@phdthesis{Agarwal2010,
  author    = {Agarwal, Shruti},
  title     = {Functional characterization of four CDK-like kinases and one Calmodulin-dependent kinase of the human malaria parasite, Plasmodium falciparum},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48522},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Malaria still persists as one of the deadliest infectious disease in addition to AIDS and tuberculosis. lt is a leading cause of high mortality and morbidity rates in the developing world despite of groundbreaking research on global eradication of the disease initiated by WHO, about half a century ago. Lack of a commercially available vaccine and rapid spread of drug resistance have hampered the attempts of extinguishing malaria, which still leads to an annual death toll of about one million people. Resistance to anti-malarial compounds thus renders search for new target proteins imperative. The kinome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum comprises representatives of most eukaryotic protein kinase groups, including kinases which regulate proliferation and differentiation processes. Several reports till date have suggested involvement of parasite kinases in the human host and as well as in the mosquito vector. Kinases essential for life cycle stages of the parasite represent promising targets for anti-malarial compounds thus, provoking characterization of additional malarial kinases. Despite extensive research on most plasmodial enzymes, very little information is available regarding the four identified members of the cyclin dependent kinase like kinase (CLK) family. Thus, the present thesis dealt with the functional characterization of four members of the PfCLK kinase family of the parasite denoted as PfCLK-1/Lammer, PfCLK-2, PfCLK-3 and PfCLK-4 with a special focus on the first two kinases. Additionally, one Ca2+/Calmodulin dependent putative kinase-related protein, PfPKRP, presumed to be involved in sexual stage development of the parasite, was investigated for its expression in the life cycle of the parasite. In other eukaryotes, CLK kinases regulate mRNA splicing through phosphorylation of Serine/Arginine-rich proteins. Transcription analysis revealed abundance of PfCLK kinase genes throughout the asexual blood stages and in gametocytes. By reverse genetics approach it was demonstrated that all four kinases are essential for completion of the asexual replication cycle of P. falciparum. PfCLK 1/Lammer possesses two nuclear localization signals and PfCLK-2 possesses one of these signals upstream of the C-terminal catalytic domains. Protein level expression and sub-cellular localization of the two kinases was determined by generation of antiserum directed against the kinase domains of the respective kinase. Indirect immunofluorescence, Western blot and electron microscopy data confirm that the kinases are primarily localized in the parasite nucleus, and in vitro assays show that both enzymes are associated with phosphorylation activity. Finally, mass spectrometric analysis of co immunoprecipitated proteins shows interactions of the two PfCLK kinases with proteins, which have putative nuclease, phosphatase or helicase functions. PfPKRP on the other hand is predominantly expressed during gametocyte differentiation as identified from transcriptional analysis. Antiserum directed against the catalytic domain of PfPKRP detected the protein expression profile in both asexual and gametocyte parasite lysates. Via immunofluorescence assay, the kinase was localized in the parasite cytoplasm in a punctuated manner, mostly in the gametocyte stages. Reverse genetics resulted in the generation of PfPKRP gene-disruptant parasites, thus demonstrating that unlike CLK kinases, PfPKRP is dispensable for asexual parasite survival and hence might have crucial role in sexual development of the parasite. On one hand, characterization of PfCLK kinases exemplified the kinases involved in parasite replication cycle. Successful gene-disruption and protein expression of PfPKRP kinase on the other hand, demonstrated a role of the kinase in sexual stage development of the parasite. Both kinase families therefore, represent potential candidates for anti-plasmodial compounds.},
  subject      = {Plasmodium falciparum},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Hartmann2010,
  author    = {Hartmann, Thomas},
  title     = {Nitrogen metabolism in Aspergillus fumigatus with emphasis on the oligopeptide transporter (OPT) gene family},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-54027},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {The saprophytic filamentous fungus Aspergillus fumigatus has been gaining importance as an opportunistic human pathogen over the past decades. Advances in modern medicine have created a growing group of patients susceptible to infection with A. fumigatus, often contracting potentially deadly invasive aspergillosis. The virulence of this pathogen appears to be a multifactorial trait, a combination of physiological characteristics that enables the fungus to infect immunocompromised humans. This work concentrates on the nitrogen metabolism of A. fumigatus, which is essential for meeting the nutritional needs inside the human host. Using DNA microarrays, the transcriptional response during growth on three different secondary nitrogen sources was examined, which revealed the metabolic versatility of A. fumigatus, especially when challenged with proteins as the sole source of nitrogen. In-depth transcriptional profiling of the eight-member oligopeptide transporter (OPT) gene family underlined the importance of oligopeptide transport for growth on complex nitrogen sources like BSA or collagen. Heterologous expression of the opt genes in Saccharomyces cerevisiae showed their functionality as oligopeptide transporters, and characterized their substrate specificity. Using a Cre/loxP based genetic tool, a complete deletion of all opt genes in A. fumigatus was achieved. The resultant strain exhibited diminished growth on medium where the oligopeptide GPGG was the sole nitrogen source, but did not show any other in vitro phenotype. The opt deletion strain was not attenuated in virulence in a murine model of pulmonary aspergillosis, suggesting that the OPT gene family is not necessary for successful infection. The connection of oligopeptide transport and extracellular proteolytic activity was investigated by deleting the genes encoding Dpp4 and Dpp5, two dipeptidyl peptidases, or PrtT, the transcriptional regulator of major secreted proteases, in the complete opt deletion background. In contrast to the deletion of dpp4 and dpp5, which did not result in any additional phenotype, the absence of prtT led to a drastic growth defect on porcine lung agar. This suggests a synergistic action of extracellular proteolytic digest of proteins and transport of oligopeptide degradation products into the cell. Finally, this work established the bacterial β-Rec/six site-specific recombination system as a novel genetic tool for targeted gene deletion in A. fumigatus.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Geissinger2010,
  author    = {Geissinger, Ulrike},
  title     = {Vaccinia Virus-mediated MR Imaging of Tumors in Mice: Overexpression of Iron-binding Proteins in Colonized Xenografts},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48099},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Vaccinia virus plays an important role in human medicine and molecular biology ever since the 18th century after E. Jenner discovered its value as a vaccination virus against smallpox. After the successful eradication of smallpox, vaccinia virus, apart from its use as a vaccine carrier, is today mainly used as a viral vector in molecular biology and increasingly in cancer therapy. The capability to specifically target and destroy cancer cells makes it a perfect agent for oncolytic virotherapy. Furthermore, the virus can easily be modified by inserting genes encoding therapeutic or diagnostic proteins to be expressed within the tumor. The emphasis in this study was the diagnosis of tumors using different vaccinia virus strains. Viruses with metal-accumulating capabilities for tumor detection via MRI technology were generated and tested for their usefulness in cell culture and in vivo. The virus strains GLV-1h131, GLV-1h132, and GLV-1h133 carry the gene encoding the two subunits of the iron storage protein ferritin under the control of three different promoters. GLV-1h110, GLV-1h111, and GLV-1h112 encode the bacterial iron storage protein bacterioferritin, whereas GLV-1h113 encodes the codon-optimized version of bacterioferritin for more efficient expression in human cells. GLV-1h22 contains the transferrin receptor gene, which plays an important role in iron uptake, and GLV-1h114 and GLV-1h115 contain the murine transferrin receptor gene. For possibly better iron uptake the virus strains GLV-1h154, GLV-1h155, GLV-1h156, and GLV-1h157 were generated, each with a version of a ferritin gene and a transferrin receptor gene. GLV-1h154 carries the genes that encode bacterioferritin and human transferrin receptor, GLV-1h155 the human ferritin H-chain gene and the human transferrin receptor gene. GLV-1h156 and GLV-1h157 infected cells both express the mouse transferrin receptor and bacterioferritin or human ferritin H-chain, respectively. The virus strains GLV-1h186 and GLV-1h187 were generated to contain a mutated form of the ferritin light chain, which was shown to result in iron overload and the wildtype light chain gene, respectively. The gene encoding the Divalent Metal Transporter 1, which is a major protein in the uptake of iron, was inserted in the virus strain GLV-1h102. The virus strain GLV-1h184 contains the magA gene of the magnetotactic bacterium Magnetospirillum magnetotacticum, which produces magnetic nanoparticles for orientation in the earth's magnetic field. Initially the infection and replication capability of all the virus strains were analyzed and compared to that of the parental virus strain GLV-1h68, revealing that all the viruses were able to infect cells of the human cancer cell lines A549 and GI-101A. All constructs exhibited a course of infection comparable to that of GLV-1h68. Next, to investigate the expression of the foreign proteins in GI-101A and A549 cells with protein analytical methods, SDS-gelelectrophoresis, Western blots and ELISAs were performed. The proteins, which were expressed under the control of the strong promoters, could be detected using these methods. To be able to successfully detect the protein expression of MagA and DMT1, which were expressed under the control of the weak promoter, the more sensitive method RT-PCR was used to at least confirm the transcription of the inserted genes. The determination of the iron content in infected GI-101A and A549 cells showed that infection with all used virus strains led to iron accumulation in comparison to uninfected cells, even infection with the parental virus strain GLV-1h68. The synthetic phytochelatin EC20 was also shown to enhance the accumulation of different heavy metals in bacterial cultures. In vivo experiments with A549 tumor-bearing athymic nude mice revealed that 24 days post infection virus particles were found mainly in the tumor. The virus-mediated expression of recombinant proteins in the tumors was detected successfully by Western blot. Iron accumulation in tumor lysates was investigated by using the ferrozine assay and led to the result that GLV-1h68-infected tumors had the highest iron content. Histological stainings confirmed the finding that iron accumulation was not a direct result of the insertion of genes encoding iron-accumulating proteins in the virus genome. Furthermore virus-injected tumorous mice were analyzed using MRI technology. Two different measurements were performed, the first scan being done with a seven Tesla small animal scanner seven days post infection whereas the second scan was performed using a three Tesla human scanner 21 days after virus injection. Tumors of mice injected with the virus strains GLV-1h113 and GLV-1h184 were shown to exhibit shortened T2 and T2* relaxation times, which indicates enhanced iron accumulation. In conclusion, the experiments in this study suggest that the bacterioferritin-encoding virus strain GLV-1h113 and the magA-encoding virus strain GLV-1h184 are promising candidates to be used for cancer imaging after further analyzation and optimization.},
  subject      = {Vaccinia-Virus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Schubert2010,
  author    = {Schubert, Alice},
  title     = {Immunhistochemische und funktionelle Charakterisierung der Serin/Arginin-Proteinkinase SRPK79D mit Identifizierung von Interaktionspartnern in Drosophila melanogaster},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-53841},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Auf der Suche nach Mutanten mit einer vom Wildtyp abweichenden Verteilung des Aktive Zone-Proteins Bruchpilot wurde die Serin/Arginin-Proteinkinase SRPK79D identifiziert. Hier zeigte sich, dass die Mutation im Srpk79D-Gen zu einer Agglomeration von Bruchpilot in den larvalen segmentalen und intersegmentalen Nerven f{\"u}hrt. In der vorliegenden Arbeit sollte die SRPK79D genauer charakterisiert werden. Nach Pr{\"a}adsorptionen und Affinit{\"a}tsreinigungen von in einer fr{\"u}heren Arbeit erzeugten Antiseren, gelang es die Lokalisation der {\"u}berexprimierten SRPK79D-GFP-Isoformen zu bestimmen. Dabei zeigte sich, dass keines der Antiseren die endogene Kinase im Western Blot oder immunhistocheimisch detektieren konnte. Dies legt den Schluss nahe, dass die Expression der SRPK79D in einer geringen Konzentration erfolgt. Es war jedoch m{\"o}glich die endogene SRPK79D-PC-Isoform mittels einer Immunpr{\"a}zipitation soweit anzureichern, dass sie im Western Blot nachweisbar war. F{\"u}r die SRPK79D-PB-Isoform gelang dies allerdings nicht. Anhand von larvalen Nerv-Muskel-Pr{\"a}paraten konnte gezeigt werden, dass die panneural {\"u}berexprimierte SRPK79D-PC-GFP-Isoform an die Aktiven Zone transportiert wird und dort mit Bruchpilot, sowie den Interaktionspartnern von Bruchpilot Liprin-α und Rab3 kolokalisiert. Außerdem liegt sie diffus im Zytoplasma von neuronalen Zellk{\"o}rpern vor. In adulten Gehirnen lokalisiert die transgen {\"u}berexprimierte SRPK79D-PC-GFP im Fanshaped body, Ringkomplex und in neuronalen Zellk{\"o}rpern. Die panneural {\"u}berexprimierte SRPK79D-PB-GFP-Isoform liegt im larvalen und adulten Gehirn lokal im Zytoplasma der Perikaryen akkumuliert vor und wird nicht an die Aktive Zone transportiert. Das PB-Antiserum erkennt im adulten Gehirn neuronale Zellk{\"o}rper und das Neuropil in der Calyxregion der Pilzk{\"o}rper. Immunhistochemische F{\"a}rbungen von larvalen Nerv-Muskel-Pr{\"a}paraten mit verschiedenen Antik{\"o}rpern gegen neuronale Proteine belegen, dass die Agglomerate in der Srpk79D-Mutante f{\"u}r Bruchpilot spezifisch sind. Es konnten bisher keine weiteren Komponenten der Agglomerate detektiert werden. Auch ein genereller axonaler Defekt konnte durch F{\"a}rbungen gegen CSP, Synaptotagmin und Experimenten mit dem Mitochondrienfarbstoff MitoTracker® FM Green ausgeschlossen werden. Die quantitative Auswertung der Pr{\"a}parate zeigte, dass die Morphologie der synaptischen Boutons und die Zahl der Aktiven Zonen durch die Mutation im Srpk79D-Gen nicht beeinflusst werden. Um gesicherte Kenntnis dar{\"u}ber zu erlangen, ob die Mutation im Srpk79D-Gen die beobachteten Ph{\"a}notypen verursacht, wurden Rettungsexperimente durchgef{\"u}hrt. Es konnte sowohl f{\"u}r das hypomorphe Srpk79DP1-Allel, als auch f{\"u}r die Nullmutante Srpk79DVN eine nahezu vollst{\"a}ndige Rettung des Agglomerat-Ph{\"a}notyps mit der panneural exprimierten SRPK79D-PF- oder der SRPK79D-PB-Isoform erreicht werden. Aus diesen Ergebnissen folgt, dass beide Isoformen der SRPK79D in der Lage sind den Bruchpilot-Agglomerat-Ph{\"a}notyp zu retten, die Rettung der Verhaltensdefizite jedoch alle Isoformgruppen ben{\"o}tigen. Um zu untersuchen, ob der Agglomerations-Ph{\"a}notyp der Srpk79D-Mutanten auf einer {\"U}berexpression des Bruchpilotgens oder auf Fehlspleißen seiner pr{\"a}-mRNA beruht, wurden Immunpr{\"a}zipitationen, semiquantitative RT-PCRs und Real Time-PCRs durchgef{\"u}hrt. Ausgehend von den Ergebnissen kann eine m{\"o}gliche {\"U}berexpression bzw. Spleißdefekte von Bruchpilot weitgehend ausgeschlossen werden. Die simultane {\"U}berexpression von SRPK79D und Bruchpilot konnte den Ph{\"a}notyp der Bruchpilot-{\"U}berexpression nicht retten. Anhand der stimulated emission depletion-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass die gebildeten Agglomerate das charakteristische Donut-f{\"o}rmige Muster der T-bars zeigen und wahrscheinlich als fusionierte Ketten von T-bars in den larvalen Nerven vorliegen. Beim in vivo Imaging Versuch konnte demonstriert werden, dass das verk{\"u}rzte Bruchpilot-D3-Strawberry in die Bruchpilot-Agglomerate der Srpk79D-Nullmutante eingebaut wird und dass gr{\"o}ßere Agglomerate unbewegt im Nerv verharren. Der anterograde und retrograde Transport kleinerer Agglomerate konnte verzeichnet werden. Bei CytoTrap-Yeast-two-hybrid-Experimenten konnten f{\"u}r die SRPK79D-PB Isoform vier potentielle Interaktionspartner identifiziert werden: das Hitzeschockprotein Hsp70Bbb, die mitochondriale NADH-Dehydrogenase mt:ND5, das large ribosomal RNA Gen in Mitochondrien und das am Spleißen beteiligte Protein 1.3CC/Caper. Die Sequenzierung zeigte, dass nur das letzte Exon von Caper im pMyr-Vektor vorliegt. Der f{\"u}r die PC-Isoform durchgef{\"u}hrte CytoTrap-Versuch ergab nur Temperatur-Revertanten. SR-Proteinkinasen phosphorylieren die RS-Dom{\"a}ne von SR-Proteinen und sind dadurch an der Regulation des konstitutiven und alternativen Spleißens beteiligt. Somit stellen die acht identifizierten SR-Proteine in Drosophila potentielle Interaktionspartner der SRPK79D dar. Die durch RNAi-vermittelte Reduktion von sieben SR-Proteinen f{\"u}hrte zu keiner Agglomeration von Bruchpilot. Jedoch f{\"u}hrte die RNAi-vermittelte Reduktion des SR-Proteins Spleißfaktor 2 (SF2) zu kleineren Bruchpilot-Agglomeraten in den axonalen Nerven. SF2 ist selbst kein Bestandteil der Agglomerate der Srpk79D-Nullmutante. Die {\"U}berexpression von SF2 f{\"u}hrt wahrscheinlich zu einem axonalen Transportdefekt, wie die F{\"a}rbung gegen das Cysteine string protein zeigte. Weiterhin f{\"u}hrt die {\"U}berexpression zu einer Akkumulation von SF2 in larvalen Axonen und im adulten Gehirn der Fliegen. SF2 ist nicht nur in Zellkernen s{\"a}mtlicher Zellen nachweisbar, sondern es konnte auch ein spezifisches Signal im subsynaptischen Retikulum der Postsynapse detektiert werden, wie die F{\"a}rbungen gegen Disc large best{\"a}tigten.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Woelke2010,
  author    = {W{\"o}lke, Stefan},
  title     = {Funktionelle Analyse von bakteriellen W-xxx-E Rho GTPasen GEF Mimetika mittels Typ 3 Sekretionssystems von Yersinia enterocolitica},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55010},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Die zellul{\"a}ren Rho GTPasen kontrollieren und regulieren zentrale elementare Zellvorg{\"a}nge wie Phagozytose, Migration und epitheliale Integrit{\"a}t. Aufgrund ihrer zentralen Stellung, interagiert eine Vielzahl von bakteriellen Cytotoxinen und Modulinen mit den Rho GTPasen und wirken so als Pathogenit{\"a}tsfaktoren. Die zur W-xxx-E Familie geh{\"o}renden Effektoren IpgB1 und IpgB2 von Shigella und Map von E. coli (Pathotypen EHEC und EPEC) werden {\"u}ber ein Typ 3 Sekretionssystem (T3SS) in Wirtszellen injiziert und wirken als Rac1, RhoA bzw. Cdc42 GEF Mimetikum. In der vorliegenden Arbeit wurden die Effektor Funktionen von IpgB1 IpgB2 und Map mit Hilfe des Yersinia (Ysc)-T3SS untersucht, was zur Etablierung der „Yersinia-Toolbox" f{\"u}hrte. Damit k{\"o}nnen heterologe Effektoren isoliert im physiologischen Kontext der Erreger-Zell-Interaktion zellbiologisch untersucht werden unter Vermeidung von simultaner Injektion redundanter oder unbekannter Effektoren. Zur Etablierung der Yersinia-Toolbox wurden zun{\"a}chst die Gene f{\"u}r die Rho GTPasen modulierenden Shigella Effektoren IpgB1 und IpgB2 sowie der E. coli (EHEC)-Effektor Map mit unterschiedlich langen Gensequenzen der N-terminalen Bereiche des Yersinia-Effektorproteins YopE fusioniert (Hybridproteine: YopEi-X:i = 18, 53 bzw. 138 Aminos{\"a}urereste, X = IpgB1, IpgB2 bzw. Map). In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Hybridproteine YopE53-X und YopE138-X (X=IpgB1, IpgB2, Map) in den Kultur{\"u}berstand sezerniert bzw. in Zielzellen injiziert wurden. In einem weiteren Schritt konnte die zellbiologische Aktivit{\"a}t der heterologen Proteine fluoreszenzmikroskopisch durch Aktinzytoskelettumlagerungen gezeigt werden. So wurden „Membrane Ruffles" (Rac1-Aktivierung) durch YopE138-IpgB1, Stressfasern (RhoA-Aktivierung) durch E138-IpgB2 und „Mikrospikes" (Cdc42-Aktivierung) durch YopE138-Map nachgewiesen. Invasionstudien zeigten, dass YopEi-IpgB1 (i = 53, 138) die Yersinia-Invasion induzierte, wohingegen YopEi-IpgB2 die Invasionsrate der St{\"a}mme WA (pT3SS, pEi-IpgB2) (i=53, 138) verglichen mit dem Stamm WA (pT3SS) reduziert war. Durch Kombination verschiedener Yersinia-Toolbox-St{\"a}mme konnte im Co-Infektionsmodell mit HeLa-Zellen gezeigt werden, dass (1) die YopE138-IpgB1 vermittelte Invasion durch YopE138-IpgB2 signifikant inhibiert werden kann, was auf eine antagonistische Wirkung zwischen IpgB1 und IpgB2 schließen l{\"a}sst, dass (2) YopT ebenfalls die IpgB1 vermittelte Invasionsrate reduziert (inhibitorische Wirkung auf Rac1), und dass (3) YopE als GAP f{\"u}r RhoG/Rac1 (bevorzugt RhoG) praktisch nicht die IpgB1-vermittelte Invasion hemmt. Durch Klonierung der YopE138-IpgB1 und YopE138-IpgB2 kodierenden Fusionsgene in zwei kompatible Plasmidvektoren konnten die Hybridproteine simultan transloziert werden und die Co-Infektionsergebnisse best{\"a}tigt werden. In der Literatur ist beschrieben, dass die Ysc-Translokationspore YopB/YopD Rho-abh{\"a}ngig Membranporen-bedingte Zellsch{\"a}digungen verursacht (LDH-Freisetzung, PI-Kernf{\"a}rbung). Mit der Yersinia-Toolbox konnte mit dem Stamm WA (pT3SS) Zytoplasmamembransch{\"a}digung / Zytotoxizit{\"a}t nachgewiesen werden, nicht aber mit den St{\"a}mmen WA (pE138-X) X = IpgB1, IpgB2 oder Map. Co-Infektionen jedoch zeigen, dass vermehrt LDH bei der Infektion mit WA (pT3SS) + WA (pT3SS, pE138-IpgB1) detektiert wurde, wohingegen dieser Effekt von YopE138-IpgB2 in einer Co-Infektion von WA (pT3SS) + WA (pT3SS, pE138-IpgB2) inhibiert wurde. Auch hier wurde der Antagonismus zwischen IpgB1 und IpgB2 erneut sichtbar. Diese Befunde widersprechen publizierten Daten, die eine RhoA-Aktivierung/Aktinpolymerisierung mit verst{\"a}rkter Porenbildung in einen Zusammenhang bringen. Rho GTPasen sind beteiligt an der Erhaltung der polarisierten Eipthelzellschichtintegrit{\"a}t {\"u}ber Adh{\"a}sionskomplexbildung. Mittels Infektion von polarisierten MDCK-Zellschichten mit verschiedenen Yersinia-St{\"a}mmen und Messung des transepithelialen elektrischen Widerstandes/Resistenz (TER) konnte gezeigt werden, dass die Ysc-T3SS vermittelte Injektion von YopE138-IpgB1 (Rac1-Aktivierung) oder YopE138-Map (Cdc42-Aktivierung) zur Abnahme der TER und damit Sch{\"a}digung der Zellschichtintegrit{\"a}t f{\"u}hrt, wogegen bei YopE138-IpgB2-Injektion der TER-Wert unver{\"a}ndert blieb. Um bakterielle Rho GTPasen-modulierende Effektorproteine detailliert untersuchen zu k{\"o}nnen und um die Rolle von Rho GTPasen im Mausinfektionsmodell mit Yersinia enterocolitica und Salmonellen zu bestimmen, wurden M{\"a}use mit deletierten Genen f{\"u}r RhoA, Rac1 bzw. Cdc42 in Makrophagen hergestellt.},
  subject      = {Actin},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Dombrowski2010,
  author    = {Dombrowski, Yvonne},
  title     = {Charakterisierung von GDF-15 als Immunmodulator im Ovarialkarzinom},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48885},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {GDF-15 ist ein atypisches Mitglied der TGF-b-Superfamilie. Unter physiologischen Bedingungen kommt es nur in der Plazenta in gr{\"o}ßeren Mengen vor, w{\"a}hrend es in zahlreichen Tumoren {\"u}berexprimiert gefunden wurde. Die genaue Funktion von GDF-15 im Tumorkontext ist nicht genau gekl{\"a}rt. Aufgrund der h{\"a}ufigen und hohen Expression in Tumoren scheint GDF-15 eine wesentliche Funktion im Tumorprogress auszu{\"u}ben. Das Ovarialkarzinom (OvCA) nimmt die Stellung als t{\"o}dlichste gyn{\"a}kologische Erkrankung ein. Da der Tumor meist erst in fortgeschrittenen Stadien diagnostiziert wird, sind bis heute die Heilungschancen schlecht. H{\"a}ufig kommt es zum Rezidiv nach zun{\"a}chst erfolgreicher Chemotherapie und mit 30\% ist die 5-Jahres-{\"U}berlebenschance gering. F{\"u}r die chemoresistenten F{\"a}lle gibt es bis zum heutigen Zeitpunkt keine effektive Therapie. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit, neue innovative Therapiestrategien zu entwickeln. G{\"u}nstige immunologische Parameter korrelieren mit der {\"U}berlebensdauer von OvCA-Patientinnen, was die Immuntherapie beim OvCA in den Fokus der experimentellen klinischen Therapie r{\"u}ckt. Doch um neue immuntherapeutische Strategien entwickeln zu k{\"o}nnen, m{\"u}ssen zun{\"a}chst immunologisch relevante Angriffspunkte identifiziert werden. Das in vielen Tumoren exprimierte GDF-15 ist mit einem der st{\"a}rksten immunsuppressiven Faktoren verwandt, was die Vermutung nahe legt, dass auch GDF-15 eine immunologisch relevante Funktion im Tumorkontext aus{\"u}ben k{\"o}nnte. Daher wurden die Expression und die m{\"o}gliche Funktion von GDF-15 als Immunmodulator im Ovarialkarzinom untersucht. Expressionsanalysen von OvCA-Gewebe und prim{\"a}ren OvCA-Zellen zeigten, dass GDF-15 das am st{\"a}rksten {\"u}berexprimierte Gen der untersuchten TGF-b-Familienmitglieder im OvCA ist. Auch als sezerniertes Protein wird GDF-15 in vivo und in vitro im OvCA detektiert, was auf eine funktionale Rolle von GDF-15 im OvCA hindeutet. Normalerweise eliminiert das Immunsystem entartete k{\"o}rpereigene Zellen. Manchmal gelingt es Tumorzellen jedoch, sich dieser Immun{\"u}berwachung zu entziehen und dem Immunsystem zu „entwischen". Inwieweit GDF-15 bei der Koordination des „immune escape" des OvCA eine Rolle spielt, sollte im Fokus dieser Arbeit stehen. Das Hauptaugenmerk lag dabei auf der Wirkung von GDF-15 auf NK-Zellen, da diese als fr{\"u}he Effektoren und wichtige Mediatoren zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem nicht nur eine Schl{\"u}sselrolle bei der immunologische {\"U}berwachung spielen, sondern sich dadurch auch als ideale Werkzeuge f{\"u}r die Tumorimmuntherapie auszeichnen. Exogenes GDF-15 hemmt in vitro die Lyseaktivit{\"a}t von NK-Zellen gegen{\"u}ber OvCA-Zellen. Endogene GDF-15-Defizienz der OvCA-Zellen sensitiviert diese f{\"u}r NK-Zell-Lyse und endogene GDF-15-{\"U}berexpression mindert die NK-Lyseaktivit{\"a}t. Die Hemmung der NK-Lyseaktivit{\"a}t kann durch verschiedene synergistisch wirkende Mechanismen erfolgen: durch Rezeptormodulation, durch direkte Modulation des Lysemechanismus und durch Apoptoseregulation. Wie TGF-b1 reguliert GDF-15 die Expression des aktivierenden NK-Rezeptors NKG2D von der Zelloberfl{\"a}che herunter und induziert zus{\"a}tzlich die Expression des inhibierenden Rezeptors CD305 und die des mit NKG2A- und NKG2C-assoziierten Rezeptors CD94. Daneben greift GDF-15 direkt in den Lysemechanismus der NK-Zellen ein, indem es die Granzym B-Expression beeinflusst. Dar{\"u}ber hinaus sensitiviert GDF-15 Immunzellen f{\"u}r die Apoptose durch die Induktion von Fas/CD95. Signaltransduktionsanalysen zeigen, dass GDF-15 in Immunzellen die SMAD-Proteine zeitverz{\"o}gert zu TGF-b aktiviert, was auf eine indirekte Wirkung schließen l{\"a}sst. Zus{\"a}tzlich kann GDF-15 auch die die p38/MAPK in Immunzellen aktivieren. Die Genregulation von GDF-15 und TGF-b1 in NK-Zellen ist sehr verschieden. Beide Zytokine regulieren {\"u}berwiegend Gene aus gleichen Funktionalit{\"a}tsclustern, allerdings sind die einzelnen von TGF-b1 und GDF-15 regulierten Gene verschieden. Nur drei Gene (CD55, Caspase-8 und Apolipoprotein 6) sind durch GDF-15 und TGF-b1 gleich reguliert. Zusammengefasst zeigt sich eine funktionale Analogie von GDF-15 und TGF-b1 in NK-Zellen. TGF-b1 scheint eine st{\"a}rkere Wirkung zu induzieren, daf{\"u}r zeigt GDF-15 hier ein breiteres Funktionalit{\"a}tsspektrum. Durch die Charakterisierung der funktionalen Rolle von GDF-15 als Immunmodulator in Tumoren ist hier ein neuer potentieller Angriffspunkt identifiziert worden, welcher Grundlage f{\"u}r neue Tumortherapiestrategien, nicht nur f{\"u}r das OvCA, sondern auch f{\"u}r andere GDF-15-exprimierende Tumore sein kann.},
  subject      = {Immunmodulator},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Brandl2010,
  author    = {Brandl, Carolin},
  title     = {Molekulare Mechanismen und zellul{\"a}re Kooperationen tolerogener Dendritischer Zellen bei der Experimentellen Autoimmun-Enzephalomyelitis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-49380},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Aus Vorarbeiten in der Arbeitsgruppe war bekannt, dass M{\"a}use durch Injektion von tolerogenen, TNF-gereiften und MOG-beladenen DZ vor EAE gesch{\"u}tzt werden k{\"o}nnen. Eines der Ziele dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob das koinhibitorische Molek{\"u}l B7-H1 auf der Oberfl{\"a}che der DZ einen Einfluss auf das tolerogene Potential der DZ hat. Dazu wurden B7-H1-defiziente DZ generiert, mit TNF gereift, mit MOG-Peptid beladen und intraven{\"o}s in M{\"a}use injiziert, bevor die EAE induziert wurde. Es zeigte sich, dass diese DZ die Tiere sogar noch besser vor der Krankheit sch{\"u}tzen konnten als die WT DZ. Die Injektion der B7-H1-/- DZ bewirkte eine verst{\"a}rkte Produktion von IL-10 and IL-13 nach Restimulation der Milz-Zellen in vitro und eine erh{\"o}hte Menge von protektiven Serum-Zytokinen (IL-4 und IL-13), welche von NKT-Zellen produziert wurden. Versuche mit CD1d-/- und J\&\#945;281-/- M{\"a}usen haben ergeben, dass diese Zytokine von Typ II NKT-Zellen produziert wurden. Weitere Versuche mit Typ I und II NKT-Zell-Linien haben best{\"a}tigt, dass nur die Typ II NKT-Zellen von einem endogenen CD1d-Ligand der DZ stimuliert werden k{\"o}nnen. Außerdem wird dies {\"u}ber B7-H1 reguliert, da die NKT-Zell-Reaktion in Abwesenheit von B7-H1 st{\"a}rker ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass neben den NKT-Zellen MZ B-Zellen n{\"o}tig sind, um die M{\"a}use vor der EAE-Entwicklung zu sch{\"u}tzen. Versuche mit CD22-/- M{\"a}usen, welche eine Reduktion in der MZ B-Zell-Population zeigen, haben ergeben, dass in Abwesenheit von MZ B-Zellen keine EAE-Protektion mehr m{\"o}glich ist. In dieser Arbeit wurde auch der Effekt von Glykolipid-Antigenen, welche einen Großteil der Myelinscheide des ZNS ausmachen, auf DZ untersucht. Ausgew{\"a}hlte Lipide f{\"u}hren zu einer Reifung der DZ, welche sich in der verst{\"a}rkten MHC II- und CD86-Expression, jedoch nicht in der Produktion von Zytokinen {\"a}ußert. Außerdem sind diese Lipid-gereiften DZ in der Lage T-Zellen zu stimulieren. Als letzter Punkt wurde in dieser Arbeit der Zusammenhang zwischen Masern-Virus-Infektionen und EAE untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine cerebrale Masern-Infektion zusammen mit einer EAE-Induktion einen dramatischen Effekt auf die Tiere hat. F{\"u}r diese Versuche wurde ein Maus-Modell einer persistierenden Masern-Infektion im Gehirn verwendet. Diese Tiere leben nach der Virus-Behandlung ohne Symptome. Nach der EAE-Induktion starben diese Tiere jedoch bereits wenige Tage sp{\"a}ter aufgrund einer MOG-Peptid-spezifischen Reaktion.},
  subject      = {Encephalomyelitis},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Knapek2010,
  author    = {Knapek, Stephan},
  title     = {Synapsin and Bruchpilot, two synaptic proteins underlying specific phases of olfactory aversive memory in Drosophila melanogaster},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-49726},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Memory is dynamic: shortly after acquisition it is susceptible to amnesic treatments, gets gradually consolidated, and becomes resistant to retrograde amnesia (McGaugh, 2000). Associative olfactory memory of the fruit fly Drosophila melanogaster also shows these features. After a single associative training where an odor is paired with electric shock (Quinn et al., 1974; Tully and Quinn, 1985), flies form an aversive odor memory that lasts for several hours, consisting of qualitatively different components. These components can be dissociated by mutations, their underlying neuronal circuitry and susceptibility to amnesic treatments (Dubnau and Tully, 1998; Isabel et al., 2004; Keene and Waddell, 2007; Masek and Heisenberg, 2008; Xia and Tully, 2007). A component that is susceptible to an amnesic treatment, i.e. anesthesia-sensitive memory (ASM), dominates early memory, but decays rapidly (Margulies et al., 2005; Quinn and Dudai, 1976). A consolidated anesthesia-resistant memory component (ARM) is built gradually within the following hours and lasts significantly longer (Margulies et al., 2005; Quinn and Dudai, 1976). I showed here that the establishment of ARM requires less intensity of shock reinforcement than ASM. ARM and ASM rely on different molecular and/or neuronal processes: ARM is selectively impaired in the radish mutant, whereas for example the amnesiac and rutabaga genes are specifically required for ASM (Dudai et al., 1988; Folkers et al., 1993; Isabel et al., 2004; Quinn and Dudai, 1976; Schwaerzel et al., 2007; Tully et al., 1994). The latter comprise the cAMP signaling pathway in the fly, with the PKA being its supposed major target (Levin et al., 1992). Here I showed that a synapsin null-mutant encoding the evolutionary conserved phosphoprotein Synapsin is selectively impaired in the labile ASM. Further experiments suggested Synapsin as a potential downstream effector of the cAMP/PKA cascade. Similar to my results, Synapsin plays a role for different learning tasks in vertebrates (Gitler et al., 2004; Silva et al., 1996). Also in Aplysia, PKA-dependent phosphorylation of Synapsin has been proposed to be involved in regulation of neurotransmitter release and short-term plasticity (Angers et al., 2002; Fiumara et al., 2004). Synapsin is associated with a reserve pool of vesicles at the presynapse and is required to maintain vesicle release specifically under sustained high frequency nerve stimulation (Akbergenova and Bykhovskaia, 2007; Li et al., 1995; Pieribone et al., 1995; Sun et al., 2006). In contrast, the requirement of Bruchpilot, which is homologous to the mammalian active zone proteins ELKS/CAST (Wagh et al., 2006), is most pronounced in immediate vesicle release (Kittel et al., 2006). Under repeated stimulation of a bruchpilot mutant motor neuron, immediate vesicle release is severely impaired whereas the following steady-state release is still possible (Kittel et al., 2006). In line with that, knockdown of the Bruchpilot protein causes impairment in clustering of Ca2+ channels to the active zones and a lack of electron-dense projections at presynaptic terminals (T-bars). Thus, less synaptic vesicles of the readily-releasable pool are accumulated to the release sites and their release probability is severely impaired (Kittel et al., 2006; Wagh et al., 2006). First, I showed that Bruchpilot is required for aversive olfactory memory and localized the requirement of Bruchpilot to the Kenyon cells of the mushroom body, the second-order olfactory interneurons in Drosophila. Furthermore, I demonstrated that Bruchpilot selectively functions for the consolidated anesthesia-resistant memory. Since Synapsin is specifically required for the labile anesthesia sensitive memory, different synaptic proteins can dissociate consolidated and labile components of olfactory memory and two different modes of neurotransmission (high- vs. low frequency dependent) might differentiate ASM and ARM.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Stange2010,
  author    = {Stange, Annette},
  title     = {Beziehung zwischen Ca2+-Hom{\"o}ostase und Aktivit{\"a}t der S-Typ Anionenkan{\"a}le in Schließzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52131},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Pflanzen regulieren ihren Gasaustausch mit der Atmosph{\"a}re, indem sie die {\"O}ffnungsweite von Poren in der Epidermis von Bl{\"a}ttern, sog. Stomata, ver{\"a}ndern. Bei Wassermangel werden die stomat{\"a}ren Poren geschlossen, um den Verlust von Wasser zu minimieren. Dieser Vorgang wird durch das Phytohormon ABA ausgel{\"o}st, welches eine Aktivierung von Anionenkan{\"a}len in der Plasmamembran der Schließzellen induziert. Obwohl die Aktivierung der Anionenkan{\"a}le ein zentrales Element in der ABA-Antwort darstellt, ist der Signalweg, der zu der Aktivierung der Anionenkan{\"a}le f{\"u}hrt, nur l{\"u}ckenhaft verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle von Signalintermediaten wie Proteinkinasen, -phosphatasen, Lipid-abgeleiteten Botenstoffen und Ca2+ bei der Aktivierung der Anionenkan{\"a}le untersucht. Hinsichtlich Ca2+ lag ein spezieller Fokus auf der Generierung von Ca2+-Signalen und auf der Frage, inwieweit ein Anstieg in der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration f{\"u}r eine Aktivierung der Anionenkan{\"a}le ausreicht. F{\"u}r diese Studien wurde haupts{\"a}chlich die Zwei-Elektroden-Spannungsklemm- (DEVC) Technik in Kombination mit Ca2+-Konzentrationsmessungen durch den Ca2+-sensitiven Farbstoff FURA-2 angewendet. Die M{\"o}glichkeit Anionenkan{\"a}le durch Ca2+ zu aktivieren wurde getestet, indem Ca2+-Signale in intakten Schließzellen von Nicotiana tabacum durch hyper- und depolarisierte Spannungen ausgel{\"o}st wurden und gleichzeitig die Str{\"o}me, die {\"u}ber die Plasmamembran flossen, gemessen wurden. Dabei f{\"u}hrte eine Hyperpolarisation zu einer transienten Erh{\"o}hung der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration w{\"a}hrend des Spannungssprunges, wohingegen eine Depolarisation zun{\"a}chst eine Erniedrigung der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration ausl{\"o}ste und das Ca2+-Signal bei Repolarisation der Plasmamembran auftrat. Dies weist darauf hin, dass in beiden F{\"a}llen hyperpolarisations-aktivierte Ca2+-Kan{\"a}le beteiligt sind, wobei das Schwellenpotential der Schließzellen, bei dem ein Ca2+-Signal ausgel{\"o}st wird, nach einer langen Depolarisation zu positiveren Spannungen verschoben ist. Die Modulation der Spannungssensitivit{\"a}t der Schließzellen w{\"a}hrend einer langen Depolarisation findet m{\"o}glicherweise durch eine Aktivierung der Ca2+-Kan{\"a}le und/oder eine Inhibierung verschiedener Ca2+-Transportproteine durch eine niedrige cytosolische freie Ca2+-Konzentration statt. Der durch Hyperpolarisation bzw. durch lange Depolarisation induzierte transiente Anstieg in der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration korrelierte mit einer transienten Aktivierung von S-Typ Anionenkan{\"a}len. Die Analyse der Ca2+-Konzentrations- und Zeitabh{\"a}ngigkeit ergab, dass die S-Typ Anionenkan{\"a}le durch Ca2+ in einem schnellen Signalweg mit einer halbmaximalen cytosolischen freien Ca2+-Konzentration von 515 nM (SE=235, n=33) aktiviert werden. Der durchschnittliche maximale S-Typ Anionenstrom lag bei -349 pA (SE=107, n=33) bei einer Spannung von -100 mV. Die Wirkung von Ca2+ auf Transportvorg{\"a}nge {\"u}ber die Plasmamembran wurde auch in Dr{\"u}senzellen von Dionaea muscipula untersucht. In diesem Zelltyp induzierte eine mechanische Stimulierung der Triggerhaare ein Ca2+-Signal, wobei mehr als zwei Aktionspotentiale n{\"o}tig waren, um einen transienten Ca2+-Anstieg auszul{\"o}sen. Diese Daten zeigen, dass die Depolarisationsphase des Aktionspotentials in den Dr{\"u}sen nicht direkt mit Ca2+-Fl{\"u}ssen assoziiert ist. Anstelle einer Ca2+-abh{\"a}ngigen Aktivierung scheinen Anionenkan{\"a}le in Dr{\"u}sen von Dionaea muscipula also in einem Ca2+-unabh{\"a}ngigen Signalweg aktiviert zu werden. Diesen Aktivierungsmechanismus gibt es auch im ABA-Signalweg in Schließzellen. Dort findet eine Ca2+-unabh{\"a}ngige Aktivierung der S-Typ Anionenkan{\"a}le durch Proteinkinasen wie OST1 und CPK23 statt, wobei die Proteinphosphatase ABI1 als negativer Regulator diskutiert wird. In dieser Arbeit konnte die Redundanz von OST1 und CPK23 sowie Komponenten des Ca2+-abh{\"a}ngigen Weges in DEVC-Experimenten mit ost1-2- und cpk23-Mutanten von Arabidopsis thaliana beobachtet werden, die beide S-Typ Anionenkanalaktivit{\"a}t zeigten. Die Aktivit{\"a}t von S-Typ Anionenkan{\"a}len in Arabidopsis thaliana Mutanten, denen der S-Typ Anionenkanal SLAC1 fehlt, deutet außerdem an, dass redundante S-Typ Anionenkan{\"a}le vorhanden sind, die auch durch andere Proteinkinasen aktiviert werden k{\"o}nnten. ABA-induzierte S-Typ Anionenstr{\"o}me waren auch in abi1-Transformanten von Nicotiana tabacum messbar, wobei eine geringere Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber ABA als im Wildtyp auftrat, was auf eine unvollst{\"a}ndige Inhibierung des ABA-Signalweges hindeutet. Die Redundanz der Intermediate im ABA-Signalweg war auch in Studien mit dem Lipid-abgeleiteten Botenstoff Phosphatids{\"a}ure sichtbar, der nur einen langsamen und unvollst{\"a}ndigen Stomaschluss induzierte, was allerdings auch auf eine untergeordnete Rolle von Phosphatids{\"a}ure im ABA-Signalweg hinweisen k{\"o}nnte.},
  subject      = {Schließzelle},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Ondrusch2010,
  author    = {Ondrusch, Nicolai},
  title     = {Der Thiol:Disulfid-Redox Metabolismus und der Blaulichtrezeptor Lmo0799 von Listeria monocytogenes},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52612},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Der Thiol-Redox-Metabolismus, der in allen lebenden Zellen zu finden ist, wirkt oxidativem Stress entgegen. Des Weiteren dient er auch der Aufrechterhaltung der intrazellul{\"a}ren Thiol:Disulfid-Balance, die wiederum f{\"u}r die Funktion vieler Proteine essentiell ist. Auch stellt er Reduktions{\"a}quivalente f{\"u}r die Produktion von Desoxyribonucleotiden f{\"u}r die DNA-Synthese bereit und hilft oxidierte Proteine zu reparieren. Der Thiol:Disulfid-Redox-Metabolismus (TDRM) unterscheidet sich von anderen metabolischen Netzwerken dadurch, dass keine Kohlenstoff- oder Stickstoffbindungen ver{\"a}ndert werden. In vielen F{\"a}llen beinhaltet er die reversible Oxidation zweier benachbarter Cysteinreste im entsprechenden Protein, was zur Ausbildung von Disulfidbr{\"u}cken f{\"u}hrt. Da ein totaler Ausfall der GSH-Synthese einen geringeren Effekt zu haben schien als ein teilweiser, wurden DNA-Microarray-Transkriptomanalysen der ΔgshF-Mutante durchgef{\"u}hrt. Es wurden rund 750 Gene als signifikant reguliert (p < 0,05, Fold-change <0,5 bzw. >2) identifiziert. Da die am st{\"a}rksten regulierten Gene von besonderem Interesse waren, wurden die Ausschlussgrenzen auf <0,2 bzw. >5 -fach reguliert heraufgesetzt. Diese Parameter trafen auf 92 Gene zu, davon 41 durch GSH-Mangel herauf-regulierte (d.h. die mRNA-Menge war in der Mutante h{\"o}her als im Wildtyp) und 51 herunter-regulierte. Auff{\"a}llig war, dass die Expression vieler Gene, welche durch den Stress-Sigmafaktor SigB reguliert werden, bei Fehlen von GSH ver{\"a}ndert war. Zu den am st{\"a}rksten (sechs- bis elffach) herauf-regulierten Genen z{\"a}hlen lmo0135-7, sie codieren f{\"u}r einen putativen Oligopeptidtransporter. Die Vermutung lag nahe, dass dieser evtl. GSH aus dem Medium in die Zellen transportieren k{\"o}nnte. Man kann also davon ausgehen, dass GSH von Listeria aktiv aus dem Medium aufgenommen wird und dass die Effekte, die im Versuch ohne zus{\"a}tzliches GSH auftreten, direkt auf das Fehlen von GSH zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind. Zusammengefasst zeigte sich, dass ein Ausfall der GSH-Synthese in Listeria keinen auff{\"a}lligen Ph{\"a}notyp zeigt. Es wurden jedoch sehr umfangreiche Ver{\"a}nderungen des Transkriptionsprofils beobachtet, offenbar konnten die Bakterien dadurch eine neue zellul{\"a}re Hom{\"o}ostase erreichen. Physiologische Mengen von GSH im Medium komplementierten den Ausfall der GSH-Synthese fast vollst{\"a}ndig. Im Laufe dieser Analysen fiel das Augenmerk auf ein Gen mit unbekannter Funktion, lmo0799, das in der ΔgshF-Mutante als deutlich heraufreguliert identifiziert worden war. Eine n{\"a}here in-silico-Analyse ergab deutliche Homologien des Lmo0799 Proteins zu einem Blaulicht-photorezeptor, YtvA, von Bacillus subtilis. Da ein Zusammenhang mit dem TDRM aufgrund der Microarray-Analysen mehr als wahrscheinlich schien, richtete sich das Augenmerk verst{\"a}rkt auf die Charakterisierung des putativen Blaulichtrezeptors Lmo0799. Es wurde eine In-Frame-Deletionsmutante in lmo0799 hergestellt, die mit Δlmo0799-Mutante bezeichnet wurde. Darin ist das urspr{\"u}nglich 253 Aminos{\"a}uren (AS) große Genprodukt von lmo0799 auf sieben AS verk{\"u}rzt, ohne den Promotor- oder Terminatorbereich bzw. umliegende Gene zu ver{\"a}ndern. Parallel wurde begonnen, Versuche zum Einfluss von Licht (blau, λ=455nm bzw. rot, λ=625nm) in vivo und in vitro auf L. monocytogenes durchzuf{\"u}hren. Versuche mittels qRT-PCR wurden durchgef{\"u}hrt um die genaue Wirkweise von Lmo0799 n{\"a}her aufzukl{\"a}ren. Dazu wurden Testgene aus verschiedenen Regulons ausgew{\"a}hlt und deren Transkription in Proben von Wildtyp und Δlmo0799-Mutante mit und ohne blauem bzw. rotem Licht sowie mit und ohne Salzstress gemessen. Dabei zeigte sich, dass vor allem die Transkription von Genen des SigB-Regulons, das f{\"u}r die allgemeine Stressantwort in Listerien zust{\"a}ndig ist, durch Licht moduliert wurde. Die Wirkung von Blaulicht hing in hohem Maße von der Anwesenheit von Lmo0799 ab, welches wahrscheinlich eine Komponente des „Stressosoms" von Listeria darstellt. Die Lichtregulation betraf auch die Internaline A und B, deren Transkription durch Belichtung stark erh{\"o}ht wurde. Infektionsversuche mit blau belichteten bzw. dunkel gehaltenen Wildtyp- bzw. Δlmo0799-Bakterien an humanen Caco-2 Enterozyten zeigten, dass wildtypische Listerien nach Bestrahlung mit blauem Licht ihre Invasionsrate verdoppelten, w{\"a}hrend die Δlmo0799-Listerien auf Niveau der Dunkelkontrolle blieben. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass L. monocytogenes (und wohl auch die anderen Listeria-Arten) in Lmo0799 einen funktionalen Blaulichtrezeptor besitzt, der eine wichtige Rolle in der Vermittlung von Stressreizen via SigB spielt und auch die Motilit{\"a}t und Virulenz moduliert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass auch rotes Licht die Transkription zahlreicher durch Blaulicht regulierter Gene beeinflusst. Der molekulare Mechanismus konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr aufgekl{\"a}rt werden.},
  subject      = {Listeria monocytogenes},
  language  = {de}
}
@phdthesis{vanAlen2010,
  author    = {van Alen, Tessa},
  title     = {Vergleichende Proteomanalyse von Biofilmen und planktonischen Zellen bei dem humanen Infektionserreger Neisseria meningitidis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52463},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Neisseria meningitidis ist ein humaner Infektionserreger, der Meningitis und Sepsis hervorruft. Das asymptomatische Tr{\"a}gertum im Nasenrachenraum ist entscheidend f{\"u}r die {\"U}bertragung des Bakteriums und dessen Interaktion mit dem menschlichen Wirt. Fr{\"u}here Beobachtungen legen die Annahme nahe, dass Meningo¬kokken im Tonsillengewebe in einem biofilm{\"a}hnlichen Stadium vorliegen. Daher werden in vitro Biofilme als Modell f{\"u}r das Tr{\"a}gertum verwendet. Expressionsunterschiede zwischen Biofilmen und planktonisch gewachsenen pathogenen Neisserien wurden in wenigen Transkriptomanalysen untersucht, w{\"a}hrend bisher keine Proteomanalysen durchgef{\"u}hrt wurden. Kartierungen des Proteoms und des Immunoproteoms von Meningokokken liegen allerdings vor. In dieser Studie wurde das Biofilmproteom des unbekapselten N. meningitidis Stammes WUE3671 im Vergleich zum Proteom der planktonisch gewachsenen Bakterien untersucht. Dazu wurde ein auf Silikonschl{\"a}uchen basierendes Biofilmmodell mit kontinuierlichem Fluss etabliert. Es erfolgte eine Anreicherung bakterieller Biomasse {\"u}ber 48 h, wobei die kolonie-bildenden Einheiten bei 24 h ein Plateau erreichten. Licht- und Elektronen¬mikroskopie belegten die deutliche Zunahme der Biomasse {\"u}ber 48 h und zeigten zudem eine Struktur-ierung des 48 h Biofilms in eine apikale Region mit {\"u}berwiegend vitalen Meningokokken und eine basale Region mit einer verst{\"a}rkten Anzahl von Bakterien mit avitalem Erscheinungs-bild. Das Proteom von N. meningitidis Biofilmen, die 24 beziehungsweise 48 h gewachsen waren, wurde mit dem einer exponentiell gewachsenen planktonischen Kultur mit 2D-Gelelektro¬phorese verglichen. Unterschiedlich exprimierte Proteine wurden mit Massen-spektrometrie identifiziert und die Ergebnisse mit Spectral Counting und, wenn m{\"o}glich, mit spezifischen Antik{\"o}rpern abgesichert. Die Expression von ungef{\"a}hr 2 \% aller Proteinspots im Biofilm unterschied sich von der in planktonischen Zellen wenigstens um das 2-fache. Es wurden Ver{\"a}nderungen beobachtet, die mit einem N{\"a}hrstoff- und Sauerstoffmangel sowie einer Zunahme von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) in Verbindung gebracht werden k{\"o}nnen. Die Expression der Proteine SodC und MntC war im Biofilm deutlich erh{\"o}ht, was mutmaßlich auf ROS im Biofilm zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MntC in der Tat essentiell f{\"u}r Biofilmwachstum, nicht aber f{\"u}r planktonisches Wachstum ist. Die Daten zu SodC und MntC legen die Hypothese nahe, dass Meningokokken im Biofilm trainiert werden mit Mediatoren des Immunsystems, wie ROS, umzugehen. Zudem wird NMB0573, ein Lrp-Homolog, als wesentlicher globaler Regulator f{\"u}r metabolische Anpassungen im Biofilm postuliert. Es konnte {\"u}ber die Proteomanalyse hinaus gezeigt werden, dass die Adh{\"a}sine Opc und Opa, die unter der Kontrolle von NMB0573 stehen, im Biofilm vermindert exprimiert werden.},
  subject      = {Biofilm},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Saverschek2010,
  author    = {Saverschek, Nicole},
  title     = {The influence of the symbiotic fungus on foraging decisions in leaf-cutting ants - Individual behavior and collective patterns},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52087},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Foraging behavior is a particularly fascinating topic within the studies of social insects. Decisions made by individuals have effects not only on the individual level, but on the colony level as well. Social information available through foraging in a group modulates individual preferences and shapes the foraging pattern of a colony. Identifying parameters influencing foraging behavior in leaf-cutting ants is especially intriguing because they do not harvest for themselves, but for their symbiotic fungus which in turn influences their plant preferences after the incorporation of the substrate. To learn about the substrates' unsuitability for the fungus, ants need to be able to identify the incorporated substrate and associate it with detrimental effects on the fungus. Odor is an important plant characteristic known to be used as recognition key outside the nest in the context of foraging. Chapter 1 shows that foragers are able to recall information about the unsuitability of a substrate through odor alone and consequently reject the substrate, which leads to the conclusion that inside the nest, odor might be enough to indentify incorporated substrate. Identification of plant species is a key factor in the foraging success of leaf-cutting ants as they harvest a multitude of different plant species in a diverse environment and host plant availability and suitability changes throughout the year. Fixed plant preferences of individuals through innate tendencies are therefore only one factor influencing foraging decisions. On the individual as well as the colony level, foraging patterns are flexible and a result of an intricate interplay between the different members involved in the harvesting process: foragers, gardeners and the symbiotic fungus. In chapter 2 I identified several conditions necessary for na{\"i}ve foragers to learn about the unsuitability of substrate inside the nest. In order to exchange of information about the unsuitability of a substrate, the plant in question must be present in the fungus garden. Foragers can learn without own foraging experience and even without experiencing the effects of the substrate on the fungus, solely through the presence of experienced gardeners. The presence of experienced foragers alone on the other hand is not enough to lower the acceptance of substrate by na{\"i}ve foragers in the presence of na{\"i}ve gardeners, even if experienced foragers make up the majority of the workforce inside the nest. Experienced foragers are also able to reverse their previous negative experience and start accepting the substrate again. The individual behavior of foragers and gardeners with different experiential backgrounds in the presence of suitable or unsuitable substrate inside the fungus chamber was investigated in chapter 3 to shed some light on possible mechanisms involved in the flow of information about substrate suitability from the fungus to the ants. Gardeners as well as foragers are involved in the leaf processing and treatment of the applied leaf patches on the fungus. If the plant material is unsuitable, significantly more ants treat the plant patches, but foragers are less active overall. Contacts between workers initiated by either gardeners or foragers occur significantly more frequent and last longer if the substrate is unsuitable. Even though experienced gardeners increase na{\"i}ve foragers' contact rates and duration with other workers in the presence of suitable plant patches, na{\"i}ve foragers show no differences in the handling of the plant patches. This suggests that foragers gain information about plant suitability not only indirectly through the gardening workers, but might also be able to directly evaluate the effects of the substrate on the fungus themselves. Outside the nest, foragers influence each other the trail (chapter 4). Foraging in a group and the presence of social information is a decisive factor in the substrate choice of the individual and leads to a distinct and consentaneous colony response when encountering unfamiliar or unsuitable substrates. As leaf-cutting ants harvest different plant species simultaneously on several trails, foragers gain individual experiences concerning potential host plants. Preferences might vary among individuals of the same colony to the degree that foragers on the same trail perceive a certain substrate as either suitable or unsuitable. If the majority of foragers on the trail perceives one of the currently harvested substrates as unsuitable, na{\"i}ve foragers lower their acceptance within 4 hours. In the absence of a cue in the fungus, na{\"i}ve foragers harvesting by themselves still eventually (within 6 hours) reject the substrate as they encounter experienced gardeners during visits to the nest within foraging bouts. As foraging trails can be up to 100 m long and foragers spend a considerable amount of time away from the nest, learning indirectly from experienced foragers on the trail accelerates the distribution of information about substrate suitability. The level of rejection of a formerly unsuitable substrate after eight hours of foraging by na{\"i}ve foragers correlates with the average percentage of unladen experienced foragers active on the trail. This suggests that unladen experienced foragers might actively contact laden na{\"i}ve workers transmitting information about the unsuitability of the load they carry. Results from experiments were I observed individual laden foragers on their way back to the nest backed up this assumption as individuals were antennated and received bites into the leaf disk they carried. Individuals were contacted significantly more often by nestmates that perceived the carried leaf disk as unsuitable due to previous experience than by nestmates without this experience (chapter 6). Leaf-cutting ants constantly evaluate, learn and re-evaluate the suitability of harvested substrate and adjust their foraging activity accordingly. The importance of the different sources of information within the colony and their effect on the foraging pattern of the colony depend on the presence or absence of each of them as e.g. experienced foragers have a bigger influence on the plant preferences of na{\"i}ve foragers in the absence of a cue in the fungus garden.},
  subject      = {Blattschneiderameisen},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Vainshtein2010,
  author    = {Vainshtein, Yevhen},
  title     = {Applying microarray-based techniques to study gene expression patterns: a bio-computational approach},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51967},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {The regulation and maintenance of iron homeostasis is critical to human health. As a constituent of hemoglobin, iron is essential for oxygen transport and significant iron deficiency leads to anemia. Eukaryotic cells require iron for survival and proliferation. Iron is part of hemoproteins, iron-sulfur (Fe-S) proteins, and other proteins with functional groups that require iron as a cofactor. At the cellular level, iron uptake, utilization, storage, and export are regulated at different molecular levels (transcriptional, mRNA stability, translational, and posttranslational). Iron regulatory proteins (IRPs) 1 and 2 post-transcriptionally control mammalian iron homeostasis by binding to iron-responsive elements (IREs), conserved RNA stem-loop structures located in the 5'- or 3'- untranslated regions of genes involved in iron metabolism (e.g. FTH1, FTL, and TFRC). To identify novel IRE-containing mRNAs, we integrated biochemical, biocomputational, and microarray-based experimental approaches. Gene expression studies greatly contribute to our understanding of complex relationships in gene regulatory networks. However, the complexity of array design, production and manipulations are limiting factors, affecting data quality. The use of customized DNA microarrays improves overall data quality in many situations, however, only if for these specifically designed microarrays analysis tools are available. Methods In this project response to the iron treatment was examined under different conditions using bioinformatical methods. This would improve our understanding of an iron regulatory network. For these purposes we used microarray gene expression data. To identify novel IRE-containing mRNAs biochemical, biocomputational, and microarray-based experimental approaches were integrated. IRP/IRE messenger ribonucleoproteins were immunoselected and their mRNA composition was analysed using an IronChip microarray enriched for genes predicted computationally to contain IRE-like motifs. Analysis of IronChip microarray data requires specialized tool which can use all advantages of a customized microarray platform. Novel decision-tree based algorithm was implemented using Perl in IronChip Evaluation Package (ICEP). Results IRE-like motifs were identified from genomic nucleic acid databases by an algorithm combining primary nucleic acid sequence and RNA structural criteria. Depending on the choice of constraining criteria, such computational screens tend to generate a large number of false positives. To refine the search and reduce the number of false positive hits, additional constraints were introduced. The refined screen yielded 15 IRE-like motifs. A second approach made use of a reported list of 230 IRE-like sequences obtained from screening UTR databases. We selected 6 out of these 230 entries based on the ability of the lower IRE stem to form at least 6 out of 7 bp. Corresponding ESTs were spotted onto the human or mouse versions of the IronChip and the results were analysed using ICEP. Our data show that the immunoselection/microarray strategy is a feasible approach for screening bioinformatically predicted IRE genes and the detection of novel IRE-containing mRNAs. In addition, we identified a novel IRE-containing gene CDC14A (Sanchez M, et al. 2006). The IronChip Evaluation Package (ICEP) is a collection of Perl utilities and an easy to use data evaluation pipeline for the analysis of microarray data with a focus on data quality of custom-designed microarrays. The package has been developed for the statistical and bioinformatical analysis of the custom cDNA microarray IronChip, but can be easily adapted for other cDNA or oligonucleotide-based designed microarray platforms. ICEP uses decision tree-based algorithms to assign quality flags and performs robust analysis based on chip design properties regarding multiple repetitions, ratio cut-off, background and negative controls (Vainshtein Y, et al., 2010).},
  subject      = {Microarray},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Laisney2010,
  author    = {Laisney, Juliette Agn{\`e}s Genevi{\`e}ve Claire},
  title     = {Characterisation and regulation of the Egfr/Egfr ligand system in fish models for melanoma},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51369},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Fish of the genus Xiphophorus belong to the oldest animal models in cancer research. The oncogene responsible for the generation of spontaneous aggressive melanoma encodes for a mutated epidermal growth factor receptor (Egfr) and is called xmrk for Xiphophorus melanoma receptor kinase. Xmrk constitutive activation mechanisms and subsequent signaling pathways have already been investigated and charaterized but it is still unknown if Egfr ligands may also play a role in Xmrk-driven melanoma formation. To investigate the potential role of Egfr ligands in Xmrk-driven melanoma, I firstly analyzed the evolution of teleost and tetrapod Egfr/Egfr ligand systems. I especially focused on the analysis on the medaka fish, a closely related species to Xiphophorus, for which the whole genome has been sequenced. I could identify all seven Egfr ligands in medaka and could show that the two teleost-specific Egfr copies of medaka display dissimilar expression patterns in adult tissues together with differential expression of Egfr ligand subsets, arguing for subfunctionalization of receptor functions in this fish. Our phylogenetic and synteny analyses supported the hypothesis that only one gene in the chordate ancestor gave rise to the diversity of Egfr ligands found in vertebrate genomes today. I also could show that the Egfr extracellular subdomains implicated in ligand binding are not evolutionary conserved between tetrapods and teleosts, making the use of heterologous ligands in experiments with fish cells debatable. Despite its well understood and straight-forward process, Xmrk-driven melanomagenesis in Xiphophorus is problematic to further investigate in vivo. Our laboratory recently established a new melanoma animal model by generating transgenic mitf::xmrk medaka fishes, a Xiphophorus closely related species offering many more advantages. These fishes express xmrk under the control of the pigment-cell specific Mitf promoter. During my PhD thesis, I participated in the molecular analysis of the stably transgenic medaka and could show that the Xmrk-induced signaling pathways are similar when comparing Xiphophorus with transgenic mitf::xmrk medaka. These data together with additional RNA expression, protein, and histology analyses showed that Xmrk expression under the control of a pigment cell-specific promoter is sufficient to induce melanoma in the transgenic medaka, which develop very stereotyped tumors, including uveal and extracutaneous melanoma, with early onset during larval stages. To further investigate the potential role of Egfr ligands in Xmrk-driven melanoma, I made use of two model systems. One of them was the above mentioned mitf::xmrk medaka, the other was an in-vitro cell culture system, where the EGF-inducible Xmrk chimera HERmrk is stably expressed in murine melanocytes. Here I could show that HERmrk activation strongly induced expression of amphiregulin (Areg) and heparin-binding EGF-like growth factor (Hbegf) in melanocytes. This regulation was dependent on the MAPK and SRC signaling pathways. Moreover, upregulation of Adam10 and Adam17, the two major sheddases of Egfr ligands, was observed. I also could demonstrate the functionality of the growth factors by invitro analyses. Using the mitf::xmrk medaka model I could also show the upregulation of a subset of ligand genes, namely egf, areg, betacellulin (btc) and epigen (epgn) as well as upregulation of medaka egfrb in tumors from fish with metastatic melanoma. All these results converge to support an Xmrk-induced autocrine Egfr ligand loop. Interestingly, my in-vitro experiments with conditioned supernatant from medaka Egf- and Hbegf-producing cells revealed that not only Xiphophorus Egfrb, but also the pre-activated Xmrk could be further stimulated by the ligands. Altogether, I could show with in-vitro and in-vivo experiments that Xmrk is capable of inducing a functional autocrine Egfr ligand loop. These data confirm the importance of autocrine loops in receptor tyrosine kinase (RTK)-dependent cancer development and show the possibility for a constitutively active RTK to strengthen its oncogenic signaling by ligand binding.},
  subject      = {Schwertk{\"a}rpfling},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Vershenya2010,
  author    = {Vershenya, Stanislav},
  title     = {Quantitative and qualitative analyses of in-paralogs},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51358},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {In our analysis I was interested in the gene duplications, with focus on in-paralogs. In-paralogs are gene duplicates which arose after species split. Here I analysed the in-paralogs quantitatively, as well as qualitatively. For quantitative analysis genomes of 21 species were taken. Most of them have vastly different lifestyles with maximum evolutionary distance between them 1100 million years. Species included mammals, fish, insects and worm, plus some other chordates. All the species were pairwised analysed by the Inparanoid software, and in-paralogs matrix were built representing number of in-paralogs in all vs. all manner. Based on the in-paralogs matrix I tried to reconstruct the evolutionary tree using in-paralog numbers as evolutionary distance. If all 21 species were used the resulting tree was very far from real one: a lot of species were misplaced. However if the number was reduced to 12, all of the species were placed correctly with only difference being wrong insect and fish clusters switched. Then to in-paralogs matrix the neighbour-net algorithm was applied. The resulting "net" tree showed the species with fast or slow duplications rates compared to the others. We could identify species with very high or very low duplications frequencies and it correlates with known occurrences of the whole genome duplications. As the next step I built the graphs for every single species showing the correlation between their in-paralogs number and evolutionary distance. As we have 21 species, graph for every species is built using 20 points. Coordinates of the points are set using the evolutionary distance to that particular species and in-paralogs number. In mammals with increasing the distance from speciation the in-paralogs number also increased, however not in linear fashion. In fish and insects the graph close to zero is just the same in mammals' case. However, after reaching the evolutionary distances more than 800 million years the number of inparalogs is beginning to decrease. We also made a simulation of gene duplications for all 21 species and all the splits according to the fossil and molecular clock data from literature. In our simulation duplication frequency was minimal closer to the past and maximum in the near-present time. Resulting curves had the same shape the experimental data ones. In case of fish and insect for simulation the duplication rate coefficient even had to be set negative in order to repeat experimental curve shape. To the duplication rate coefficient in our simulation contribute 2 criteria: gene duplications and gene losses. As gene duplication is stochastical process it should always be a constant. So the changing in the coefficient should be solely explained by the increasing gene loss of old genes. The processes are explained by the evolution model with high gene duplication and loss ratio. The drop in number of in-paralogs is probably due to the BLAST algorithm. It is observed in comparing highly divergent species and BLAST cannot find the orthologs so precisely anymore. In the second part of my work I concentrated more on the specific function of inparalogs. Because such analysis is time-consuming it could be done on the limited number species. Here I used three insects: Drosophila melanogaster (fruit y), Anopheles gambiae (mosquito) and Apis mellifera (honeybee). After Inparnoid analyses and I listed the cluster of orthologs. Functional analyses of all listed genes were done using GO annotations and also KEGG PATHWAY database. We found, that the gene duplication pattern is unique for each species and that this uniqueness is rejected through the differences in functional classes of duplicated genes. The preferences for some classes reject the evolutionary trends of the last 350 million years and allow assumptions on the role of those genes duplications in the lifestyle of species. Furthermore, the observed gene duplications allowed me to find connections between genomic changes and their phenotypic manifestations. For example I found duplications within carbohydrate metabolism rejecting feed pattern adaptation, within photo- and olfactory-receptors indicating sensing adaptation and within troponin indicating adaptations in the development. Despite these species specific differences, found high correlations between the independently duplicated genes between the species. This might hint for a "pool" of genes preferentially duplicated. Taken together, the observed duplication patterns reject the adaptational process and provide us another link to the field of genomic zoology.},
  subject      = {Duplikation},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Boerner2010,
  author    = {B{\"o}rner, Juliane},
  title     = {Charakterisierung der Phosphorylierungsstellen der Guanylyl Cyklase A, dem Rezeptor f{\"u}r das atriale natriuretische Peptid, mittels Massenspektrometrie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51914},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Das ANP/GC-A-System spielt durch die Produktion des sekund{\"a}ren Botenstoffs cGMP eine wichtige Rolle bei der Regulation des Blutdruckes und des Blutvolumens. Bei Patienten mit Herzhypertrophie oder Herzinsuffizienz sind die ANP-Plasmakonzentrationen erh{\"o}ht, aber die GC-A-vermittelten Effekte stark reduziert, was auf einen Defekt des Signalsystems hinweist. Studien an metabolisch markierten GC-A-{\"u}berexprimierenden HEK 293-Zellen zeigten, dass der GC-A-Rezeptor im basalen Zustand stark phosphoryliert und die homologe bzw. heterologe Desensitisierung wahrscheinlich mit einer Dephosphorylierung verbunden ist. Die Desensitisierung stellt einen Mechanismus dar, der in vivo zu einem Funktionsverlust des Rezeptors beitragen k{\"o}nnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mittels Massenspektrometrie sieben Phosphorylierungsstellen in der Kinasehomologen Dom{\"a}ne aus FLAG-GC-A exprimierenden HEK 293-Zellen detektiert werden: Ser487, Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 und Thr513. Die massenspektrometrische relative Quantifizierung basierend auf der Multiple-Reaction-Monitoring (MRM)-Methode zeigte bei ANP-induzierter, homologer Desensitisierung eine Dephosphorylierung der Phosphorylierungsstellen Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 und Thr513, was mit bereits publizierten Daten {\"u}bereinstimmt, und einen starken Anstieg der Phosphorylierung an Ser487. Nach Inkubation mit Angiotensin II, welches eine heterologe Desensitisierung hervorruft, wurde eine Reduzierung aller Phosphorylierungen verzeichnet, die zudem st{\"a}rker ausgepr{\"a}gt war als bei der ANP-abh{\"a}ngigen Desensitisierung. Die Funktion der neu identifizierten Phosphorylierung an Ser487 wurde mittels Mutagenese analysiert. Die Substitution des Serins durch Alanin, welche den unphosphorylierten Zustand nachstellt, resultierte in einer Rezeptoraktivit{\"a}t und desensitisierung vergleichbar zum GC-A Wildtyp-Rezeptor. Wurde hingegen Serin gegen Glutamat getauscht, um den phosphorylierten Zustand zu imitieren, konnte der Rezeptor weder aktiviert noch desensitisiert werden. Diese Ergebnisse best{\"a}tigen vorherige Studien, dass die GC-A-Rezeptorantwort auf ANP durch die Phosphorylierungen reguliert wird. Allerdings scheint bei der homologen Desensitisierung die Phosphorylierung an der Position Ser487 eine Rolle zu spielen, da sie die Aktivit{\"a}t des Rezeptors inhibiert. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Phosphorylierungsstelle tr{\"a}gt zum Verst{\"a}ndnis des Mechanismus der homologen Desensitierung bei. Zus{\"a}tzlich konnten einige der beschriebenen Phosphorylierungen in Zellsystemen detektiert werden, die die GC-A endogen exprimieren. Dadurch sind unter physiologischen Bedingungen Analysen der Mechanismen m{\"o}glich, die bei der Aktivierung und Deaktivierung der GC-A involviert sind und somit wichtige pathophysiologische Konsequenzen haben k{\"o}nnen.},
  subject      = {Guanylatcyclase},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Choi2010,
  author    = {Choi, Soon Won},
  title     = {Analyse des neuralen Differenzierungspotentials androgenetischer muriner embryonaler Stammzellen in vitro und in vivo},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48452},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Pluripotente embryonale Stammzellen (ES Zellen) sind aufgrund ihrer Selbsterneuerung- und ihrer Multiliniendifferenzierungs-F{\"a}higkeiten interessante Zelltypen sowohl f{\"u}r die Grundlagenforschung als auch f{\"u}r die regenerative Medizin. Uniparentale Zygoten mit zwei v{\"a}terlichen (androgenetisch: AG) oder zwei m{\"u}tterlichen (gynogenetisch: GG; parthenogenetisch: PG) Genomen sind nicht in der Lage, lebensf{\"a}hige Nachkommen zu entwickeln. Sie entwickeln sich jedoch erfolgreich bis zu Blastozysten, aus denen pluripotente ES Zellen abgeleitet werden k{\"o}nnen. Mit uniparentalen ES Zellen k{\"o}nnen zum Einen parent-of-origin-spezifische Einfl{\"u}sse auf die Gewebeentwicklung untersucht und zum Anderen histokompatible und somit therapeutisch relevante Zellpopulationen generiert werden. Obwohl viele Aspekte des in vitro und in vivo Differenzierungspotenzials von PG ES Zellen aus mehreren Spezies in den zur{\"u}ckliegenden Jahren untersucht worden sind, ist das volle Differenzierungspotenzial von AG ES Zellen bisher nicht ersch{\"o}pfend analysiert worden. Zellen der Inneren Zellmasse (ICM) von PG und AG Embryonen zeigten nach Blastozysteninjektion ortsspezifische Kontribution zur Gehirnentwicklung, wobei PG Zellen bevorzugt im Cortex und im Striatum lokalisierten, w{\"a}hrend sich AG Zellen verst{\"a}rkt im Hypothalamus nachzuweisen waren. Aus AG und GG ES Zellen konnten zudem in vitro h{\"a}matopoetische Stammzellen differenziert werden, die nach Transplantation im Mausmodell tumorfrei das gesamte h{\"a}matopoetische System repopulierten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass AG ES Zellen ein mit N ES Zellen vergleichbares in vitro und in vivo Differenzierungspotential in der fr{\"u}hen neuralen Entwicklung besitzen. Das Ziel meiner Arbeit war es zu untersuchen, ob murine AG ES Zellen sich zu verschiedenen neuronalen Subtypen entwickeln k{\"o}nnen und ob sie tumorfrei neurale Zelltypen nach Transplantation bilden k{\"o}nnen. In dieser Studie wurden AG ES Zellen im Vergleich zu biparentalen (N) ES Zellen in vitro {\"u}ber Embryoid Bodies (EBs) zun{\"a}chst zu pan-neuronalen Vorl{\"a}uferzellen (pNPCs) und weiter zu Neuron- und Glialzell-Marker (ß-III Tubulin (Tuj-1), NeuN, TH und GFAP) positiven Zellen differenziert.. Weiterhin wurde das dopaminerge (DA) Differenzierungspotential von AG ES Zellen n{\"a}her untersucht, indem sie in einem Ko-Kultursystem mit Stromazellen gerichtet differenziert wurden. Diese DA Neurone wurden durch semiquantitative RT-PCR Analysen und immunhistochemische F{\"a}rbungen f{\"u}r DA Neuronen-spezifische Marker (TH, PITX3, Nurr1) charakterisiert. Dar{\"u}ber hinaus wurde der Imprinting-Status von neun ausgesuchten Loci in AG und N ES, pNPC und DA Zellkulturen durch real-time RT-PCR Analysen untersucht. Die hier analysierten Gene, die im Gehirn allelspezifisch exprimiert werden, zeigten in pNPCs eine parent-of-origin-spezifische Genexpression mit Ausnahme von Ube3a. Nach Blastozysteninjektion wurde die Bildung von DA Neuronen in AG und N f{\"o}talen chim{\"a}ren Gehirnen untersucht. Hier zeigte sich, dass TH- and PITX3-positive AG DA Neurone abgeleitet aus ES Zellen im Mittelhirn von E12.5 und E16.5 Chim{\"a}ren detektiert werden konnten. Diese f{\"o}talen chim{\"a}ren Gehirne zeigten eine verbreitete und gleichm{\"a}ßige Verteilung der AG Donorzellen in den Arealen Cortex, Striatum und Hypothalamus. Stereotaktische Transplantationen von AG und N pNPCs in ein „Traumatic Brain Injury (TBI) Model" zeigten zudem, dass fr{\"u}he Differenzierungsstufen von AG und N pNPC-Kulturen h{\"a}ufig Teratome generierten. Durch die Transplantation von langzeitdifferenzierten AG oder N pNPC-Kulturen konnte jedoch ein tumorfreies Anwachsen neuronaler und glialer Zellen erreicht werden. Die immunhistochemische Auswertung von Transplantaten bez{\"u}glich der Donorzellkontribution im Gehirn erfolgten bis zu drei Monaten nach der Injektion. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass AG ES Zellen neurales Differenzierungspotential, speziell zur Bildung von DA Neuronen, besitzen. Dar{\"u}ber hinaus konnte gezeigt werden, dass langzeitdifferenzierte AG und N pNPCs nach Transplantation im traumatisierte Mausgehirnmodell tumorfrei anwachsen und anschließend zu neuralen Zellen differenzieren k{\"o}nnen. Trotz unbalancierter Genexpression von imprinted Genen l{\"a}sst sich feststellen, dass AG ES Zellen therapeutisch relevant f{\"u}r zuk{\"u}nftige zellul{\"a}re Ersatzstrategien von Nervengewebe sein k{\"o}nnen.},
  subject      = {Deutschland / Stammzellgesetz},
  language  = {de}
}
@phdthesis{HaddadWeber2010,
  author    = {Haddad-Weber, Meike},
  title     = {Development of stem cell-based ACL- and tendon reconstruction},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-66796},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Ruptures of the anterior cruciate ligament (ACL) and defects of the rotator cuff represent the most common ligament and tendon injuries in knee and shoulder. Both injuries represent significant implications for the patients. After an injury, the ACL and the rotator cuff both exhibit poor intrinsic healing capacities. In order to prevent further defects such as arthritis of the knee and fatty infiltration of the rotator cuff, surgical interaction is essential. In both cases, the currently used surgical techniques are far from optimal because even after the therapy many patients report problems ranging from pain and reduced mobility to complete dysfunction of the involved joint and muscles. Tissue engineering may be a possible solution. It is a promising field of regenerative medicine and might be an advantageous alternative for the treatment of musculoskeletal injuries and diseases in the near future. In this thesis, different tissue engineering based approaches were investigated. For the reconstruction of damaged or diseased ligaments and tendons, the use of MSCs and gene therapy with growth factors is especially suitable and possesses a great therapeutic potential. Therefore, the first method studied and tested in this thesis was the development of a biomaterial based construct for the repair of a ruptured ACL. The second approach represents a cell based strategy for the treatment of the fatty infiltration in the rotator cuff. The third approach was a combined cell, biomaterial, and growth factor based strategy for ACL ruptures. Biomaterial based ACL construct The implant is currently tested in a preclinical in vivo study in mini pigs. This proof-of-principle study is performed to validate the functional capability of the collagen fiber based implant under load in vivo and its population with fibroblasts which produce a ligamentogenic matrix. Cell based treatment of the fatty infiltration in the rotator cuff Regarding the treatment of the fatty infiltration of the rotator cuff in a rabbit model, the in vivo results are also promising. The group treated with autologous MSCs (+MSC group) showed a lower fat content than the untreated group (-MSC group) 6 weeks after the treatment. Furthermore, the SSP muscle of the MSC-treated animals revealed macroscopically and microscopically only few differences compared to the healthy control group. The exact underlying mechanisms leading to the positive results of the treatment are not yet fully understood and have therefore to be further investigated in the future. Cell, biomaterial, and growth factor based treatment of ACL ruptures Studies described in current literature show that collagen hydrogel scaffolds are not ideal for a complete ligament or tendon reconstruction, because of their insufficient mechanical stability. Introduced as an alternative and superior therapy, the combined strategy used in this thesis proves that the cultivation of BMP-12, -13, and IGF-1 transduced MSCs and ACL fibroblasts in a collagen hydrogel is successful. The results of the performed in vitro study reveal that the cells exhibit a fibroblastic appearance and produce a ligamentogenic matrix after 3 weeks. Furthermore, the adenoviral transduction of MSCs and ACL fibroblasts showed no negative effects on proliferation or viability of the cells nor was apoptosis caused. Therefore, the application of these cells represents a possible future therapy for a partial ligament and tendon rupture where the mechanical stability of the remaining ligament or tendon is sufficient and the healing can be improved substantially by this therapy. In general, prospective randomized clinical trials still have to prove the postulated positive effect of MSCs for the treatment of various musculoskeletal diseases, but the results obtained here are already very promising. Ideally, the treatment with MSCs is superior compared to the standard surgical procedures. Because of current safety issues the use of genetically modified cells cannot be expected to be applied clinically in the near future. In summary, the different tissue engineering approaches for novel therapies for musculoskeletal injuries and diseases invested in this thesis showed very promising results and will be further developed and tested in preclinical and clinical trials.},
  subject      = {Kreuzband},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Mumm2010,
  author    = {Mumm, Patrick},
  title     = {Elektrophysiologische Untersuchungen der Ionenfl{\"u}sse und ihrer Regulation in Stomakomplex-bildenden Zellen von Zea mays und Schließzellen von Arabidopsis thaliana},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-49267},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {1. Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse hinsichtlich des angenomme-nen gerichteten Ionentransports zwischen Schließ- und Nebenzellen von Zea mays gewonnen werden: a. Mittels der Patch-Clamp-Technik wurden in beiden Zelltypen S-Typ-{\"a}hnliche Anionenkan{\"a}le identifiziert. In Nebenzellen konnten sie durch steigende zytosolische Ca2+-Konzentrationen gehemmt und durch ABA und zytosolische Alkalisierung stimuliert werden. Die S-Typ-Anionenkan{\"a}le der Schließzellen wurden hingegen durch eine Alkalisierung kaum beeinflusst und durch steigende zytosolische Ca2+-Konzentrationen stimuliert. b. Dar{\"u}ber hinaus konnte an intakten Mais-Pflanzen mit der Einstich-Elektroden-Technik gezeigt werden, dass Nebenzellen eine gegenl{\"a}ufige Polarisation des Membranpotentials w{\"a}hrend der Licht-/Dunkel-induzierten Stomabewegung aufweisen. Da das Membranpotential der Nebenzellen von Hordeum vulgare ein zu Mais {\"a}hnliches Verhalten w{\"a}hrend der Stomabewegung zeigte und gegenl{\"a}u-fig zur Membranpolarisation der benachbarten Schließzellen war, ist ein {\"a}hnli-ches Verhalten bei Zea mays Schließzellen naheliegend. c. Zudem wurde in intakten Nebenzellen von Zea mays eine zytosolische Alkali-sierung w{\"a}hrend der Licht-induzierten Stoma{\"o}ffnung beobachtet, die bei Stomaschluss wieder auf den Ursprungswert zur{\"u}ckkehrte. d. Mit Hilfe rekonstruktierter 3D-Modelle von intakten Mais-Stomakomplexen konnte ein Volumenverh{\"a}ltnis zwischen Schließ- und Nebenzellen von 1:6 bzw. 1:4 bei ge{\"o}ffneten und geschlossenen Stomata ermittelt werden. Unter Einbeziehung der Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten die hier gewon-nenen Erkenntnisse schl{\"u}ssig in ein Modell zur Beschreibung des Shuttle-Ionentransports zwischen Neben- und Schließzellen w{\"a}hrend der Licht-induzierten Stomabewegung eingebunden werden. 2. Des Weiteren wurden die S-Typ-Anionenstromantworten von A. thaliana Schließ-zellen in Patch-Clamp-Experimenten n{\"a}her untersucht. Dabei waren die S-Typ-Anionenstr{\"o}me bei Ca2+- bzw. ABA-Stimulation in CPK23- und OST1-Verlustmutanten im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert. Diese in vivo generierten Daten untermauern die in vitro Ergebnisse der Arbeitsgruppe von Prof. R. Hedrich (Universit{\"a}t W{\"u}rzburg), dass OST1 und CPK23 Interaktionspartner des S-Typ-Anionenkanals SLAC1 in A. thaliana sind. Das SLAC1-homologe Gen SLAH3 ko-diert f{\"u}r einen Nitrat-permeablen S-Typ-Anionenkanal in Schließzellen, der zudem durch externes Nitrat aktiviert wird. Da in slac1-3 Verlustmutanten S-Typ-{\"a}hnliche Anionenstr{\"o}me generiert werden konnten, wenn Nitrat das dominierende Anion dar-stellte oder den Chlorid-basierten L{\"o}sungen externes Nitrat zugegeben wurde, scheint SLAH3 unter bestimmten Bedingungen einen alternativen Weg f{\"u}r die Ent-lassung von Anionen aus der Schließzelle darzustellen. 3. Die elektrophysiologische Charakterisierung der R-Typ-Anionenkan{\"a}le in A. thaliana Schließzellen belegt, dass dieser Kanal {\"a}hnliche Grundcharakteristika aufweist, die schon in Vicia faba beschrieben wurden: eine starke Spannungsab¬h{\"a}ngigkeit, sowie schnelle Aktivierungs- und Deaktivierungskinetiken. Im Gegensatz zu Vicia faba wurde die Spannungsabh{\"a}ngigkeit dieses Kanaltyps in A. thaliana nicht durch externes Malat beeinflusst. Jedoch war unter externen Malatbedingungen die Stromantwort einer almt12-Verlustmutante im Vergleich zu Wildtyp-Schließzellen erheblich reduziert, w{\"a}hrend unter externen Sulfatbe¬dingungen keine Unterschiede zwischen Wildtyp und almt12-Verlustmutante auszu¬machen waren. ALMT12 scheint demnach f{\"u}r den Malat-aktivierten Teil des R-Typ-Anionenkanals verantwortlich zu sein.},
  subject      = {Schließzelle},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schmitt2010,
  author    = {Schmitt, Kathrin},
  title     = {Identification and Characterization of GAS2L3 as a Novel Mitotic Regulator in Human Cells},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52704},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Precise control of mitotic progression is vital for the maintenance of genomic integrity. Since the loss of genomic integrity is known to promote tumorigenesis, the identification of knew G2/M regulatory genes attracts great attention. LINC, a human multiprotein complex, is a transcriptional activator of a set of G2/M specific genes. By depleting LIN9 in MEFs, a core subunit of LINC, Gas2l3 was identified as a novel LINC target gene. The so far uncharacterized Gas2l3 gene encodes for a member of the family of growth arrest specific 2 (GAS2) proteins, which share a highly conserved putative actin binding CH and a putative microtubule binding GAS2 domain. In the present study GAS2L3 was identified as a LINC target gene also in human cells. Gene expression analysis revealed that GAS2L3 transcription, in contrast to all other GAS2 family members, is highly regulated during the cell cycle with highest expression in G2/M. The GAS2L3 protein showed a specific localization pattern during the M phase: In metaphase, GAS2L3 localized to the mitotic spindle, relocated to the spindle midzone microtubules in late anaphase and concentrated at the midbody in telophase where it persisted until the end of cytokinesis. Overexpression of a set of different GAS2L3 deletion mutants demonstrated that the localization to the mitotic microtubule network is dependent on the C-terminus, whereas the midbody localization is dependent on full length GAS2L3 protein. Additionally, exclusive overexpression of the CH domain induced the formation of actin stress fibers, suggesting that the CH domain is an actin binding domain. In contrast, the GAS2 domain was neither needed nor sufficient for microtubule binding, indicating that there must be an additional so far unknown microtubule binding domain in the C-terminus. Interestingly, immunoblot analysis also identified the C-terminus as the domain responsible for GAS2L3 protein instability, partially dependent on proteasomal degradation. Consistent with its specific localization pattern, GAS2L3 depletion by RNAi demonstrated its responsibility for proper mitosis and cytokinesis. GAS2L3 depletion in HeLa cells resulted in the accumulation of multinucleated cells, an indicator for chromosome mis-segregation during mitosis. Also the amount of cells in cytokinesis was enriched, indicating failures in completing the last step of cytokinesis, the abscission. Strikingly, treatment with microtubule poisons that lead to the activation of the spindle assembly checkpoint (SAC) indicated that the SAC was weakened in GAS2L3 depleted cells. Although the exact molecular mechanism is still unknown, fist experiments support the hypothesis that GAS2L3 might be a regulator of the SAC master kinase BUBR1. In conclusion, this study provides first evidence for GAS2L3 as a novel regulator of mitosis and cytokinesis and it might therefore be an important guardian against tumorigenesis.},
  subject      = {Mensch},
  language  = {en}
}