@phdthesis{Zoran2022,
  author    = {Zoran, Tamara},
  title     = {Multilevel analysis of the human immune response to \(Aspergillus\) \(fumigatus\) infection: Characteristic molecular signatures and individual risk factors},
  doi       = {10.25972/OPUS-29851},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-298512},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2022},
  abstract  = {Although the field of fungal infections advanced tremendously, diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis (IPA) in immunocompromised patients continues to be a challenge. Since IPA is a multifactorial disease, investigation from different aspects may provide new insights, helpful for improving IPA diagnosis. This work aimed to characterize the human immune response to Aspergillus fumigatus in a multilevel manner to identify characteristic molecular candidates and risk factors indicating IPA, which may in the future support already established diagnostic assays. We combined in vitro studies using myeloid cells infected with A. fumigatus and longitudinal case-control studies investigating patients post allogeneic stem cell transplantation (alloSCT) suffering from IPA and their match controls. Characteristic miRNA and mRNA signatures indicating A. fumigatus-infected monocyte-derived dendritic cells (moDCs) demonstrated the potential to differentiate between A. fumigatus and Escherichia coli infection. Transcriptome and protein profiling of alloSCT patients suffering from IPA and their matched controls revealed a distinctive IPA signature consisting of MMP1 induction and LGAL2 repression in combination with elevated IL-8 and caspase-3 levels. Both, in vitro and case-control studies, suggested cytokines, matrix-metallopeptidases and galectins are important in the immune response to A. fumigatus. Identified IPA characteristic molecular candidates are involved in numerous processes, thus a combination of these in a distinctive signature may increase the specificity. Finally, low monocyte counts, severe GvHD of the gut (grade ≥ 2) and etanercept administration were significantly associated with IPA diagnosis post alloSCT. Etanercept in monocyte-derived macrophages (MDM) infected with A. fumigatus downregulates genes involved in the NF-κB and TNF-α pathway and affects the secretion of CXCL10. Taken together, identified characteristic molecular signatures and risk factors indicating IPA may in the future in combination with established fungal biomarkers overcome current diagnostic challenges and help to establish tailored antifungal therapy. Therefore, further multicentre studies are encouraged to evaluate reported findings.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Wilhelm2010,
  author    = {Wilhelm, Daniela Elisabeth},
  title     = {Die Rolle von GSK3 im Rahmen der angeborenen Immunabwehr gegen Aspergillus fumigatus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71674},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Aspergillus fumigatus ist ein ubiquit{\"a}r vorkommender Schimmelpilz, dessen Sporen vom Menschen t{\"a}glich zu hunderten mit der Atemluft aufgenommen werden. Aufgrund ihrer geringen Gr{\"o}ße gelangen die Konidien leicht bis in die Alveolen der Lunge, wo sie normalerweise sofort vom angeborenen Immunsystem beseitigt werden. Immunsupprimierte Menschen leiden an einer qualitativen oder quantitativen Einschr{\"a}nkung dieses Teiles der Immunabwehr, weshalb die Inokulation der Sporen bei ihnen zur Ausl{\"o}sung der lebensgef{\"a}hrlichen Invasiven Aspergillose f{\"u}hren kann, deren Mortalit{\"a}t in der Hochrisikogruppe der Patienten nach h{\"a}matopoetischer Stammzelltransplantation {\"u}ber 90\% betr{\"a}gt. Bei diesen Patienten gewinnt die adaptive Immunabwehr an Bedeutung. Dendritische Zellen geh{\"o}ren dem angeborenen Immunsystem an und besitzen einzigartige F{\"a}higkeiten zur Aktivierung und Steuerung der erworbenen Immunabwehr. Durch die Aktivierung naiver T-Zelen und die Sekretion bestimmter immunmodulatorischer Zytokine bestimmen sie die Art der konsekutiv asugel{\"o}sten T-Helferzellantwort. Lediglich eine T-Helfer 1-Zellantwort wird hierbei mit einer erh{\"o}hten Resistenz gegen{\"u}ber der invasiven Aspergillose in Verbindung gebracht. Die Zytokinsekretion der Dendritischen Zellen wird durch intrazellul{\"a}re Signalkaskaden reguliert, welche sich an ihre PRRs anschließen. F{\"u}r die Erkennung des bakteriellen LPS durch den TLR wurde die Regulation der immunmodulatorischen Zytokine durch die Serin-Threonin-Kinase GSK3 festgestellt. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob es bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus durch humane dendritische Zellen ebenfalls einen Zusammenhang mit GSK3 und der Sekretion immunmodulatorischer Zytokine gibt. Daf{\"u}r wurden aus humanen Monozyten generierte dendritische Zellen mit rekombinanten Antigenen von Aspergillus fumigatus sowie verschiedenen Morphologien stiumuliert und teilweise mit dem GSK3-Inhibitor LiCl gehemmt. Anschließend wurde die Expression bestimmter immunmodulatorischer Zytokine und der GSK3 mittels quantitativer real-time RT-PCR bestimmt. Hierbei konnte f{\"u}r eines der getesteten Antigene, Aspf 1, ein deutlicher Einfluss auf die GSK3-Expression der Zellen festgestellt werden. Ein paralleler Anstieg der Expression proinflammatorischer Zytokine erh{\"a}rtete die Annahme einer immunregulierenden Rolle der GSK3 bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus. Einen deutlicheren Hinweis auf den Zusammenhang zwischen der Aktivit{\"a}t der GSK3 und der Expression proinflammatorischer Zytokine erbrachte die Inhibierung mittels LiCl. Die mit Aspergillus fumigatus stimulierten Zellen reagierten hierauf im Vergleich zu den nicht-inhibierten Zellen mit einer Reduktion der IL12p35-Expression um 86,1\% sowie mit einer Reduktion der IL23-Expression um 49,5\%. Der letzte Teil der Experimente sollte ausgehend von der Vorstellung, dass verschiedene Aspergillus-Morphologien von unterschiedlichen Rezeptoren erkannt werden quantitative Unterschiede der GSK3-Beteiligung bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus durch dendritische Zellen zeigen. Obwohl alle Morphologien des Schimmelpilzes einen Einfluss auf die GSK3-Expression der Zellen zeigten, konnten hierbei keine einheitlichen quantitativen Unterschiede festgestellt werden. Zusammengefasst konnte in der vorliegenden Arbeit die Beteiligung von GSK3 bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus durch humane dendritische Zellen gezeigt werden. Außerdem konnten Hinweise auf eine immunregulierende Rolle der GSK3 bei der Abwehr des fakultativ pathogenen Schimmelpilzes erbracht werden, wobei die genaue Einbindung der Serin-Threonin-Kinase in dieser Situation noch unklar ist und weitere Experimente erforderlich macht.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Weiss2021,
  author    = {Weiß, Esther},
  title     = {Host-pathogen interactions of natural killer cells and Aspergillus fumigatus: Relevance of immune cell cross-talk and fungal recognition receptors},
  doi       = {10.25972/OPUS-20607},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-206077},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {The human pathogen Aspergillus (A.) fumigatus is a fungal mold that can cause severe infections in immunocompromised hosts. Pathogen recognition and immune cell cross-talk are essential for clearing fungal infections efficiently. Immune cell interactions in particular may enhance individual cell activation and cytotoxicity towards invading pathogens. This study analyzed the reciprocal cell activation of natural killer (NK) cells and monocyte-derived dendritic cells (moDCs) after stimulation with A. fumigatus cell wall fractions and whole-cell lysates. Furthermore, the impact of the on moDCs expressed fungal receptors Dectin-1 and TLR-2 on NK cell activation was analyzed. Stimulation of moDCs with ligands for Dectin-1 and TLR-2 and transfer of soluble factors on autologous NK cells showed that moDCs could induce NK cell activation solely by secreting factors. In summary, both cell types could induce reciprocal cell activation if the stimulated cell type recognized fungal morphologies and ligands. However, moDCs displayed a broader set of A. fumigatus receptors and, therefore, could induce NK cell activation when those were not activated by the stimulus directly. Consequently, new fungal receptors should be identified on NK cells. The NK cell characterization marker CD56 was reduced detected in flow cytometry after fungal co-culture. Notably, this decreased detection was not associated with NK cell apoptosis, protein degradation, internalization, or secretion of CD56 molecules. CD56 was shown to tightly attach to hyphal structures, followed by its concentration at the NK-A. fumigatus interaction site. Actin polymerization was necessary for CD56 relocalization, as pre-treatment of NK cells with actin-inhibitory reagents abolished CD56 binding to the fungus. Blocking of CD56 suppressed fungal mediated NK cell activation and secretion of the immune-recruiting chemokines MIP-1α, MIP-1β, and RANTES, concluding that CD56 is functionally involved in fungal recognition by NK cells. CD56 binding to fungal hyphae was inhibited in NK cells obtained from patients during immune-suppressing therapy after allogeneic stem cell transplantation (alloSCT). Additionally, reduced binding of CD56 correlated with decreased actin polymerization of reconstituting NK cells challenged with the fungus. The immune-suppressing therapy with corticosteroids negatively influenced the secretion of MIP-1α, MIP-1β, and RANTES in NK cells after fungal stimulation ex vivo. Similar results were obtained when NK cells from healthy donors were treated with corticosteroids prior to fungal co-culture. Thus, corticosteroids were identified to have detrimental effects on NK cell function during infection with A. fumigatus.},
  subject      = {Nat{\"u}rliche Killerzelle},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Wallstein2021,
  author    = {Wallstein, Marion Alice},
  title     = {Einfluss von Hypoxie auf die Interaktion von moDCs und T-Zellen mit \(Aspergillus\) \(fumigatus\)},
  doi       = {10.25972/OPUS-23854},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-238543},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Die invasive Aspergillose ist eine gef{\"u}rchtete Erkrankung besonderes bei immunsupprimierten Patienten, die eine Stammzelltransplanation erhalten sollen. Diese Patienten leiden in der Regel an einer h{\"a}matologischen Grunderkrankung wie einer Leuk{\"a}mie oder einem Lymphom. Das Prinzip der Stammzelltransplanatation ist es, das kranke Knochenmark mittels Chemotherapie und Bestrahlung zu zerst{\"o}ren und es dann mit gesunden Stammzellen zu ersetzen. W{\"a}hrend dieser Konditionierung ist der Patient also ohne eigene Abwehrzellen. In dieser Phase gestaltet sich die rechtzeitige Diagnose h{\"a}ufig als schwierig, weil die konventionellen Diagnosemethoden von der Anwesenheit von neutrophilen Granulozyten abh{\"a}ngen. H{\"a}ufig ist die Infektion bei der Entwicklung von unspezifischen Symptomen wie Fieber oder Dyspnoe schon weit fortgeschritten. Hat sich der Pilz in der Lunge ausgebreitet, so kommt es zur Ausbildung einer Hypoxie und im Verlauf auch zu einer Hypox{\"a}mie aufgrund einer Diffusionsst{\"o}rung in den entz{\"u}ndeten Lungenabschnitten. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von Hypoxie auf die Interaktion zwischen dendritischen Zellen und T-Zellen besser zu verstehen. Dendritische Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Immunabwehr von Pilzinfektion und bilden das Verbindungsst{\"u}ck zwischen angeborenen und erworbenen Immunsystem. T-Zellen {\"u}bernehmen ebenfalls wichtige Aufgaben bei der Abwehr von Pilzinfektionen, indem sie Interferon gamma produzieren. Zudem sollte die Funktion verschiedener Botenstoffe in Signalkaskaden n{\"a}her untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion von dendritischen Zellen mit Aspergillus fumigatus unter Hypoxie, die dendritischen Zellen anschließend unter Normoxie dazu bef{\"a}higt, eine verst{\"a}rkte adaptive Immunantwort hervorzurufen. Hypoxie k{\"o}nnte somit als zus{\"a}tzlicher Faktor verwendet werden, um dendritische Zellen als effektive Adjuvantien in einer Impfung gegen Aspergillus fumigatus zu verwenden. Urs{\"a}chlich f{\"u}r die verst{\"a}rkte F{\"a}higkeit naive T-Zellen zu aktivieren, scheint zum einen die Apoptose und zum anderen eine verst{\"a}rkte Produktion von Interleukin 12p70 zu sein.},
  subject      = {Dendritische Zelle},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Trinks2024,
  author    = {Trinks, Nora Isabel},
  title     = {Super-resolution fluorescence microscopic visualization and analysis of interactions between human immune cells and \(Aspergillus\) \(fumigatus\)},
  doi       = {10.25972/OPUS-26640},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-266407},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2024},
  abstract  = {The mold Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) is known as human pathogen and can cause life-threatening infections in humans with a weakened immune system. This is a known complication in patients receiving glucocorticoids, e.g. after hematopoietic stem cell transplantation or solid organ transplantation. Although research in the field of immune cell/fungus interaction has discovered key strategies how immune cells fight against infectious fungi, our knowledge is still incomplete. In order to develop effective treatment options against fungal infections, a detailed understanding of their interactions is crucial. Thus, visualization of immune cell and fungus is an excellent approach to gain further knowledge. For a detailed view of such interaction processes, a high optical resolution on nanometer scale is required. There is a variety of super resolution microscopy techniques, enabling fluorescence imaging beyond the diffraction limit. This work combines the use of three complementary super resolution microscopy techniques, in order to study immune cell/fungus interaction from different points of view. Aim of this work is the introduction of the recently invented imaging technique named expansion microscopy (ExM) for the study of immune cell/fungus interactions. The core aspect of this method is the physical magnification of the specimen, which increases the distance between protein structures that are close to each other and which can therefore be imaged separately. The simultaneous magnification of primary human natural killer (NK) cells and A. fumigatus hyphae was established in this work using ExM. Reorganization of cytoskeletal components of interacting NK cells was demonstrated here, by expansion of the immunological synapse (IS), formed between NK cells and A. fumigatus. In addition, reorganization of the microtubule-organizing center (MTOC) towards fungal hyphae and an accumulation of actin at the IS has been observed. Furthermore, ExM has been used to visualize lytic granules of NK cells after degranulation. After magnification of the specimen, lysosome associated protein 1 (LAMP1) was shown to surround perforin. In absence of the plasma membrane-exposed degranulation marker LAMP1, a "ring-shaped" structure was often observed for fluorescently labeled perforin. Volume calculation of lytic granules demonstrated the benefit of ExM. Compared to pre-expansion images, analyses of post-expansion images showed two volume distributions for degranulated and non-degranulated NK cells. In addition, this work emphasizes the importance of determining the expansion factor for a structure in each species, as variations of expansion factors have been observed. This factor, as well as possible sample distortions should be considered, when ExM is used in order to analyze the interaction between two species. A second focus of this work is the visualization of a chimeric antigen receptor (CAR), targeting an epitope on the cell wall of A. fumigatus. Structured illumination microscopy (SIM) revealed that the CAR is part of the immunological synapse of primary human CAR T cells and CAR-NK-92 cells. At the interaction site, an accumulation of the CAR was observed, as well as the presence of perforin. CAR accumulation at fungal hyphae was further demonstrated by automated live cell imaging of interacting CAR-NK-92 cells, expressing a fluorescent fusion protein. Additionally, the use of direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) gave first insights in CAR expression levels on the basal membrane of CAR-NK-92 cells, with single molecule sensitivity. CAR cluster analyses displayed a heterogeneous CAR density on the basal membrane of transfected NK 92 cells. In summary, this work provides insights into the application of ExM for studying the interaction of primary human NK cells and A. fumigatus for the first time. Furthermore, this thesis presents first insights regarding the characterization of an A. fumigatus-targeting CAR, by applying super-resolution fluorescence microscopy, like SIM and dSTORM.},
  subject      = {Mikroskopie},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Stuehler2010,
  author    = {St{\"u}hler, Claudia},
  title     = {Strategies to prevent graft-versus-host disease and augment anti-fungal immunity in allogeneic hematopoietic stem cell transplant recipients},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51957},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is often the only effective treatment for patients with hematological malignancies, but its curative potential is often limited by the development of acute or chronic graft-versus-host disease (GvHD). Although extensive immunosuppressive therapy is highly efficient in the prevention or treatment of GvHD, it greatly increases the risk for life-threatening opportunistic fungal or viral infections and the recurrence of malignant disease. The possibility to selectively deplete alloreactive T cells from donor grafts prior or after transplantation would greatly diminish the need for immunosuppressive therapy in the transplant recipient and thereby greatly improve its clinical outcome. The molecular chaperone heat shock protein of 90 kDa (Hsp90) has been previously shown to stabilize many signal transduction proteins involved in T lymphocyte activation and proliferation and is furthermore able to exert anti-apoptotic effects in different cell types. The aim of this study was therefore to investigate the possibility to selectively target activated, proliferating T cells in lymphocyte populations by inhibition of Hsp90, without compromising viability and function of non-reactive T cell populations including pathogen-specific T lymphocytes. It could be shown in this work, that activated T cells are indeed more prone to apoptotic cell death in the presence of Hsp90 inhibitors than resting cells and that treatment of mixed lymphocyte cultures with such inhibitors eliminates the proliferation of alloreactive cells. In contrast, T cells remaining in a resting state during inhibitor treatment remain viable and also display functional virus-specific responses after inhibitor removal. These data suggest, that Hsp90 could represent a novel target for selective depletion of alloreactive T cells and that application of Hsp90 inhibitors could be a potential approach to prevent or treat GvHD without impairing pathogen-specific T cell immunity. In the second part of this work, the immune responses to strictly defined antigens of the opportunistic pathogenic fungus Aspergillus fumigatus were characterized. Opportunistic fungal infections are highly prevalent in immunocompromized and immunosuppressed individuals, especially in HSCT recipients suffering from GvDH. Although antifungal treatment is permanently improved, invasive fungal infections are still often fatal. In healthy individuals clinical disease is rare, because innate and adaptive immunity act in conjunction to protect the host. Therefore one possible strategy to prevent and treat life-threatening fungal infections in immunocompromized patients is to improve host resistance by augmenting the antifungal functions of the immune system, for example by vaccination or adoptive transfer of antigen-specific T cells. Based on previous findings, the objective of this dissertation was to identify and characterize distinct immunogenic A. fumigatus antigens that could be used for clinical application like vaccination or ex vivo generation of antigen-specific T cells and to characterize the interaction of this antigen-specific lymphocytes with cells of the innate immune system. First, memory T cell responses to different recombinant A. fumigatus proteins in healthy individuals were evaluated. The majority of tested donors displayed stable CD4+ TH1 responses to the Crf1 protein, whereas responses to the other antigens tested could only be detected in a limited number of donors, qualifying Crf1 as potential candidate antigen for clinical use. It was also possible to identify an immunodominant MHC class II DRB1*04-restricted epitope of Crf1 and to generate T cell clones specific for this epitope. This Crf1-specific T cell clones could be specifically activated by dendritic cells fed with synthetic peptide, recombinant protein or germinating A. fumigatus conidia or outgrown hyphae. Interestingly, these A. fumigatus-specific T cell clones also responded to stimulation with Candida albicans, which likewise causes opportunistic infections in immunocompromized patients and encodes for a glucosyltransferase similar to A. fumigatus Crf1. It was also possible to show that supernatant harvested from activated Crf1-specific T cell cultures was able to significantly increase fungal killing by monocytes. These data indicate that the specified FHT epitope of the A. fumigatus protein Crf1 could be potentially used as antigen for vaccination protocols or for the generation of Aspergillus-specific effector T cells for adoptive transfer.},
  subject      = {Transplantat-Wirt-Reaktion},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Semmlinger2015,
  author    = {Semmlinger, Anna},
  title     = {Der Einfluss von Hyperthermie auf die Interaktion humaner dendritischer Zellen mit Aspergillus fumigatus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-127481},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Der Schimmelpilz Aspergillus (A.) fumigatus stellt den h{\"a}ufigsten Erreger der invasiven Aspergillose (IA) dar, die vor allem bei immunsupprimierten Patienten auftritt. Unter den unspezifischen klinischen Symptomen dieser Erkrankung ist Fieber das h{\"a}ufigste. Dennoch wurden physiologische Aspekte wie eine erh{\"o}hte K{\"o}rpertemperatur in Arbei-ten zur Interaktion menschlicher Immunzellen mit A. fumigatus bisher nicht ber{\"u}ck-sichtigt. Zahlreiche Studien konnten den Einfluss einer erh{\"o}hten Temperatur auf den Verlauf von Infektionserkrankungen in vivo sowie auf die Funktionen verschiedener Immunzellen - einschließlich dendritischer Zellen (DCs) - in vitro zeigen. DCs spielen eine wichtige Rolle in der Immunabwehr gegen{\"u}ber A. fumigatus, ihre besondere Be-deutung liegt in der Verkn{\"u}pfung der angeborenen mit der erworben Immunantwort. Ziel dieser Arbeit war die in vitro Analyse des Einflusses einer erh{\"o}hten Temperatur auf die Immunantwort humaner DCs gegen{\"u}ber A. fumigatus. Dazu wurden DCs mit A. fumigatus oder Zymosan, einem ß-1,3-Glucan, bei Normo- (37 °C) und Hyperthermie (40 °C) f{\"u}r bis zu 24 h inkubiert und spezifische DC-Funktionen charakterisiert. Hierbei tolerierten DCs die Inkubation und Stimulation unter Hyperthermie ohne signifikanten Viabilit{\"a}tsverlust. Die Zytokinexpression und -sekretion durch A. fumigatus-Stimulation wurde durch Hyperthermie nicht signifikant ver{\"a}ndert. Die F{\"a}higkeit zur Aufnahme von A. fumigatus-Konidien wurde durch eine kurzzeitige (1 h) Hyperthermie nicht beein-flusst, l{\"a}ngerfristige (24 h) Hyperthermie reduzierte diese F{\"a}higkeit jedoch signifikant. Ebenso bestand unter Hyperthermie eine verst{\"a}rkte Expression von CD86 und HLA-DR auf unstimulierten DCs sowie von CD80, CD86 und HLA-DR auf stimulierten DCs. Die reduzierte Aufnahmekapazit{\"a}t f{\"u}r A. fumigatus-Konidien und die verst{\"a}rkte Expression der kostimulatorischen Molek{\"u}le unter Hyperthermie zeigten, dass Hyper-thermie in vitro einen reiferen Ph{\"a}notyp unstimulierter DCs bewirkt sowie die DC-Reifung durch A. fumigatus-Stimulation verst{\"a}rken kann. Diese reiferen DCs k{\"o}nnten zu einer verbesserten T-Zell-Aktivierung und Abwehr von A. fumigatus und zu einem verbesserten Outcome der IA beitragen. Außerdem k{\"o}nnte Hyperthermie als Adjuvans zur in vitro Generierung A. fumigatus-spezifischer DCs eingesetzt werden.},
  subject      = {Aspergillose},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schedler2018,
  author    = {Schedler, Anette},
  title     = {Analyse von Wirt-Pathogen-Interaktionen zur Untersuchung des Einflusses von \(Aspergillus\) \(fumigatus\) auf die H{\"a}mostase},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-152512},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {Als H{\"a}mostase bezeichnet man die Gesamtheit der Reaktionen, die zu einer effektiven Blutgerinnung beitragen. Sie l{\"a}sst sich in die prim{\"a}re (thrombozyt{\"a}re) H{\"a}mostase, in die sekund{\"a}re (plasmatische) H{\"a}mostase und in das Fibrinolysesystem einteilen. Thrombozyten, oder auch Pl{\"a}ttchen genannt, spielen hierbei eine entscheidende Rolle. Sie binden an die durch eine Verletzung einer Blutgef{\"a}ßwand freigelegten Faktoren, werden so aktiviert und aggregieren mit weiteren Thrombozyten, wodurch ein Thrombus entsteht, der die Verletzung verschließt. Zudem besitzen Thrombozyten Immunokompetenz und k{\"o}nnen mit anderen Immunzellen interagieren, {\"u}ber Rezeptoren Pathogene erkennen und sie direkt angreifen. Einer dieser Pathogene ist der opportunistische Pilz Aspergillus fumigatus. Dieser bildet im Verlauf seines Lebenszyklus 2,5 -3 µm kleine Konidien aus, die mit dem Wind verbreitet werden und bis tief in die Alveolen der menschlichen Lunge eingeatmet werden k{\"o}nnen. W{\"a}hrend diese Konidien im gesunden Menschen durch das Immunsystem und andere Abwehrmechanismen eliminiert werden, k{\"o}nnen sie im immunsupprimierten Patienten, z. B. bei Patienten nach einer h{\"a}matopoietischen Stammzelltransplantation, auskeimen und verschiedene Krankheiten, sogenannte Aspergillosen, ausl{\"o}sen mit der Invasiven Aspergillose (IA) als schwerwiegendste Form. Diese ist assoziiert mit Gewebezerst{\"o}rungen, Blutungen und Thrombenbildung am Ort der Infektion. Diese Komplikationen k{\"o}nnten auf einer {\"u}berh{\"o}hten Immunantwort des Wirtes, auf dem mechanischen Eindringen des Pilzes in das Gewebe und die Blutgef{\"a}ße oder auf einer {\"A}nderung der lokalen H{\"a}mostase durch sezernierte hydrolytische Enzyme (Proteasen) oder Sekund{\"a}rmetabolite von A. fumigatus beruhen. Um diese {\"A}nderung der H{\"a}mostase im Verlauf einer IA zu analysieren, wurde der Einfluss von Morphologien (Konidien, geschwollene Konidien, Keimschl{\"a}uche und Hyphen), deren {\"U}berst{\"a}nde, sowie von proteolytisch aktivem {\"U}berstand und von verschiedenen Sekund{\"a}rmetaboliten von A. fumigatus auf die sekund{\"a}re H{\"a}mostase und die Aggregation und Aktivit{\"a}t von humanen Thrombozyten untersucht. Bei der Analyse der sekund{\"a}ren H{\"a}mostase konnte f{\"u}r keinen dieser eingesetzten Effektoren ein Einfluss festgestellt werden. Bei der Analyse der prim{\"a}ren H{\"a}mostase und dem Einsatz von Morphologien und ihrer {\"U}berst{\"a}nde konnte f{\"u}r Hyphen und ihren ankonzentrierten {\"U}berstand eine aggregationssteigernde Wirkung auf Thrombozyten beobachtet werden, die m{\"o}glicherweise auf Bestandteile der Zellwand von A. fumigatus, wie z. B. β-Galactosaminogalactan (GAG) zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Proteolytisch aktiver {\"U}berstand f{\"u}hrte zu einer Aktivierung der Thrombozyten, die zum Teil auf die PrtT-abh{\"a}ngige proteolytische Spaltung und damit die Aktivierung der Thrombinrezeptoren PAR1 und/oder PAR4 auf der Thrombozytenoberfl{\"a}che, zum Teil aber auch auf GAG zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sein kann. Von den hier verwendeten Mykotoxinen Gliotoxin, Fumagillin, Citrinin, Verruculogen und Deoxynivalenol konnte f{\"u}r Gliotoxin ein negativer Einfluss auf die Thrombozytenaktivit{\"a}t nachgewiesen werden. Dieses Toxin inhibierte die Aggregation und die Aktivit{\"a}t der Thrombozyten, m{\"o}glicherweise durch die Bildung von Disulfid-Br{\"u}ckenbindungen oder auch durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies. Zudem wurde im Verlauf dieser Arbeit eine direkte Interaktion von Gliotoxin mit den ADP-Rezeptoren P2Y1 und P2Y12 sowie mit dem Integrin αIIbβ3 postuliert, die so zwar nicht best{\"a}tigt, aber auch nicht vollst{\"a}ndig wiederlegt werden konnte. Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich zwei Wirkungen von A. fumigatus auf humane Thrombozyten: zum einen eine Aktivierung oder auch verst{\"a}rkte Aggregation durch sezernierte Proteasen oder Zellwandbestandteile, zum anderen eine Hemmung durch Gliotoxin, was die bei einer IA beobachtete Thrombenbildung sowie die Blutungen erkl{\"a}ren kann. Die Interaktion der aktivierten Thrombozyten mit den Zellen des Immunsystems sowie die zytotoxischen Eigenschaften von Gliotoxin k{\"o}nnten zudem f{\"u}r die beobachtete Gewebezerst{\"o}rung verantwortlich sein. Dennoch ist weitere Forschung in diesem Gebiet unabdingbar, um die pathophysiologische {\"A}nderung der lokalen H{\"a}mostase durch A. fumigatus und seine Wirkung auf humane Thrombozyten besser zu verstehen und so eine schnellere Erkennung und Behandlung von Aspergillosen zu erm{\"o}glichen.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Rauer2020,
  author    = {Rauer, Andreas},
  title     = {Etablierung und Evaluierung einer Extraktionskontrolle f{\"u}r den Nachweis von Aspergillus fumigatus-DNA aus Humanserum},
  doi       = {10.25972/OPUS-19456},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-194565},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {Die invasive Aspergillose spielt in der modernen Medizin und speziell bei malignen Bluterkrankungen, die mit einer Immunsuppression des Patienten einhergehen, eine entscheidende Rolle. Die bisherigen Methoden erlauben eine Diagnose meist erst sehr sp{\"a}t oder liefern oft falsch-negative Ergebnisse. Bis zum heutigen Tag ist es nicht gelungen, ein standardisiertes Verfahren zur PCR-Diagnostik aus Blutproben zu etablieren. In den der Arbeit zugrunde liegenden Versuchsreihen wurden verschiedene Ans{\"a}tze an Mastermix im Monoplex- und Duplexformat zur Aspergillus fumigatus-Detektion in Humanserum getestet und optimiert. Es wurde versucht, eine Extraktionskontrolle mit Bacillus subtilis in die Probe zu integrieren, um so die Aussagekraft der extrahierten Probe zu evaluieren. Dabei zeigte sich ein Elutionsvolumen von 35 µl am effizientesten. Der Cq-Wert war bei 35 µl Eluationsvolumen ca. einen Zyklus niedriger als bei 65 µl und 1,5-2 Zyklen niedriger als bei 100 µl. Bei den Versuchen im Monoplexformat konnte gezeigt werden, dass bei der Extraktion viel DNA in den Filtern zur{\"u}ckbleibt. Es wurden aus einer Serumextraktion zwei Eluate mit je 35 µl Elutionsvolumen erstellt und getestet. Hier zeigten sich in Abh{\"a}ngigkeit von der Menge der DNA teils hohe Cq-Werte im zweiten Eluat, bei einigen Proben aber sogar ein niedrigerer Cq-Wert im zweiten Eluat. Dies war sowohl f{\"u}r Aspergillus fumigatus als auch f{\"u}r Bacillus subtilis zu beobachten. Die Gr{\"u}nde f{\"u}r dieses Ergebnis k{\"o}nnten die l{\"a}ngere Inkubationszeit und die zweite Zentrifugation des zweiten Eluats sein. Die Extraktionseffizienz hatte bei der Aufbereitung mit dem QIAamp Ultrasens Kit (Qiagen) einen Faktor von im Mittel 2,7 bei Aspergillus fumigatus und von 4,7 bei Bacillus subtilis beim GEX-Mastermix. Beim Sso-Mastermix lag der Faktor f{\"u}r Aspergillus fumigatus im Mittel bei 4,4 und der f{\"u}r Bacillus subtilis bei 5,4. Bei den Versuchen im Duplexformat wurden sowohl Aspergillus fumigatus als auch Bacillus subtilis in unterschiedlichen Konzentrationen in dieselbe Probe eingebracht. Hier zeigte sich, dass im Sso-Mastermix die Menge an Bacillus subtilis-DNA und an Aspergillus fumigatus-DNA einen deutlichen Einfluss auf die jeweiligen Cq-Werte und die Sensitivit{\"a}t haben. Zus{\"a}tzlich zeigte der Sso-Mastermix immer ein positives Ergebnis f{\"u}r Bacillus subtilis zwischen 36-40 Zyklen. Beim GEX-Mastermix hatte die Menge an Bacillus subtilis-DNA ebenfalls einen deutlichen Einfluss auf die Cq-Werte und die Sensitivit{\"a}t f{\"u}r Aspergillus fumigatus. Die Cq-Werte f{\"u}r Aspergillus fumigatus erh{\"o}hten sich bei 10 Kopien mit 104 Kopien Bacillus subtilis um 6,1 Zyklen und bei 105 Kopien Bacillus subtilis um 10,6 Zyklen im GEX-Mastermix. Ein Einfluss auf die Cq-Werte f{\"u}r Bacillus subtilis konnte bei den Versuchen im Duplexformat mit GEX-Mastermix nicht verzeichnet werden. Zusammenfassend l{\"a}sst sich sagen, dass eine Extraktionskontrolle mit Bacillus subtilis im Sso-Mastermix auf Grund der sich gegenseitig beeinflussenden Sonden und Primer sowie der DNA-Mengen an Aspergillus fumigatus und Bacillus subtilis nicht m{\"o}glich ist, da keine Aussage {\"u}ber den Verlauf und die Effizienz der Extraktion getroffen werden k{\"o}nnte. Bei den Versuchen mit GEX-Mastermix konnte gezeigt werden, dass die Menge an eingegebener Bacillus subtilis-DNA einen entscheidenden Einfluss auf die Sensitivit{\"a}t f{\"u}r die Cq-Werte von Aspergillus fumigatus in niedriger Konzentration hat. Einen Einfluss auf die Cq-Werte f{\"u}r Bacillus subtilis wurde nicht detektiert. Eine Extraktionskontrolle mittels Bacillus subtilis w{\"a}re denkbar, wenn die Menge eingegebener Bacillus subtilis-DNA so reduziert werden k{\"o}nnte, dass stabile Cq-Werte f{\"u}r Bacillus subtilis erreicht w{\"u}rden, die dann aber keinen oder nur einen sehr geringen Einfluss auf die Sensitivit{\"a}t f{\"u}r Aspergillus fumigatus h{\"a}tten.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Ok2011,
  author    = {Ok, Michael},
  title     = {Analyse der Interaktion und die gezielte Modifikation von angeborener Immunantwort gegen{\"u}ber Aspergillus fumigatus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-56866},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Die invasive Aspergillose stellt eine ersthafte Erkrankung sowie auch eine signifikante Ursache von Morbidit{\"a}t und Mortalit{\"a}t bei verschiedenen Patientengruppen dar. Dabei tritt sie haupts{\"a}chlich durch den opportunistischen Pathogen Aspergillus fumigatus hervorgerufen mit einer Inzidenz von 4\% bis 15\% vorwiegend bei immunsupprimierten Patienten nach allogenen h{\"a}matopoetischer Stammzelltransplantationen (HSCT) oder Organtransplantationen auf und f{\"u}hrt bei 40\% bis 90\% der F{\"a}lle zum Tod des Patienten. Die Behandlung dieser Hochrisikogruppe erfolgt bestenfalls mit Antimykotika prophylaktisch, denn eine schnelle sowie auch verl{\"a}ssliche Diagnose von invasiver Aspergillose l{\"a}ßt sich aufgrund der hohen zeitlichen Latenz des Pilzes und dem Defizit an Sensitivit{\"a}t bzw. Spezifit{\"a}t in vielen F{\"a}llen nicht ermitteln. Zus{\"a}tzlich steigt die Zahl der Resistenzen von Aspergillus-St{\"a}mmen gegen die verschiedenen Antimykotika stetig an, so dass klinische und {\"o}konomische Nebenwirkungen unvermeidbar sind. Als Alternative zur konventionellen Behandlung mit Azolen stellt eine Immuntherapie mittels Antigen-behandelten dendritischen Zellen (DCs) dar, welche durch Pr{\"a}sentation von Aspergillus fumigatus-Antigenepitopen eine spezifische ex vivo T-Zellenexpansion von allogenen CD8+CD3+ T-Zellen bewirken kann und damit ein schonenderes Mittel f{\"u}r den Patienten ist. Dazu wurden sieben verschiedene rekombinante Proteine aus A. fumigatus in dieser Arbeit charakterisiert und deren Potential ermittelt, bei DCs eine pro-inflammatische Immunantwort auszul{\"o}sen. Es stellte sich heraus, dass sowohl die Ribonuklease Mitogillin (Aspf1) als auch die myceliale Katalase Cat1 in der Lage waren, den nukle{\"a}ren Faktor kappa B (NFκB) zu aktivieren und eine Translokation der Untereinheit p65 in den Nukleus zu induzieren, woraufhin Gene von pro-inflammatorischen Zytokine und Chemokine sowie auch von Aktivierungs- und Reifungsmarker der DCs exprimiert wurden. Im Gegensatz zum Aspf1, war es beim Cat1 zus{\"a}tzlich auch m{\"o}glich gewesen eine Verifizierung auf Proteinebene f{\"u}r segregierte Zytokine und Chemokine bzw. Oberfl{\"a}chenmarker zu erhalten. Dar{\"u}ber hinaus konnte festgestellt werden, dass die Zytotoxizit{\"a}t von Cat1 entsprechend der unbehandelten Zellen gewesen ist und dass es den Cat1-behandelten moDCs gelang nach der Aufnahme des Antigens und dessen Prozessierung durch die darauffolgende Pr{\"a}sentation der Proteinepitope {\"u}ber den MHC II Komplex eine ex vivo-Aktivierung von autologen zytotoxischen T-Zellen zu erreichen. Damit ist nun ein potentieller Kandidat f{\"u}r eine auf Immuneffektorzellen basierte Immuntherapie gegen invasive Aspergillose f{\"u}r immungeschw{\"a}chte Patienten gefunden. Erg{\"a}nzt wurde diese Arbeit mit der experimentellen Untersuchung von H{\"a}mostase w{\"a}hrend einer invasiven Aspergillose, da geh{\"a}uft pathologische Beobachtungen von lokalen Einblutungen bei Patienten mit pulmonaler Aspergillose verzeichnet wurden. Es stellte sich heraus, dass die durch Collagen induzierte Aggregation sich durch aktive Pilzmorphologien beeintr{\"a}chtigen l{\"a}ßt, wohingegen die untersuchten Gerinnungsparameter nicht betroffen gewesen sind. Dies verdeutlicht neben der bereits bekannten Bedeutung der Thrombozyten als antimikrobielle Komponente im Blut nun auch ihrer Empfindlichkeit gegen{\"u}ber sezernierten oder Zellwand-gebundenen Aspergillus fumigatus-Faktoren w{\"a}hrend der invasiven Aspergillose.},
  subject      = {Immunstimulation},
  language  = {de}
}