darzustellen. 3. Die elektrophysiologische Charakterisierung der R-Typ-Anionenkan{\"a}le in A. thaliana Schließzellen belegt, dass dieser Kanal {\"a}hnliche Grundcharakteristika aufweist, die schon in Vicia faba beschrieben wurden: eine starke Spannungsab¬h{\"a}ngigkeit, sowie schnelle Aktivierungs- und Deaktivierungskinetiken. Im Gegensatz zu Vicia faba wurde die Spannungsabh{\"a}ngigkeit dieses Kanaltyps in A. thaliana nicht durch externes Malat beeinflusst. Jedoch war unter externen Malatbedingungen die Stromantwort einer almt12-Verlustmutante im Vergleich zu Wildtyp-Schließzellen erheblich reduziert, w{\"a}hrend unter externen Sulfatbe¬dingungen keine Unterschiede zwischen Wildtyp und almt12-Verlustmutante auszu¬machen waren. ALMT12 scheint demnach f{\"u}r den Malat-aktivierten Teil des R-Typ-Anionenkanals verantwortlich zu sein.}, subject = {Schließzelle}, language = {de} } @phdthesis{Deuchert2010, author = {Deuchert, Thomas}, title = {Entwicklung eines experimentellen Systems zur Untersuchung der subzellul{\"a}ren Lokalisierung der Alpha-Methylacyl-CoA-Racemase}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-46495}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Entwicklung eines experimentellen Systems zur Untersuchung der subzellul{\"a}renLokalisierung der Alpha-Methylacyl-CoA-Racemase (AMACR) (Methode der retroviralen Transfektion von transformierten, embryonalen Mausfibroblasten)}, subject = {Alpha-Methylacyl-CoA-Racemase}, language = {de} } @phdthesis{Bauchart2010, author = {Bauchart, Philippe Michel Paul}, title = {Evaluation of the Zoonotic Risk of Escherichia coli Strains involved in Extraintestinal Infections of Humans and Animals. Characterization of New Virulences Factors in ExPEC}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48848}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) represent a subset of the so-called extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) pathotype that can cause various extraintestinal infections in humans and animals. APEC are the causative agent of localized colibacillosis or systemic infection in poultry. In this latter case, the syndrome starts as an infection of the upper respiratory tract and develops into a systemic infection. Generally, ExPEC are characterized by a broad variety of virulence-associated factors that may contribute to pathogenesis. Major virulence factors, however, that clearly define this pathotype, have not been identified. Instead, virulence-associated genes of ExPEC and thus also of APEC could be used in a mix-and-match-fashion. Both pathotypes could not be clearly distinguished by molecular epidemiology, and this suggested a hypothetical zoonotic risk caused by APEC. Accordingly, the main scientific question of this study was to characterize common traits as well as differences of APEC and human ExPEC variants that could either support the possible zoonotic risk posed by these pathogenic E. coli strains or indicate factors involved in host specificity. Comparative genomic analysis of selected APEC and human ExPEC isolates of the same serotype indicated that these variants could not be clearly distinguished on the basis of (i) general phenotypes, (ii) phylogeny, (iii) the presence of typical ExPEC virulence genes, and (iv) the presence of pathoadaptive mutations. Allelic variations in genes coding for adhesins such as MatB and CsgA or their regulators MatA and CsgD have been observed, but further studies are required to analyze their impact on pathogenicity. On this background, the second part of this thesis focused on the analysis of differences between human ExPEC and APEC isolates at the gene expression level. The analysis of gene expression of APEC and human ExPEC under growth conditions that mimick their hosts should answer the question whether these bacterial variants may express factors required for their host-specificity. The transcriptomes of APEC strain BEN374 and human ExPEC isolate IHE3034 were compared to decipher whether there was a specific or common behavior of APEC and human ExPEC, in response to the different body temperatures of man (37°C) or poultry (41°C). Only a few genes were induced at 41 °C in each strain relative to growth at 37 °C. The group of down-regulated genes in both strains was markedly bigger and mainly included motility and chemotaxis genes. The results obtained from the transcriptome, genomic as well as phenotypic comparison of human ExPEC and APEC, supports the idea of a potential zoonotic risk of APEC and certain human ExPEC variants. In the third part of the thesis, the focus was set on the characterization of Mat fimbriae, and their potential role during ExPEC infection. Comparison of the mat gene cluster in K-12 strain MG1655 and O18:K1 isolate IHE3034 led to the discovery of differences in (i) DNA sequence, (ii) the presence of transcriptional start and transcription factor binding sites as well as (iii) the structure of the matA upstream region that account for the different regulation of Mat fimbriae expression in these strains. A negative role of the H-NS protein on Mat fimbriae expression was also proven at 20 °C and 37 °C by real-time PCR. A major role of this fimbrial adhesin was demonstrated for biofilm formation, but a significant role of Mat fimbriae for APEC in vivo virulence could not yet be determined. Interestingly, the absence of either a functional matA gene or that of the structural genes matBCDEF independently resulted in upregulation of motility in E. coli strains MG1655 and IHE3034 by a so far unknown mechanism. In conclusion, the results of this thesis indicate a considerable overlap between human and animal ExPEC strains in terms of genome content and phenotypes. It becomes more and more apparent that the presence of a common set of virulence-associated genes among ExPEC strains as well as similar virulence gene expression patterns and phylogenetic backgrounds indicate a significant zoonotic risk of avian-derived E. coli isolates. In addition, new virulence factors identified in human ExPEC may also play a role in the pathogenesis of avian ExPEC.}, subject = {Escherichia coli}, language = {en} } @phdthesis{Schielke2010, author = {Schielke, Stephanie}, title = {Functional and molecular characterization of FarR - a transcriptional regulator of the MarR family in Neisseria meningitidis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48550}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Neisseria meningitidis is a facultatively pathogenic human commensal and strictly adapted to its niche within the human host, the nasopharynx. Not much is known about the regulatory processes required for adaptation to this environment. Therefore the role of the transcriptional regulator NMB1843, one of the two predicted regulators of the MarR family in the meningococcal genome, was investigated. As this gene displayed a high sequence homology to FarR, the Fatty acid resistance Regulator in N. gonorrhoeae, we designated the meningococcal protein FarR (NmFarR). Homology modeling of this protein revealed a dimeric structure with the characteristic winged helix-turn-helix DNA binding motif of the MarR family. NmFarR is highly conserved among meningococcal strains and expression of farR during exponential growth is controlled post-transcriptionally, being highest in the late exponential phase. By means of electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) the direct and specific binding of FarR to the farAB promoter region was shown, comparable to its homologue in gonococci. As FarR is involved in fatty acid resistance in N. gonorrhoeae, susceptibility assays with the medium chain lauric acid (C12:0), the long chain saturated palmitic acid (C16:0) and the long chain unsaturated linoleic acid (C18:2) were performed, testing a wide variety of strains of both species. In contrast to the unusually susceptible gonococci, a high intrinsic fatty acid resistance was detected in almost all meningococcal isolates. The molecular basis for this intrinsic resistance in N. meningitidis was elucidated, showing that both a functional FarAB efflux pump system as well as an intact lipopolysaccharide (LPS) are responsible for palmitic acid resistance. However, even despite circumvention of the intrinsic resistance, FarR could not be connected with fatty acid resistance in meningococci. Instead, FarR was shown to directly and specifically repress expression of the Neisseria adhesin A (nadA), a promising vaccine candidate absent in N. gonorrhoeae. Microarray analyses verified these results and disclosed no further similarly regulated genes, rendering the FarR regulon the smallest regulon in meningococci reported until now. The exact FarR binding site within the nadA promoter region was identified as a 16 bp palindromic repeat and its influence on nadA transcription was proved by reporter gene fusion assays. This repression was also shown to be relevant for infection as farR deficient mutant strains displayed an increased attachment to epithelial cells. Furthermore, farR transcription was attested to be repressed upon contact with active complement components within human serum. Concluding, it is shown that FarR adopted a role in meningococcal host niche adaptation, holding the balance between immune evasion by repressing the highly antigenic nadA and host cell attachment via this same adhesin.}, subject = {Transkription }, language = {en} } @phdthesis{Agarwal2010, author = {Agarwal, Shruti}, title = {Functional characterization of four CDK-like kinases and one Calmodulin-dependent kinase of the human malaria parasite, Plasmodium falciparum}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48522}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Malaria still persists as one of the deadliest infectious disease in addition to AIDS and tuberculosis. lt is a leading cause of high mortality and morbidity rates in the developing world despite of groundbreaking research on global eradication of the disease initiated by WHO, about half a century ago. Lack of a commercially available vaccine and rapid spread of drug resistance have hampered the attempts of extinguishing malaria, which still leads to an annual death toll of about one million people. Resistance to anti-malarial compounds thus renders search for new target proteins imperative. The kinome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum comprises representatives of most eukaryotic protein kinase groups, including kinases which regulate proliferation and differentiation processes. Several reports till date have suggested involvement of parasite kinases in the human host and as well as in the mosquito vector. Kinases essential for life cycle stages of the parasite represent promising targets for anti-malarial compounds thus, provoking characterization of additional malarial kinases. Despite extensive research on most plasmodial enzymes, very little information is available regarding the four identified members of the cyclin dependent kinase like kinase (CLK) family. Thus, the present thesis dealt with the functional characterization of four members of the PfCLK kinase family of the parasite denoted as PfCLK-1/Lammer, PfCLK-2, PfCLK-3 and PfCLK-4 with a special focus on the first two kinases. Additionally, one Ca2+/Calmodulin dependent putative kinase-related protein, PfPKRP, presumed to be involved in sexual stage development of the parasite, was investigated for its expression in the life cycle of the parasite. In other eukaryotes, CLK kinases regulate mRNA splicing through phosphorylation of Serine/Arginine-rich proteins. Transcription analysis revealed abundance of PfCLK kinase genes throughout the asexual blood stages and in gametocytes. By reverse genetics approach it was demonstrated that all four kinases are essential for completion of the asexual replication cycle of P. falciparum. PfCLK 1/Lammer possesses two nuclear localization signals and PfCLK-2 possesses one of these signals upstream of the C-terminal catalytic domains. Protein level expression and sub-cellular localization of the two kinases was determined by generation of antiserum directed against the kinase domains of the respective kinase. Indirect immunofluorescence, Western blot and electron microscopy data confirm that the kinases are primarily localized in the parasite nucleus, and in vitro assays show that both enzymes are associated with phosphorylation activity. Finally, mass spectrometric analysis of co immunoprecipitated proteins shows interactions of the two PfCLK kinases with proteins, which have putative nuclease, phosphatase or helicase functions. PfPKRP on the other hand is predominantly expressed during gametocyte differentiation as identified from transcriptional analysis. Antiserum directed against the catalytic domain of PfPKRP detected the protein expression profile in both asexual and gametocyte parasite lysates. Via immunofluorescence assay, the kinase was localized in the parasite cytoplasm in a punctuated manner, mostly in the gametocyte stages. Reverse genetics resulted in the generation of PfPKRP gene-disruptant parasites, thus demonstrating that unlike CLK kinases, PfPKRP is dispensable for asexual parasite survival and hence might have crucial role in sexual development of the parasite. On one hand, characterization of PfCLK kinases exemplified the kinases involved in parasite replication cycle. Successful gene-disruption and protein expression of PfPKRP kinase on the other hand, demonstrated a role of the kinase in sexual stage development of the parasite. Both kinase families therefore, represent potential candidates for anti-plasmodial compounds.}, subject = {Plasmodium falciparum}, language = {en} } @phdthesis{Looser2010, author = {Looser, Jens}, title = {Funktionelle Analyse der Photoaktivierten Adenylatzyklase (PAC) aus Euglena gracilis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48283}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Die Photoaktivierte Adenylatzyklase PAC ist in E. gracilis an der Phototaxis beteiligt und besteht aus den zwei unterschiedlich großen Proteinen PACalpha und PACbeta. Beide besitzen jeweils zwei FAD bindende (BLUF) Dom{\"a}nen F1 und F2 sowie zwei Zyklasedom{\"a}nen C1 und C2. An den Zyklasedom{\"a}nen findet die Umsetzung von ATP in cAMP statt und die BLUF-Dom{\"a}nen werden f{\"u}r die Lichtaktivierung ben{\"o}tigt. F{\"u}r diese Arbeit wurde PAC und Mutanten davon heterolog in Oocyten von Xenopus laevis exprimiert. PAC besitzt bereits im Dunkeln Adenylatzyklaseaktivit{\"a}t, die durch Belichtung erh{\"o}ht werden kann. Die Zunahme der Aktivit{\"a}t erfolgt mit einer Zeitkonstante von unter 100 ms, die Abnahme nach der Belichtung hat eine Zeitkonstante im Bereich von 10ms. Das f{\"u}r die katalytische Umsetzung in allen Klasse III Nukleotidzyklasen ben{\"o}tigte Dimer zweier Zyklasedom{\"a}nen ist in PAC das Dimer aus C1 und C2. Durch Messungen mit PAC-Mutanten, bei denen jeweils eine Zyklasedom{\"a}ne defekt war, konnte gezeigt werden, dass diese Dimerisierung in PACalpha intermolekular auftritt. Ebenso wurde gezeigt, dass ein solches Dimer aus Zyklasedom{\"a}nen von PACalpha und PACbeta bestehen kann. Der Austausch der Zyklasedom{\"a}nen von PACalpha durch Zyklasedom{\"a}nen der Guanylatzyklasen GCY35 und GCY36 aus C. elegans f{\"u}hrte zu einem Verlust der Zyklaseaktivit{\"a}t. Die Proteine wurden aber zumindest teilweise korrekt gefaltet, was durch Dimerbildung mit Knockoutmutanten von PAC in Koexpressionsexperimenten gezeigt werden konnte. Die Fusionsproteine aus PACalpha und den CNG-Kan{\"a}len CNGA2 und OLF f{\"u}hrten in Oocyten zu einer deutlich geringeren Leitwert{\"a}nderung als eine Expression der Einzelproteine. Sowohl bei einer N-terminalen Fusion des Kanals an PAC als auch bei der C-terminalen Fusion war es jeweils der Kanal, der im Fusionsprotein stark gehemmt war. Eine Deletion des C-Terminus von PACalpha f{\"u}hrte zu einem nicht funktionsf{\"a}higen Protein, das auch in Koexpression mit PAC-Knockoutmutanten keine messbare Adenylatzyklaseaktivit{\"a}t zeigte. Wurde die F2-Dom{\"a}ne deletiert, so verlor PAC ebenfalls seine Zyklaseaktivit{\"a}t vollst{\"a}ndig. Die C1-Dom{\"a}ne war aber korrekt gefaltet, was durch eine Koexpression mit PAC-Mutanten gezeigt werden konnte, die in einer ihrer Zyklasedom{\"a}nen defekt waren. Beide Chim{\"a}ren aus PACalpha und PACbeta besaßen Adenylatzyklaseaktivit{\"a}t. Diese war bei der Chim{\"a}re mit dem C-terminalen Teil von PACalpha deutlich h{\"o}her als bei der Chim{\"a}re mit dem C-terminalen Teil von PACbeta, was darauf hindeutet, dass im C-terminalen Teil von PAC der Grund f{\"u}r den Aktivit{\"a}tsunterschied zwischen PACalpha und PACbeta liegt. F{\"u}r die Ver{\"a}nderung der Substratspezifit{\"a}t von einer Adenylat- zu einer Guanylatzyklase waren Mutationen an mindestens drei Aminos{\"a}uren erforderlich. Die ebenfalls hergestellten Einzel- und Doppelmutanten verhielten sich wie der Wildtyp oder hatten eine deutlich eingeschr{\"a}nkte Adenylatzyklaseaktivit{\"a}t. Bei der Tripelmutante PACalpha K250E T319G S329Y war Guanylatzyklaseaktivit{\"a}t nachweisbar, die aber geringer war als die noch vorhandene Adenylatzyklaseaktivit{\"a}t. Die Quadrupelmutante PACalpha K250E D317K T319G S329Y zeigte ebenfalls lichtinduzierbare Adenylatzyklaseaktivit{\"a}t, die ca. 0,3\% der Aktivit{\"a}t der Wildtyp-PACalpha entsprach. Die Guanylatzyklaseaktivit{\"a}t dieser Mutante war ca. dreifach h{\"o}her als deren Adenylatzyklaseaktivit{\"a}t. Somit konnte gezeigt werden, dass sich durch die Mutation weniger einzelner Aminos{\"a}uren die Substratspezifit{\"a}t von PAC von ATP nach GTP verschieben l{\"a}sst.}, subject = {Euglena gracilis}, language = {de} } @phdthesis{Woelke2010, author = {W{\"o}lke, Stefan}, title = {Funktionelle Analyse von bakteriellen W-xxx-E Rho GTPasen GEF Mimetika mittels Typ 3 Sekretionssystems von Yersinia enterocolitica}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55010}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Die zellul{\"a}ren Rho GTPasen kontrollieren und regulieren zentrale elementare Zellvorg{\"a}nge wie Phagozytose, Migration und epitheliale Integrit{\"a}t. Aufgrund ihrer zentralen Stellung, interagiert eine Vielzahl von bakteriellen Cytotoxinen und Modulinen mit den Rho GTPasen und wirken so als Pathogenit{\"a}tsfaktoren. Die zur W-xxx-E Familie geh{\"o}renden Effektoren IpgB1 und IpgB2 von Shigella und Map von E. coli (Pathotypen EHEC und EPEC) werden {\"u}ber ein Typ 3 Sekretionssystem (T3SS) in Wirtszellen injiziert und wirken als Rac1, RhoA bzw. Cdc42 GEF Mimetikum. In der vorliegenden Arbeit wurden die Effektor Funktionen von IpgB1 IpgB2 und Map mit Hilfe des Yersinia (Ysc)-T3SS untersucht, was zur Etablierung der „Yersinia-Toolbox" f{\"u}hrte. Damit k{\"o}nnen heterologe Effektoren isoliert im physiologischen Kontext der Erreger-Zell-Interaktion zellbiologisch untersucht werden unter Vermeidung von simultaner Injektion redundanter oder unbekannter Effektoren. Zur Etablierung der Yersinia-Toolbox wurden zun{\"a}chst die Gene f{\"u}r die Rho GTPasen modulierenden Shigella Effektoren IpgB1 und IpgB2 sowie der E. coli (EHEC)-Effektor Map mit unterschiedlich langen Gensequenzen der N-terminalen Bereiche des Yersinia-Effektorproteins YopE fusioniert (Hybridproteine: YopEi-X:i = 18, 53 bzw. 138 Aminos{\"a}urereste, X = IpgB1, IpgB2 bzw. Map). In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Hybridproteine YopE53-X und YopE138-X (X=IpgB1, IpgB2, Map) in den Kultur{\"u}berstand sezerniert bzw. in Zielzellen injiziert wurden. In einem weiteren Schritt konnte die zellbiologische Aktivit{\"a}t der heterologen Proteine fluoreszenzmikroskopisch durch Aktinzytoskelettumlagerungen gezeigt werden. So wurden „Membrane Ruffles" (Rac1-Aktivierung) durch YopE138-IpgB1, Stressfasern (RhoA-Aktivierung) durch E138-IpgB2 und „Mikrospikes" (Cdc42-Aktivierung) durch YopE138-Map nachgewiesen. Invasionstudien zeigten, dass YopEi-IpgB1 (i = 53, 138) die Yersinia-Invasion induzierte, wohingegen YopEi-IpgB2 die Invasionsrate der St{\"a}mme WA (pT3SS, pEi-IpgB2) (i=53, 138) verglichen mit dem Stamm WA (pT3SS) reduziert war. Durch Kombination verschiedener Yersinia-Toolbox-St{\"a}mme konnte im Co-Infektionsmodell mit HeLa-Zellen gezeigt werden, dass (1) die YopE138-IpgB1 vermittelte Invasion durch YopE138-IpgB2 signifikant inhibiert werden kann, was auf eine antagonistische Wirkung zwischen IpgB1 und IpgB2 schließen l{\"a}sst, dass (2) YopT ebenfalls die IpgB1 vermittelte Invasionsrate reduziert (inhibitorische Wirkung auf Rac1), und dass (3) YopE als GAP f{\"u}r RhoG/Rac1 (bevorzugt RhoG) praktisch nicht die IpgB1-vermittelte Invasion hemmt. Durch Klonierung der YopE138-IpgB1 und YopE138-IpgB2 kodierenden Fusionsgene in zwei kompatible Plasmidvektoren konnten die Hybridproteine simultan transloziert werden und die Co-Infektionsergebnisse best{\"a}tigt werden. In der Literatur ist beschrieben, dass die Ysc-Translokationspore YopB/YopD Rho-abh{\"a}ngig Membranporen-bedingte Zellsch{\"a}digungen verursacht (LDH-Freisetzung, PI-Kernf{\"a}rbung). Mit der Yersinia-Toolbox konnte mit dem Stamm WA (pT3SS) Zytoplasmamembransch{\"a}digung / Zytotoxizit{\"a}t nachgewiesen werden, nicht aber mit den St{\"a}mmen WA (pE138-X) X = IpgB1, IpgB2 oder Map. Co-Infektionen jedoch zeigen, dass vermehrt LDH bei der Infektion mit WA (pT3SS) + WA (pT3SS, pE138-IpgB1) detektiert wurde, wohingegen dieser Effekt von YopE138-IpgB2 in einer Co-Infektion von WA (pT3SS) + WA (pT3SS, pE138-IpgB2) inhibiert wurde. Auch hier wurde der Antagonismus zwischen IpgB1 und IpgB2 erneut sichtbar. Diese Befunde widersprechen publizierten Daten, die eine RhoA-Aktivierung/Aktinpolymerisierung mit verst{\"a}rkter Porenbildung in einen Zusammenhang bringen. Rho GTPasen sind beteiligt an der Erhaltung der polarisierten Eipthelzellschichtintegrit{\"a}t {\"u}ber Adh{\"a}sionskomplexbildung. Mittels Infektion von polarisierten MDCK-Zellschichten mit verschiedenen Yersinia-St{\"a}mmen und Messung des transepithelialen elektrischen Widerstandes/Resistenz (TER) konnte gezeigt werden, dass die Ysc-T3SS vermittelte Injektion von YopE138-IpgB1 (Rac1-Aktivierung) oder YopE138-Map (Cdc42-Aktivierung) zur Abnahme der TER und damit Sch{\"a}digung der Zellschichtintegrit{\"a}t f{\"u}hrt, wogegen bei YopE138-IpgB2-Injektion der TER-Wert unver{\"a}ndert blieb. Um bakterielle Rho GTPasen-modulierende Effektorproteine detailliert untersuchen zu k{\"o}nnen und um die Rolle von Rho GTPasen im Mausinfektionsmodell mit Yersinia enterocolitica und Salmonellen zu bestimmen, wurden M{\"a}use mit deletierten Genen f{\"u}r RhoA, Rac1 bzw. Cdc42 in Makrophagen hergestellt.}, subject = {Actin}, language = {de} } @phdthesis{Nietzer2010, author = {Nietzer, Sarah}, title = {Gene and environment interactions in serotonin transporter knockout mice - how stress influences gene expression and neuronal morphology}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-54391}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Serotonin (5-HT) is an important modulator of many physiological, behavioural and developmental processes and it plays an important role in stress coping reactions. Anxiety disorders and depression are stress-related disorders and they are associated with a malfunction of the 5-HT system, in which the 5-HT transporter (5-HTT) plays an important role. 5-Htt knockout (KO) mice represent an artificially hyperserotonergic environment, show an increased anxiety-like behaviour and seem to be a good model to investigate the role of the 5-HT system concerning stress reactions and anxiety disorders. As synaptic proteins (SPs) seem to be involved in stress reactions, the effect of acute immobilization stress on the expression of the three SPs Synaptotagmin (Syt) I, Syt IV and Syntaxin (Stx) 1A was studied in the 5-Htt KO mouse model as well as the expression of the two immediate early genes (IEGs) FBJ osteosarcoma oncogene (c-Fos) and fos-like antigen 2 (Fra-2). Additionally, the expression of the corticotrophin releasing hormone (CRH) and its two receptors CRHR1 and CRHR2 was investigated as part of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) stress system. Based on gender- and genotype-dependent differences in corticosterone levels, expression differences in the brain were investigated by performing a quantitative real time-PCR study using primer pairs specific for these SPs and for the IEGs c-Fos and Fra-2 in five different brain regions in 5-Htt KO and 5-Htt wild-type (WT) mice. Mainly gender-dependent differences could be found and weaker stress effects on the expression of SPs could be demonstrated. Regarding the expression of IEGs, stress-, gender- and genotype-dependent differences were found mainly in the hypothalamus. Also in the hypothalamus, gender effects were found concerning the expression of CRH and its both receptors. Additionally, in a second study, male 5-Htt WT and male 5-Htt deficient mice were subjected to a resident-intruder-paradigm which stresses the animals through a loser experience. The morphological changes of neurons were subsequently analyzed in Golgi-Cox-stained sections of limbic brain areas in stressed and unstressed animals of both genotypes using the computer-based microscopy system Neurolucida (Microbrightfield, Inc.). While no differences concerning dendritic length, branching patterns and spine density were found in the hippocampus and no differences concerning dendritic length and branching patterns could be shown in the cingulate cortex (CG), pyramidal neurons in the infralimbic cortex (IL) of stressed 5-Htt WT mice displayed longer dendrites compared to unstressed 5-Htt WT mice. The results indicate that, although in this model drastic alterations of neuronal morphology are absent, subtle changes can be found in specific brain areas involved in stress- and anxiety-related behaviour which may represent neural substrates underlying behavioural phenomena.}, subject = {Serotonin}, language = {en} } @phdthesis{Friehs2010, author = {Friehs, Gudrun}, title = {Genotoxizit{\"a}t von Nikotin in humanem Speicheldr{\"u}sengewebe}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51875}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Tumore entstehen in einem mehrstufigen Prozess, der die Tumorinitiation, Promotion und Progression beinhaltet. Dabei spielen exogene Faktoren, wie Fremdstoffe, Umwelteinfl{\"u}sse, Lebensgewohnheiten, Ern{\"a}hrungsverhalten oder Tabakkonsum eine wichtige Rolle. F{\"u}r viele Fremdstoffe aus unserer Umwelt, die als Aerosole eingeatmet werden, stellen die Zellen des oberen und unteren Aerodigestivtrakts das prim{\"a}re Kontaktorgan dar. Der Aerodigestivtrakt ist somit eine der wichtigsten Lokalisationen f{\"u}r Tabak assoziierten Karzinome. Dabei ist Nikotin nicht nur suchterzeugend, sondern spielt eine direkte Rolle bei der Entstehung und dem Wachstum von Tumoren. Um einen Beitrag zur Tumorpr{\"a}vention zu leisten, sollten in vitro Testsysteme etabliert werden, welche die Charakterisierung von Nikotin in seiner tumorinitiierenden und promovierenden Potenz erm{\"o}glichen. In dieser Arbeit wurden genotoxische Effekte von Nikotin an frisch isolierten Zellen, prim{\"a}ren adh{\"a}renten Zellen und Miniorgankulturen der Glandula parotidea untersucht. Die Vitalit{\"a}t und Morphologie der Miniorgankulturen wurden mit histologischen Schnitten {\"u}berpr{\"u}ft. Zur Charakterisierung der prim{\"a}ren adh{\"a}renten Zellen wurden immunhistochemische F{\"a}rbungen mit anti-α-Amylase durchgef{\"u}hrt. Die Erfassung nikotininduzierter DNA-Sch{\"a}den erfolgte mit Hilfe des Comet Assays, des Mikrokerntests und des Chromosomenaberrationstests. Zur Untersuchung der Apoptoseinduktion durch Nikotin kam der Sandwich-ELISA-Test zum Einsatz. Methylmethansulfonat wurde dabei als Positivkontrolle verwendet. W{\"a}hrend des ganzen Kultivierungszeitraums der Miniorgankulturen der Glandula parotidea konnten keine Anzeichen von Apoptosen oder Nekrosen festgestellt werden. Die Morphologie der Miniorgankulturen blieb w{\"a}hrend der Kultivierung intakt. Bei der F{\"a}rbung der histologischen Schnitte gegen α-Amylase zeigte sich w{\"a}hrend der Kultivierung der Miniorgankulturen die typische α-Amylase im Zytoplasma der Zellen. Die immunhistochemische F{\"a}rbung der prim{\"a}ren adh{\"a}renten Zelllinie der Glandula parotidea zeigte die typische α-Amylase im Zytoplasma der Zellen. Im Comet Assay zeigte sich bei den frisch isolierten und den prim{\"a}ren adh{\"a}renten Zellen der Glandula parotidea eine dosisabh{\"a}ngige DNA-Sch{\"a}digung im einst{\"u}ndigen Inkubationsversuch durch Nikotin. Diese Sch{\"a}digung war ab einer Konzentration von 0,25 mM Nikotin bei den frisch isolierten und ab 0,1 mM Nikotin bei den prim{\"a}ren adh{\"a}renten Zellen signifikant. Im Mikrokerntest und im Chromosomenaberrationstest zeigten sich ein dosisabh{\"a}ngiger Anstieg der Mikrokerne, der sich ab 0,1 mM Nikotin als signifikant erwies, bzw. ein signifikanter Anstieg der Chromosomenaberrationen ab 0,001 mM Nikotin. Eine abfallende Apoptoserate war bei steigender Nikotinkonzentration im Sandwich-ELISA-Test zu beobachten. Ein signifikanter DNA-Schaden konnte nach ein- und dreist{\"u}ndiger Exposition mit Nikotin bei den Miniorgankulturen der Glandula parotidea nachgewiesen werden. Es zeigte sich weder ein signifikanter DNA-Schaden {\"u}ber die dreimalige Exposition mit Nikotin bei den Miniorgankulturen, noch konnte eine Reparatur der nikotininduzierten DNA-Sch{\"a}den nachgewiesen werden. Bei der repetitiven Exposition mit der Positivkontrolle Methylmethansulfonat bei den Miniorgankulturen zeigte sich ein signifikanter Anstieg der OTM-Werte. Diese erh{\"o}hte Migration konnte nach einer 24-st{\"u}ndigen Regenerationsphase nicht nachgewiesen werden. Das Modell der Miniorgankulturen der Glandula parotidea erweist sich f{\"u}r genotoxikologische Untersuchungen als gut geeignet. Durch die M{\"o}glichkeit der mehrfachen Exposition mit anschließenden Regenerationsphasen ist eine Ann{\"a}herung an reale Lebensbedingungen m{\"o}glich. Ebenfalls konnten mit der Etablierung der prim{\"a}ren adh{\"a}renten Zelllinie weitere Testsysteme, wie beispielsweise der Mikrokerntest, der Chromosomenaberrationstest und der Sandwich-ELISA-Test, zur Analyse der Genotoxizit{\"a}t von Nikotin angewendet werden. In der Zusammenschau dieser Testsysteme konnte ein {\"U}berblick der Genotoxizit{\"a}t von Nikotin gewonnen werden. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass Nikotin eine entscheidende Rolle bei der Initiation von tabakassoziierten Tumoren im Aerodigestivtrakt spielen kann. Zum Verst{\"a}ndnis der intrazellul{\"a}ren Sch{\"a}digungswege von Nikotin, insbesondere im Hinblick auf eine direkte DNA-Sch{\"a}digung, sind weitere Untersuchungen notwendig. Dabei werden spezifische nikotinerge Acetylcholinrezeptor Ago-nisten wie Epibatidin oder Mecamylamin verwendet.}, subject = {Speicheldr{\"u}se}, language = {de} } @article{FriedrichRahmannWeigeletal.2010, author = {Friedrich, Torben and Rahmann, Sven and Weigel, Wilfried and Rabsch, Wolfgang and Fruth, Angelika and Ron, Eliora and Gunzer, Florian and Dandekar, Thomas and Hacker, Joerg and Mueller, Tobias and Dobrindt, Ulrich}, title = {High-throughput microarray technology in diagnostics of enterobacteria based on genome-wide probe selection and regression analysis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67936}, year = {2010}, abstract = {The Enterobacteriaceae comprise a large number of clinically relevant species with several individual subspecies. Overlapping virulence-associated gene pools and the high overall genome plasticity often interferes with correct enterobacterial strain typing and risk assessment. Array technology offers a fast, reproducible and standardisable means for bacterial typing and thus provides many advantages for bacterial diagnostics, risk assessment and surveillance. The development of highly discriminative broad-range microbial diagnostic microarrays remains a challenge, because of marked genome plasticity of many bacterial pathogens. Results: We developed a DNA microarray for strain typing and detection of major antimicrobial resistance genes of clinically relevant enterobacteria. For this purpose, we applied a global genome-wide probe selection strategy on 32 available complete enterobacterial genomes combined with a regression model for pathogen classification. The discriminative power of the probe set was further tested in silico on 15 additional complete enterobacterial genome sequences. DNA microarrays based on the selected probes were used to type 92 clinical enterobacterial isolates. Phenotypic tests confirmed the array-based typing results and corroborate that the selected probes allowed correct typing and prediction of major antibiotic resistances of clinically relevant Enterobacteriaceae, including the subspecies level, e.g. the reliable distinction of different E. coli pathotypes. Conclusions: Our results demonstrate that the global probe selection approach based on longest common factor statistics as well as the design of a DNA microarray with a restricted set of discriminative probes enables robust discrimination of different enterobacterial variants and represents a proof of concept that can be adopted for diagnostics of a wide range of microbial pathogens. Our approach circumvents misclassifications arising from the application of virulence markers, which are highly affected by horizontal gene transfer. Moreover, a broad range of pathogens have been covered by an efficient probe set size enabling the design of high-throughput diagnostics.}, subject = {Mikroarray}, language = {en} } @phdthesis{Raab2010, author = {Raab, Viktoria Maria}, title = {Histologische Charakterisierung Vaccinia-Virus infizierter humaner Tumore im Mausmodell}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-49024}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Onkolytische Viren spielen eine immer bedeutendere Rolle f{\"u}r die Tumorforschung, weil in zahlreichen pr{\"a}klinischen Studien gezeigt werden konnte, dass viral bedingte Onkolyse zu einer Tumorregression f{\"u}hrt. Ein {\"a}ußerst vielversprechender Kandidat der onkolytischen Viren ist das Vaccinia-Virus. In der vorliegenden Arbeit wurde mit dem attenuierten Vaccinia-Virus GLV-1h68 gearbeitet, welches nach systemischer Applikation eine Regression von Tumoren verursacht. Obwohl bereits zahlreiche onkolytische Viren in klinischen Studien Anwendung finden, sind zugrunde liegende Abl{\"a}ufe bei einer Virusinfektion solider Tumore sowie Mechanismen, welche f{\"u}r die Tumorregression verantwortlich sind, immer noch nicht erschlossen. Um Aufschluss {\"u}ber notwendige Parameter f{\"u}r eine effiziente Infektion eines soliden Tumors mit GLV-1h68 zu erlangen, wurden im ersten Teil dieser Arbeit die uninfizierte Tumormikroumgebung sowie stromale Ver{\"a}nderungen in der fr{\"u}he Phase der Infektion untersucht. Als Tumormodell diente hierbei ein humanes autologes Melanomzellpaar (888-MEL und 1936-MEL). Diese beiden Zelllinien sind Teil einer Reihe von f{\"u}nf verschiedenen Melanomzelllinien, welche alle aus den widerkehrenden Metastasen eines einzelnen Patienten (Patient 888) isoliert wurden. 888-MEL zeigt nach Virusinfektion mit GLV-1h68 ein regredierendes Verhalten (therapeutischer Index: 88,0) und ist somit respondierend nach GLV-1h68-Infektion. 1936-MEL hingegen zeigte mit einem therapeutischen Index von 13,7 ein nur schwach verlangsamtes Wachstum solider Tumore, und ist somit schwach-respondierend nach GLV-1h68-Infektion. Als ein Grund, weshalb diese beiden autologen Melanomzelllinien unterschiedlich auf GLV-1h68-Infektion reagieren, wurde die Anzahl der Viruspartikel vermutet, welche 1 dpi im soliden Tumor vorliegt. Eine m{\"o}gliche Korrelation zwischen initialem viralen Titer 1 dpi und sp{\"a}terer Tumorregression konnte experimentell aber nicht nachgewiesen werden. Zwei voneinander unabh{\"a}ngige Experimentreihen zeigten, dass bei identischer systemischer Applikation in den beiden soliden Tumoren kein Unterschied des viralen Titers vorlag. Weiterhin wurden die Komponenten der Tumormikroumgebung und ihr m{\"o}glicher Einfluss auf die Effizienz der Virusinfektion untersucht. Immunhistologische Studien zeigten, dass es im uninfizierten Zustand bei soliden 888-MEL Tumoren zu einer massiven Infiltration CD45-positiver Zellen kam, die bei 1936-MEL-Tumoren jedoch nicht zu finden war. Die Beobachtung steht in {\"U}bereinstimmung mit Ergebnissen einer vergleichenden Microarray-Analyse, die das Infiltrat CD45-positiver Zellen in 888-MEL Tumoren genauer charakterisierte. Es wurde mit Microarray-Analyse eine erh{\"o}hte Expression chemotaktischer Molek{\"u}le in soliden 888-MEL Tumoren nachgewiesen. Unter anderem wird CCL8 (MCP-2) erh{\"o}ht exprimiert. Als chemotaktisches Molek{\"u}l hat CCL8 eine erh{\"o}hte Monozyteninfiltration zur Folge. Weiterhin wurde eine erh{\"o}hte Expression von MIF (macrophage migration inhibitory factor) und dem entsprechendem Rezeptor CD74 in uninfizierten 888-MEL-Tumoren gemessen. MIF induziert als proinflammatorisches Zytokin die Synthese inflammatorischer Mediatoren. Dies erkl{\"a}rt die Anh{\"a}ufung CD45-positiver Zellen in der Tumormikroumgebung. Durch eine erh{\"o}hte Expression MHC II-verwandter Gene in soliden 888-MEL- Tumoren wurden die CD45-positiven Zellen als Monozyten identifiziert. Um die Funktion der Immunzellen zu analysieren, wurde durch eine intraperitoneale Applikation des Zytostatikums Cyclophosphamid eine Monozytendepletion induziert. Diese Immundepletion resultierte in soliden 888-MEL- Tumoren in einer signifikant verringerten Virusreplikation und -Ausbreitung nach Infektion mit GLV-1h68. Diese Ergebnisse implizieren, dass durch eine erh{\"o}hte Infiltration CD45-positiver Zellen in die Tumormikroumgebung die GLV-1h68-Infektion und -Replikation erleichtert wird. Nach Ausbreitung der Infektion kommt es in respondierenden Tumoren nach einem ersten Wachtumsarrest zu einer Tumorregression. Um Aufschluss {\"u}ber den beteiligten Mechanismus bei der Tumorregression zu erlangen, wurden GLV-1h68-infizierte-Tumore in der sp{\"a}ten Phase der Infektion untersucht. Drei m{\"o}gliche Mechanismen viral verursachter Onkolyse wurden beschrieben: Tumorzell-spezifische Onkolyse, Zerst{\"o}rung der Tumorvaskulatur oder anti-tumorale Immunantwort. F{\"u}r diese Experimente wurden humane Brustkarzinomzellen als Tumormodell verwendet. Mit diesem Tumormodell sollte analysiert werden, welcher der drei bislang diskutierten Mechanismen bei einer GLV-1h68-Infektion vorlag. Als erstes zeigten histologische Studien, dass Virusinfektion und -Replikation zu ausgedehnten Tumornekrosen f{\"u}hren. Dabei blieben die Blutgef{\"a}ße in uninfizierten und auch in infizierten Bereichen des Tumors intakt und funktionell aktiv. Systemische Perfusion der Vaskulatur mit Lektin zeigte, dass die Tumorvaskulatur an das periphere Blutgef{\"a}ßsystem angeschlossen war. Nachfolgende Experimente zeigten, dass Endothelzellen nicht durch die Viren infiziert wurden, wohingegen aber Endothelzell-ummantelnde, Gef{\"a}ß-stabilisierende Perizyten nur in uninfizierten, nicht aber in infizierten Bereichen des Tumors vorkamen. Perizyten wurden m{\"o}glicherweise durch Virusinfektion lysiert. Morphologische und funktionelle Analyse der Blutgef{\"a}ße im Tumor zeigte, dass GLV-1h68-Infektion Hyperpermeabilit{\"a}t, Vasodilatation und eine erh{\"o}hte Expression des Adh{\"a}sionsmolek{\"u}ls CD31 verursachte. Eine erh{\"o}hte CD31-Expression erleichtert eine Infiltration rekrutierter Immunzellen. Das konnte durch immunhistochemische F{\"a}rbung von CD45 und MHC II besonders in intratumoralen Bereichen gezeigt werden. Durch Cyclophosphamid-vermittelte Immunsuppression wurde nachgewiesen, dass diese rekrutierten Immunzellen keinen ausschlaggebenden Einfluss auf die Tumorregression haben. Nach Immundepletion in soliden GI-101A-Tumoren konnte eine verst{\"a}rkte Virusinfektion, effektivere Onkolyse und fr{\"u}hzeitigere Tumorregression nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse, dass der dominierende Mechanismus, welcher zur Tumorregression f{\"u}hrt, die Onkolyse ist.}, subject = {Vaccinia-Virus}, language = {de} } @article{BrocherVogelHock2010, author = {Brocher, Jan and Vogel, Benjamin and Hock, Robert}, title = {HMGA1 down-regulation is crucial for chromatin composition and a gene expression profile permitting myogenic differentiation}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67914}, year = {2010}, abstract = {Background: High mobility group A (HMGA) proteins regulate gene transcription through architectural modulation of chromatin and the formation of multi-protein complexes on promoter/enhancer regions. Differential expression of HMGA variants has been found to be important for distinct differentiation processes and deregulated expression was linked to several disorders. Here we used mouse C2C12 myoblasts and C2C12 cells stably over-expressing HMGA1a-eGFP to study the impact of deregulated HMGA1 expression levels on cellular differentiation. Results: We found that induction of the myogenic or osteogenic program of C2C12 cells caused an immediate down-regulation of HMGA1. In contrast to wild type C2C12 cells, an engineered cell line with stable overexpression of HMGA1a-eGFP failed to differentiate into myotubes. Immunolocalization studies demonstrated that sustained HMGA1a-eGFP expression prevented myotube formation and chromatin reorganization that normally accompanies differentiation. Western Blot analyses showed that elevated HMGA1a-eGFP levels affected chromatin composition through either down-regulation of histone H1 or premature expression of MeCP2. RT-PCR analyses further revealed that sustained HMGA1a expression also affected myogenic gene expression and caused either down-regulation of genes such as MyoD, myogenin, Igf1, Igf2, Igfbp1-3 or up-regulation of the transcriptional repressor Msx1. Interestingly, siRNA experiments demonstrated that knock-down of HMGA1a was required and sufficient to reactivate the myogenic program in induced HMGA1a over-expressing cells. Conclusions: Our data demonstrate that HMGA1 down-regulation after induction is required to initiate the myogenic program in C2C12 cells. Sustained HMGA1a expression after induction prevents expression of key myogenic factors. This may be due to specific gene regulation and/or global effects on chromatin. Our data further corroborate that altered HMGA1 levels influence the expression of other chromatin proteins. Thus, HMGA1 is able to establish a specific chromatin composition. This work contributes to the understanding of how differential HMGA1 expression is involved in chromatin organization during cellular differentiation processes and it may help to comprehend effects of HMGA1 over-expression occurring in malign or benign tumours.}, subject = {HMG-Proteine}, language = {en} } @phdthesis{Duraphe2010, author = {Duraphe, Prashant}, title = {Identification and characterization of AUM, a novel human tyrosine phosphatase}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-44256}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Protein Phosphatasen werden aufgrund der Aminos{\"a}uresequenzen ihrer aktiven Zentren in drei große Familien unterteilt. In einer neu entdeckten Familie von Phosphatasen ist das aktive Zentrum durch die Sequenz DXDX(T/V) charakterisiert. Diese Aspartat-abh{\"a}ngigen Phosphatasen geh{\"o}ren zu der Superfamilie der Hydrolasen vom Haloazid Dehalogenase(HAD)-Typ, einer evolution{\"a}r konservierten und ubiquit{\"a}r verbreiteten Enzymfamilie. Bislang konnten 58 menschliche HAD Enzyme durch Datenbankanalysen identifiziert werden. Ihre Funktionen sind jedoch nach wie vor nur rudiment{\"a}r verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zun{\"a}chst das Komplement aller menschlichen HAD Phosphatasen durch Datenbank-Recherchen erfasst. Zusammen mit phylogenetischen Analysen gelang es, eine zum damaligen Zeitpunkt unbekannte, putative Phosphatase zu identifizieren, die eine vergleichsweise hohe Sequenz-Homologie zu der Zytoskelettregulierenden HAD Phosphatase Chronophin aufweist. Dieses neuartige Enzym wurde kloniert und mit biochemischen und zellbiologischen Methoden charakterisiert. Auf der Basis dieser Befunde bezeichnen wir dieses neuartige Protein als AUM (actin remodeling, ubiquitously expressed, magnesium-dependent HAD phosphatase).Mittels Northern blot, real-time PCR und Western blot Analysen konnte gezeigt werden, dass AUM in allen untersuchten menschlichen und murinen Geweben exprimiert wird. Die h{\"o}chste Expression konnte in Hodengewebe nachgewiesen werden. Durch immunohistochemische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass AUM spezifisch in reifenden Keimzellen mit einem Expressionsmaximum zum Zeitpunkt der Spermiogenese exprimiert wird. Um die Substratpr{\"a}ferenz von AUM zu charakterisieren, wurde zun{\"a}chst ein peptidbasierter in vitro Phosphatase-Substrat-Screen durchgef{\"u}hrt. Hierbei wurden 720 aus menschlichen Phosphoproteinen abgeleitete Phosphopeptide untersucht. Interessanterweise dephosphorylierte AUM ausschließlich Phosphotyrosin (pTyr)-enthaltende Peptide. Nur 17 pTyr-Peptide (~2\% aller untersuchten Peptide) fungierten als AUM-Substrate. Diese Daten legen eine hohe Substratspezifit{\"a}t von AUM nahe. Zu den putativen AUM Substraten geh{\"o}ren Proteine, die in die Dynamik der Zytoskelett-Reorganisation sowie in Tyrosin Kinasevermittelte Signalwege eingebunden sind. In {\"U}bereinstimmung mit den Ergebnissen dieses Phosphopeptid-Screens konnte mittels Phosphatase overlay assays sowie in Zellextrakten aus Pervanadat-behandelten HeLa Zellen demonstriert werden, dass AUM eine begrenzte Anzahl Tyrosin-phosphorylierter Proteinen dephosphorylieren kann.In zellul{\"a}ren Untersuchungen wurde die m{\"o}gliche Rolle von AUM im Rahmen der durch den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ausgel{\"o}sten Tyrosin-Phosphorylierung in einer Spermatogonien Zelllinie (GC-1 spg-Zellen) analysiert. So konnte nachgewiesen werden, dass die {\"U}berexpression von AUM zu einer moderaten Abnahme Tyrosin phosphorylierter Proteine nach EGF-Stimulation f{\"u}hrte. Im Gegensatz dazu l{\"o}ste jedoch die durch RNAInterferenz vermittelte Depletion von endogenem AUM einen robusten Anstieg Tyrosinphosphorylierter Proteine aus, zu denen auch der EGF-Rezeptor selbst z{\"a}hlt. Zus{\"a}tzlich zu dem EGF-Rezeptor wurde die Src-Kinase im Zuge des Phosphopeptid- Screens als m{\"o}gliches AUM Substrat identifiziert. Daher wurden in vitro Kinase/Phosphatase-Assays mit gereinigtem Src und AUM durchgef{\"u}hrt. Mit diesem Ansatz konnte erstmals gezeigt werden, dass AUM in der Lage ist, die Src-Kinase zu aktivieren, w{\"a}hrend Src AUM phosphoryliert und die AUM Phosphatase-Aktivit{\"a}t blockiert. Diese Ergebnisse deuten auf eine gekoppelte, wechselseitige Regulation von AUM und Src hin. Obwohl die Details dieser Regulation derzeit noch unklar sind, zeigen unsere initialen Ergebnisse, dass AUM die Src-Aktivit{\"a}t unabh{\"a}ngig von seiner Phosphatase Aktivit{\"a}t steigert, w{\"a}hrend Src die AUM Phosphatase-Aktivit{\"a}t Kinase-abh{\"a}ngig vermindert. Auf zellul{\"a}rer Ebene sind AUM-depletierte Zellen durch Ver{\"a}nderungen der Aktin- Zytoskelett-Dynamik und der Zelladh{\"a}sion charakterisiert. So weisen AUM-defiziente Zellen stabilisierte Aktin Streßfasern und vergr{\"o}ßerte fokale Adh{\"a}sionen auf. Weiterhin sind AUMdepletierte Zellen durch ein beschleunigtes spreading auf Fibronektin gekennzeichnet. Wir haben mit AUM ein bisher nicht beschriebenes Mitglied der Familie Aspartat-abh{\"a}ngiger Phosphatasen entdeckt. In dieser Arbeit ist es gelungen, AUM phylogenetisch, biochemisch und zellbiologisch zu charakterisieren. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass AUM einen wichtigen, neuartigen Regulator der Src-vermittelten Zytoskelett-Dynamik im Rahmen der Zelladh{\"a}sion und Migration darstellt.}, subject = {Tyrosin}, language = {en} } @phdthesis{Schmitt2010, author = {Schmitt, Kathrin}, title = {Identification and Characterization of GAS2L3 as a Novel Mitotic Regulator in Human Cells}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52704}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Precise control of mitotic progression is vital for the maintenance of genomic integrity. Since the loss of genomic integrity is known to promote tumorigenesis, the identification of knew G2/M regulatory genes attracts great attention. LINC, a human multiprotein complex, is a transcriptional activator of a set of G2/M specific genes. By depleting LIN9 in MEFs, a core subunit of LINC, Gas2l3 was identified as a novel LINC target gene. The so far uncharacterized Gas2l3 gene encodes for a member of the family of growth arrest specific 2 (GAS2) proteins, which share a highly conserved putative actin binding CH and a putative microtubule binding GAS2 domain. In the present study GAS2L3 was identified as a LINC target gene also in human cells. Gene expression analysis revealed that GAS2L3 transcription, in contrast to all other GAS2 family members, is highly regulated during the cell cycle with highest expression in G2/M. The GAS2L3 protein showed a specific localization pattern during the M phase: In metaphase, GAS2L3 localized to the mitotic spindle, relocated to the spindle midzone microtubules in late anaphase and concentrated at the midbody in telophase where it persisted until the end of cytokinesis. Overexpression of a set of different GAS2L3 deletion mutants demonstrated that the localization to the mitotic microtubule network is dependent on the C-terminus, whereas the midbody localization is dependent on full length GAS2L3 protein. Additionally, exclusive overexpression of the CH domain induced the formation of actin stress fibers, suggesting that the CH domain is an actin binding domain. In contrast, the GAS2 domain was neither needed nor sufficient for microtubule binding, indicating that there must be an additional so far unknown microtubule binding domain in the C-terminus. Interestingly, immunoblot analysis also identified the C-terminus as the domain responsible for GAS2L3 protein instability, partially dependent on proteasomal degradation. Consistent with its specific localization pattern, GAS2L3 depletion by RNAi demonstrated its responsibility for proper mitosis and cytokinesis. GAS2L3 depletion in HeLa cells resulted in the accumulation of multinucleated cells, an indicator for chromosome mis-segregation during mitosis. Also the amount of cells in cytokinesis was enriched, indicating failures in completing the last step of cytokinesis, the abscission. Strikingly, treatment with microtubule poisons that lead to the activation of the spindle assembly checkpoint (SAC) indicated that the SAC was weakened in GAS2L3 depleted cells. Although the exact molecular mechanism is still unknown, fist experiments support the hypothesis that GAS2L3 might be a regulator of the SAC master kinase BUBR1. In conclusion, this study provides first evidence for GAS2L3 as a novel regulator of mitosis and cytokinesis and it might therefore be an important guardian against tumorigenesis.}, subject = {Mensch}, language = {en} } @phdthesis{Schubert2010, author = {Schubert, Alice}, title = {Immunhistochemische und funktionelle Charakterisierung der Serin/Arginin-Proteinkinase SRPK79D mit Identifizierung von Interaktionspartnern in Drosophila melanogaster}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-53841}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Auf der Suche nach Mutanten mit einer vom Wildtyp abweichenden Verteilung des Aktive Zone-Proteins Bruchpilot wurde die Serin/Arginin-Proteinkinase SRPK79D identifiziert. Hier zeigte sich, dass die Mutation im Srpk79D-Gen zu einer Agglomeration von Bruchpilot in den larvalen segmentalen und intersegmentalen Nerven f{\"u}hrt. In der vorliegenden Arbeit sollte die SRPK79D genauer charakterisiert werden. Nach Pr{\"a}adsorptionen und Affinit{\"a}tsreinigungen von in einer fr{\"u}heren Arbeit erzeugten Antiseren, gelang es die Lokalisation der {\"u}berexprimierten SRPK79D-GFP-Isoformen zu bestimmen. Dabei zeigte sich, dass keines der Antiseren die endogene Kinase im Western Blot oder immunhistocheimisch detektieren konnte. Dies legt den Schluss nahe, dass die Expression der SRPK79D in einer geringen Konzentration erfolgt. Es war jedoch m{\"o}glich die endogene SRPK79D-PC-Isoform mittels einer Immunpr{\"a}zipitation soweit anzureichern, dass sie im Western Blot nachweisbar war. F{\"u}r die SRPK79D-PB-Isoform gelang dies allerdings nicht. Anhand von larvalen Nerv-Muskel-Pr{\"a}paraten konnte gezeigt werden, dass die panneural {\"u}berexprimierte SRPK79D-PC-GFP-Isoform an die Aktiven Zone transportiert wird und dort mit Bruchpilot, sowie den Interaktionspartnern von Bruchpilot Liprin-α und Rab3 kolokalisiert. Außerdem liegt sie diffus im Zytoplasma von neuronalen Zellk{\"o}rpern vor. In adulten Gehirnen lokalisiert die transgen {\"u}berexprimierte SRPK79D-PC-GFP im Fanshaped body, Ringkomplex und in neuronalen Zellk{\"o}rpern. Die panneural {\"u}berexprimierte SRPK79D-PB-GFP-Isoform liegt im larvalen und adulten Gehirn lokal im Zytoplasma der Perikaryen akkumuliert vor und wird nicht an die Aktive Zone transportiert. Das PB-Antiserum erkennt im adulten Gehirn neuronale Zellk{\"o}rper und das Neuropil in der Calyxregion der Pilzk{\"o}rper. Immunhistochemische F{\"a}rbungen von larvalen Nerv-Muskel-Pr{\"a}paraten mit verschiedenen Antik{\"o}rpern gegen neuronale Proteine belegen, dass die Agglomerate in der Srpk79D-Mutante f{\"u}r Bruchpilot spezifisch sind. Es konnten bisher keine weiteren Komponenten der Agglomerate detektiert werden. Auch ein genereller axonaler Defekt konnte durch F{\"a}rbungen gegen CSP, Synaptotagmin und Experimenten mit dem Mitochondrienfarbstoff MitoTracker® FM Green ausgeschlossen werden. Die quantitative Auswertung der Pr{\"a}parate zeigte, dass die Morphologie der synaptischen Boutons und die Zahl der Aktiven Zonen durch die Mutation im Srpk79D-Gen nicht beeinflusst werden. Um gesicherte Kenntnis dar{\"u}ber zu erlangen, ob die Mutation im Srpk79D-Gen die beobachteten Ph{\"a}notypen verursacht, wurden Rettungsexperimente durchgef{\"u}hrt. Es konnte sowohl f{\"u}r das hypomorphe Srpk79DP1-Allel, als auch f{\"u}r die Nullmutante Srpk79DVN eine nahezu vollst{\"a}ndige Rettung des Agglomerat-Ph{\"a}notyps mit der panneural exprimierten SRPK79D-PF- oder der SRPK79D-PB-Isoform erreicht werden. Aus diesen Ergebnissen folgt, dass beide Isoformen der SRPK79D in der Lage sind den Bruchpilot-Agglomerat-Ph{\"a}notyp zu retten, die Rettung der Verhaltensdefizite jedoch alle Isoformgruppen ben{\"o}tigen. Um zu untersuchen, ob der Agglomerations-Ph{\"a}notyp der Srpk79D-Mutanten auf einer {\"U}berexpression des Bruchpilotgens oder auf Fehlspleißen seiner pr{\"a}-mRNA beruht, wurden Immunpr{\"a}zipitationen, semiquantitative RT-PCRs und Real Time-PCRs durchgef{\"u}hrt. Ausgehend von den Ergebnissen kann eine m{\"o}gliche {\"U}berexpression bzw. Spleißdefekte von Bruchpilot weitgehend ausgeschlossen werden. Die simultane {\"U}berexpression von SRPK79D und Bruchpilot konnte den Ph{\"a}notyp der Bruchpilot-{\"U}berexpression nicht retten. Anhand der stimulated emission depletion-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass die gebildeten Agglomerate das charakteristische Donut-f{\"o}rmige Muster der T-bars zeigen und wahrscheinlich als fusionierte Ketten von T-bars in den larvalen Nerven vorliegen. Beim in vivo Imaging Versuch konnte demonstriert werden, dass das verk{\"u}rzte Bruchpilot-D3-Strawberry in die Bruchpilot-Agglomerate der Srpk79D-Nullmutante eingebaut wird und dass gr{\"o}ßere Agglomerate unbewegt im Nerv verharren. Der anterograde und retrograde Transport kleinerer Agglomerate konnte verzeichnet werden. Bei CytoTrap-Yeast-two-hybrid-Experimenten konnten f{\"u}r die SRPK79D-PB Isoform vier potentielle Interaktionspartner identifiziert werden: das Hitzeschockprotein Hsp70Bbb, die mitochondriale NADH-Dehydrogenase mt:ND5, das large ribosomal RNA Gen in Mitochondrien und das am Spleißen beteiligte Protein 1.3CC/Caper. Die Sequenzierung zeigte, dass nur das letzte Exon von Caper im pMyr-Vektor vorliegt. Der f{\"u}r die PC-Isoform durchgef{\"u}hrte CytoTrap-Versuch ergab nur Temperatur-Revertanten. SR-Proteinkinasen phosphorylieren die RS-Dom{\"a}ne von SR-Proteinen und sind dadurch an der Regulation des konstitutiven und alternativen Spleißens beteiligt. Somit stellen die acht identifizierten SR-Proteine in Drosophila potentielle Interaktionspartner der SRPK79D dar. Die durch RNAi-vermittelte Reduktion von sieben SR-Proteinen f{\"u}hrte zu keiner Agglomeration von Bruchpilot. Jedoch f{\"u}hrte die RNAi-vermittelte Reduktion des SR-Proteins Spleißfaktor 2 (SF2) zu kleineren Bruchpilot-Agglomeraten in den axonalen Nerven. SF2 ist selbst kein Bestandteil der Agglomerate der Srpk79D-Nullmutante. Die {\"U}berexpression von SF2 f{\"u}hrt wahrscheinlich zu einem axonalen Transportdefekt, wie die F{\"a}rbung gegen das Cysteine string protein zeigte. Weiterhin f{\"u}hrt die {\"U}berexpression zu einer Akkumulation von SF2 in larvalen Axonen und im adulten Gehirn der Fliegen. SF2 ist nicht nur in Zellkernen s{\"a}mtlicher Zellen nachweisbar, sondern es konnte auch ein spezifisches Signal im subsynaptischen Retikulum der Postsynapse detektiert werden, wie die F{\"a}rbungen gegen Disc large best{\"a}tigten.}, subject = {Taufliege}, language = {de} } @article{KellerFoersterMuelleretal.2010, author = {Keller, Alexander and Foerster, Frank and Mueller, Tobias and Dandekar, Thomas and Schultz, Joerg and Wolf, Matthias}, title = {Including RNA secondary structures improves accuracy and robustness in reconstruction of phylogenetic trees}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67832}, year = {2010}, abstract = {Background: In several studies, secondary structures of ribosomal genes have been used to improve the quality of phylogenetic reconstructions. An extensive evaluation of the benefits of secondary structure, however, is lacking. Results: This is the first study to counter this deficiency. We inspected the accuracy and robustness of phylogenetics with individual secondary structures by simulation experiments for artificial tree topologies with up to 18 taxa and for divergency levels in the range of typical phylogenetic studies. We chose the internal transcribed spacer 2 of the ribosomal cistron as an exemplary marker region. Simulation integrated the coevolution process of sequences with secondary structures. Additionally, the phylogenetic power of marker size duplication was investigated and compared with sequence and sequence-structure reconstruction methods. The results clearly show that accuracy and robustness of Neighbor Joining trees are largely improved by structural information in contrast to sequence only data, whereas a doubled marker size only accounts for robustness. Conclusions: Individual secondary structures of ribosomal RNA sequences provide a valuable gain of information content that is useful for phylogenetics. Thus, the usage of ITS2 sequence together with secondary structure for taxonomic inferences is recommended. Other reconstruction methods as maximum likelihood, bayesian inference or maximum parsimony may equally profit from secondary structure inclusion. Reviewers: This article was reviewed by Shamil Sunyaev, Andrea Tanzer (nominated by Frank Eisenhaber) and Eugene V. Koonin. Open peer review: Reviewed by Shamil Sunyaev, Andrea Tanzer (nominated by Frank Eisenhaber) and Eugene V. Koonin. For the full reviews, please go to the Reviewers' comments section.}, subject = {Phylogenie}, language = {en} } @phdthesis{Ulbrich2010, author = {Ulbrich, Jannes}, title = {Integrierung und biochemische Charakterisierung ektoper BMP Rezeptoren in Zellmembranen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55462}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {BMPs vermitteln ihre zellul{\"a}ren Effekte durch Rekrutierung und Aktivierung von zwei Typen spezifischer, membranst{\"a}ndiger Rezeptoren. Die genauen Mechanismen der Rezeptorakivierung und die Komposition eines funktionellen, signalvermittelnden Komplexes auf der Zelloberfl{\"a}che sind in den letzten Jahren genau untersucht worden. Die dimere Natur aller BMPs, die Promiskuitivit{\"a}t der BMPs sowie der entsprechenden Rezeptoren und die unterschiedlichen Rezeptorkonformationen (PFC, BISC) erschweren jedoch die experimentelle Zug{\"a}nglichkeit dieser Proteinfamilie. Um den Einfluss der Membranverankerung der Rezeptoren auf deren Affinit{\"a}t zu einzelnen Liganden zu untersuchen, wurden verschiedene Methoden evaluiert, die eine quantitative Kopplung an Plasmamembranen erm{\"o}glichten. Die BMP Rezeptorektodom{\"a}nen wurden u.a. mittels einer lysin-spezifischen Kopplung lipidiert, oder aber als His6-Ektodom{\"a}nen an membranintegrierte Chelatlipide gekoppelt.}, subject = {Knochen-Morphogenese-Proteine}, language = {de} } @article{AbdelmohsenPimentelElardoHanoraetal.2010, author = {Abdelmohsen, Usama Ramadan and Pimentel-Elardo, Sheila M. and Hanora, Amro and Radwan, Mona and Abou-El-Ela, Soad H. and Ahmed, Safwat and Hentschel, Ute}, title = {Isolation, Phylogenetic Analysis and Anti-infective Activity Screening of Marine Sponge-Associated Actinomycetes}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-68307}, year = {2010}, abstract = {Terrestrial actinomycetes are noteworthy producers of a multitude of antibiotics, however the marine representatives are much less studied in this regard. In this study, 90 actinomycetes were isolated from 11 different species of marine sponges that had been collected from offshore Ras Mohamed (Egypt) and from Rovinj (Croatia). Phylogenetic characterization of the isolates based on 16S rRNA gene sequencing supported their assignment to 18 different actinomycete genera representing seven different suborders. Fourteen putatively novel species were identified based on sequence similarity values below 98.2\% to other strains in the NCBI database. A putative new genus related to Rubrobacter was isolated on M1 agar that had been amended with sponge extract, thus highlighting the need for innovative cultivation protocols. Testing for anti-infective activities was performed against clinically relevant, Gram-positive (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus) and Gram-negative (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) bacteria, fungi (Candida albicans) and human parasites (Leishmania major, Trypanosoma brucei). Bioactivities against these pathogens were documented for 10 actinomycete isolates. These results show a high diversity of actinomycetes associated with marine sponges as well as highlight their potential to produce anti-infective agents.}, subject = {Biologie}, language = {en} } @article{ShityakovDandekar2010, author = {Shityakov, Sergey and Dandekar, Thomas}, title = {Lead expansion and virtual screening of Indinavir derivate HIV-1 protease inhibitors using pharmacophoric - shape similarity scoring function}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67824}, year = {2010}, abstract = {Indinavir (Crivaxan®) is a potent inhibitor of the HIV (human immunodeficiency virus) protease. This enzyme has an important role in viral replication and is considered to be very attractive target for new antiretroviral drugs. However, it becomes less effective due to highly resistant new viral strains of HIV, which have multiple mutations in their proteases. For this reason, we used a lead expansion method to create a new set of compounds with a new mode of action to protease binding site. 1300 compounds chemically diverse from the initial hit were generated and screened to determine their ability to interact with protease and establish their QSAR properties. Further computational analyses revealed one unique compound with different protease binding ability from the initial hit and its role for possible new class of protease inhibitors is discussed in this report.}, subject = {Proteasen}, language = {en} } @article{LaisneyBraaschWalteretal.2010, author = {Laisney, Juliette A. G. C. and Braasch, Ingo and Walter, Ronald B. and Meierjohann, Svenja and Schartl, Manfred}, title = {Lineage-specific co-evolution of the Egf receptor/ligand signaling system}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67922}, year = {2010}, abstract = {Background: The epidermal growth factor receptor (Egfr) with its numerous ligands has fundamental roles in development, cell differentiation and physiology. Dysfunction of the receptor-ligand system contributes to many human malignancies. Consistent with such various tasks, the Egfr gene family has expanded during vertebrate evolution as a consequence of several rounds of whole genome duplication. Of particular interest is the effect of the fish-specific whole genome duplication (FSGD) on the ligand-receptor system, as it has supplied this largest group of vertebrates with additional opportunities for sub- and/or neofunctionalization in this signaling system. Results: We identified the predicted components of the Egf receptor-ligand signaling system in teleost fishes (medaka, platyfish, stickleback, pufferfishes and zebrafish). We found two duplicated egfr genes, egfra and egfrb, in all available teleost genomes. Surprisingly only one copy for each of the seven Egfr ligands could be identified in most fishes, with zebrafish hbegf being the only exception. Special focus was put on medaka, for which we more closely investigated all Egf receptors and Egfr ligands. The different expression patterns of egfra, egfrb and their ligands in medaka tissues and embryo stages suggest differences in role and function. Preferential co-expression of different subsets of Egfr ligands corroborates the possible subfunctionalization and specialization of the two receptors in adult tissues. Bioinformatic analyses of the ligand-receptor interface between Egfr and its ligands show a very weak evolutionary conservation within this region. Using in vitro analyses of medaka Egfra, we could show that this receptor is only activated by medaka ligands, but not by human EGF. Altogether, our data suggest a lineage-specific Egfr/Egfr ligand co-evolution. Conclusions: Our data indicate that medaka Egfr signaling occurs via its two copies, Egfra and Egfrb, each of them being preferentially coexpressed with different subsets of Egfr ligands. This fish-specific occurrence of Egf receptor specialization offers unique opportunities to study the functions of different Egf receptor-ligand combinations and their biological outputs in vertebrates. Furthermore, our results strongly support the use of homologous ligands in future studies, as sufficient cross-specificity is very unlikely for this ligand/receptor system.}, subject = {Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor}, language = {en} } @phdthesis{Foerster2010, author = {F{\"o}rster, Frank}, title = {Making the most of phylogeny: Unique adaptations in tardigrades and 216374 internal transcribed spacer 2 structures}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51466}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {The phylum Tardigrada consists of about 1000 described species to date. The animals live in habitats within marine, freshwater and terrestrial ecosystems allover the world. Tardigrades are polyextremophiles. They are capable to resist extreme temperature, pressure or radiation. In the event of desiccation, tardigrades enter a so-called tun stage. The reason for their great tolerance capabilities against extreme environmental conditions is not discovered yet. Our Funcrypta project aims at finding answers to the question what mechanisms underlie these adaption capabilities particularly with regard to the species Milnesium tardigradum. The first part of this thesis describes the establishment of expressed sequence tags (ESTs) libraries for different stages of M. tardigradum. From proteomics data we bioinformatically identified 144 proteins with a known function and additionally 36 proteins which seemed to be specific for M. tardigradum. The generation of a comprehensive web-based database allows us to merge the proteome and transcriptome data. Therefore we created an annotation pipeline for the functional annotation of the protein and nucleotide sequences. Additionally, we clustered the obtained proteome dataset and identified some tardigrade-specific proteins (TSPs) which did not show homology to known proteins. Moreover, we examined the heat shock proteins of M. tardigradum and their different expression levels depending on the actual state of the animals. In further bioinformatical analyses of the whole data set, we discovered promising proteins and pathways which are described to be correlated with the stress tolerance, e.g. late embryogenesis abundant (LEA) proteins. Besides, we compared the tardigrades with nematodes, rotifers, yeast and man to identify shared and tardigrade specific stress pathways. An analysis of the 50 and 30 untranslated regions (UTRs) demonstrates a strong usage of stabilising motifs like the 15-lipoxygenase differentiation control element (15-LOX-DICE) but also reveals a lack of other common UTR motifs normally used, e.g. AU rich elements. The second part of this thesis focuses on the relatedness between several cryptic species within the tardigrade genus Paramacrobiotus. Therefore for the first time, we used the sequence-structure information of the internal transcribed spacer 2 (ITS2) as a phylogenetic marker in tardigrades. This allowed the description of three new species which were indistinguishable using morphological characters or common molecular markers like the 18S ribosomal ribonucleic acid (rRNA) or the Cytochrome c oxidase subunit I (COI). In a large in silico simulation study we also succeeded to show the benefit for the phylogenetic tree reconstruction by adding structure information to the ITS2 sequence. Next to the genus Paramacrobiotus we used the ITS2 to corroborate a monophyletic DO-group (Sphaeropleales) within the Chlorophyceae. Additionally we redesigned another comprehensive database—the ITS2 database resulting in a doubled number of sequence-structure pairs of the ITS2. In conclusion, this thesis shows the first insights (6 first author publications and 4 coauthor publications) into the reasons for the enormous adaption capabilities of tardigrades and offers a solution to the debate on the phylogenetic relatedness within the tardigrade genus Paramacrobiotus.}, subject = {Phylogenie}, language = {en} } @article{GoebSchmittBenaventeetal.2010, author = {Goeb, Eva and Schmitt, Johannes and Benavente, Ricardo and Alsheimer, Manfred}, title = {Mammalian Sperm Head Formation Involves Different Polarization of Two Novel LINC Complexes}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-68449}, year = {2010}, abstract = {Background: LINC complexes are nuclear envelope bridging protein structures formed by interaction of SUN and KASH proteins. They physically connect the nucleus with the peripheral cytoskeleton and are critically involved in a variety of dynamic processes, such as nuclear anchorage, movement and positioning and meiotic chromosome dynamics. Moreover, they are shown to be essential for maintaining nuclear shape. Findings: Based on detailed expression analysis and biochemical approaches, we show here that during mouse sperm development, a terminal cell differentiation process characterized by profound morphogenic restructuring, two novel distinctive LINC complexes are established. They consist either of spermiogenesis-specific Sun3 and Nesprin1 or Sun1g, a novel non-nuclear Sun1 isoform, and Nesprin3. We could find that these two LINC complexes specifically polarize to opposite spermatid poles likely linking to sperm-specific cytoskeletal structures. Although, as shown in co-transfection / immunoprecipitation experiments, SUN proteins appear to arbitrarily interact with various KASH partners, our study demonstrates that they actually are able to confine their binding to form distinct LINC complexes. Conclusions: Formation of the mammalian sperm head involves assembly and different polarization of two novel spermiogenesis-specific LINC complexes. Together, our findings suggest that theses LINC complexes connect the differentiating spermatid nucleus to surrounding cytoskeletal structures to enable its well-directed shaping and elongation, which in turn is a critical parameter for male fertility.}, subject = {Sperma}, language = {en} } @article{MeierjohannHufnagelWendeetal.2010, author = {Meierjohann, Svenja and Hufnagel, Anita and Wende, Elisabeth and Kleinschmidt, Markus A. and Wolf, Katarina and Friedl, Peter and Gaubatz, Stefan and Schartl, Manfred}, title = {MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-68335}, year = {2010}, abstract = {Background: Melanoma cells are usually characterized by a strong proliferative potential and efficient invasive migration. Among the multiple molecular changes that are recorded during progression of this disease, aberrant activation of receptor tyrosine kinases (RTK) is often observed. Activation of matrix metalloproteases goes along with RTK activation and usually enhances RTK-driven migration. The purpose of this study was to examine RTKdriven three-dimensional migration of melanocytes and the pro-tumorigenic role of matrix metalloproteases for melanocytes and melanoma cells. Results: Using experimental melanocyte dedifferentiation as a model for early melanomagenesis we show that an activated EGF receptor variant potentiates migration through three-dimensional fibrillar collagen. EGFR stimulation also resulted in a strong induction of matrix metalloproteases in a MAPK-dependent manner. However, neither MAPK nor MMP activity were required for migration, as the cells migrated in an entirely amoeboid mode. Instead, MMPs fulfilled a function in cell cycle regulation, as their inhibition resulted in strong growth inhibition of melanocytes. The same effect was observed in the human melanoma cell line A375 after stimulation with FCS. Using sh- and siRNA techniques, we could show that MMP13 is the protease responsible for this effect. Along with decreased proliferation, knockdown of MMP13 strongly enhanced pigmentation of melanocytes. Conclusions: Our data show for the first time that growth stimuli are mediated via MMP13 in melanocytes and melanoma, suggesting an autocrine MMP13-driven loop. Given that MMP13-specific inhibitors are already developed, these results support the evaluation of these inhibitors in the treatment of melanoma.}, subject = {Medizin}, language = {en} } @phdthesis{Li2010, author = {Li, Jian-Qiang}, title = {Modulating the expression of enzymes of isoprenoid synthesis: effects on Vgamma9Vdelta2 T cell activation and tumor cell growth}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-46388}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {This study focuses on phosphoantigen specific Vg9Vd2 T cells which only exist in human and non-human primates. This population accounts for 1\%-5\% of peripheral blood T-lymphocytes but their frequency can rise to 50\% of total blood T cells upon infection. Vg9Vd2 T cells can be activated by nonpeptide compounds with critical phosphate moieties which are termed as phosphoantigens. These include isopentenyl pyrophosphate (IPP), a key compound of isoprenoid synthesis in all organisms, and (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), a direct precursor of IPP in DOXP pathway which only exist in eubacteria, plants, apicomplexaen parasites. Its activity as phosphoantigen is at least 1000 fold higher than that of IPP. However, direct structural evidence of phosphoantigen binding to the TCR is missing so far. Moreover, Vg9Vd2 T cells have potent anti-tumor activity e.g. against the B-cell lymphoma Daudi, whose Vg9Vd2 T cell activating properties have been suggested to result from sensing of abnormal intracellular IPP levels by the Vg9Vd2 TCR or Vg9Vd2 TCR binding to other postulated ligands such as an ectopically expressed F1-ATPase or UL-16 binding protein 4 (ULBP4). Aminobisphosphonates and alkymines were hypothesized to activate Vg9Vd2 T cells indirectly by inhibiting the IPP consuming enzyme farnysyl pyrophosphates synthesis (FPPS) although off target effects of these drugs or a direct interaction with the Vg9Vd2 TCR could not be excluded. This thesis presents new approaches for the mechanistic analysis of Vg9Vd2 T cell activation. By employing retroviral transduction of FPPS specific shRNA, it shows that specific shRNA reduces expression of FPPS and is sufficient to convert hematopoietic and non-hematopoietic tumor cell lines into Vg9Vd2 T cell activators. FPPS knockdown cells activated Vg9Vd2 T cells as measured by increased levels of CD69 and CD107a, kill of FPPS knockdown cells and induction of IFN-\&\#947; secretion. The IPP-synthesis-inhibiting drug mevastatin reduced Vg9Vd2 T cell activation by FPPS knockdown cells or aminobisphosphonate treated cells but not activation by the phosphoantigen bromohydrin pyrophosphate (BrHPP). A reduced growth of the FPPS knockdown cells has not been observed which is different to what has been reported for aminobisphosphonate treated cells. Finally, the human B-cell lymphoma RAJI has been transduced with Tetracyclin-inducible FPPS specific shRNA and proven to gain and loose the capacity to activate Vg9Vd2 TCR transductants upon doxycylin provision or removal. Another approach for the analysis of Vg9Vd2 T cell activation is Vg9Vd2 TCR transduced mouse cell lines with specificity for phosphoantigens. In contrast to the previously used Vg9Vd2 TCR transduced Jurkat cells, these cells do not present phosphoantigens, and are therefore specially suited for analysis of phosphoantigen presentation. The response of the new TCR transductants to presumed Vg9Vd2 TCR ligands/activators such as phosphoantigens, aminobisphosphonates or FPPS knockdown cells, depended strongly on the expression of a rat/mouse CD28 molecule by the transductants and its ligation by the (CD80) counter receptor on the ligand-presenting cell. The response is likely to reflect recognition of cognate Vg9Vd2 TCR antigens since mutations in the TCR-\&\#948; chain CDR2 and 3 abolished this response but activation by TCR or CD3 specific antibodies. A major difference between TCR transductants and primary gd T cells, was the lacking response of TCR transductants to Daudi or IPP. In addition their sensitivity to other soluble phosphoantigens was about 100 fold weaker than that of primary cells, stimulation of both cell type to CD80 expressing FPPS knock down or aminobisphosphonates was similar. Finally, the transductants have also been used to analyze effects of over-expression or knockdown of enzymes of isoprenoid synthesis such as 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reductase or HMGR), mevalonate-5-pyrophosphate decarboxylase (MVD), isopentenyl pyrophosphate isomerase (IDI), geranyl-geranyl pyrophosphate synthase (GGPPS) but no clear effects have been found. In conclusion, this thesis supports the concept of Vg9Vd2 T cells being sensors of a dysregulated isoprenoid metabolism and established new tools to study ligand recognition and TCR mediated activation of this T cell population. These tools will be most useful to address following questions: 1) How does the dysregulation of isoprenoid metabolism affect tumor growth? 2) What is the correlation between the modulation of IPP levels and the Vg9Vd2 TCR binding or expression of other postulated ligands? 3) Are there any mevalonate pathway enzymes other than FPPS and HMGR, which play an important role in Vg9Vd2 T cells activation? 4) What is/are the putative phosphoantigen-presenting molecule(s)?}, subject = {Primaten}, language = {en} } @phdthesis{Harth2010, author = {Harth, Stefan}, title = {Molecular Recognition in BMP Ligand-Receptor Interactions}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52797}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are secreted multifunctional signaling proteins that play an important role during development, maintenance and regeneration of tissues and organs in almost all vertebrates and invertebrates. BMPs transmit their signals by binding to two types of serine-/threonine-kinase receptors. BMPs bind first to their high affinity receptor, thereby recruiting their low affinity receptor into the complex. This receptor assembly starts a Smad (Small mothers against decapentaplegic) protein signaling cascade which regulates the transcription of responsive genes. Up to date, only seven type I and five type II receptors are known for more than 30 ligands. Therefore, many BMP ligands can recruit more than one receptor subtype. Vice versa, receptors can bind to several ligands, indicating a highly promiscuous ligand-receptor interaction. This raises the following questions: (i) How are BMPs able to induce ligand-specific signals, despite forming complexes with identical receptor composition and (ii) how are they able to recognize and bind various binding partners in a highly specific manner. From the ligand's point of view, heterodimeric BMPs are valuable tools for studying the interplay between different sets of receptors, thereby providing new insights into how the various BMP signals can be generated. This study describes the expression and purification of the heterodimers BMP-2/6 and -2/7 from E.coli cells. BIAcore interaction studies and various in vitro cell activity assays revealed that the generated heterodimers are biologically active. Furthermore, BMP-2/6 and -2/7 exhibit a higher biological activity in most of the cell assays compared to their homodimeric counterparts. In addition, the BMP type I receptor BMPR-IA is involved in heterodimeric BMP signaling. However, the usage of other type I receptor subtypes (e.g. ActR-I) building a heteromeric ligand-receptor type I complex as indicated in previous works could not be determined conclusively. Furthermore, BMP heterodimers seem to require only one type I receptor for signaling. From the receptors' point of view, the BMP type I receptor BMPR-IA is a prime example for its promiscuous binding to different BMP ligands. The extracellular binding interface of BMPR-IA is mainly unfolded in its unbound form, requiring a large induced fit to adopt the conformation when bound to its ligand BMP-2. In order to unravel whether the binding promiscuity of BMPR-IA is linked to structural plasticity of its binding interface, the interaction of BMPR-IA bound to an antibody Fab fragment was investigated. The Fab fragment was selected because of its ability to recognize the BMP-2 binding epitope on BMPR-IA, thus neutralizing the BMP-2 mediated receptor activation. This study describes the crystal structure of the complex of the extracellular domain of BMPR-IA bound to the antibody Fab fragment AbyD1556. The crystal structure revealed that the contact surface of BMPR-IA overlaps extensively with the contact surface of BMPR-IA for BMP-2 interaction. Although the contact epitopes of BMPR-IA to both binding partners coincide, the three-dimensional structures of BMPR-IA in both complexes differ significantly. In contrast to the structural differences, alanine-scanning mutagenesis of BMPR-IA showed that the functional determinants for binding to both the antibody and BMP-2 are almost identical. Comparing the structures of BMPR-IA bound to BMP-2 or to the Fab AbyD1556 with the structure of unbound BMPR-IA revealed that binding of BMPR-IA to its interaction partners follows a selection fit mechanism, possibly indicating that the ligand promiscuity of BMPR-IA is inherently encoded by structural adaptability.}, subject = {Knochen-Morphogenese-Proteine}, language = {en} } @phdthesis{Brandl2010, author = {Brandl, Carolin}, title = {Molekulare Mechanismen und zellul{\"a}re Kooperationen tolerogener Dendritischer Zellen bei der Experimentellen Autoimmun-Enzephalomyelitis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-49380}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Aus Vorarbeiten in der Arbeitsgruppe war bekannt, dass M{\"a}use durch Injektion von tolerogenen, TNF-gereiften und MOG-beladenen DZ vor EAE gesch{\"u}tzt werden k{\"o}nnen. Eines der Ziele dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob das koinhibitorische Molek{\"u}l B7-H1 auf der Oberfl{\"a}che der DZ einen Einfluss auf das tolerogene Potential der DZ hat. Dazu wurden B7-H1-defiziente DZ generiert, mit TNF gereift, mit MOG-Peptid beladen und intraven{\"o}s in M{\"a}use injiziert, bevor die EAE induziert wurde. Es zeigte sich, dass diese DZ die Tiere sogar noch besser vor der Krankheit sch{\"u}tzen konnten als die WT DZ. Die Injektion der B7-H1-/- DZ bewirkte eine verst{\"a}rkte Produktion von IL-10 and IL-13 nach Restimulation der Milz-Zellen in vitro und eine erh{\"o}hte Menge von protektiven Serum-Zytokinen (IL-4 und IL-13), welche von NKT-Zellen produziert wurden. Versuche mit CD1d-/- und J\&\#945;281-/- M{\"a}usen haben ergeben, dass diese Zytokine von Typ II NKT-Zellen produziert wurden. Weitere Versuche mit Typ I und II NKT-Zell-Linien haben best{\"a}tigt, dass nur die Typ II NKT-Zellen von einem endogenen CD1d-Ligand der DZ stimuliert werden k{\"o}nnen. Außerdem wird dies {\"u}ber B7-H1 reguliert, da die NKT-Zell-Reaktion in Abwesenheit von B7-H1 st{\"a}rker ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass neben den NKT-Zellen MZ B-Zellen n{\"o}tig sind, um die M{\"a}use vor der EAE-Entwicklung zu sch{\"u}tzen. Versuche mit CD22-/- M{\"a}usen, welche eine Reduktion in der MZ B-Zell-Population zeigen, haben ergeben, dass in Abwesenheit von MZ B-Zellen keine EAE-Protektion mehr m{\"o}glich ist. In dieser Arbeit wurde auch der Effekt von Glykolipid-Antigenen, welche einen Großteil der Myelinscheide des ZNS ausmachen, auf DZ untersucht. Ausgew{\"a}hlte Lipide f{\"u}hren zu einer Reifung der DZ, welche sich in der verst{\"a}rkten MHC II- und CD86-Expression, jedoch nicht in der Produktion von Zytokinen {\"a}ußert. Außerdem sind diese Lipid-gereiften DZ in der Lage T-Zellen zu stimulieren. Als letzter Punkt wurde in dieser Arbeit der Zusammenhang zwischen Masern-Virus-Infektionen und EAE untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine cerebrale Masern-Infektion zusammen mit einer EAE-Induktion einen dramatischen Effekt auf die Tiere hat. F{\"u}r diese Versuche wurde ein Maus-Modell einer persistierenden Masern-Infektion im Gehirn verwendet. Diese Tiere leben nach der Virus-Behandlung ohne Symptome. Nach der EAE-Induktion starben diese Tiere jedoch bereits wenige Tage sp{\"a}ter aufgrund einer MOG-Peptid-spezifischen Reaktion.}, subject = {Encephalomyelitis}, language = {de} } @phdthesis{Matthes2010, author = {Matthes, Daniel}, title = {Molekulare Untersuchungen zum Gag-Protein der Foamyviren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52162}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Foamyviren (FV) weisen eine Reihe von Merkmalen auf, welche sie von Orthoretroviren unterscheidet, die sie jedoch gleichzeitig mit den Hepadnaviren teilen. Dies betrifft neben der Genomorganisation, der Proteinexpression sowie dem Replikationsverhalten auch die Partikelmorphogenese. Die zentrale Komponente in diesem Prozeß stellt das Gag-Protein dar. FV ben{\"o}tigen im Gegensatz zu Orthoretroviren und vergleichbar den Hepadnaviren die Koexpression des homologen Glykoproteins f{\"u}r den zellul{\"a}ren Partikelexport. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde mittels eines chim{\"a}ren Konstruktes aus den Gag-Proteinen von MPMV und PFV versucht, ein Env-interagierendes Motiv sowie die f{\"u}r die Interaktion mit dem Glykoprotein essentiellen As in PFV Gag zu identifizieren. Dabei wiesen die chim{\"a}ren Gag-Proteine Gemeinsamkeiten mit PFV Gag auf, wie eine perinukle{\"a}re Akkumulation, eine Vorraussetzung f{\"u}r das Assembly sowohl von PFV als auch MPMV. Desweiteren waren die Gag-Chim{\"a}ren f{\"u}r einen zellul{\"a}ren Export auf die Koexpression des homologen Glykoproteins angewiesen. Dies deutete auf die Integrit{\"a}t und Funktionalit{\"a}t des daf{\"u}r notwendigen PFV Gag N-Terminus hin. Die chim{\"a}ren Gag-Molek{\"u}le multimerisierten jedoch nicht zu Kapsiden oder vergleichbaren partikul{\"a}ren Strukturen, vermutlich aufgrund massiver sterischer Zw{\"a}nge infolge der Beteiligung heterologer Proteindom{\"a}nen, weswegen sie kein geeignetes System zur funktionellen Analyse der PFV Gag-Env-Interaktion darstellten. Eine weitere Besonderheit foamyviraler Gag-Proteine ist ihr {\"a}ußerst geringer Lysinanteil. Im Gegensatz zu den Gag-Proteinen der Orthoretroviren wird der {\"u}berwiegende Anteil basischer Aminos{\"a}uren (As) durch Arginin vertreten. Da {\"u}ber 60 \% der Arginin-spezifizierenden Kodons {\"u}ber eine Einzelmutation aus Lysin-Kodons hervorgegangen sein k{\"o}nnten, ist es wahrscheinlich, daß im Verlauf der foamyviralen Evolution eine positive Selektionierung von Gag-Mutanten mit einer Lysin-zu-Arginin-Substitution stattfand. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde anhand der Beispiele von PFV sowie FFV der Frage nachgegangen, welche Funktionen Arginine in foamyviralen Gag-Proteinen w{\"a}hrend der Replikation {\"u}bernehmen. Dazu wurde in infekti{\"o}sen PFV- sowie FFV-Klonen eine Reihe von Argininen gegen Lysine substituiert. Zus{\"a}tzlich wurde das singul{\"a}re Lysin in PFV Gag gegen Arginin substituiert. Dabei konnte gezeigt werden, daß s{\"a}mtliche PFV- sowie FFV-Mutanten replikationskompetent waren. Das singul{\"a}re Lysin in PFV Gag war f{\"u}r dessen Replikation in immortalisierten Zellen entbehrlich, in einer prim{\"a}ren Zellinie wies die entsprechende Mutante jedoch eine stark eingeschr{\"a}nkte Replikationsf{\"a}higkeit auf. Eine PFV-Substitutionsmutante (M141) induzierte in transfizierten 293T-Zellkulturen einen CPE, ein Hinweis auf eine Beteiligung dieses Gag-Abschnittes an der Interaktion mit dem PFV Glykoprotein. Nach zehnmaliger Zellkultur-Passagierung der PFV Gag-Mutanten traten weder Revertanten noch Pseudorevertanten auf, was jedoch aufgrund der kurzen Zeitspanne des Experimentes nur eine begrenzte Aussagekraft bez{\"u}glich der genetischen Stabilit{\"a}t der Mutanten zuließ. Mittels der Applikation von AZT, eines Inhibitors der foamyviralen reversen Transkription, entweder auf die virusproduzierenden Zellen oder die zur Infektion verwendeten Zielzellen konnte gezeigt werden, daß sich die PFV Gag-Lysinmutanten hinsichtlich ihrer Replikationsstrategie nicht von WT-Viren unterscheiden und ihre genomische RNA gr{\"o}ßtenteils noch in der Produktionszelle revers transkribieren. Desweiteren konnte mittels quantitativer real-time PCR nachgewiesen werden, daß die PFV- und FFV-Mutanten wie f{\"u}r FV {\"u}blich sowohl DNA als auch RNA in ihre Partikel verpacken. Die infekti{\"o}se Natur foamyviraler genomischer DNA konnte bereits in fr{\"u}heren Ver{\"o}ffentlichungen gezeigt werden. Auch in dieser Arbeit konnte nach Transfektion von Zellen mit aufgereinigter Virionen-DNA und anschließendem {\"U}berstandtransfer ein CPE in den infizierten Indikatorzellen induziert werden, was die Produktion infekti{\"o}ser Viruspartikel bewies. Die -Aminogruppe von Lysin fungiert als potentieller Ubiquitinakzeptor. F{\"u}r das singul{\"a}re Lysin im WT Gag-Protein von PFV konnte wie in fr{\"u}heren Ver{\"o}ffentlichungen keine Ubiquitinierung festgestellt werden, im Gegensatz dazu wurde bei vier der f{\"u}nf PFV Substitutionsmutanten eine Ubiquitinierung der neu eingef{\"u}hrten Lysine detektiert. Diese kovalente Modifikation hatte jedoch keinen Einfluß auf die Env-Restriktion des PFV-Kapsidexportes aus der Zelle. F{\"u}r FFV konnte sowohl f{\"u}r den WT als auch die Substitutionsmutanten weder eine LP- noch eine Gag-Ubiquitinierung festgestellt werden. Als wahrscheinliche Ursache daf{\"u}r kommen Unterschiede in den Komponenten der Ubiquitinierungsmaschinerie zwischen humanen Zellen und Katzenzellen in Frage, weshalb die Analyse einer m{\"o}glichen Ubiquitinierung der neu in FFV Gag eingef{\"u}hrten Lysine in Katzenzellen als Produktionszellen durchgef{\"u}hrt werden sollte. Die Replikationsf{\"a}higkeit mehrerer Substitutionsmutanten der Gegenwart von IFN- und - war im Vergleich zum WT stark eingeschr{\"a}nkt. Dies deutete darauf hin, daß IFN-vermittelte Abwehrmechanismen eine Rolle w{\"a}hrend der positiven Selektion der Lysin-zu-Arginin-Substitutionsmutanten gespielt haben k{\"o}nnten. Die in dieser Arbeit erzielten Resultate zeigten, daß sich die PFV- sowie FFV-Lysinmutanten in ihrem Replikationsverhalten nicht von WT-Viren unterscheiden. Im Kontext einer {\"u}ber Millionen von Jahren andauernden Wirts-Erreger-Koevolution stellt jedoch der durch zellul{\"a}re Restriktionsfaktoren vermittelte Selektionsdruck auf das Virus einen wichtigen Aspekt dar. Demnach k{\"o}nnte die Substitution von Lysin gegen Arginin beispielsweise {\"u}ber eine ver{\"a}nderte kovalente Modifikation eine Interaktion mit antiretroviralen Restriktionsfaktoren der Wirtszelle modifiziert oder inhibiert haben, wodurch diese Mutanten im Verlauf der foamyviralen Evolution positiv selektioniert wurden.}, subject = {Spumaviren}, language = {de} } @phdthesis{Niewalda2010, author = {Niewalda, Thomas}, title = {Neurogenetic analyses of pain-relief learning in the fruit fly}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65035}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {All animals learn in order to cope with challenges imposed on them by their environment. This is true also for both larval and adult fruit flies as exemplified in pavlovian conditioning. The focus of this Thesis is on various aspects of the fruit flies learning ability. My main project deals with two types of learning which we call punishment-learning and pain-relief learning. Punishment learning happens when fruit flies are exposed to an odour which is followed by electric shock. After such training, flies have learned that that odour signals pain and consequently will avoid it in the future. If the sequence of the two stimuli is reversed such that odour follows shock, flies learn the odour as a signal for relief and will later on approach it. I first report a series of experiments investigating qualitative and parametric features of relief-learning; I find that (i) relief learning does result from true associative conditioning, (ii) it requires a relatively high number of training trials, (iii) context-shock training is ineffective for subsequent shock-odour learning. A further question is whether punishment-learning and pain-relief learning share genetic determinants. In terms of genetics, I test a synapsin mutant strain, which lacks all Synapsin protein, in punishment and relief-learning. Punishment learning is significantly reduced, and relief-learning is abolished. Pan-neuronal RNAi-mediated knock-down of Synapsin results in mutant-like phenotypes, confirming the attribution of the phenotype to lack of Synapsin. Also, a rescue of Synapsin in the mushroom body of syn97 mutants restores both punishment- and relief-learning fully, suggesting the sufficiency of Synapsin in the mushroom body for both these kinds of learning. I also elucidate the relationship between perception and physiology in adult fruit flies. I use odour-shock conditioning experiments to identify degrees of similarity between odours; I find that those similarity measures are consistent across generalization and discrimination tasks of diverse difficulty. Then, as collaborator of T. V{\"o}ller and A. Fiala, I investigate how such behavioural similarity/dissimilarity is reflected at the physiological level. I combine the behaviour data with calcium imaging data obtained by measuring the activity patterns of those odours in either the sensory neurons or the projection neurons at the antennal lobe. Our interpretation of the results is that the odours perceptual similarity is organized by antennal lobe interneurons. In another project I investigate the effect of gustatory stimuli on reflexive behaviour as well as their role as reinforcer in larval learning. Drosophila larvae greatly alter their behaviour in presence of sodium chloride. Increasing salt concentration modulates choice behaviour from weakly appetitive to strongly aversive. A similar concentration-behaviour function is also found for feeding: larval feeding is slightly enhanced in presence of low salt concentrations, and strongly decreased in the presence of high salt concentrations. Regarding learning, relatively weak salt concentrations function as appetitive reinforcer, whereas high salt concentrations function as aversive reinforcer. Interestingly, the behaviour-concentration curves are shifted towards higher concentrations from reflexive behaviour (choice behaviour, feeding) as compared to associative learning. This dissociation may reflect a different sensitivity in the respective sensory-motor circuitry.}, subject = {Taufliege}, language = {en} } @phdthesis{Hartmann2010, author = {Hartmann, Thomas}, title = {Nitrogen metabolism in Aspergillus fumigatus with emphasis on the oligopeptide transporter (OPT) gene family}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-54027}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {The saprophytic filamentous fungus Aspergillus fumigatus has been gaining importance as an opportunistic human pathogen over the past decades. Advances in modern medicine have created a growing group of patients susceptible to infection with A. fumigatus, often contracting potentially deadly invasive aspergillosis. The virulence of this pathogen appears to be a multifactorial trait, a combination of physiological characteristics that enables the fungus to infect immunocompromised humans. This work concentrates on the nitrogen metabolism of A. fumigatus, which is essential for meeting the nutritional needs inside the human host. Using DNA microarrays, the transcriptional response during growth on three different secondary nitrogen sources was examined, which revealed the metabolic versatility of A. fumigatus, especially when challenged with proteins as the sole source of nitrogen. In-depth transcriptional profiling of the eight-member oligopeptide transporter (OPT) gene family underlined the importance of oligopeptide transport for growth on complex nitrogen sources like BSA or collagen. Heterologous expression of the opt genes in Saccharomyces cerevisiae showed their functionality as oligopeptide transporters, and characterized their substrate specificity. Using a Cre/loxP based genetic tool, a complete deletion of all opt genes in A. fumigatus was achieved. The resultant strain exhibited diminished growth on medium where the oligopeptide GPGG was the sole nitrogen source, but did not show any other in vitro phenotype. The opt deletion strain was not attenuated in virulence in a murine model of pulmonary aspergillosis, suggesting that the OPT gene family is not necessary for successful infection. The connection of oligopeptide transport and extracellular proteolytic activity was investigated by deleting the genes encoding Dpp4 and Dpp5, two dipeptidyl peptidases, or PrtT, the transcriptional regulator of major secreted proteases, in the complete opt deletion background. In contrast to the deletion of dpp4 and dpp5, which did not result in any additional phenotype, the absence of prtT led to a drastic growth defect on porcine lung agar. This suggests a synergistic action of extracellular proteolytic digest of proteins and transport of oligopeptide degradation products into the cell. Finally, this work established the bacterial β-Rec/six site-specific recombination system as a novel genetic tool for targeted gene deletion in A. fumigatus.}, subject = {Aspergillus fumigatus}, language = {en} } @phdthesis{Worschech2010, author = {Worschech, Andrea}, title = {Oncolytic Therapy with Vaccinia Virus GLV-1h68 - Comparative Microarray Analysis of Infected Xenografts and Human Tumor Cell Lines -}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-45338}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Aim of this thesis was to study the contribution of the hosts immune system during tumor regression. A wild-type rejection model was studied in which tumor regression is mediated through an adaptive, T cell host response (Research article 1). Additionally, the relationship between VACV infection and cancer rejection was assessed by applying organism-specific microarray platforms to infected and non-infected xenografts. It could be shown that tumor rejection in this nude mouse model was orchestrated solely by the hosts innate immune system without help of the adaptive immunity. In a third study the inflammatory baseline status of 75 human cancer cell lines was tested in vitro which was correlated with the susceptibility to VACV and Adenovirus 5 (Ad5) replication of the respective cell line (Manuscript for Research article 3). Although xenografts by themselves lack the ability to signal danger and do not provide sufficient proinflammatory signals to induce acute inflammation, the presence of viral replication in the oncolytic xenograft model provides the "tissue-specific trigger" that activates the immune response and in concordance with the hypothesis, the ICR is activated when chronic inflammation is switched into an acute one. Thus, in conditions in which a switch from a chronic to an acute inflammatory process can be induced by other factors like the immune-stimulation induced by the presence of a virus in the target tissue, adaptive immune responses may not be necessary and immune-mediated rejection can occur without the assistance of T or B cells. However, in the regression study using neu expressing MMC in absence of a stimulus such as a virus and infected cancer cells thereafter, adaptive immunity is needed to provoke the switch into an acute inflammation and initiate tissue rejection. Taken together, this work is supportive of the hypothesis that the mechanisms prompting TSD differ among immune pathologies but the effect phase converges and central molecules can be detected over and over every time TSD occurs. It could be shown that in presence of a trigger such as infection with VACV and functional danger signaling pathways of the infected tumor cells, innate immunity is sufficient to orchestrate rejection of manifested tumors.}, subject = {Tumorimmunologie}, language = {en} } @phdthesis{Seubert2010, author = {Seubert, Carolin}, title = {Onkolytische Virotherapie : Virus-vermittelte Expression von MCP-1 oder ß-Galaktosidase in Vaccinia-Virus-kolonisierten Tumoren f{\"u}hrt zu einer erh{\"o}hten Tumorregression}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48083}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Ungeachtet der enormen Entwicklung in Krebsdiagnostik und -Therapie in den letzten Jahren, sind vollst{\"a}ndige Heilungsaussichten weiterhin gering und die aktuellen Behandlungsmethoden oftmals mit schwerwiegenden Nebeneffekten verbunden. Aufgrund dessen sind alternative Behandlungsmethoden unbedingt erforderlich und f{\"u}hrten zu einer zunehmenden Bedeutung des Vaccinia-Virus als onkolytisches Virus in der Krebstherapie. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei m{\"o}gliche Therapieans{\"a}tze zur Verst{\"a}rkung der onkolytischen Effekte in humanen Tumormodellen untersucht. Die Kombination einer gene-directed enzyme prodrug Therapie (GDEPT) mit dem onkolytischen Vaccinia-Virus GLV 1h68 sollte zur Selektivit{\"a}tssteigerung eines ß-Galaktosidase-aktivierbaren, cytotoxisch-aktiven Drugs f{\"u}hren. Dar{\"u}ber hinaus diente das f{\"u}r MCP-1 codierende Vaccinia-Virus GLV-1h80, zielend auf eine Cytokin-vermittelten Immuntherapie, als Vektor zur spezifischen Beeinflussung des intratumoralen Chemokin-Netzwerks. Im Zuge der GDEPT wurde in dieser Arbeit ein, durch enzymatische Deglykosylierug aktivierbares Prodrug, basierend auf dem cytotoxischem Antibiotikum Duocarmycin SA verwendet. Durch eine Infektion mit GLV-1h68 und einer resultierenden Expression des aktivierenden Enzyms ß-Galaktosidase, sollte eine Umwandlung des Prodrugs in ein cytotoxisches Drug erfolgen. In vitro Infektionsstudien zeigten ein nahezu identisches Replikationsverhalten des Vaccinia-Virus GLV-1h68 und des als Kontrollvirus dienenden rVACV GLV-1h43 in humanen GI-101A-Brustkrebszellen. Die Expression der beiden Reporter-Gene Ruc-GFP sowie ß-Galaktosidase konnten auf Protein-Ebene und mittels RT-PCR nach Infektion mit GLV-1h68 nachgewiesen werden. GLV-1h43-Infektion von GI-101A-Zellen f{\"u}hrte zu GFP-Expression, jedoch nicht zur Expression des Enzyms ß Galaktosidase. Untersuchung der Enzym-Aktivit{\"a}t in Zelllysaten und Zellkultur-{\"U}berst{\"a}nden zeigten nach Infektion mit GLV 1h68 steigende Menge zellul{\"a}r assoziierter und freier ß-Galaktosidase. Des Weiteren wurde durch Koinkubation von GI-101A-Zellen mit Virus-freien, ß Galaktosidase-haltigen Zelllysaten bzw. -{\"u}berst{\"a}nden und Prodrug eine Aktivierung des Prodrugs durch das Virus codierte Enzym nachgewiesen. Diese Koinkubation f{\"u}hrte zur Abt{\"o}tung der Zellen. Nach Inkubation mit Proben mock- oder GLV 1h43-infizierter Zellen konnte keiner Ver{\"a}nderung der Proliferationsrate von GI-101A-Zellen gefunden werden. Kombinierte Behandlung von GI 101A-Zellen mit Viren des Stammes GLV 1h68 und Prodrug f{\"u}hrte zu starken Synergieeffekten bei der Abt{\"o}tung der Zellen und wies einen Bystander Effekt der Kombinationstherapie nach. Dieser konnte in 4 weiteren humanen und 2 Hunde-Brustkrebszellen best{\"a}tigt werden. Der erzielte Bystander-Effekt zeigt, dass es nach Virus-induzierter ß-Galaktosidase-Expression in GLV 1h68-infizierten Zellen zu einer enzymatischen Spaltung des Prodrugs in das cytotoxische seco-Analogon des Antibiotikums Duocarmycin SA kommt. Durch die Membrang{\"a}ngigkeit des Drugs konnte auch in angrenzenden uninfizierten Zellen eine Wirkung erzielt werden. Anhand von Expressionsanalysen an Apoptose-assoziierten Proteinen, wie PARP und Caspasen, wurde eine Wirkung des Prodrugs {\"u}ber den intrinsischen Apoptose-Signalweg nachgewiesen. In athymischen Nude-M{\"a}usen durchgef{\"u}hrte Replikationsanalysen und X-Gal-F{\"a}rbungen GLV 1h68 infizierter Tumore nach Prodrug-Behandlung zeigten, dass GLV-1h68 ungeachtet der simultanen Behandlung mit Prodrug im Tumorgewebe repliziert und es nicht zur Anreicherung lacZ-negativer Virusmutanten kommt. Es konnten, durch Prodrug-Behandlung und einer simultanen Expression aktiver ß Galaktosidase, starke synergistische Effekte und eine signifikante Steigerung der Tumorregression erzielt werden. Da die Kombinationstherapie zu keinerlei Unterschieden in Gewicht und Gesundheitszustand behandelter Versuchstiere f{\"u}hrte, konnte eine systemische Toxizit{\"a}t außerhalb des Tumorgewebes ausgeschlossen werden. Verschiedene Zelllinien weisen Unterschiede in ihrer Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber der onkolytischen Aktivit{\"a}t von Vaccinia-Virus GLV-1h68 auf. W{\"a}hrend einige Zelllinien trotz Virus-Behandlung unver{\"a}ndertes Proliferationsverhalten zeigen (non- oder poor-responder), f{\"u}hrt diese Behandlung in anderen Zelllinien zu einer vollst{\"a}ndigen Tumorregression (responder). In Anbetracht dieser Unterschiede wurden in dieser Arbeit die Effekte einer induzierten Expression des murinen Chemokins MCP-1 in GI-101A-Tumoren (responder) und HT29-CBG-Tumoren (poor-responder) untersucht. MCP-1 zeichnet sich durch seine chemotaktischen Eigenschaften gegen{\"u}ber mononukle{\"a}rer Zellen aus und f{\"u}hrt zu pleiotropen Tumor-Effekten. Replikationsstudien am Virus GLV-1h80 und des als Kontrollvirus dienenden rVACV GLV-1h68 zeigten, dass aus der Expression des Fremd-Gens mcp-1 sowohl in vitro als auch in vivo keinerlei negativen Effekte auf das Replikationsverhalten in humanen GI-101A- und HT29-CBG-Zellen resultieren. Durch Real-time Monitoring der GFP-Expression im Tumorgewebe lebender Tiere konnte zun{\"a}chst eine mit dem Infektionsverlauf zunehmende Signalst{\"a}rke beobachtet werden, welche dann 42 dpi an Intensit{\"a}t verlor. Toxizit{\"a}t und sch{\"a}dliche Nebeneffekte durch Infektion mit den beiden rVACV konnten anhand der viralen Titer in den Organen der Maus ausgeschlossen werden. Die Titer wiesen auf eine ausschließlich auf das Tumorgewebe begrenzte Replikation der Viren nach Injektion in Tumor-tragende Tiere hin. Die Expression des Chemokins MCP-1 wurde sowohl auf transkriptioneller als auch auf translationeller Ebene in GLV-1h80-inifzierten Zellen und im Tumorgewebe GLV 1h80-injizierter M{\"a}use nachgewiesen. Nach Infektion mit GLV-1h80 konnte eine mit dem Infektionsverlauf zunehmende MCP-1-Expression gezeigt werden. Dabei wurde zudem deutlich, dass nicht nur eine GLV-1h80-Infektion in vivo zu einer Zunahme der intratumoralen MCP-1-Expression f{\"u}hrte, sondern eine Vaccinia-Virus-Infektion allein einen Anstieg des Chemokins zu bewirken vermag. Eine Quantifizierung durch ELISA machte Konzentrationsunterschiede von MCP-1 zwischen den Tumormodellen GI-101A und HT29-CBG deutlich. Sowohl in vitro als auch in vivo f{\"u}hrte ein GLV-1h80-Infektion zu deutlich niedrigeren Konzentrationen im HT29-CBG-Kolon-Adenokarzinommodell. Ein Nachweis murinen MCP-1 in Blutseren Tumor-tragender Tiere zeigte eine f{\"u}r therapeutische Effekte erw{\"u}nschte systemische Freisetzung des intratumoral durch die Infektion mit GLV-1h80 gebildeten Chemokins MCP-1. Durch immunhistologische Untersuchungen GLV-1h80-infizierter Zellen und Tumoren konnte diese, mit dem Infektionsverlauf zunehmende MCP-1-Expression best{\"a}tigt werden. Die funktionelle Aktivit{\"a}t des rekombinanten Proteins wurde anhand TNF-\&\#945;-spezifischer ELISA-Analysen {\"u}berpr{\"u}ft. Dabei zeigte sich eine erh{\"o}hte Expression dieses proinflammatorischen Cytokins in GI-101A-Tumoren nach Infektion mit GLV-1h80. Dagegen konnte keine Steigerung der Expression im HT29-CBG-Tumorgewebe nachgewiesen werden. Ein Nachweis des durch proinflammatorische Immunzellen exprimierten Oberlfl{\"a}chenproteins CD14 zeigte ebenfalls einen Anstieg nach Infektion mit GLV-1h80. Auch diese ver{\"a}nderte Expression blieb im poor-Responder-Modell HT29-CBG aus. Die steigende intratumorale Expression der beiden Proteine in GI-101A-Tumoren nach GLV 1h80-Infektion l{\"a}sst auf eine Zunahme pro-inflammatorischer Immunzellen, basierend auf einer Virus-induzierten MCP-1-Expression schließen. Ein Monitoring der Tumorprogression nach Implantation von GI 101A-Zellen und Injektion der rVACV GLV-1h80 und GLV-1h68 bzw. einer PBS-Injektion f{\"u}hrte nach einer anf{\"a}nglichen Zunahme des Tumorwachstums schließlich bei beiden Viren zu einer Tumorregression. Jedoch konnte durch die GLV-1h80-vermittelte MCP-1-Expression eine Verst{\"a}rkung der onkolytischen Effekte erzielt werden, welche sich durch eine signifikante Abnahme des Tumorvolumens zeigte. Im HT29-CBG-Modell f{\"u}hrten die therapeutischen Effekte durch rVACV GLV-1h80 zwar zu keiner Regression des Tumors, jedoch zeigte sich auch in diesem humanen Tumormodell eine Verst{\"a}rkung der onkolytischen Effekte nach GLV-1h80-Infektion im Vergleich zu einer GLV 1h68-Behandlung. Durch die GLV-1h80-induzierte Expression des Chemokins MCP-1 konnte somit eine Hemmung des Tumorwachstums auch im poor-Responder-Modell HT29-CBG erzielt werden. Sowohl die Verwendung eines ß-Galaktosidase-aktivierbaren Prodrugs im Zuge einer GDEPT, als auch die Beeinflussung des intratumoralen Chemokin-Netzwerks durch Expression des Chemokins MCP-1 f{\"u}hrten in dieser Arbeit zu positiven Synergismus-Effekten in der onkolytischen Virustherapie. Durch k{\"u}nftige Konstruktion eines rVACV, welches sowohl die Expression des Chemokins MCP-1, als auch des prodrug-aktivierenden Enzyms ß-Galaktosidase im Tumorgewebe induziert, k{\"o}nnte in Kombination mit einer Prodrug-Behandlung eine zus{\"a}tzliche Verst{\"a}rkung der Effekte erzielt und m{\"o}glicherweise eine erfolgreiche Virustherapie in bisher schwach ansprechenden poor- bzw. non-Responder-Modellen erm{\"o}glicht werden.}, subject = {Vaccinia-Virus}, language = {de} } @phdthesis{Nuwal2010, author = {Nuwal, Nidhi}, title = {Optogenetic investigation of nervous system functions using walking behavior and genome wide transcript analysis of Synapsin and Sap47 mutants of Drosophila}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51694}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {PART I Animals need to constantly evaluate their external environment in order to survive. In some cases the internal state of the animal changes to cope with it's surrounding. In our study we wanted to investigate the role of amines in modulating internal states of Drosophila. We have designed a behavioral paradigm where the flies are fixed in space but can walk on a small styrofoam ball suspended by a gentle stream of air. The walking activity of flies was used as behavioral readout. PART I Animals need to constantly evaluate their external environment in order to survive. In some cases the internal state of the animal changes to cope with it's surrounding. In our study we wanted to investigate the role of amines in modulating internal states of Drosophila. We have designed a behavioral paradigm where the flies are fixed in space but can walk on a small styrofoam ball suspended by a gentle stream of air. The walking activity of flies was used as behavioral readout. An operant training paradigm was established by coupling one of the walking directions to incidence of heat punishment. We observed that animals quickly realized the contingency of punishment with walking direction and avoided walking in the punished direction in the presence of punishment, but did not continue walking in the unpunished direction in the absence of the punishment. This would indicate that the flies do not form a memory for the punished direction or rapidly erase it under new conditions. On having established the paradigm with heat punishment we have attempted to activate selected subsets of neuronal populations of Drosophila while they were walking on the ball. The selective activation of neurons was achieved by expressing the light-activated ion channel channelrhodopsin-2 (ChR2) using the Gal4-UAS system and coupling the unidirectional walking of the animals on the ball with the incidence of blue light required to activate the channels and depolarize the neurons. The feasibility of this approach was tested by light-activating sugar sensitive gustatory receptor neurons expressing ChR2, we found that when the light was actuated the flies preferred to turn in one direction the optically "rewarded" direction. Next we similarly activated different subsets of aminergic neurons. We observed that in our setup animals avoided to turn in the direction which was coupled to activation of dopaminergic neurons indicating that release of dopamine is disliked by the animals. This is in accordance with associative learning experiments where dopamine is believed to underlie the formation of an association between a neutral conditioned stimulus with the aversive unconditioned stimulus. However, when we activated tyraminergic/octopaminergic neurons we did not observe any directional preference. The activation of dopaminergic and tyraminergic/octopaminergic neurons led to arousal of the animals indicating that we were indeed successful in activating those neurons. Also, the activation of serotonergic neurons did not have any effect on directional preference of the animals. With this newly established paradigm it will be interesting to find out if in insects like in mammals a reward mediating system exists and to test subsets of aminergic or peptidergic neurons that could possibly be involved in a reward signaling system which has not been detected in our study. Also, it would be interesting to localize neuropile regions that would be involved in mediating choice behavior in our paradigm. PART II In collaboration with S. Kneitz (IZKF Wuerzburg) and T. Nuwal we performed genome-wide expression analysis of two pre-synaptic mutants - Synapsin (Syn97) and Synapse associated protein of 47 kDa (Sap47156). The rationale behind these experiments was to identify genes that were up- or down-regulated due to these mutations. The microarray experiments provided us with several candidate genes some of which we have verified by qPCR. From our qPCR analysis we can conclude that out of the verified genes only Cirl transcripts seem to be reproducibly down regulated in Synapsin mutants. The Cirl gene codes for a calcium independent receptor for latrotoxin. Further qPCR experiments need to be performed to verify other candidate genes. The molecular interactions between CIRL and SYN or their genes should now be investigated in detail.}, subject = {Taufliege}, language = {en} } @phdthesis{Queisser2010, author = {Queisser, Nina}, title = {Oxidative and nitrosative stress induced by the mineralocorticoid aldosterone - Mechanism of induction and role of signal transduction pathways and transcription factors}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-53566}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Several epidemiological studies found that hypertensive patients have an increased risk to develop kidney cancer. Hyperaldosteronism frequently results in arterial hypertension and contributes to the development and progression of kidney injury, with reactive oxygen species (ROS) playing an important role. ROS are thought to be associated with many pathological conditions such as cancer and other disorders, like cardiovascular complications , which often go along with hypertension. The aim of the present work was to investigate whether the effects of elevated aldosterone concentrations might be involved in the increased cancer incidence of hypertensive individuals. First, the potential capacity of aldosterone to induce oxidative stress and DNA damage was investigated in vitro and in vivo. In LLC-PK1 porcine kidney cells and MDCK canine kidney cells the significant formation of ROS, and especially of superoxide (O2˙ˉ) was assessed. With two genotoxicity tests, the comet assay and the micronucleus frequency test, the DNA damaging potential of aldosterone was quantified. In both genotoxicity tests a dose-dependent increase in aldosterone-induced structural DNA damage was observed. Oxidative stress and DNA damage were prevented by antioxidants, suggesting ROS as a major cause of DNA damage. Furthermore, the oxidatively modified DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydro-2´-deoxyguanosine (8-oxodG), was found to be significantly elevated. In kidneys of rats with desoxycorticosterone acetate (DOCA)/salt-induced hypertension, which is a model of severe mineralocorticoid-dependent hypertension, elevated levels of ROS and superoxide were found, compared to kidneys of sham rats. Also DNA strand breaks, measured with the comet assay and double strand breaks, visualized with antibodies against the double strand break-marker gamma-H2AX were significantly elevated in kidneys of DOCA/salt-treated rats. In addition, significantly increased amounts of 8-oxodG were detected. Proliferation of kidney cells was found to be increased, which theoretically enables the DNA damage to manifest itself as mutations, since the cells divide. Second, the effects of aldosterone on the activation of transcription factors and signaling pathways were investigated. A significant activation of the potentially protective transcription factor Nrf2 was observed in LLC-PK1 cells. This activation was triggered by an increase of ROS or reactive nitrogen species (RNS). In response to oxidative stress, glutathione synthesis and detoxifying enzymes, such as the subunits of the glutathione-cysteine-ligase or heme oxygenase 1 were rapidly induced after 4 h. Nevertheless, after 24 h a decrease of glutathione levels was observed. Since ROS levels were still high after 24 h, but Nrf2 activation decreased, this adaptive survival response seems to be transient and quickly saturated and overwhelmed by ROS/RNS. Furthermore, Nrf2 activation was not sufficient to protect cells against oxidative DNA damage, because the amounts of double strand breaks and 8-oxodG lesions steadily rose up to 48 h of aldosterone treatment. The second transcription factor that was time- and dose-dependently activated by aldosterone in LLC-PK1 and MDCK cells was NF-kappaB. Furthermore, a significant cytosolic and nuclear activation of ERK was detected. Aldosterone induced the phosphorylation of the transcription factors CREB, STAT1 and STAT3 through ERK. Third, the underlying mechanisms of oxidant production, DNA damage and activation of transcription factors and signaling pathways were studied. Aldosterone exclusively acted via the MR, which was proven by the MR antagonists eplerenone, spironolactone and BR-4628, whereas the glucocorticoid receptor (GR) antagonist mifepristone did not show any effect. Furthermore, aldosterone needed cytosolic calcium to exert its negative effects. Calcium from intracellular stores and the influx of calcium across the plasma membrane was involved in aldosterone signaling. The calcium signal activated on the one hand, the prooxidant enzyme complex NAD(P)H oxidase through PKC, which subsequently caused the generation of O2˙ˉ. On the other hand, nitric oxide synthase (NOS) was activated, which in turn produced NO. NO and O2˙ˉ can react to the highly reactive species ONOO- that can damage the DNA more severely than the less reactive O2˙ˉ. In the short term, the activation of transcription factors and signaling pathways could be a protective response against aldosterone-induced oxidative stress and DNA damage. However, a long-term NF-B and ERK/CREB/STAT activation by persistently high aldosterone levels could unfold the prosurvival activity of NF-kappaB and ERK/CREB/STAT in aldosterone-exposed cells. DNA damage caused by increased ROS might become persistent and could be inherited to daughter cells, probably initiating carcinogenesis. If these events also occur in patients with hyperaldosteronism, these results suggest that aldosterone could be involved in the increased cancer incidence of hypertensive individuals.}, subject = {Aldosteron}, language = {en} } @phdthesis{Brandes2010, author = {Brandes, Nicolas}, title = {Oxidative Thiol Modifications in Pro- and Eukaryotic Organisms}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-46542}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Cystein spielt eine wichtige Rolle in der Biochemie vieler Proteine. Aufgrund der Redox-Eigenschaften und der hohen Reaktivit{\"a}t der freien Thiol-Gruppe sowie dessen F{\"a}higkeit Metallionen zu koordinieren, ist Cystein oft Bestandteil von katalytischen Zentren vieler Enzyme. Zudem lassen sich Cysteine durch reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies leicht reversibel oxidativ modifizieren. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass Proteine redox-bedingte Thiol-Modifikationen nutzen, um Ver{\"a}nderungen ihrer Aktivit{\"a}t zu steuern. Diese redox-regulierten Proteine spielen eine zentrale Rolle in vielen physiologischen Prozessen. Das erste Ziel meiner Arbeit war die Identifizierung von Stickstoffmonoxid (NO)-sensitiven Proteinen in E. coli. Die redox-bedingten Funktions{\"a}nderungen solcher Proteine erkl{\"a}ren m{\"o}glicherweise die ver{\"a}nderte Physiologie von E. coli Zellen, die unter NO-Stress leiden. Um E. coli Proteine zu identifizieren, die unter Einwirkung von NO-Stress reversibel Thiol-modifiziert werden, wandte ich eine Kombination aus differentiellem Thiol-Trapping und 2D Gel-Elektrophorese an. Es wurden zehn Proteinen identifiziert, welche NO-sensitive Thiol-Gruppen enthalten. Genetische Studien ergaben, dass Modifikationen an AceF \& IlvC mitverantwortlich sind f{\"u}r die NO-induzierte Wachstumshemmung. Bemerkenswert ist es, dass die Mehrheit der identifizierten Proteine speziell nur gegen reaktive Stickstoffspezies empfindlich ist, welches an einem der identifizierten Stickstoffmonoxid-sensitiven Proteinen, der kleinen Untereinheit von Glutamate synthase, getestet wurde. In vivo und in vitro Aktivit{\"a}tsstudien zeigten, dass es zu einer schnellen Inaktivierung von Glutamate synthase nach NO-Behandlung kommt, das Protein aber resistent gegen{\"u}ber anderen Oxidationsmittel ist. Diese Resultate implizieren, dass reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies unterschiedliche physiologische Vorg{\"a}nge in Bakterien beeinflussen. Das zweite Ziel meiner Arbeit war es, redox-sensitive Proteine in S. cerevisiae zu identifizieren und deren Redox-Zustand als in vivo Read-Out zu verwenden, um die Rolle von oxidativen Stress w{\"a}hrend des Alterungsprozess eukaryotischer Zellen zu analysieren. Zun{\"a}chst bestimmte ich in Hefezellen mit Hilfe von OxICAT, einer hochsensiblen quantitativen Methode, die Thiol-Trapping mit Massenspektrometrie verbindet, den exakten in vivo Thiol-Status von fast 300 Proteinen. Diese Proteine lassen sich in vier Gruppen einteilen: 1) Proteine, deren Cysteinreste resistent gegen Oxidation sind; 2) Proteine, in denen Cysteinmodifikationen strukturelle Aufgaben {\"u}bernehmen; 3) Proteine mit oxidationsempfindlichen Cysteinen, die bereits eine gewisse Oxidation in exponentiell wachsenden Hefezellen aufweisen; 4) Proteine, die reduziert sind, aber redox-sensitive Cysteinreste enthalten, die die Funktion der Proteine bei Vorhandensein von oxidativen Stress beeinflussen. Die Sensitivit{\"a}t dieser Proteine gegen{\"u}ber oxidativen Stress wurde durch Exposition subletaler Konzentrationen von H2O2 oder Superoxid auf Hefezellen nachgewiesen. Es wurde gezeigt, dass die wichtigsten zellul{\"a}ren Angriffspunkte von H2O2- und Superoxid-bedingtem Stress Proteine sind, die an Vorg{\"a}ngen der Translation, Glykolyse, des Citratzyklus und der Aminos{\"a}ure-Biosynthese beteiligt sind. Diese Zielproteine zeigen, dass Zellen f{\"u}r die Bek{\"a}mpfung von oxidativen Stress Metabolite schnell in Richtung des Pentosephosphatweges umleiten, um die Produktion des Reduktionsmittels NADPH sicherzustellen. Die hier pr{\"a}sentierten Ergebnisse belegen, dass die quantitative Bestimmung des Oxidationsstatus von Proteinen eine wertvolle Methode ist, um redox-sensitive Cysteinreste zu identifizieren. Die OxICAT Technologie wurde dann verwendet, um das genaue Ausmaß und die Entstehung von oxidativen Stress in chronologisch alternden S. cerevisiae Zellen zu bestimmen. F{\"u}r diese Bestimmung wurde der Oxidationsstatus von Proteinen in alternden Hefezellen als physiologischer Read-Out verwendet. Ich zeigte, dass die zellul{\"a}re Redox-Hom{\"o}ostase in chronologisch alternden Hefezellen global zusammenbricht, wobei es sich dabei um einen Prozess handelt, der dem Zelltod vorausgeht. Der Beginn dieses Zusammenbruchs scheint mit der Lebensdauer der Hefezellen zu korrelieren, da Kalorienrestriktion die Lebensdauer der Hefezellen erh{\"o}ht und den Zusammenbruch des Redox-Gleichgewichts verz{\"o}gert. Die Oxidation einer kleinen Anzahl an Proteinen (z.B. Thioredoxin reductase) geht dem Redox-Zusammenbruch deutlich voraus, was maßgeblich zum Verlust der Redox-Hom{\"o}ostase beitragen k{\"o}nnte. Diese Studien an alternden Hefezellen erweitern unser Verst{\"a}ndnis, wie sich Ver{\"a}nderungen in der Redox-Hom{\"o}ostase auf die Lebensdauer von Hefezellen auswirken. Zudem best{\"a}tigen die hier pr{\"a}sentierten Ergebnisse die Bedeutung von oxidativen Thiol-Modifikationen als eine der wichtigsten posttranslationalen Proteinmodifikationen in pro-und eukaryotischen Organismen}, subject = {Oxidativer Stress}, language = {en} } @phdthesis{Nazeer2010, author = {Nazeer, Ahmed}, title = {Physiological and molecular basis of Azospirillum-Arabidopsis Interaction}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51673}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {The present study was aimed at revealing the early signalling events during the interaction of the diazotrophic soil bacterium Azospirillum brasilense with its host plant Arabidopsis thaliana. Furthermore, taking advantage of the micro array technique, a comprehensive overview of Arabidopsis genes has been undertaken which are affected upon association with A. brasilense The characterization of the early responses of Arabidopsis plants upon inoculation with Azospirillum brasilense strain Sp7 clearly indicated parallels with the initial events in plant pathogen interaction. For instance, not only bacterial preprations (lysates) form Azospirillum elicited an apoplastic alkalinization of the culture medium, but also the live bacteria, which were even more effective. Besides, in a luminol based assay, the bacterial lysates triggered production of the reactive oxygen species (ROS) in the Arabidopsis leaf discs. Interestingly, the elongation factor receptor mutants (efr) were completely insensitive to Azospirillum, suggesting elongation factor Tu (EF-TU) recognition as elicitor by Arabidopsis. This hypothesis was further validated with a bioinformatic approach. The N terminus initial 26 amino acids from Azospirillum EF-TU gene (elf26) showed more similarity to the elf26 sequences of bacteria like Agrobacterium tumefaciens which elicit responses in the plants through EF-TU rather than Pseudomonas syringae where the potent elicitor is flagellin 22. Universal transcriptome profiling of Arabidopsis thaliana seedlings upon inoculation with Azospirillum brasilense over a time course of six, twenty four and ninty six hours revealed very little genetic responses in the early time points. However, a bulk of genes was differentially regulated in 96 hours post inoculation (96hpi). The nature of these genes indicated that the bacterial treatment, among others, greatly affect the processes like cell wall modification, hormone metabolism, stress and secondary metabolism. Additionally expression levels of a numer of transcription factors (TFs) related to basic helix loop helix (BHLH) and MYB domain containing TF families were altered with Azospirillum inoculation. Particularly the BHLH TFs were among the most highly regulated genes. The array results from Azospirillum treated plants were further compared with the already available data emnating from treatment with flagellin 22 (flg22), oligogalacturonides (OGs) and Agrobacterium tumefaciens. Noteworthy, very different set of genes were affected upon inoculation with Azospirillum in relation to other treatments. Secondly a cluster of proteins involved in the biosynthesis of aliphatic glucosinolates (GSL) were uniquely induced upon Sp7 exposure. Genes operating in flavonoid biosynthesis also showed a distinct regulation trend in the comparative analysis. Taken together, the study in question provides insights into the early signalling events in the context of Azospirillum-Arabidopsis association and the bacterial signals recognized by the plants. The array data, at the same time, elucidates the genetic factors of Arabidopsis triggered upon association with Azospirillum brasilense.}, subject = {Azospirillum brasilense}, language = {en} }