@phdthesis{Zoelch2019,
  author    = {Z{\"o}lch, Michael Ludwig},
  title     = {Effekt der Interleukin-1 Rezeptor-assoziierten Kinase 2 (IRAK2)-Mutation N333D auf den Signalweg von TLR4},
  doi       = {10.25972/OPUS-18067},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-180678},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {IRAK2 besitzt eine Schl{\"u}sselrolle im Signalweg des TLR4. Fehlregulationen dieses Signalwegs f{\"u}hren zu fehlgeleiteten Immunreaktionen, die auch die Entstehung und Progression von Krebserkrankungen f{\"o}rdern. Bevor IRAK2 als therapeutisches Ziel in Frage kommen kann, muss erst noch weitere Klarheit {\"u}ber die grunds{\"a}tzliche Funktionsweise dieses Proteins bestehen. So ist f{\"u}r IRAK2 aufgrund der Substitution einer Aminos{\"a}ure in der Kinase-Dom{\"a}ne im Vergleich zu IRAK1 noch nicht abschließend gekl{\"a}rt, ob es sich um eine aktive Kinase oder eine Pseudokinase handelt und ob diese Ver{\"a}nderung eine Erh{\"o}hung oder eine Erniedrigung der Funktion im TLR4-Signalweg nach sich zieht. Um diese Fragen anzugehen, wurde in dieser Arbeit Asparagin im vermeintlich aktiven Zentrum (Aminos{\"a}ure 333) wieder zur Asparagins{\"a}ure [N333D] revertiert und damit versucht die Phosphorylierungsaktivit{\"a}t zu steigern bzw. vergleichbar zu IRAK1 wiederherzustellen. Das Einbringen der Mutation in IRAK2 erfolgte mittels ortsspezifischer Mutagenese. Mit dieser und anderen Mutanten und mit wildtypischem IRAK2 wurden durch die CRISPR/Cas9-Methode generierte IRAK2-defiziente 264.7 Makrophagen rekonstituiert und damit ein System etabliert, mit dem der Einfluss der Mutation auf den Signalweg des TLR4 nach Stimulation mit LPS quantitativ analysiert werden konnte. Sowohl die indirekte NF-κB-Messung {\"u}ber CD40-Expression als auch die direkte NF-κB-Messung {\"u}ber die NF-κB-getriebene Expression eines Reportergens (cyan fluorescent protein) ergab, dass IRAK2[N333D] die LPS-abh{\"a}ngige NF-κB-Aktivierung {\"u}ber den TLR4 Signalweg schlechter erm{\"o}glicht als IRAK2. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die in der Entwicklungsgeschichte aufgetretene Ver{\"a}nderung des aktiven Zentrums von IRAK2 im Vergleich zu IRAK1 zu einer besseren Aktivierung der MyD88-abh{\"a}ngigen NF-κB-Aktivit{\"a}t f{\"u}hrte und somit eine erh{\"o}hte und l{\"a}nger anhaltende Signalleitung erm{\"o}glichte. Diese Erkenntnis kann als weiterer Schritt hin zu einem besseren Verst{\"a}ndnis der Funktion des IRAK2-Proteins und zu einer m{\"o}glichen zuk{\"u}nftigen Verwendung von IRAK2 als Ziel therapeutischer Behandlungen gesehen werden.},
  subject      = {Toll-like-Rezeptoren},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Dambacher2021,
  author    = {Dambacher, Helena},
  title     = {Die Etablierung des CRISPR/Cas9-Systems in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen zur Untersuchung der Funktion des Kanalproteins Connexin 43 in der Embryonalentwicklung},
  doi       = {10.25972/OPUS-24015},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-240152},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Die Rolle von Connexinen und Gap Junction-vermittelter Kommunikation in pluripotenten Stammzellen sowie der fr{\"u}hen Embryonalentwicklung sind bis heute nicht vollst{\"a}ndig aufgekl{\"a}rt. Mutationen in humanen Connexinen verursachen eine Vielzahl von Krankheiten. Connexin-defiziente iPS Zellen stellen eine gute Basis f{\"u}r die Erforschung der Rolle von Connexinen w{\"a}hrend der Embryonalentwicklung und bei der Krankheitsentstehung dar. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das CRISPR/Cas9-System in pluripotenten Stammzellen erfolgreich anzuwenden und ein Protokoll zur Erstellung verschiedener Cx43-Defektmutanten zu entwerfen. Nach der Etablierung der CRSIPR/Cas9-Methode in HEK293T-Zellen konnte in der vorliegenden Arbeit dar{\"u}ber hinaus erfolgreich eine Cx43-Defizienz in FSiPS-Zellen erzeugt werden. Weiterhin wurden mehrere Cx43-Mutanten geschaffen und initial auf Pluripotenzmarker und ihr Differenzierungspotential untersucht. Diese Arbeit bildet die Basis f{\"u}r weitere Untersuchungen des Cx43 in iPS-Zellklonen und davon abgeleiteten Zelltypen sowie artifiziellen 3D-Gewebekulturen. Dar{\"u}ber hinaus bildet sie die Grundlage f{\"u}r die Bildung weiterer Connexin-Defektmutanten sowie von iPS-Zellen mit krankheitsrelevanten Mutationen.},
  subject      = {CRISPR/Cas-Methode},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Rehm2022,
  author    = {Rehm, Alexandra},
  title     = {Etablierung von USP8 und USP48 Mutationen in Zelllinien f{\"u}r Cushing-Syndrom Analysen mittels CRISPR/Cas9},
  doi       = {10.25972/OPUS-23450},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-234503},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2022},
  abstract  = {Morbus Cushing ist die h{\"a}ufigste Ursache f{\"u}r endogenes Cushing-Syndrom und f{\"u}hrt auf Grund eines kortikotropen Hypophysenadenoms zu einem Glucocorticoid {\"U}berschuss und wiederum zu einer hohen Morbidit{\"a}t und Mortalit{\"a}t. Die Ursache hierf{\"u}r sind unter anderem somatische Mutationen in den Deubiquitinasen USP8 und USP48. Das Ziel dieser Arbeit war es mittels der CRISPR/Cas9-Methode, die Mutationen USP8 und USP48 in Zelllinien zu etablieren und diese f{\"u}r Cushing-Syndrom Analysen zu verwenden. Hierf{\"u}r wurden in dieser Arbeit gRNAs f{\"u}r USP8 und USP48 designt, welche anschließend in die humane embryonale Zelllinie HEK293AD Zellen transfiziert wurden. Diese Zellen wurden zu monoklonalen Zellen vereinzelt. Ziel war einen Knock-out von USP8 bzw. USP48 zu generieren. Es konnte ein erfolgreicher Zellklon generiert werden mit einem Knock-out von USP48. Ebenfalls konnte ein Genomediting von USP8 in Exon 20 durchgef{\"u}hrt werden. Zusammenfassend konnte die CRISPR/Cas9 Methode f{\"u}r ein M. Cushing-Zellmodells etabliert und eine gute Ausgangsbasis f{\"u}r weitere Experimente (z.B. ein gezielter Knock-in von USP8- und USP48- Mutationen) generiert werden.},
  subject      = {Cushing-Syndrom},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schiffmaier2024,
  author    = {Schiffmaier, Jana},
  title     = {Parathormon als potentielle Therapiestrategie der Odonto-Hypophosphatasie - Untersuchungen in einem dentogenen \(in-vitro\)-Modell},
  doi       = {10.25972/OPUS-34915},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-349152},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2024},
  abstract  = {Hypophosphatasie (HPP) beschreibt eine seltene Erbkrankheit, die haupts{\"a}chlich durch heterozygote Mutationen im ALPL-Gen verursacht wird. Diese f{\"u}hren zu einer verminderten Aktivit{\"a}t der gewebeunspezifischen alkalischen Phosphatase (TNAP). Neben skelettalen Symptomen sind Zahnanomalien wie der vorzeitige Verlust von Milchz{\"a}hnen ohne resorbierte Wurzel sowie eine gest{\"o}rte Mineralisierung der Zahnhart-substanzen ein typisches Merkmal der HPP. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind bisher noch nicht vollst{\"a}ndig verstanden. In der vorliegenden Arbeit wurden Zelllinien des parodontalen Ligaments mit Mutationen im ALPL-Gen charakterisiert, um anschließend m{\"o}gliche Therapiestrategien f{\"u}r die HPP auf molekularer Ebene zu untersuchen. Im Rahmen der basalen Charakterisierung wurden die Zelllinien hinsichtlich der TNAP-Expression (Immunhistochemie, Western Blot), des Stoffwechselprofils (ATP-Assay) und des osteogenen Differenzierungspotenzials (Alizarin-F{\"a}rbung) analysiert. Von Interesse war auch, ob durch CRISPR/Cas9-basiertes Genediting Off-Target Mutationen entstanden sind. Zur Untersuchung der molekularen Auswirkungen von PTH, welches die ALPL-Expression steigern kann, wurden zwei Protokolle etabliert, die eine kontinuier-liche, kurzzeitige bzw. intermittierende Pr{\"a}senz von PTH in-vitro imitieren. Anschließend wurde die ALPL-Expression (qPCR) sowie TNAP-Aktivit{\"a}t (CSPD-Assay) ermittelt. Die basale TNAP-Expression war variabel und reichte vom v{\"o}lligen Fehlen in den Zell-linien mit Deletionen bis hin zu einer starken TNAP-Expression in der Zelllinie mit einer heterogenen Punktmutation. Eine niedrige Expression ging mit einer verringerten Zell-proliferation sowie extrazellul{\"a}ren ATP einher. Es zeigte sich ein unterschiedliches Mineralisierungspotenzial, das haupts{\"a}chlich das TNAP-Expressionsniveau in den verschiedenen Zelllinien widerspiegelt, w{\"a}hrend die PTH-Stimulation keine Wirkung auf die Differenzierung hatte. Im Gegensatz zu klinischen Beobachtungen deuten die Ergebnisse auf eine hohe Korrelation zwischen Genotyp und Ph{\"a}notyp in-vitro hin, die in-vivo noch best{\"a}tigt werden m{\"u}ssen. Die Sequenzierung best{\"a}tigte, dass durch die Geneditierung keine Off-Target Mutationen aufgetreten sind, welche somit keinen limitierenden Faktor hinsichtlich der Differenzierungskapazit{\"a}t darstellen k{\"o}nnen. Die Stimulation mit PTH f{\"u}hrte zwar nicht zu einer gesteigerten ALPL-Expression, doch konnte die TNAP-Aktivit{\"a}t in den ALPL-defizienten Zelllinien punktuell gesteigert werden und bildet somit eine solide Basis f{\"u}r weitere Experimente, die zur Therapieentwicklung f{\"u}r die Odonto-HPP beitragen k{\"o}nnen.},
  subject      = {Hypophosphatasie},
  language  = {de}
}