@phdthesis{Zoran2022,
  author    = {Zoran, Tamara},
  title     = {Multilevel analysis of the human immune response to \(Aspergillus\) \(fumigatus\) infection: Characteristic molecular signatures and individual risk factors},
  doi       = {10.25972/OPUS-29851},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-298512},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2022},
  abstract  = {Although the field of fungal infections advanced tremendously, diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis (IPA) in immunocompromised patients continues to be a challenge. Since IPA is a multifactorial disease, investigation from different aspects may provide new insights, helpful for improving IPA diagnosis. This work aimed to characterize the human immune response to Aspergillus fumigatus in a multilevel manner to identify characteristic molecular candidates and risk factors indicating IPA, which may in the future support already established diagnostic assays. We combined in vitro studies using myeloid cells infected with A. fumigatus and longitudinal case-control studies investigating patients post allogeneic stem cell transplantation (alloSCT) suffering from IPA and their match controls. Characteristic miRNA and mRNA signatures indicating A. fumigatus-infected monocyte-derived dendritic cells (moDCs) demonstrated the potential to differentiate between A. fumigatus and Escherichia coli infection. Transcriptome and protein profiling of alloSCT patients suffering from IPA and their matched controls revealed a distinctive IPA signature consisting of MMP1 induction and LGAL2 repression in combination with elevated IL-8 and caspase-3 levels. Both, in vitro and case-control studies, suggested cytokines, matrix-metallopeptidases and galectins are important in the immune response to A. fumigatus. Identified IPA characteristic molecular candidates are involved in numerous processes, thus a combination of these in a distinctive signature may increase the specificity. Finally, low monocyte counts, severe GvHD of the gut (grade ≥ 2) and etanercept administration were significantly associated with IPA diagnosis post alloSCT. Etanercept in monocyte-derived macrophages (MDM) infected with A. fumigatus downregulates genes involved in the NF-κB and TNF-α pathway and affects the secretion of CXCL10. Taken together, identified characteristic molecular signatures and risk factors indicating IPA may in the future in combination with established fungal biomarkers overcome current diagnostic challenges and help to establish tailored antifungal therapy. Therefore, further multicentre studies are encouraged to evaluate reported findings.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Wilhelm2010,
  author    = {Wilhelm, Daniela Elisabeth},
  title     = {Die Rolle von GSK3 im Rahmen der angeborenen Immunabwehr gegen Aspergillus fumigatus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71674},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Aspergillus fumigatus ist ein ubiquit{\"a}r vorkommender Schimmelpilz, dessen Sporen vom Menschen t{\"a}glich zu hunderten mit der Atemluft aufgenommen werden. Aufgrund ihrer geringen Gr{\"o}ße gelangen die Konidien leicht bis in die Alveolen der Lunge, wo sie normalerweise sofort vom angeborenen Immunsystem beseitigt werden. Immunsupprimierte Menschen leiden an einer qualitativen oder quantitativen Einschr{\"a}nkung dieses Teiles der Immunabwehr, weshalb die Inokulation der Sporen bei ihnen zur Ausl{\"o}sung der lebensgef{\"a}hrlichen Invasiven Aspergillose f{\"u}hren kann, deren Mortalit{\"a}t in der Hochrisikogruppe der Patienten nach h{\"a}matopoetischer Stammzelltransplantation {\"u}ber 90\% betr{\"a}gt. Bei diesen Patienten gewinnt die adaptive Immunabwehr an Bedeutung. Dendritische Zellen geh{\"o}ren dem angeborenen Immunsystem an und besitzen einzigartige F{\"a}higkeiten zur Aktivierung und Steuerung der erworbenen Immunabwehr. Durch die Aktivierung naiver T-Zelen und die Sekretion bestimmter immunmodulatorischer Zytokine bestimmen sie die Art der konsekutiv asugel{\"o}sten T-Helferzellantwort. Lediglich eine T-Helfer 1-Zellantwort wird hierbei mit einer erh{\"o}hten Resistenz gegen{\"u}ber der invasiven Aspergillose in Verbindung gebracht. Die Zytokinsekretion der Dendritischen Zellen wird durch intrazellul{\"a}re Signalkaskaden reguliert, welche sich an ihre PRRs anschließen. F{\"u}r die Erkennung des bakteriellen LPS durch den TLR wurde die Regulation der immunmodulatorischen Zytokine durch die Serin-Threonin-Kinase GSK3 festgestellt. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob es bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus durch humane dendritische Zellen ebenfalls einen Zusammenhang mit GSK3 und der Sekretion immunmodulatorischer Zytokine gibt. Daf{\"u}r wurden aus humanen Monozyten generierte dendritische Zellen mit rekombinanten Antigenen von Aspergillus fumigatus sowie verschiedenen Morphologien stiumuliert und teilweise mit dem GSK3-Inhibitor LiCl gehemmt. Anschließend wurde die Expression bestimmter immunmodulatorischer Zytokine und der GSK3 mittels quantitativer real-time RT-PCR bestimmt. Hierbei konnte f{\"u}r eines der getesteten Antigene, Aspf 1, ein deutlicher Einfluss auf die GSK3-Expression der Zellen festgestellt werden. Ein paralleler Anstieg der Expression proinflammatorischer Zytokine erh{\"a}rtete die Annahme einer immunregulierenden Rolle der GSK3 bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus. Einen deutlicheren Hinweis auf den Zusammenhang zwischen der Aktivit{\"a}t der GSK3 und der Expression proinflammatorischer Zytokine erbrachte die Inhibierung mittels LiCl. Die mit Aspergillus fumigatus stimulierten Zellen reagierten hierauf im Vergleich zu den nicht-inhibierten Zellen mit einer Reduktion der IL12p35-Expression um 86,1\% sowie mit einer Reduktion der IL23-Expression um 49,5\%. Der letzte Teil der Experimente sollte ausgehend von der Vorstellung, dass verschiedene Aspergillus-Morphologien von unterschiedlichen Rezeptoren erkannt werden quantitative Unterschiede der GSK3-Beteiligung bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus durch dendritische Zellen zeigen. Obwohl alle Morphologien des Schimmelpilzes einen Einfluss auf die GSK3-Expression der Zellen zeigten, konnten hierbei keine einheitlichen quantitativen Unterschiede festgestellt werden. Zusammengefasst konnte in der vorliegenden Arbeit die Beteiligung von GSK3 bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus durch humane dendritische Zellen gezeigt werden. Außerdem konnten Hinweise auf eine immunregulierende Rolle der GSK3 bei der Abwehr des fakultativ pathogenen Schimmelpilzes erbracht werden, wobei die genaue Einbindung der Serin-Threonin-Kinase in dieser Situation noch unklar ist und weitere Experimente erforderlich macht.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Weiss2021,
  author    = {Weiß, Esther},
  title     = {Host-pathogen interactions of natural killer cells and Aspergillus fumigatus: Relevance of immune cell cross-talk and fungal recognition receptors},
  doi       = {10.25972/OPUS-20607},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-206077},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {The human pathogen Aspergillus (A.) fumigatus is a fungal mold that can cause severe infections in immunocompromised hosts. Pathogen recognition and immune cell cross-talk are essential for clearing fungal infections efficiently. Immune cell interactions in particular may enhance individual cell activation and cytotoxicity towards invading pathogens. This study analyzed the reciprocal cell activation of natural killer (NK) cells and monocyte-derived dendritic cells (moDCs) after stimulation with A. fumigatus cell wall fractions and whole-cell lysates. Furthermore, the impact of the on moDCs expressed fungal receptors Dectin-1 and TLR-2 on NK cell activation was analyzed. Stimulation of moDCs with ligands for Dectin-1 and TLR-2 and transfer of soluble factors on autologous NK cells showed that moDCs could induce NK cell activation solely by secreting factors. In summary, both cell types could induce reciprocal cell activation if the stimulated cell type recognized fungal morphologies and ligands. However, moDCs displayed a broader set of A. fumigatus receptors and, therefore, could induce NK cell activation when those were not activated by the stimulus directly. Consequently, new fungal receptors should be identified on NK cells. The NK cell characterization marker CD56 was reduced detected in flow cytometry after fungal co-culture. Notably, this decreased detection was not associated with NK cell apoptosis, protein degradation, internalization, or secretion of CD56 molecules. CD56 was shown to tightly attach to hyphal structures, followed by its concentration at the NK-A. fumigatus interaction site. Actin polymerization was necessary for CD56 relocalization, as pre-treatment of NK cells with actin-inhibitory reagents abolished CD56 binding to the fungus. Blocking of CD56 suppressed fungal mediated NK cell activation and secretion of the immune-recruiting chemokines MIP-1α, MIP-1β, and RANTES, concluding that CD56 is functionally involved in fungal recognition by NK cells. CD56 binding to fungal hyphae was inhibited in NK cells obtained from patients during immune-suppressing therapy after allogeneic stem cell transplantation (alloSCT). Additionally, reduced binding of CD56 correlated with decreased actin polymerization of reconstituting NK cells challenged with the fungus. The immune-suppressing therapy with corticosteroids negatively influenced the secretion of MIP-1α, MIP-1β, and RANTES in NK cells after fungal stimulation ex vivo. Similar results were obtained when NK cells from healthy donors were treated with corticosteroids prior to fungal co-culture. Thus, corticosteroids were identified to have detrimental effects on NK cell function during infection with A. fumigatus.},
  subject      = {Nat{\"u}rliche Killerzelle},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Wallstein2021,
  author    = {Wallstein, Marion Alice},
  title     = {Einfluss von Hypoxie auf die Interaktion von moDCs und T-Zellen mit \(Aspergillus\) \(fumigatus\)},
  doi       = {10.25972/OPUS-23854},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-238543},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Die invasive Aspergillose ist eine gef{\"u}rchtete Erkrankung besonderes bei immunsupprimierten Patienten, die eine Stammzelltransplanation erhalten sollen. Diese Patienten leiden in der Regel an einer h{\"a}matologischen Grunderkrankung wie einer Leuk{\"a}mie oder einem Lymphom. Das Prinzip der Stammzelltransplanatation ist es, das kranke Knochenmark mittels Chemotherapie und Bestrahlung zu zerst{\"o}ren und es dann mit gesunden Stammzellen zu ersetzen. W{\"a}hrend dieser Konditionierung ist der Patient also ohne eigene Abwehrzellen. In dieser Phase gestaltet sich die rechtzeitige Diagnose h{\"a}ufig als schwierig, weil die konventionellen Diagnosemethoden von der Anwesenheit von neutrophilen Granulozyten abh{\"a}ngen. H{\"a}ufig ist die Infektion bei der Entwicklung von unspezifischen Symptomen wie Fieber oder Dyspnoe schon weit fortgeschritten. Hat sich der Pilz in der Lunge ausgebreitet, so kommt es zur Ausbildung einer Hypoxie und im Verlauf auch zu einer Hypox{\"a}mie aufgrund einer Diffusionsst{\"o}rung in den entz{\"u}ndeten Lungenabschnitten. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von Hypoxie auf die Interaktion zwischen dendritischen Zellen und T-Zellen besser zu verstehen. Dendritische Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Immunabwehr von Pilzinfektion und bilden das Verbindungsst{\"u}ck zwischen angeborenen und erworbenen Immunsystem. T-Zellen {\"u}bernehmen ebenfalls wichtige Aufgaben bei der Abwehr von Pilzinfektionen, indem sie Interferon gamma produzieren. Zudem sollte die Funktion verschiedener Botenstoffe in Signalkaskaden n{\"a}her untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion von dendritischen Zellen mit Aspergillus fumigatus unter Hypoxie, die dendritischen Zellen anschließend unter Normoxie dazu bef{\"a}higt, eine verst{\"a}rkte adaptive Immunantwort hervorzurufen. Hypoxie k{\"o}nnte somit als zus{\"a}tzlicher Faktor verwendet werden, um dendritische Zellen als effektive Adjuvantien in einer Impfung gegen Aspergillus fumigatus zu verwenden. Urs{\"a}chlich f{\"u}r die verst{\"a}rkte F{\"a}higkeit naive T-Zellen zu aktivieren, scheint zum einen die Apoptose und zum anderen eine verst{\"a}rkte Produktion von Interleukin 12p70 zu sein.},
  subject      = {Dendritische Zelle},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Trinks2024,
  author    = {Trinks, Nora Isabel},
  title     = {Super-resolution fluorescence microscopic visualization and analysis of interactions between human immune cells and \(Aspergillus\) \(fumigatus\)},
  doi       = {10.25972/OPUS-26640},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-266407},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2024},
  abstract  = {The mold Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) is known as human pathogen and can cause life-threatening infections in humans with a weakened immune system. This is a known complication in patients receiving glucocorticoids, e.g. after hematopoietic stem cell transplantation or solid organ transplantation. Although research in the field of immune cell/fungus interaction has discovered key strategies how immune cells fight against infectious fungi, our knowledge is still incomplete. In order to develop effective treatment options against fungal infections, a detailed understanding of their interactions is crucial. Thus, visualization of immune cell and fungus is an excellent approach to gain further knowledge. For a detailed view of such interaction processes, a high optical resolution on nanometer scale is required. There is a variety of super resolution microscopy techniques, enabling fluorescence imaging beyond the diffraction limit. This work combines the use of three complementary super resolution microscopy techniques, in order to study immune cell/fungus interaction from different points of view. Aim of this work is the introduction of the recently invented imaging technique named expansion microscopy (ExM) for the study of immune cell/fungus interactions. The core aspect of this method is the physical magnification of the specimen, which increases the distance between protein structures that are close to each other and which can therefore be imaged separately. The simultaneous magnification of primary human natural killer (NK) cells and A. fumigatus hyphae was established in this work using ExM. Reorganization of cytoskeletal components of interacting NK cells was demonstrated here, by expansion of the immunological synapse (IS), formed between NK cells and A. fumigatus. In addition, reorganization of the microtubule-organizing center (MTOC) towards fungal hyphae and an accumulation of actin at the IS has been observed. Furthermore, ExM has been used to visualize lytic granules of NK cells after degranulation. After magnification of the specimen, lysosome associated protein 1 (LAMP1) was shown to surround perforin. In absence of the plasma membrane-exposed degranulation marker LAMP1, a "ring-shaped" structure was often observed for fluorescently labeled perforin. Volume calculation of lytic granules demonstrated the benefit of ExM. Compared to pre-expansion images, analyses of post-expansion images showed two volume distributions for degranulated and non-degranulated NK cells. In addition, this work emphasizes the importance of determining the expansion factor for a structure in each species, as variations of expansion factors have been observed. This factor, as well as possible sample distortions should be considered, when ExM is used in order to analyze the interaction between two species. A second focus of this work is the visualization of a chimeric antigen receptor (CAR), targeting an epitope on the cell wall of A. fumigatus. Structured illumination microscopy (SIM) revealed that the CAR is part of the immunological synapse of primary human CAR T cells and CAR-NK-92 cells. At the interaction site, an accumulation of the CAR was observed, as well as the presence of perforin. CAR accumulation at fungal hyphae was further demonstrated by automated live cell imaging of interacting CAR-NK-92 cells, expressing a fluorescent fusion protein. Additionally, the use of direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) gave first insights in CAR expression levels on the basal membrane of CAR-NK-92 cells, with single molecule sensitivity. CAR cluster analyses displayed a heterogeneous CAR density on the basal membrane of transfected NK 92 cells. In summary, this work provides insights into the application of ExM for studying the interaction of primary human NK cells and A. fumigatus for the first time. Furthermore, this thesis presents first insights regarding the characterization of an A. fumigatus-targeting CAR, by applying super-resolution fluorescence microscopy, like SIM and dSTORM.},
  subject      = {Mikroskopie},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Stuehler2010,
  author    = {St{\"u}hler, Claudia},
  title     = {Strategies to prevent graft-versus-host disease and augment anti-fungal immunity in allogeneic hematopoietic stem cell transplant recipients},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51957},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is often the only effective treatment for patients with hematological malignancies, but its curative potential is often limited by the development of acute or chronic graft-versus-host disease (GvHD). Although extensive immunosuppressive therapy is highly efficient in the prevention or treatment of GvHD, it greatly increases the risk for life-threatening opportunistic fungal or viral infections and the recurrence of malignant disease. The possibility to selectively deplete alloreactive T cells from donor grafts prior or after transplantation would greatly diminish the need for immunosuppressive therapy in the transplant recipient and thereby greatly improve its clinical outcome. The molecular chaperone heat shock protein of 90 kDa (Hsp90) has been previously shown to stabilize many signal transduction proteins involved in T lymphocyte activation and proliferation and is furthermore able to exert anti-apoptotic effects in different cell types. The aim of this study was therefore to investigate the possibility to selectively target activated, proliferating T cells in lymphocyte populations by inhibition of Hsp90, without compromising viability and function of non-reactive T cell populations including pathogen-specific T lymphocytes. It could be shown in this work, that activated T cells are indeed more prone to apoptotic cell death in the presence of Hsp90 inhibitors than resting cells and that treatment of mixed lymphocyte cultures with such inhibitors eliminates the proliferation of alloreactive cells. In contrast, T cells remaining in a resting state during inhibitor treatment remain viable and also display functional virus-specific responses after inhibitor removal. These data suggest, that Hsp90 could represent a novel target for selective depletion of alloreactive T cells and that application of Hsp90 inhibitors could be a potential approach to prevent or treat GvHD without impairing pathogen-specific T cell immunity. In the second part of this work, the immune responses to strictly defined antigens of the opportunistic pathogenic fungus Aspergillus fumigatus were characterized. Opportunistic fungal infections are highly prevalent in immunocompromized and immunosuppressed individuals, especially in HSCT recipients suffering from GvDH. Although antifungal treatment is permanently improved, invasive fungal infections are still often fatal. In healthy individuals clinical disease is rare, because innate and adaptive immunity act in conjunction to protect the host. Therefore one possible strategy to prevent and treat life-threatening fungal infections in immunocompromized patients is to improve host resistance by augmenting the antifungal functions of the immune system, for example by vaccination or adoptive transfer of antigen-specific T cells. Based on previous findings, the objective of this dissertation was to identify and characterize distinct immunogenic A. fumigatus antigens that could be used for clinical application like vaccination or ex vivo generation of antigen-specific T cells and to characterize the interaction of this antigen-specific lymphocytes with cells of the innate immune system. First, memory T cell responses to different recombinant A. fumigatus proteins in healthy individuals were evaluated. The majority of tested donors displayed stable CD4+ TH1 responses to the Crf1 protein, whereas responses to the other antigens tested could only be detected in a limited number of donors, qualifying Crf1 as potential candidate antigen for clinical use. It was also possible to identify an immunodominant MHC class II DRB1*04-restricted epitope of Crf1 and to generate T cell clones specific for this epitope. This Crf1-specific T cell clones could be specifically activated by dendritic cells fed with synthetic peptide, recombinant protein or germinating A. fumigatus conidia or outgrown hyphae. Interestingly, these A. fumigatus-specific T cell clones also responded to stimulation with Candida albicans, which likewise causes opportunistic infections in immunocompromized patients and encodes for a glucosyltransferase similar to A. fumigatus Crf1. It was also possible to show that supernatant harvested from activated Crf1-specific T cell cultures was able to significantly increase fungal killing by monocytes. These data indicate that the specified FHT epitope of the A. fumigatus protein Crf1 could be potentially used as antigen for vaccination protocols or for the generation of Aspergillus-specific effector T cells for adoptive transfer.},
  subject      = {Transplantat-Wirt-Reaktion},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Semmlinger2015,
  author    = {Semmlinger, Anna},
  title     = {Der Einfluss von Hyperthermie auf die Interaktion humaner dendritischer Zellen mit Aspergillus fumigatus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-127481},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Der Schimmelpilz Aspergillus (A.) fumigatus stellt den h{\"a}ufigsten Erreger der invasiven Aspergillose (IA) dar, die vor allem bei immunsupprimierten Patienten auftritt. Unter den unspezifischen klinischen Symptomen dieser Erkrankung ist Fieber das h{\"a}ufigste. Dennoch wurden physiologische Aspekte wie eine erh{\"o}hte K{\"o}rpertemperatur in Arbei-ten zur Interaktion menschlicher Immunzellen mit A. fumigatus bisher nicht ber{\"u}ck-sichtigt. Zahlreiche Studien konnten den Einfluss einer erh{\"o}hten Temperatur auf den Verlauf von Infektionserkrankungen in vivo sowie auf die Funktionen verschiedener Immunzellen - einschließlich dendritischer Zellen (DCs) - in vitro zeigen. DCs spielen eine wichtige Rolle in der Immunabwehr gegen{\"u}ber A. fumigatus, ihre besondere Be-deutung liegt in der Verkn{\"u}pfung der angeborenen mit der erworben Immunantwort. Ziel dieser Arbeit war die in vitro Analyse des Einflusses einer erh{\"o}hten Temperatur auf die Immunantwort humaner DCs gegen{\"u}ber A. fumigatus. Dazu wurden DCs mit A. fumigatus oder Zymosan, einem ß-1,3-Glucan, bei Normo- (37 °C) und Hyperthermie (40 °C) f{\"u}r bis zu 24 h inkubiert und spezifische DC-Funktionen charakterisiert. Hierbei tolerierten DCs die Inkubation und Stimulation unter Hyperthermie ohne signifikanten Viabilit{\"a}tsverlust. Die Zytokinexpression und -sekretion durch A. fumigatus-Stimulation wurde durch Hyperthermie nicht signifikant ver{\"a}ndert. Die F{\"a}higkeit zur Aufnahme von A. fumigatus-Konidien wurde durch eine kurzzeitige (1 h) Hyperthermie nicht beein-flusst, l{\"a}ngerfristige (24 h) Hyperthermie reduzierte diese F{\"a}higkeit jedoch signifikant. Ebenso bestand unter Hyperthermie eine verst{\"a}rkte Expression von CD86 und HLA-DR auf unstimulierten DCs sowie von CD80, CD86 und HLA-DR auf stimulierten DCs. Die reduzierte Aufnahmekapazit{\"a}t f{\"u}r A. fumigatus-Konidien und die verst{\"a}rkte Expression der kostimulatorischen Molek{\"u}le unter Hyperthermie zeigten, dass Hyper-thermie in vitro einen reiferen Ph{\"a}notyp unstimulierter DCs bewirkt sowie die DC-Reifung durch A. fumigatus-Stimulation verst{\"a}rken kann. Diese reiferen DCs k{\"o}nnten zu einer verbesserten T-Zell-Aktivierung und Abwehr von A. fumigatus und zu einem verbesserten Outcome der IA beitragen. Außerdem k{\"o}nnte Hyperthermie als Adjuvans zur in vitro Generierung A. fumigatus-spezifischer DCs eingesetzt werden.},
  subject      = {Aspergillose},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schedler2018,
  author    = {Schedler, Anette},
  title     = {Analyse von Wirt-Pathogen-Interaktionen zur Untersuchung des Einflusses von \(Aspergillus\) \(fumigatus\) auf die H{\"a}mostase},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-152512},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {Als H{\"a}mostase bezeichnet man die Gesamtheit der Reaktionen, die zu einer effektiven Blutgerinnung beitragen. Sie l{\"a}sst sich in die prim{\"a}re (thrombozyt{\"a}re) H{\"a}mostase, in die sekund{\"a}re (plasmatische) H{\"a}mostase und in das Fibrinolysesystem einteilen. Thrombozyten, oder auch Pl{\"a}ttchen genannt, spielen hierbei eine entscheidende Rolle. Sie binden an die durch eine Verletzung einer Blutgef{\"a}ßwand freigelegten Faktoren, werden so aktiviert und aggregieren mit weiteren Thrombozyten, wodurch ein Thrombus entsteht, der die Verletzung verschließt. Zudem besitzen Thrombozyten Immunokompetenz und k{\"o}nnen mit anderen Immunzellen interagieren, {\"u}ber Rezeptoren Pathogene erkennen und sie direkt angreifen. Einer dieser Pathogene ist der opportunistische Pilz Aspergillus fumigatus. Dieser bildet im Verlauf seines Lebenszyklus 2,5 -3 µm kleine Konidien aus, die mit dem Wind verbreitet werden und bis tief in die Alveolen der menschlichen Lunge eingeatmet werden k{\"o}nnen. W{\"a}hrend diese Konidien im gesunden Menschen durch das Immunsystem und andere Abwehrmechanismen eliminiert werden, k{\"o}nnen sie im immunsupprimierten Patienten, z. B. bei Patienten nach einer h{\"a}matopoietischen Stammzelltransplantation, auskeimen und verschiedene Krankheiten, sogenannte Aspergillosen, ausl{\"o}sen mit der Invasiven Aspergillose (IA) als schwerwiegendste Form. Diese ist assoziiert mit Gewebezerst{\"o}rungen, Blutungen und Thrombenbildung am Ort der Infektion. Diese Komplikationen k{\"o}nnten auf einer {\"u}berh{\"o}hten Immunantwort des Wirtes, auf dem mechanischen Eindringen des Pilzes in das Gewebe und die Blutgef{\"a}ße oder auf einer {\"A}nderung der lokalen H{\"a}mostase durch sezernierte hydrolytische Enzyme (Proteasen) oder Sekund{\"a}rmetabolite von A. fumigatus beruhen. Um diese {\"A}nderung der H{\"a}mostase im Verlauf einer IA zu analysieren, wurde der Einfluss von Morphologien (Konidien, geschwollene Konidien, Keimschl{\"a}uche und Hyphen), deren {\"U}berst{\"a}nde, sowie von proteolytisch aktivem {\"U}berstand und von verschiedenen Sekund{\"a}rmetaboliten von A. fumigatus auf die sekund{\"a}re H{\"a}mostase und die Aggregation und Aktivit{\"a}t von humanen Thrombozyten untersucht. Bei der Analyse der sekund{\"a}ren H{\"a}mostase konnte f{\"u}r keinen dieser eingesetzten Effektoren ein Einfluss festgestellt werden. Bei der Analyse der prim{\"a}ren H{\"a}mostase und dem Einsatz von Morphologien und ihrer {\"U}berst{\"a}nde konnte f{\"u}r Hyphen und ihren ankonzentrierten {\"U}berstand eine aggregationssteigernde Wirkung auf Thrombozyten beobachtet werden, die m{\"o}glicherweise auf Bestandteile der Zellwand von A. fumigatus, wie z. B. β-Galactosaminogalactan (GAG) zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Proteolytisch aktiver {\"U}berstand f{\"u}hrte zu einer Aktivierung der Thrombozyten, die zum Teil auf die PrtT-abh{\"a}ngige proteolytische Spaltung und damit die Aktivierung der Thrombinrezeptoren PAR1 und/oder PAR4 auf der Thrombozytenoberfl{\"a}che, zum Teil aber auch auf GAG zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sein kann. Von den hier verwendeten Mykotoxinen Gliotoxin, Fumagillin, Citrinin, Verruculogen und Deoxynivalenol konnte f{\"u}r Gliotoxin ein negativer Einfluss auf die Thrombozytenaktivit{\"a}t nachgewiesen werden. Dieses Toxin inhibierte die Aggregation und die Aktivit{\"a}t der Thrombozyten, m{\"o}glicherweise durch die Bildung von Disulfid-Br{\"u}ckenbindungen oder auch durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies. Zudem wurde im Verlauf dieser Arbeit eine direkte Interaktion von Gliotoxin mit den ADP-Rezeptoren P2Y1 und P2Y12 sowie mit dem Integrin αIIbβ3 postuliert, die so zwar nicht best{\"a}tigt, aber auch nicht vollst{\"a}ndig wiederlegt werden konnte. Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich zwei Wirkungen von A. fumigatus auf humane Thrombozyten: zum einen eine Aktivierung oder auch verst{\"a}rkte Aggregation durch sezernierte Proteasen oder Zellwandbestandteile, zum anderen eine Hemmung durch Gliotoxin, was die bei einer IA beobachtete Thrombenbildung sowie die Blutungen erkl{\"a}ren kann. Die Interaktion der aktivierten Thrombozyten mit den Zellen des Immunsystems sowie die zytotoxischen Eigenschaften von Gliotoxin k{\"o}nnten zudem f{\"u}r die beobachtete Gewebezerst{\"o}rung verantwortlich sein. Dennoch ist weitere Forschung in diesem Gebiet unabdingbar, um die pathophysiologische {\"A}nderung der lokalen H{\"a}mostase durch A. fumigatus und seine Wirkung auf humane Thrombozyten besser zu verstehen und so eine schnellere Erkennung und Behandlung von Aspergillosen zu erm{\"o}glichen.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Rauer2020,
  author    = {Rauer, Andreas},
  title     = {Etablierung und Evaluierung einer Extraktionskontrolle f{\"u}r den Nachweis von Aspergillus fumigatus-DNA aus Humanserum},
  doi       = {10.25972/OPUS-19456},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-194565},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {Die invasive Aspergillose spielt in der modernen Medizin und speziell bei malignen Bluterkrankungen, die mit einer Immunsuppression des Patienten einhergehen, eine entscheidende Rolle. Die bisherigen Methoden erlauben eine Diagnose meist erst sehr sp{\"a}t oder liefern oft falsch-negative Ergebnisse. Bis zum heutigen Tag ist es nicht gelungen, ein standardisiertes Verfahren zur PCR-Diagnostik aus Blutproben zu etablieren. In den der Arbeit zugrunde liegenden Versuchsreihen wurden verschiedene Ans{\"a}tze an Mastermix im Monoplex- und Duplexformat zur Aspergillus fumigatus-Detektion in Humanserum getestet und optimiert. Es wurde versucht, eine Extraktionskontrolle mit Bacillus subtilis in die Probe zu integrieren, um so die Aussagekraft der extrahierten Probe zu evaluieren. Dabei zeigte sich ein Elutionsvolumen von 35 µl am effizientesten. Der Cq-Wert war bei 35 µl Eluationsvolumen ca. einen Zyklus niedriger als bei 65 µl und 1,5-2 Zyklen niedriger als bei 100 µl. Bei den Versuchen im Monoplexformat konnte gezeigt werden, dass bei der Extraktion viel DNA in den Filtern zur{\"u}ckbleibt. Es wurden aus einer Serumextraktion zwei Eluate mit je 35 µl Elutionsvolumen erstellt und getestet. Hier zeigten sich in Abh{\"a}ngigkeit von der Menge der DNA teils hohe Cq-Werte im zweiten Eluat, bei einigen Proben aber sogar ein niedrigerer Cq-Wert im zweiten Eluat. Dies war sowohl f{\"u}r Aspergillus fumigatus als auch f{\"u}r Bacillus subtilis zu beobachten. Die Gr{\"u}nde f{\"u}r dieses Ergebnis k{\"o}nnten die l{\"a}ngere Inkubationszeit und die zweite Zentrifugation des zweiten Eluats sein. Die Extraktionseffizienz hatte bei der Aufbereitung mit dem QIAamp Ultrasens Kit (Qiagen) einen Faktor von im Mittel 2,7 bei Aspergillus fumigatus und von 4,7 bei Bacillus subtilis beim GEX-Mastermix. Beim Sso-Mastermix lag der Faktor f{\"u}r Aspergillus fumigatus im Mittel bei 4,4 und der f{\"u}r Bacillus subtilis bei 5,4. Bei den Versuchen im Duplexformat wurden sowohl Aspergillus fumigatus als auch Bacillus subtilis in unterschiedlichen Konzentrationen in dieselbe Probe eingebracht. Hier zeigte sich, dass im Sso-Mastermix die Menge an Bacillus subtilis-DNA und an Aspergillus fumigatus-DNA einen deutlichen Einfluss auf die jeweiligen Cq-Werte und die Sensitivit{\"a}t haben. Zus{\"a}tzlich zeigte der Sso-Mastermix immer ein positives Ergebnis f{\"u}r Bacillus subtilis zwischen 36-40 Zyklen. Beim GEX-Mastermix hatte die Menge an Bacillus subtilis-DNA ebenfalls einen deutlichen Einfluss auf die Cq-Werte und die Sensitivit{\"a}t f{\"u}r Aspergillus fumigatus. Die Cq-Werte f{\"u}r Aspergillus fumigatus erh{\"o}hten sich bei 10 Kopien mit 104 Kopien Bacillus subtilis um 6,1 Zyklen und bei 105 Kopien Bacillus subtilis um 10,6 Zyklen im GEX-Mastermix. Ein Einfluss auf die Cq-Werte f{\"u}r Bacillus subtilis konnte bei den Versuchen im Duplexformat mit GEX-Mastermix nicht verzeichnet werden. Zusammenfassend l{\"a}sst sich sagen, dass eine Extraktionskontrolle mit Bacillus subtilis im Sso-Mastermix auf Grund der sich gegenseitig beeinflussenden Sonden und Primer sowie der DNA-Mengen an Aspergillus fumigatus und Bacillus subtilis nicht m{\"o}glich ist, da keine Aussage {\"u}ber den Verlauf und die Effizienz der Extraktion getroffen werden k{\"o}nnte. Bei den Versuchen mit GEX-Mastermix konnte gezeigt werden, dass die Menge an eingegebener Bacillus subtilis-DNA einen entscheidenden Einfluss auf die Sensitivit{\"a}t f{\"u}r die Cq-Werte von Aspergillus fumigatus in niedriger Konzentration hat. Einen Einfluss auf die Cq-Werte f{\"u}r Bacillus subtilis wurde nicht detektiert. Eine Extraktionskontrolle mittels Bacillus subtilis w{\"a}re denkbar, wenn die Menge eingegebener Bacillus subtilis-DNA so reduziert werden k{\"o}nnte, dass stabile Cq-Werte f{\"u}r Bacillus subtilis erreicht w{\"u}rden, die dann aber keinen oder nur einen sehr geringen Einfluss auf die Sensitivit{\"a}t f{\"u}r Aspergillus fumigatus h{\"a}tten.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Ok2011,
  author    = {Ok, Michael},
  title     = {Analyse der Interaktion und die gezielte Modifikation von angeborener Immunantwort gegen{\"u}ber Aspergillus fumigatus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-56866},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Die invasive Aspergillose stellt eine ersthafte Erkrankung sowie auch eine signifikante Ursache von Morbidit{\"a}t und Mortalit{\"a}t bei verschiedenen Patientengruppen dar. Dabei tritt sie haupts{\"a}chlich durch den opportunistischen Pathogen Aspergillus fumigatus hervorgerufen mit einer Inzidenz von 4\% bis 15\% vorwiegend bei immunsupprimierten Patienten nach allogenen h{\"a}matopoetischer Stammzelltransplantationen (HSCT) oder Organtransplantationen auf und f{\"u}hrt bei 40\% bis 90\% der F{\"a}lle zum Tod des Patienten. Die Behandlung dieser Hochrisikogruppe erfolgt bestenfalls mit Antimykotika prophylaktisch, denn eine schnelle sowie auch verl{\"a}ssliche Diagnose von invasiver Aspergillose l{\"a}ßt sich aufgrund der hohen zeitlichen Latenz des Pilzes und dem Defizit an Sensitivit{\"a}t bzw. Spezifit{\"a}t in vielen F{\"a}llen nicht ermitteln. Zus{\"a}tzlich steigt die Zahl der Resistenzen von Aspergillus-St{\"a}mmen gegen die verschiedenen Antimykotika stetig an, so dass klinische und {\"o}konomische Nebenwirkungen unvermeidbar sind. Als Alternative zur konventionellen Behandlung mit Azolen stellt eine Immuntherapie mittels Antigen-behandelten dendritischen Zellen (DCs) dar, welche durch Pr{\"a}sentation von Aspergillus fumigatus-Antigenepitopen eine spezifische ex vivo T-Zellenexpansion von allogenen CD8+CD3+ T-Zellen bewirken kann und damit ein schonenderes Mittel f{\"u}r den Patienten ist. Dazu wurden sieben verschiedene rekombinante Proteine aus A. fumigatus in dieser Arbeit charakterisiert und deren Potential ermittelt, bei DCs eine pro-inflammatische Immunantwort auszul{\"o}sen. Es stellte sich heraus, dass sowohl die Ribonuklease Mitogillin (Aspf1) als auch die myceliale Katalase Cat1 in der Lage waren, den nukle{\"a}ren Faktor kappa B (NFκB) zu aktivieren und eine Translokation der Untereinheit p65 in den Nukleus zu induzieren, woraufhin Gene von pro-inflammatorischen Zytokine und Chemokine sowie auch von Aktivierungs- und Reifungsmarker der DCs exprimiert wurden. Im Gegensatz zum Aspf1, war es beim Cat1 zus{\"a}tzlich auch m{\"o}glich gewesen eine Verifizierung auf Proteinebene f{\"u}r segregierte Zytokine und Chemokine bzw. Oberfl{\"a}chenmarker zu erhalten. Dar{\"u}ber hinaus konnte festgestellt werden, dass die Zytotoxizit{\"a}t von Cat1 entsprechend der unbehandelten Zellen gewesen ist und dass es den Cat1-behandelten moDCs gelang nach der Aufnahme des Antigens und dessen Prozessierung durch die darauffolgende Pr{\"a}sentation der Proteinepitope {\"u}ber den MHC II Komplex eine ex vivo-Aktivierung von autologen zytotoxischen T-Zellen zu erreichen. Damit ist nun ein potentieller Kandidat f{\"u}r eine auf Immuneffektorzellen basierte Immuntherapie gegen invasive Aspergillose f{\"u}r immungeschw{\"a}chte Patienten gefunden. Erg{\"a}nzt wurde diese Arbeit mit der experimentellen Untersuchung von H{\"a}mostase w{\"a}hrend einer invasiven Aspergillose, da geh{\"a}uft pathologische Beobachtungen von lokalen Einblutungen bei Patienten mit pulmonaler Aspergillose verzeichnet wurden. Es stellte sich heraus, dass die durch Collagen induzierte Aggregation sich durch aktive Pilzmorphologien beeintr{\"a}chtigen l{\"a}ßt, wohingegen die untersuchten Gerinnungsparameter nicht betroffen gewesen sind. Dies verdeutlicht neben der bereits bekannten Bedeutung der Thrombozyten als antimikrobielle Komponente im Blut nun auch ihrer Empfindlichkeit gegen{\"u}ber sezernierten oder Zellwand-gebundenen Aspergillus fumigatus-Faktoren w{\"a}hrend der invasiven Aspergillose.},
  subject      = {Immunstimulation},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Mezger2007,
  author    = {Mezger, Markus},
  title     = {Interaktion zwischen dem humanen Cytomegalievirus, Aspergillus fumigatus, dendritischen Zellen und neutrophilen Granulozyten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27254},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Immunsupprimierte Patienten besitzen ein erh{\"o}htes Risiko f{\"u}r opportunistische Infektionen, die haupts{\"a}chlich durch das humane Cytomegalievirus (HCMV) und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus verursacht werden. Aufgrund ihrer Lokalisation in den Geweben unterhalb von Lungenepithelien und des Gastrointestinaltraktes werden dendritische Zellen (DCs) als diejenigen Zellen betrachtet, die w{\"a}hrend der fr{\"u}hen Phase einer Infektion in Kontakt mit HCMV und A. fumigatus kommen und eine Aktivierung von angeborenen und adaptiven Abwehrmechanismen vermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Bedeutung von humanen DCs bei der Bek{\"a}mpfung von HCMV und A. fumigatus n{\"a}her untersucht. Um mit dem klinisch relevanten HCMV Stamm TB40E arbeiten zu k{\"o}nnen, musste zuerst ein geeignetes Zellkultursystem zur Anzucht von HCMV etabliert werden. Die aus Fibroblasten aufgereinigten Viren eigneten sich zur erfolgreichen Infektion von DCs, was durch verschiedene F{\"a}rbemethoden nachgewiesen werden konnte. Aus diesem Grund war es m{\"o}glich, in Abh{\"a}ngigkeit der Zeit ein Expressionsprofil von Klasse I Interferonen (IFN-alpha, IFN-beta), ausgesuchten Cytokinen (CXCL10, CXCL11, Rantes) und den wichtigen Immunrezeptoren Toll-like Rezeptor 3 (TLR3) und dendritic cell-specific ICAM3-grabbing nonintegrin (DC-SIGN) zu erstellen. Nachdem ein RNA Interferenz (RNAi) System zur erfolgreichen Transfektion von DCs mit small interfering RNA (siRNA) etabliert werden konnte, gelang es die Expression von TLR3 signifikant herunterzuregulieren. Stimulationsexperimente mit dem synthetisch hergestellten Polymer poly I:C identifizierten TLR3 als den Rezeptor, der die Expression von IFN-beta vermittelt. Ferner konnte nachgewiesen werden, dass TLR9 bei ex vivo generierten DCs keine Funktion besitzt. Eine direkte Aktivierung von TLR3 durch HCMV konnte mittels siRNA nicht nachgewiesen werden. Durch den Einsatz von genomweiten Microarray-Analysen konnten eine Vielzahl an Genen gefunden werden, die nach Co-Kultivierung von DCs und lebenden A. fumigatus Keimschl{\"a}uchen (KS) differentiell exprimiert waren. Dabei wurde ein breites Spektrum an Cytokinen (TNF-alpha, IL-6, IL-10, IL-12), Chemokinen (IL-8, CCL20, CXCL10), Co-stimulatorischen Molek{\"u}len (CD40, CD80, CD83, CD86), Prostaglandin Synthese Genen (PTGS2) und Immunrezeptoren (PTX-3, TLR2, TLR4) gefunden, deren zeitabh{\"a}ngiges Expressionsprofil mittels qRT-PCR eindeutig best{\"a}tigt wurde. Als Wachen des Immunsystems m{\"u}ssen DCs Krankheitserreger zu einem fr{\"u}hen Zeitpunkt der Infektion erkennen. Die Erkennung von Pilzen wird durch die unterschiedlichen Rezeptoren vermittelt, die TLRs, C-Typ Lektine und Pentraxine umfassen, wobei ihre Bedeutung f{\"u}r humane DCs bisher nur unzureichend gekl{\"a}rt ist. Durch den Einsatz von siRNA konnte die Expression von TLR2, TLR4, myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88), DC-SIGN, Pentraxin-3 (PTX-3) und caspase recruitment domain family member 9 (Card-9) signifikant verringert werden. F{\"u}r TLR2, TLR4, PTX-3 und DC-SIGN konnte durch den Einsatz der RNAi aufgezeigt werden, dass diese Rezeptoren nicht an der Induktion einer pro-inflammatorischen Immunantwort von DCs nach Infektion mit A. fumigatus beteiligt sind. Sowohl die Stimulierung mit den TLR Liganden Zymosan und LPS, als auch mit A. fumigatus, f{\"u}hrte zu einer erh{\"o}hten Expression von TNF-alpha und IL-12 (Light Cycler), die sich in einer vermehrten Cytokinfreisetzung (ELISA) bemerkbar machte. Im Gegensatz zur TLR4 siRNA Transfektion und LPS-Stimulation war keine Reduktion der Expression von TNF-alpha und IL-12 nach TLR2 und TLR4 siRNA Transfektion und anschließender Pilzinfektion zu beobachten. Auch der Einsatz von gegen TLRs gerichteten Antik{\"o}rpern konnte eine m{\"o}gliche Signaltransduktion bei DCs nicht unterbinden. Anstelle von TLR2 und TLR4 wurde Dectin-1 als DC-Immunrezeptor f{\"u}r A. fumigatus KS identifiziert. Mit Hilfe eines spezifischen Antik{\"o}rpers gegen Dectin-1 war es m{\"o}glich, die Freisetzung von TNF-alpha und IL-12 nach Pilzinfektion zu blockieren. In einem unabh{\"a}ngigen Experiment mit siRNA wurde Dectin-1 als Rezeptor f{\"u}r A. fumigatus best{\"a}tigt. Wie fortf{\"u}hrende Experimente mit Candida albicans KS und Zymosan gezeigt haben, handelt es sich bei Dectin-1 auf humanen DCs um einen generellen Rezeptor f{\"u}r Pilze. Die durchgef{\"u}hrten SNP-Analysen (single nucleotide polymorphism) zur Ermittlung eines Zusammenhanges mit einem erh{\"o}hten Virus- und Pilzinfektionsrisiko f{\"u}r Patienten nach Stammzelltransplantation erbrachten die Erkenntnis dar{\"u}ber, dass zwei Marker (rs735240, rs2287886) in DC-SIGN mit einer erh{\"o}hten Empf{\"a}nglichkeit f{\"u}r HCMV, und drei Marker (rs1554013, rs3921, rs4257674) in CXCL10 mit einem vergr{\"o}ßerten Riskio f{\"u}r eine invasive Aspergillose assoziiert waren. Ein Screening von Patienten auf das Vorhandensein dieser definierten SNPs k{\"o}nnte helfen, die individuelle Gefahr f{\"u}r HCMV und A. fumigatus nach nach allogener Stammzelltransplantation abzusch{\"a}tzen.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Lauruschkat2023,
  author    = {Lauruschkat, Chris David},
  title     = {Entwicklung funktioneller Immunassays zur Detektion der humanen Immunantwort auf das opportunistische Pathogen \(Aspergillus\) \(fumigatus\)},
  doi       = {10.25972/OPUS-31983},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-319835},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {Aspergillus fumigatus ist ein opportunistisches fungales Humanpathogen, das ein breites Erkrankungsspektrum von der invasiven Aspergillose (IA) in immunkompromittierten Patienten bis zu einer Reihe von Hypersensitivit{\"a}tserkrankungen in immunkompetenten Individuen hervorrufen kann. Die Diagnostik f{\"u}r A. fumigatus assoziierte Krankheitsbilder beruht auf mehreren diagnostischen Tests, die auch in ihrer Kombination oft zu sp{\"a}ten und unzuverl{\"a}ssigen Diagnosen f{\"u}hren, was wiederum zu einer suboptimalen Patientenversorgung, erh{\"o}hter Mortalit{\"a}t und gesteigerten Kosten f{\"u}r das Gesundheitssystem f{\"u}hrt. Es besteht daher die unbedingte Notwendigkeit, neue und bessere diagnostische Tests zur Detektion von A. fumigatus zu entwickeln. T Zell Assays sind vielversprechende, innovative diagnostische Tests, die bereits f{\"u}r andere Infektionskrankheiten in der Routinediagnostik eingesetzt werden. Erste Versuche wurden bereits unternommen, diese Assays auch f{\"u}r A. fumigatus assoziierte Erkrankungen einzusetzen. Die g{\"a}ngigsten, auf mononukle{\"a}ren Zellen des peripheren Blutes (PBMC)-basierten T Zell Assays sind der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Enzyme-linked Immuno Spot Assay (ELISPOT) und die Durchflusszytometrie. Das Ziel dieser Dissertation war die Entwicklung eines klinisch einsetzbaren T-Zell-Assays f{\"u}r A. fumigatus assoziierte Erkrankungen. Die in der Literatur beschriebenen Assays zeigten in unseren Experimenten bei der Anwendung f{\"u}r mykologische Fragestellungen eine hohe Suszeptibilit{\"a}t gegen{\"u}ber bereits kurzen pr{\"a}analytischen Lagerzeiten und Krykonservierung, was einen klinischen Einsatz erschwerte. Wir entwickelten deshalb einen Vollblut basierten ELISA (VB-ELISA) mit dualer Kostimulation (α-CD28 und α-CD49d), hoher Reproduzierbarkeit und verbesserter Robustheit gegen{\"u}ber pr{\"a}analytischen Einflussfaktoren. Der VB ELISA konnte hohe Differenzen zwischen Typ 1 T Helferzellen (Th1) , Th2 und Th17 Zytokinkonzentrationen bei Patienten mit Aspergillus assoziierten Hypersensitivit{\"a}tskrankheitsbildern und Kontrollpatienten feststellen. Um zu testen, ob dieser Anstieg auf die Erkrankung zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist oder auch bei hoher Aspergillus-Umweltexposition vorzufinden ist, wurde der Assay in Aspergillus exponierten gesunden {\"o}kologischen Landwirten getestet. In dieser Gruppe fanden wir ebenfalls eine erh{\"o}hte Th1 und Th2 Expansion und Zytokinsekretion gegen{\"u}ber gesunden Kontrollspendern, jedoch wurde nur ein geringer Anstieg des Th17 Signalzytokines IL-17 detektiert. Die Detektion von IL-17 im VB-ELISA in Kombination mit anderen Zytokinmarkern ist daher ein vielversprechender Biomarker f{\"u}r die Diagnose von A. fumigatus assoziierten Hypersensitivit{\"a}tserkrankungen. Neben diesen Hypersensitivit{\"a}tserkrankungen haben wir den VB-ELISA auch in immunkompromittierten Patienten nach allogener Stammzelltransplantation (alloSZT), einer Hochrisikogruppe f{\"u}r die IA und die durch das humane Cytomegalovirus (HCMV) ausgel{\"o}ste Zytomegalie, evaluiert. W{\"a}hrend in unserer monozentrischen Pilotstudie aufgrund der geringen Inzidenz keine Evaluation an IA-Patienten erfolgen konnte, wurde mittels VB-ELISA eine hohe Konkordanz der HCMV-spezifischen T Zell Antwort mit der HCMV Serologie sowie eine vergleichbare Leistung zum ELISPOT, dem am h{\"a}ufigsten eingestetzen Assay f{\"u}r diese Fragestellung, festgestellt. Zusammenfassend haben wir mit dem VB ELISA einen vielversprechenden und breitfl{\"a}chig im Spektrum A. fumigatus assoziierter Erkrankungen einsetzbaren T Zell Assay entwickelt, der in der Zukunft in großen Studien mit klar definierten Patientenkohorten getestet werden sollte. Auf Grund von Daten aus Folgestudien, die auf dieser Arbeit basieren, ist des Weiteren davon auszugehen, dass der VB-ELISA auf Grund seiner St{\"a}rken potenziell in einer Vielzahl von Anwendungsgebieten und Pathogenen (eine Folgestudie mit SARS-CoV-2 wurde vor kurzem ver{\"o}ffentlicht) universell eingesetzt werden kann. Neben der Immundiagnostik f{\"u}r diverse Infektionserkrankungen k{\"o}nnte der Assay außerdem f{\"u}r T Zell Antworten auf Vakzinierungen und Immuntherapien, in vivo Experimente und in vitro Toxizit{\"a}tstests verwendet werden.},
  subject      = {Immunologie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kruhm2014,
  author    = {Kruhm, Michaela},
  title     = {Identifizierung und Isolierung Aspergillus fumigatus spezifischer T-Zell-Rezeptoren und funktionelle Charakterisierung nach Transfer auf humane T-Zellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-112184},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Der humanpathogene Pilz Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) kann in immunsupprimierten Patienten zum Teil schwere invasive Infektionen ausl{\"o}sen. Trotz Fortschritten in den Behandlungsm{\"o}glichkeiten und der medikament{\"o}ser Prophylaxe bleibt die Sterblichkeitsrate bei invasiven Erkrankungen hoch. Aus diesem Grund ist die Entwicklung von spezifischeren Immuntherapien von N{\"o}ten. Ein Ansatz ist die genetische Modifikation von T Zellen, durch den Transfer von A. fumigatus spezifischen T Zell Rezeptoren (TCRs), f{\"u}r eine adoptive Therapie. Um dieses Konzept zu evaluieren wurden TCRs, die f{\"u}r die extrazellul{\"a}ren Zellwandglykonase Crf1 (Crf1/p41) spezifisch sind, auf prim{\"a}re T Zellen transferiert und die Effektor-Funktion analysiert. Das Crf1/p41 Epitop induziert bei gesunden Spendern eine funktionelle TH1 Immunantwort gegen A. fumigatus und f{\"u}hrt zur Produktion hoher Mengen von Interferon γ (IFN-γ). F{\"u}r die Identifikation von A. fumigatus spezifischen TCRs wurden siebenunddreißig Crf1/p41 spezifische T Zellklone von drei HLA DRB1*04 Spendern generiert. Anschließend wurden die TCR β Ketten {\"u}ber die sehr variable komplementarit{\"a}tsbestimmende Region 3 (CDR3) bestimmt. Es konnten zw{\"o}lf unterschiedliche TCRs ermittelt werden, von denen vor allem die variablen β (Vβ) Kette 18 sehr dominant, w{\"a}hrend die Vβ Ketten 1 und 6 nur in wenigen Klonen vertreten waren. Zur weiteren Charakterisierung der Crf1/p41 spezifischen TCRs wurden die variablen α (Vα) Ketten bestimmt (Vα 3, Vα 15 und Vα 26). Somit liegt eine polyklonale T Zell Immunantwort vor. Anschließend wurden die Crf1/p41 spezifischen TCRs in den retroviralen Vektor pMP71 kloniert und auf Jurkat 76 Zellen, welche keinen endogenen TCR exprimieren, und auf prim{\"a}re CD4+ T Zellen transferiert. Die Expression von Crf1/p41 spezifischen TCRs, transduziert in CD4+ T Zellen, zeigten spenderspezifische Unterschiede und die Expression war niedriger im Vergleich zu den transduzierten Jurkat 76 Zellen. Daher wurde auf Optimierungsstrategien zur{\"u}ckgegriffen, die f{\"u}r den adoptiven Transfer mit TCR-modifizierten T Zellen zur Behandlung von Krebs entwickelt wurden. Angewandt wurden die Codonoptimierung der TCR codierenden Sequenz, Murinisierung der TCR konstanter Ketten, Induktion einer weiteren Disulfidbr{\"u}cke. Ebenfalls wurde das Vektorsystem optimiert. Der Optimierungsprozess der Crf1/p41 spezifischen TCR 1 f{\"u}hrte zu einer erh{\"o}hten Oberfl{\"a}chenexpression des TCR sowohl in Jurkat 76 (3 bis 5fach) als auch in prim{\"a}ren CD4+ T Zellen (2fach). In funktionellen Analysen wurde die Proliferationsf{\"a}higkeit und IFN-γ Produktion, durch die Stimulation von transduzierten CD4+ T Zellen (TCR 1 optimiert) mit Crf1/p41 beladenen dendritischen Zellen (DCs), best{\"a}tigt. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der Transfer von A. fumigatus spezifischen TCRs eine protektive anti-fungale Immunantwort f{\"o}rdern k{\"o}nnte. Demzufolge auch als ein geeignetes Mittel in einer potentiellen Immuntherapie gegen A. fumigatus Infektionen in immunsupprimierten Patienten, eingesetzt werden k{\"o}nnte.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kerber2019,
  author    = {Kerber, Isabel},
  title     = {Einfluss von Punktmutationen auf die Funktionalit{\"a}t von NK-Zellen in Interaktion mit Aspergillus fumigatus},
  doi       = {10.25972/OPUS-18925},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-189256},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung von Punktmutationen in ifng und ncam1 in Hinblick auf eine ver{\"a}nderte Funktionalit{\"a}t von NK-Zellen bei der Interaktion mit A. fumigatus. Die gewonnenen Erkenntnisse sollen langfristig zur Verbesserung der Diagnostik, Prophylaxe und Therapie einer Invasiven Aspergillose, die zum Beispiel im Rahmen einer Stammzelltransplantation auftreten k{\"o}nnte, beitragen. In dieser Arbeit wurde die DNA von zwanzig gesunden Spendern auf einen ifng-SNP (rs2069705) und einen ncam1-SNP (rs10502171) untersucht. Von je drei ausgew{\"a}hlten Spendern mit SNP und sechs Kontrollspendern wurden NK-Zellen isoliert. Diese wurden unstimuliert belassen, mit Interleukin 2/15 oder A. fumigatus stimuliert. Bei der Versuchsreihe zum ifng-SNP wurde eine qPCR zur Ermittlung der relativen Expression von ifng und ccl4, bei den Versuchen zum ncam1-SNP eine durchflusszytometrische Analyse zur Messung der Expression verschiedener Oberfl{\"a}chenmarker durchgef{\"u}hrt. Bei beiden wurde mittels ELISA die Freisetzung von IFN-gamma bzw. CCL4/MIP-1ß bestimmt. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zum ifng-SNP lassen vermuten, dass das Vorliegen dieses ifng-SNP keine durch NK-Zellen vermittelten Auswirkungen auf das Risiko der Patienten, an einer Invasiven Aspergillose zu erkranken, hat. In Bezug auf den ncam1-SNP konnte die Hypothese best{\"a}tigt werden, dass der SNP die Interaktion zwischen der NK-Zelle und A. fumigatus ver{\"a}ndert. Der SNP korreliert zwar mit einer erh{\"o}hten Grundaktivierung von NK-Zellen, jedoch auch mit einem schw{\"a}cheren Aktivierungspotential bei Stimulation mit dem Pilz.},
  subject      = {Punktmutation},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kalleda2018,
  author    = {Kalleda, Nataraja Swamy},
  title     = {Spatiotemporal analysis of immune cell recruitment and Neutrophil defence functions in \(Aspergillus\) \(fumigatus\) lung infections},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-150931},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {Humans are continuously exposed to airborne spores of the saprophytic fungus Aspergillus fumigatus. In healthy individuals, local pulmonary host defence mechanisms can efficiently eliminate the fungus without any overt symptoms. In contrast, A. fumigatus causes devastating infections in immunocompromised patients. However, local host immune responses against A. fumigatus lung infections in immunocompromised conditions have remained largely elusive. Given the dynamic changes in immune cell subsets within tissues upon immunosuppressive therapy, we dissected the spatiotemporal pulmonary immune response after A. fumigatus infection to reveal basic immunological events that fail to effectively control the invasive fungal disease. In different immunocompromised murine models, myeloid but not lymphoid cells were strongly recruited upon infection. Notably, neutrophils and macrophages were recruited to infected lungs in different immunosuppressed regimens. Other myeloid cells, particularly dendritic cells and monocytes were only recruited in the corticosteroid model after infection. Lymphoid cells, particularly CD4+ or CD8+ T-cells and NK cells were highly reduced upon immunosuppression and were not recruited after A. fumigatus infection. Importantly, adoptive CD11b+ myeloid cell transfer rescued immunosuppressed mice from lethal A. fumigatus infection. These findings illustrate that CD11b+ myeloid cells are critical for anti-A. fumigatus defence under immunocompromised conditions. Despite improved antifungal agents, invasive A. fumigatus lung infections cause a high rate morbidity and mortality in neutropenic patients. Granulocyte transfusions have been tested as an alternative therapy for the management of high-risk neutropenic patients with invasive A. fumigatus infections. To increase the granulocyte yield for transfusion, donors are treated with corticosteroids. Yet, the efficacy of granulocyte transfusion and the functional defence mechanisms of granulocytes collected from corticosteroid treated donors remain largely elusive. We aimed to assess the efficacy of granulocyte transfusion and functional defence mechanisms of corticosteroid treated granulocytes using mouse models. In this thesis, we show that transfusion of granulocytes from corticosteroid treated mice did not protect cyclophosphamide immunosuppressed mice against lethal A. fumigatus infection in contrast to granulocytes from untreated mice. Upon infection, increased levels of inflammatory cytokines helped to recruit granulocytes to the lungs without any recruitment defects in corticosteroid treated and infected mice or in cyclophosphamide immunosuppressed and infected mice that have received the granulocytes from corticosteroid treated mice. However, corticosteroid treated human or mouse neutrophils failed to form neutrophil extracellular traps (NETs) in in vitro and in vivo conditions. Further, corticosteroid treated granulocytes exhibited impaired ROS production against A. fumigatus. Notably, corticosteroids impaired the β-glucan receptor Dectin-1 (CLEC7A) on mouse and human granulocytes to efficiently recognize and phagocytize A. fumigatus, which markedly impaired fungal killing. We conclude that corticosteroid treatment of granulocyte donors for increasing neutrophil yields or patients with ongoing corticosteroid treatment could result in deleterious effects on granulocyte antifungal functions, thereby limiting the benefit of granulocyte transfusion therapies against invasive fungal infections.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Hornbach2010,
  author    = {Hornbach, Anke},
  title     = {Aktivierungsmuster humaner neutrophiler Granulozyten nach Kontakt mit den pathogenen Pilzen Candida albicans und Aspergillus fumigatus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-53520},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Humane neutrophile Granulozyten spielen eine wichtige Rolle in der Immunabwehr invasiver Infektionen durch die humanpathogenen Pilze Candida albicans und Aspergillus fumigatus. Das Ziel der hier vorliegenden Arbeit bestand in einer Charakterisierung der Interaktion beider Pilzspezies mit neutrophilen Granulozyten, mit Fokussierung auf die unterschiedlichen Effektormechanismen dieser Zellen. C. albicans exprimiert eine Reihe von Aspartatproteasen, welche mit der Virulenz des Erregers assoziiert sind und zu Adh{\"a}sion, Gewebeinvasion und Immunevasion beitragen k{\"o}nnen. In dieser Arbeit wurde die Rolle der Aspartatproteasen Sap1-6, Sap9 und Sap10 in der Interaktion mit neutrophilen Granulozyten analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass, im Gegensatz zu anderen Aspartatproteasen, das zelloberfl{\"a}chenassoziierte GPI-verankerte Enzym Sap9 einen maßgeblichen Einfluss auf die Erkennung von C. albicans durch neutrophile Granulozyten hat. SAP9-Expression ist erforderlich, um die gerichtete Motilit{\"a}t (Chemotaxis) neutrophiler Granulozyten zu C. albicans-Keimschl{\"a}uchen hin zu induzieren. Dieser Prozess stellt eine Grundvoraussetzung zur effektiven Aktivierung neutrophiler Granulozyten darstellt. Die Chemotaxis neutrophiler Granulozyten kann durch autologe Sekretion des Zytokins IL-8 verst{\"a}rkt werden. Es konnte jedoch kein Einfluss von SAP9 auf die IL-8 Sekretion beobachtet werden. Allerdings f{\"u}hrte die Deletion von SAP9 zu reduzierter Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (engl. reactive oxygen species, ROS) in neutrophilen Granulozyten. Die mit der ROS-Generierung in Verbindung stehende und durch C. albicans induzierte Apoptose neutrophiler Granulozyten war ebenfalls vermindert. In Konfrontationsassays war die Abt{\"o}tung einer SAP9-Deletionsmutante verglichen mit dem Wildtyp reduziert. Die Degranulation stellt neben der Produktion von ROS einen weiteren wichtigen Effektormechanismus zur Abt{\"o}tung von Mikroben dar, jedoch verlief die Freisetzung von Elastase ebenso unabh{\"a}ngig von SAP9 wie die durch neutrophile Granulozyten ausgel{\"o}ste Wachstumsinhibition von Keimschl{\"a}uchen. Die hier pr{\"a}sentierten Daten verbinden die Aktivit{\"a}t der Protease Sap9, der zuvor bereits eine Rolle in der Immunevasion von C. albicans zugeschrieben wurde, mit der Initiation der protektiven angeborenen Immunit{\"a}t. Wie C. albicans stimuliert auch A. fumigatus die Aktivit{\"a}t der neutrophilen Granulozyten. Microarray- Analysen mit Fokus auf dem Zytokinprofil neutrophiler Granulozyten w{\"a}hrend der Interaktion mit A. fumigatus-Hyphen offenbarten, dass nur wenige Zytokine im Lauf der Infektion hochreguliert wurden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Sap-Granulozyten-Interaktion neue molekulare Mechanismen zur Aktivierung dieser Zellen birgt. Zudem brachten die Microarray Analysen die Erkenntnis, dass die de novo-Zytokinsynthese durch A. fumigatus nur geringf{\"u}gig beeinflusst wird und eine schnelle Abt{\"o}tung des Pilzes offenbar im Vordergrund steht.},
  subject      = {Neutrophile Granulozyten},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Helm2020,
  author    = {Helm, Johanna Charlotte},
  title     = {Invasive Mykosen - Prognose und Diagnose mittels Aspergillus fumigatus-spezifischer CD154+/CD4+ Zellen},
  doi       = {10.25972/OPUS-21340},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-213406},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {In den vergangenen Jahrzehnten kam es durch den Einsatz massiv immunsupprimierender Therapien zu einer steigenden Inzidenz invasiver Mykosen. Die durch eine Infektion mit A. fumigatus ausgel{\"o}ste invasive Aspergillose stellt eine lebensbedrohliche Erkrankung f{\"u}r Patienten mit h{\"a}matologischen Malignomen oder nach h{\"a}matopoetischer Stammzelltransplantation dar. F{\"u}r die Behandlung solcher Erkrankungen ist eine fr{\"u}hzeitige Diagnosestellung unabdingbar. Da invasive diagnostische Maßnahmen bei den betroffenen Patienten jedoch h{\"a}ufig kontraindiziert sind, werden neue Biomarker und nicht invasive Diagnoseverfahren intensiv beforscht. Ein k{\"u}rzlich beschriebener Ansatz zur Prim{\"a}r- und Verlaufsdiagnostik bei Patienten mit invasiven pulmonalen Aspergillosen und Mukormykosen ist die Verwendung des auf aktivierten T-Zellen exprimierten Aktivierungsmarkers CD154 zur durchflusszytometrischen Quantifizierung A. fumigatus-spezifischer T-Helfer-Zellen. Die Detektion dieser Zellen mit dem in der Literatur beschriebenen Protokoll erfordert die Isolation von PBMCs und duldet vor der Verarbeitung der Proben in einem spezialisierten Labor nur kurze pr{\"a}analytische Lagerungszeiten. Dies stellt einen limitierenden Faktor f{\"u}r die klinische Verwendbarkeit des beschriebenen Assays dar. Die vorliegende Dissertationsschrift besch{\"a}ftige sich damit, den beschriebenen Assay zur Detektion A. fumigatus-spezifischer T-Zellen, hinsichtlich seiner Pr{\"a}analytik und klinischen Anwendbarkeit eingehender zu evaluieren und zu optimieren. Zun{\"a}chst konnte gezeigt werden, dass mittels Verd{\"u}nnung und Agitation der zur PBMC Isolation verwendeten Blutproben eine Verl{\"a}ngerung des pr{\"a}analytischen Zeitfensters zwischen Blutentnahme und Aufbereitung auf bis zu 4 h m{\"o}glich ist, ohne dass dabei die Sensitivit{\"a}t des CD154-basierten T-Zell-Assays beeintr{\"a}chtigt wird. Weiterhin konnte die Verwendung eines Vollblut-basierten Protokolls, das auf die zeitaufwendige Isolation von PBMCs verzichtet, etabliert werden. Hinsichtlich seiner Detektionsleistung zeigte sich das Vollblutprotokoll dem PBMC Protokoll grunds{\"a}tzlich {\"u}berlegen. F{\"u}r verschiedene Stimulationsperioden konnte ein gegen{\"u}ber dem PBMC Standardprotokoll reproduzierbarer Konversionsfaktor ermittelt werden, welcher einen Vergleich von Ergebnissen bei alternierender Durchf{\"u}hrung von PBMC- und Vollblut-Assay bei den selben Patienten m{\"o}glich macht. Das Protokoll erlaubt die Kombination von Stimulations- und Transportzeit unter Verwendung eines auf 37 °C temperierten Transportgef{\"a}ßes. Eine alleinige Stimulation bei Raumtemperatur zeigte sich hingegen nicht erfolgreich. Die Anwendung des Assays am Point-of-Care wird durch die Verwendung vorbereiteter, markt{\"u}blicher Blutentnahmer{\"o}hrchen m{\"o}glich, welche bis zum Zeitpunkt der Verwendung eingefroren gelagert werden k{\"o}nnen. Eine Analyse der Material- und Arbeitskosten ergab eine Reduktion der Gesamtkosten f{\"u}r die Verwendung des Vollblut-basierten Protokolls von bis zu 22 \% pro Probe. Prinzipiell kann davon ausgegangen werden, dass der entwickelte Assay mit jedem Peptid-Antigen durchf{\"u}hrbar ist, das in konstanter Qualit{\"a}t bezogen oder generiert werden kann und einen immunogenen Effekt aufweist, ohne dabei mit anderen verwendeten Reagenzien zu interagieren. Weiterhin wurde in der vorliegenden Arbeit gepr{\"u}ft, wie sich T-Zell-inhibitorische Substanzen auf die Testergebnisse auswirken. Hierbei fand sich eine nicht unwesentliche Anzahl falsch-negativer Testergebnisse. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertationsschrift zeigen, dass eine suffiziente und sensitive Bestimmung A. fumigatus-spezifischer T-Zellen im Rahmen eines Vollblut-basierten Protokolls m{\"o}glich ist. Eine Ausweitung des Assays f{\"u}r andere Infektionserreger, sowie die Entwicklung Brefeldin A-freier Protokolle w{\"a}ren w{\"u}nschenswert. Ein m{\"o}gliches Einsatzgebiet stellen klinisch infektiologische Studien oder umwelt- und arbeitsmedizinische Fragestellungen dar.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hellmann2022,
  author    = {Hellmann, Anna-Maria},
  title     = {Vergleichende Untersuchung der Interaktion humaner und muriner Immunzellen mit \(Aspergillus\) \(fumigatus\)},
  doi       = {10.25972/OPUS-26564},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-265642},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2022},
  abstract  = {Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) ist der h{\"a}ufigste Erreger der invasiven Aspergillose, welche vornehmlich immunsupprimierte Patientinnen und Patienten betrifft und mit einer hohen Letalit{\"a}t einhergeht. Zur Entwicklung neuer diagnostischer sowie therapeutischer Ans{\"a}tze ist ein besseres Verst{\"a}ndnis der Interaktion von A. fumigatus mit dem humanen Immunsystem zwingend erforderlich. Zur Erforschung dieser Interaktion werden h{\"a}ufig Mausmodelle herangezogen, welche aufgrund der unterschiedlichen Biologie des Wirts jedoch nicht direkt {\"u}bertragbar sind. Ziel dieser Studie war es, einen funktionellen in vitro Vergleich zwischen humanen und murinen Makrophagen, neutrophilen Granulozyten (PMNs) und dendritischen Zellen (DCs) in ihrer Interaktion mit A. fumigatus Konidien, Keimschl{\"a}uchen sowie depletiertem Zymosan zu erstellen, um eine bessere Beurteilung und {\"U}bertragbarkeit des Mausmodells bei der invasiven Aspergillose zu erm{\"o}glichen. Dabei wurden die verschiedenen Zellen des Immunsystems auf standardisierte und reproduzierbare Weise generiert und Stimulationsversuche durchgef{\"u}hrt. Hierbei zeigten humane und murine Zellen in vitro eine unterschiedliche Antwort auf die Stimulation mit A. fumigatus: Murine Makrophagen und neutrophile Granulozyten zeigten im Vergleich zu den humanen Zellen eine st{\"a}rkere prim{\"a}re Immunantwort mit einer vermehrten Aussch{\"u}ttung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Humane DCs hingegen, welche als Bindeglied zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem fungieren, zeigten nach Stimulation mit A. fumigatus eine vermehrte Oberfl{\"a}chenexpression von Maturationsmarkern sowie eine h{\"o}here Phagozytoserate als die murinen DCs. Weiterhin konnte eine inverse Dectin-1-Expression auf humanen und murinen DCs nach Stimulation mit A. fumigatus nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass es f{\"u}r alle untersuchten Zelltypen Unterschiede zwischen humanen und murinen Zellen in der basalen und der Zytokinaussch{\"u}ttung nach Stimulation mit A. fumigatus gab. In Zusammenschau der Ergebnisse dieser Arbeit zeigt das murine Immunsystem eine st{\"a}rkere angeborene Immunantwort mit vermehrter ROS-Aussch{\"u}ttung, jedoch auch eine anti-inflammatorische Zytokinantwort, um m{\"o}glicherweise eine {\"u}berschießende Inflammation zu verhindern. Dies k{\"o}nnte durch die st{\"a}rkere Exposition der Maus gegen{\"u}ber A. fumigatus durch den bodennahen Lebensraum sowie ihrer kurzen Lebensdauer bedingt sein. Im humanen System kommt hingegen der Aktivierung des adaptiven Immunsystems {\"u}ber die DCs eine {\"u}bergeordnete Rolle zu. So zeigen beide Spezies distinkte Unterschiede in ihrer in vitro Immunantwort gegen{\"u}ber A. fumigatus, welche bei der {\"U}bertragung von experimentellen Daten von der Maus auf den Menschen beachtet werden sollten.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hefter2018,
  author    = {Hefter, Maike Sina},
  title     = {Quantifizierung und funktionale Analysen von \(Aspergillus\)-spezifischen Rezeptoren auf humanen dendritischen Zell-Subpopulationen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-166636},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {Pilzinfektionen z{\"a}hlen zu den h{\"a}ufigsten Infektionen beim Menschen. Sie verlaufen in den meisten F{\"a}llen unkompliziert und stellen keine vitale Bedrohung f{\"u}r den Betroffenen dar. Invasive Mykosen hingegen verlaufen oft t{\"o}dlich und sind eine große Herausforderung f{\"u}r die moderne Medizin, da eine fr{\"u}he Diagnose schwierig ist und die therapeutischen M{\"o}glichkeiten limitiert sind. Die Invasive Aspergillose (IA) z{\"a}hlt mit gesch{\"a}tzt {\"u}ber 200.000 Infektionen pro Jahr weltweit zu einer der h{\"a}ufigsten Invasiven Mykosen. Die bekanntesten Risikofaktoren f{\"u}r die Entstehung einer IA sind die Neutropenie, Organtransplantationen, h{\"a}matopoetische Stammzelltransplantationen und Erkrankungen, die mit einer Kompromittierung des Immunsystems einhergehen. Erreger der Invasiven Aspergillose ist in nahezu 90 Prozent Aspergillus fumigatus (A. fumigatus), ein ubiquit{\"a}r vorkommender Schimmelpilz. Seine Verbreitung erfolgt aerogen durch Sporen, sogenannte Konidien, die aufgrund ihres geringen Durchmessers problemlos {\"u}ber die Atemwege in die Lunge gelangen k{\"o}nnen. Dendritische Zellen spielen als professionelle Antigen pr{\"a}sentierende Zellen eine wichtige Rolle in der Immunabwehr gegen A. fumigatus. Sie sind ein wichtiges Bindeglied zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem und sind mit einer Vielzahl von Rezeptoren (engl. pattern recognition receptor, PRR) zur Pathogen Erkennung ausgestattet. In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion ausgew{\"a}hlter C Typ Lektin (CLEC) Rezeptoren auf Subtypen dendritischer Zellen (DCs) mit verschiedenen A. fumigtaus Morphologien untersucht. Es wurde mit in vitro generierten Monozyten abgeleiteten (moDCs) und in vivo vorkommenden myeloiden dendritischen Zellen (mDCs) gearbeitet und die Expression von CLEC4A, CLEC6A, CLEC7A, CLEC12A und CLEC4E und eine m{\"o}gliche Regulation der Rezeptoren nach Stimulation mit Konidien, geschwollenen Konidien oder Keimschl{\"a}uchen untersucht. Hierbei wurde bei beiden Subtypen eine Herabregulation von CLEC4A, CLEC7A und CLEC12A beobachtet. Dies ist vereinbar mit der Tatsache, dass C Typ Lektin Rezeptoren nicht nur eine Rolle bei der Pathogen Erkennung spielen, sondern auch als Phagozytose Rezeptoren fungieren. Auf molekularbiologischer Ebene wurde in Analysen von moDCs ebenfalls eine Reduktion der relativen mRNA Expression von CLEC4A, CLEC6A, CLEC7A und CLEC12A beobachtet. Weiterhin wurden die Auswirkungen einer Rezeptorblockade von CLEC7A mittels blockierender Antik{\"o}rper auf das Maturierungsverhalten und Zytokinprofil beider Subtypen analysiert. Hier konnte durch die Zugabe eines CLEC7A blockierenden Antik{\"o}rpers vor Stimulation mit A. fumigatus Konidien oder depletiertem Zymosan die Maturierung effektiv inhibiert werden. Die Sekretion der pro inflammatorischen Zytokine Tumornekrosefaktor α, Interleukin 8 und 1β, als auch des anti inflammatorischen Zytokins Interleukin 10 war durch die Rezeptorblockade ebenfalls signifikant vermindert. Diese Erkenntnisse st{\"u}tzen die bislang relativ gut untersuchte Rolle von CLEC7A auf Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen als spezifischen Rezeptor f{\"u}r A. fumigatus. Dar{\"u}ber hinaus konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass CLEC7A ebenfalls auf mDCs an der Erkennung von A. fumigatus und Initiierung einer Immunantwort beteiligt ist. Diese Tatsache ist von Bedeutung, da die beiden Subtypen nicht ohne weiteres miteinander verglichen werden k{\"o}nnen und die Relevanz von in vivo vorkommen myeloiden dendritischen Zellen an einer Immunantwort gegen A. fumigatus bislang noch viele Fragen offen l{\"a}sst. Es bedarf weiterer Untersuchungen, insbesondere funktionaler Analysen von intrazellul{\"a}ren Signalwegen um ein besseres Verst{\"a}ndnis zu erlangen. Die {\"U}bertragung in ein Tiermodell und die gezielte Ausschaltung von C Typ Lektin Rezeptor Genen k{\"o}nnte ein Ausblick auf zuk{\"u}nftige Forschungsprojekte sein.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hartmann2010,
  author    = {Hartmann, Thomas},
  title     = {Nitrogen metabolism in Aspergillus fumigatus with emphasis on the oligopeptide transporter (OPT) gene family},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-54027},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {The saprophytic filamentous fungus Aspergillus fumigatus has been gaining importance as an opportunistic human pathogen over the past decades. Advances in modern medicine have created a growing group of patients susceptible to infection with A. fumigatus, often contracting potentially deadly invasive aspergillosis. The virulence of this pathogen appears to be a multifactorial trait, a combination of physiological characteristics that enables the fungus to infect immunocompromised humans. This work concentrates on the nitrogen metabolism of A. fumigatus, which is essential for meeting the nutritional needs inside the human host. Using DNA microarrays, the transcriptional response during growth on three different secondary nitrogen sources was examined, which revealed the metabolic versatility of A. fumigatus, especially when challenged with proteins as the sole source of nitrogen. In-depth transcriptional profiling of the eight-member oligopeptide transporter (OPT) gene family underlined the importance of oligopeptide transport for growth on complex nitrogen sources like BSA or collagen. Heterologous expression of the opt genes in Saccharomyces cerevisiae showed their functionality as oligopeptide transporters, and characterized their substrate specificity. Using a Cre/loxP based genetic tool, a complete deletion of all opt genes in A. fumigatus was achieved. The resultant strain exhibited diminished growth on medium where the oligopeptide GPGG was the sole nitrogen source, but did not show any other in vitro phenotype. The opt deletion strain was not attenuated in virulence in a murine model of pulmonary aspergillosis, suggesting that the OPT gene family is not necessary for successful infection. The connection of oligopeptide transport and extracellular proteolytic activity was investigated by deleting the genes encoding Dpp4 and Dpp5, two dipeptidyl peptidases, or PrtT, the transcriptional regulator of major secreted proteases, in the complete opt deletion background. In contrast to the deletion of dpp4 and dpp5, which did not result in any additional phenotype, the absence of prtT led to a drastic growth defect on porcine lung agar. This suggests a synergistic action of extracellular proteolytic digest of proteins and transport of oligopeptide degradation products into the cell. Finally, this work established the bacterial β-Rec/six site-specific recombination system as a novel genetic tool for targeted gene deletion in A. fumigatus.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Halbing2018,
  author    = {Halbing, Carolin},
  title     = {Analyse der Interaktion humaner dendritischer Zellen und nat{\"u}rlicher Killerzellen mit dem Schimmelpilz \(Aspergillus\) \(fumigatus\) mittels Echtzeitmikroskopie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-171026},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {Der humanpathogene Schimmelpilz A. fumigatus ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der ein hohes Risiko eines letalen Krankheitsverlaufs durch das Auslösen einer invasiven Aspergillose (IA) birgt. Bei der IA handelt es sich um eine Infektion des Lungengewebes, welche hauptsächlich immunsupprimierte Menschen befällt. A. fumigatus stellt die Ursache f{\"u}r diese infektiöse Komplikation dar, welche von einem intakten Immunsystem in der Regel problemlos abgewehrt wird. Eine wichtige Abwehrbarriere gegen den Pilz setzt sich aus Zellen des angeborenen Immunsystems zusammen. In der vorliegenden Arbeit waren in diesem Zusammenhang nat{\"u}rliche Killerzellen (NK-Zellen) und dendritische Zellen (DCs) von besonderer Relevanz. NK- Zellen sch{\"u}tten lösliche Faktoren aus, welche als antifungale Mediatoren agieren. DCs besitzen hingegen die Fähigkeit, Pilzmorphologien zu phagozytieren. Im Anschluss an die Interaktion mit dem Pilz sekretieren beide Zelltypen Zytokine, welche wiederum weitere Immunzellen stimulieren. Besonders den DCs wird eine wichtige Funktion in der Immunabwehr gegen A. fumigatus zugeschrieben, da ihre Fähigkeit, das angeborene mit dem adaptiven Immunsystem zu verkn{\"u}pfen, von großer Bedeutung ist. Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktionen von primären Monozyten abgeleiteten DCs (moDCs) und NK-Zellen mit dem Pilz A. fumigatus in vitro zu charakterisieren. Hierf{\"u}r wurden mit der Methode des Live-imaging verschiedene Experimente durchgef{\"u}hrt, um den reziproken Einfluss der zwei Immunzellarten in Anwesenheit von A. fumigatus zu analysieren. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl moDCs, als auch NK-Zellen mit dem Pilz interagieren. Neben NK-Zell-moDC-Interaktionen wurden auch Interaktionen mit den einzelnen Immunzelltypen und A. fumigatus beobachtet. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass die NK-Effektormolek{\"u}le IFN-ɣ, Granzym B und Perforin stimulierend auf moDCs wirken, was in einer erhöhten Zellaktivierung und einer in der Folge gesteigerten Kontaktanzahl zum Pilz resultierte.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gundel2015,
  author    = {Gundel, Daniel},
  title     = {Interaktion humaner iNKT-Zellen mit dem Schimmelpilz Aspergillus fumigatus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-134832},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Nat{\"u}rliche Killer T-Zellen stellen ein verbindendes Element zwischen angeborener und adaptiver Immunit{\"a}t dar und sind durch die Expression von T- und NK-Zell-Markern, sowie eines invarianten T-Zell-Rezeptors charakterisiert. Damit erkennen sie Lipide, welche vorwiegend durch dendritische Zellen mittels des MHC-I-{\"a}hnlichen Molek{\"u}ls CD1d pr{\"a}sentiert werden. Die protektive Rolle von iNKT-Zellen bei Autoimmun- und malignen Erkrankungen ist nachgewiesen, ebenso ihre wichtige Aufgabe bei der Abwehr bakterieller, viraler und parasit{\"a}rer Pathogene. Inwiefern iNKT-Zellen mit Pilzen und im speziellen Aspergillus fumigatus (A. f.) interagieren ist jedoch unzureichend beschrieben. iNKT-Zellen gesunder Spender wurden ex vivo selektiv kultiviert und mit A. f. Konidien und Keimschl{\"a}uchen kokultiviert. Microarray-Analyse, bzw. Multiplex-ELISA fanden Anwendung, um eine durch A. f. induzierte differentielle Genexpression bzw. Zytokinsekretion bei iNKT-Zellen zu detektieren. Zus{\"a}tzlich wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen, ob A. f. die Produktion des TH1-Zytokins IFN-γ beeinflusst. Schließlich wurde der fungizide Effekt von iNKT-Zellen auf A. f. via XTT-Assay quantifiziert. iNKT-Zellen zeigten einen ausgepr{\"a}gten fungiziden Effekt auf A. f. Keimschl{\"a}uche, welcher mit einem hohen Anteil IFN-γ+ iNKT-Zellen vergesellschaftet war. Hingegen zeigte sich kein Stimulus-spezifisches Zytokinsekretionsmuster. Besonders Keimschl{\"a}uche induzierten eine differentielle Genexpression bei iNKT-Zellen. Diese war gekennzeichnet durch eine Hochregulierung von Genen des anaeroben Glukosemetabolismus. Als Zeichen einer m{\"o}glicherweise lokalen Hypoxie waren VEGFA hoch-, bzw. CCL15 in ihrer Transkription herunterreguliert. Vor dem Hintergrund einer unbefriedigend hohen Mortalit{\"a}t der durch A. f. verursachten invasiven Aspergillose k{\"o}nnen diese ersten Ergebnisse der Interaktion des Schimmelpilzes mit iNKT-Zellen Grundlage f{\"u}r weitere Untersuchungen sein, um deren Wechselwirkung besser zu verstehen und m{\"o}glicherweise zur Verbesserung der Therapie der Aspergillose beizutragen.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Fliesser2015,
  author    = {Fließer, Mirjam},
  title     = {Hypoxia and hypoxia-inducible factor 1α modulate the immune response of human dendritic cells against Aspergillus fumigatus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-121392},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {The mold Aspergillus fumigatus causes life-threatening infections in immunocompromised patients. Over the past decade new findings in research have improved our understanding of A. fumigatus-host interactions. One of them was the detection of localized areas of tissue hypoxia in the lungs of mice infected with A. fumigatus. The transcription factor hypoxia-inducible factor 1α (HIF 1α) is known as the central regulator of cellular responses to hypoxia. Under normoxia, this constitutively expressed protein is degraded by oxygen-dependent mechanisms in most mammalian cell types. Interaction with pathogens can induce HIF 1α stabilization under normoxic conditions in innate immune cells. Bacterial infection models revealed that hypoxic microenvironments and signaling via HIF 1α modulate functions of host immune cells. Moreover, it was recently described that in murine phagocytes, HIF 1α expression is essential to overcome an A. fumigatus infection. However, the influence of hypoxia and the role of HIF 1α signaling for anti-A. fumigatus immunity is still poorly understood, especially regarding dendritic cells (DCs), which are important regulators of anti-fungal immunity. In this study, the functional relevance of hypoxia and HIF 1α signaling in the response of human DCs against A. fumigatus has been investigated. Hypoxia attenuated the pro-inflammatory response of DCs against A. fumigatus during the initial infection as shown by genome-wide microarray expression analyses and cytokine quantification. The up-regulation of maturation-associated molecules on DCs stimulated with A. fumigatus under hypoxia was reduced; however, these DCs possessed an enhanced capacity to stimulate T cells. This study thereby revealed divergent influence of hypoxia on anti-A. fumigatus DC functions that included both, inhibiting and enhancing effects. HIF-1α was stabilized in DCs following stimulation with A. fumigatus under normoxic and hypoxic conditions. This stabilization was partially dependent on Dectin-1, the major receptor for A. fumigatus on human DCs. Using siRNA-based HIF 1α silencing combined with gene expression microarrays, a modulatory effect of HIF-1α on the anti-fungal immune response of human DCs was identified. Specifically, the transcriptomes of HIF-1α silenced DCs indicated that HIF-1α enhanced DC metabolism and cytokine release in response to A. fumigatus under normoxic and hypoxic conditions. This was confirmed by further down-stream analyses that included quantification of glycolytic activity and cytokine profiling of DCs. By that, this study demonstrated functional relevance of HIF 1α expression in DCs responding to A. fumigatus. The data give novel insight into the cellular functions of HIF 1α in human DCs that include regulation of the anti-fungal immune response under normoxia and hypoxia. The comprehensive transcriptome datasets in combination with the down-stream protein analyses from this study will promote further investigations to further characterize the complex interplay between hypoxia, activation of Dectin-1 and HIF-1α signaling in host responses against A. fumigatus.},
  subject      = {Immunologie},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Etter2024,
  author    = {Etter, Sonja},
  title     = {Einfluss von beruflicher \(Aspergillus\) \(fumigatus\)-Exposition auf die adaptive Immunantwort via ELISpot und Western Blot},
  doi       = {10.25972/OPUS-34858},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-348582},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2024},
  abstract  = {Bereits in Vorstudien konnte dargelegt werden, dass eine signifikante Korrelation zwischen der T-Zell-Zytokin-Antwort und der berufs- bzw. umweltbedingten Schimmelpilzbelastung besteht. Ziel der vorliegenden Studie war, eine m{\"o}gliche Kombination von Biomarkern ausfindig zu machen, die ver{\"a}nderte T-Zell-Antworten auf A. fumigatus- Antigene bei beruflich Exponierten im Vergleich zu Kontrollprobanden/-innen vorhersagen kann. Um geeignete Marker f{\"u}r das Bio-Monitoring zu finden, wurden zur T-Zell-Aktivierung ein myzeliales A. fumigatus - Lysat und 12 proteinogene Antigene in ELISpot-Versuchen f{\"u}r die Signaturzytokine IFN-γ (TH1), IL-5 (TH2) und IL-17A (TH17) der Haupt-TH-Subpopulationen getestet. Es zeigten sich bei den Biolandwirten/-innen erwartungsgem{\"a}ß erh{\"o}hte TH1- und TH2-Antworten auf die Mehrzahl der verwendeten spezifischen A. fumigatus-Antigene, die m{\"o}glicherweise eine Schimmelpilzbelastung serologisch nachweisbar machen. Insbesondere die spezifischen A. fumigatus-Antigene Aspf22, CatB und CipC konnten eine Trennsch{\"a}rfe zwischen den beiden Kohorten hinsichtlich ihrer IFN-γ- und IL-5-Zytokinantwort erzielen. Unterschiede in der TH17-Antwort aufgrund chronischer beruflicher Sporenbelastung ohne Krankheitskorrelat konnten nicht explizit festgestellt werden. Weiterhin ergab sich, dass erh{\"o}hte TH2-Immunreaktionen, sofern sie mit einer ad{\"a}quaten TH1-gerichteten Immunantwort einhergehen und damit eine ausgeglichene TH2/TH1-Balance besteht, nicht zwangsl{\"a}ufig zu Hypersensitivit{\"a}tserkrankungen f{\"u}hren. Im Vergleich zu Langzeitexponierten wurden teilweise {\"u}berlappende TH-Zellfrequenzen bei beruflich exponierten Biolandwirten/-innen ermittelt. Welche entscheidende Rolle Treg-Zellen bei der Eind{\"a}mmung {\"u}berschießender Immunantworten einnehmen, kann hieraus erahnt werden.},
  subject      = {Schimmelpilzallergie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Englert2020,
  author    = {Englert, Anne},
  title     = {Modulation der Immunantwort humaner NK-Zellen nach Stimulation mit steigenden Konzentrationen von Aspergillus fumigatus},
  doi       = {10.25972/OPUS-20233},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-202335},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {Diese Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit den antimykotischen Eigenschaften von NK-Zellen und dient der Charakterisierung der Immunantwort gegen{\"u}ber A. fumigatus in Abh{\"a}ngigkeit der MOI (Multiplizit{\"a}t der Infektion). Klinisch interessant ist dies bei immunsupprimierten Patienten mit invasiver Aspergillose. Anhand von Oberfl{\"a}chenmarkern konnten eine an die Pilzkonzentration angepasste Bindung und Aktivierung von NK-Zellen demonstriert werden. Daneben kam es zu einer Modulation der Freisetzung ausgew{\"a}hlter Zytokine nach Konfrontation mit steigenden Mengen von A. fumigatus. Besonders deutlich war der Effekt bei den Chemokinen CCL3 und CCL4, deren Zusammenhang mit Pilzinfektionen bereits gezeigt wurde. Die Ergebnisse zum MOI-abh{\"a}ngigen Verhalten von NK-Zellen gegen{\"u}ber A. fumigatus best{\"a}tigen die Relevanz bei der antimykotischen Immunantwort und verdeutlichen, weshalb ihnen zunehmende diagnostische und therapeutische Bedeutung zukommt.},
  subject      = {Nat{\"u}rliche Killerzelle},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Decker2020,
  author    = {Decker, Christina},
  title     = {Analyse der in-vitro Aktivit{\"a}t neutrophiler Granulozyten gegen{\"u}ber Aspergillus fumigatus unter dem Einfluss von Antimykotika und Immunsuppressiva},
  doi       = {10.25972/OPUS-20998},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-209983},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {Der ubiquit{\"a}r vorkommende Schimmelpilz Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) ist Haupterreger der invasiven Aspergillose (IA). Diese invasive Pilzinfektion tritt geh{\"a}uft bei Patienten mit immunsuppressiver Langzeit-Therapie z. B. nach allogener Stammzelltransplantation zur Prophylaxe und Therapie der Graft-versus-Host-Disease (GvHD) auf. Trotz der in-vitro-Suszeptibilit{\"a}t der Pilze gegen{\"u}ber verschiedenen Antimykotika ist die Erkrankung in diesem Patientenkollektiv weiterhin mit einer hohen Letalit{\"a}t assoziiert. Neben ihren direkten, antifungalen Eigenschaften wurden durch Antimykotika auch indirekte, modulierende Wirkungen auf die Funktionalit{\"a}t von Immunzellen beschrieben, die damit m{\"o}glicherweise das therapeutische Ansprechen dieser Erkrankung beeinflussen. Insbesondere neutrophile Granulozyten (PMN) spielen als Teil der angeborenen Immunit{\"a}t durch ihre Vielzahl an Abwehrmechanismen eine essentielle Rolle f{\"u}r die Bek{\"a}mpfung von invasiven Pilzinfektionen und damit der IA. Von zus{\"a}tzlicher Bedeutung und bislang kaum untersucht ist das kombinierte Einwirken von Antimykotika und Immunsuppressiva auf die Funktionalit{\"a}t dieser Zellen. In dieser Arbeit wurde daher in-vitro der Einfluss klinisch eingesetzter Antimykotika zur Therapie der IA (liposomales Amphotericin B bzw. Amphotericin B - Desoxycholat, Voriconazol) auf wichtige Effektorfunktionen humaner neutrophiler Granulozyten nach Exposition gegen{\"u}ber A. fumigatus untersucht. Im Fokus stand hierbei die Analyse des oxidativen Burst, der Interleukin (IL)-8-Freisetzung, der Bildung von neutrophil extracellular traps (NETs) sowie der Phagozytose-Aktivit{\"a}t dieser Immunzellen. Außerdem wurde der Effekt einer zus{\"a}tzlichen Gabe klinisch relevanter Immunsuppressiva (Ciclosporin A / Mycophenolat-Mofetil, Prednisolon), die zur Prophylaxe und Therapie der akuten GvHD eingesetzt werden, auf diese vier Funktionen evaluiert. Zusammenfassend ergaben unsere Analysen keinen Anhalt f{\"u}r eine relevante Beeinflussung des oxidativen Burst, der IL-8-Freisetzung und der Phagozytose-Aktivit{\"a}t neutrophiler Granulozyten durch die untersuchten Antimykotika, insbesondere gegen{\"u}ber A. fumigatus. Weiterhin wurden in dieser Arbeit keine signifikanten Differenzen zwischen dem Einfluss von liposomalem Amphotericin B und Amphotericin B - Desoxycholat beobachtet. Durch Prednisolon konnten {\"u}berwiegend bereits bekannte, immunsuppressive Wirkungen auf PMN best{\"a}tigt sowie zus{\"a}tzlich Hinweise auf eine Modulation Antimykotika-vermittelter Immuneffekte durch Immunsuppressiva gewonnen werden. Die kurze Exposition der PMN gegen{\"u}ber Ciclosporin A / Mycophenolat-Mofetil ergab keine signifikanten Ver{\"a}nderungen der Sekretion von reaktiven Sauerstoffspezies. Des Weiteren unterst{\"u}tzen unsere Daten Hinweise auf differente Aktivierungsmechanismen von verschiedenen Effektorfunktionen der PMN. Im Gegensatz zu den anderen untersuchten Funktionen konnte in dieser Arbeit eine signifikant verminderte Bildung von NETs durch liposomales Amphotericin B, Amphotericin B - Desoxycholat und auch Voriconazol beobachtet werden. Damit geben unsere Ergebnisse Anlass zu tiefergehenden Analysen des Zusammenspiels von Antimykotika insbesondere mit dem noch immer wenig verstandenen Mechanismus der Ausl{\"o}sung und Bildung von NETs. Zudem w{\"a}ren weitere Studien w{\"u}nschenswert, um einen umfassenderen {\"U}berblick und ein besseres Verst{\"a}ndnis auch hinsichtlich anderer invasiver Pilzinfektionen sowie weiterer Abwehrmechanismen zu erhalten.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{DasGupta2013,
  author    = {Das Gupta, Mithun},
  title     = {Analyse von MicroRNA-Profilen in humanen dendritischen Zellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-108326},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {The field of microRNA research has gained enormous significance during recent years. Current studies have shown that microRNAs play an important role in many biological processes via posttranscriptional gene regulation. This also applies for the TLR-mediated recognition of pathogens by immune cells. Among others, the microRNAs miR-132, miR-146a and miR-155 have been characterized by various authors. However, the specific role of microRNAs in the defense against fungal infections by Aspergillus fumigatus has not been investigated so far, although this ubiquitous mold causes severe infections in immuno-compromised patients. As dendritic cells play a pivotal part in the in vivo recognition of A. fumigatus, the present study investigates the reaction of these cells to A. fumigatus and other pathogens on the microRNA level. For this purpose, dendritic cells were incubated with different forms of A. fumigatus and other pathogens for up to twelve hours. Subsequently, the expression of miR-132, miR-146a and miR-155 was quantified by real-time PCR. Levels of miR-132 in dendritic cells were significantly increased after stimulation with living germ tubes of A. fum, but showed no change after treatment with LPS. Relative expression level of miR-146a was moderately elevated upon stimulation with LPS, but did not respond to co-cultivation with living germ tubes. MiR-155 was highly induced by both stimuli. These results show, that dependent on the stimulus, microRNAs are differentially regulated in dendritic cells. Among the tested microRNAs, miR-155 showed the strongest and most stable expression values. Therefore, further experiments focused on this mircoRNA. It was shown, that the up-regulation of miR-155 is dependent on the germination stage of the fungus. Induction of miR-155 was low with conidia, moderate with hyphae and high with germ tubes. The extent of miR-155 induction also corresponded with the multiplicity of infection (MOI), with higher MOIs triggering a stronger miR-155 response. These results suggest that miR-132 and miR-155 play an important role in the immunologic reaction of DCs against A. fumigatus and that a further characterization of these microRNA, especially with respect to their specific function in DCs, could contribute to the understanding of the biological mechanisms of Aspergillosis.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Czakai2015,
  author    = {Czakai, Kristin Bernadette},
  title     = {Interaktionen des humanpathogenen Pilzes Aspergillus fumigatus mit dem angeborenen Immunsystem und Thrombozyten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-117496},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Pilze sind in unserer Umwelt allgegenw{\"a}rtig und besiedeln im Fall von Candida albicans (C. albicans) sogar bei {\"u}ber 50\% der Menschen die Schleimh{\"a}ute, w{\"a}hrend Sporen von Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) t{\"a}glich {\"u}ber die Atmung in die Lunge des Menschen gelangen. Dennoch sind Erkrankungen, die durch diese zwei Pilze ausgel{\"o}st werden, bei gesunden Menschen selten. Ist jedoch das Immunsystem beeintr{\"a}chtigt, k{\"o}nnen diese Pilze zu systemischen und damit lebensbedrohlichen Erkrankungen wie der invasiven Aspergillose und der systemischen Candidiasis f{\"u}hren. F{\"u}r eine Verbesserung der Behandlung solcher Infektionen ist das genaue Verst{\"a}ndnis der Immunabwehrmechanismen entscheidend. Da A. fumigatus {\"u}ber die Lunge in den K{\"o}rper gelangt, wurden in dieser Arbeit die h{\"a}ufigsten Immunzellen der Lunge, die Makrophagen, und deren Immunantwort auf A. fumigatus untersucht. Parallel hierzu wurden dendritische Zellen (DCs) verwendet, die als Br{\"u}cke zwischen dem angeborenen und adaptiven Immunsystem wirken. Ein besonderes Augenmerk wurde hierbei auf A. fumigatus induzierte Genexpressions{\"a}nderungen und deren Regulationsmechanismen gelegt. Dabei wurden kurze, regulatorische RNAs, die sogenannten miRNAs, untersucht, die eine wichtige Rolle in der post-transkriptionalen Genregulation spielen. Bislang ist nur wenig {\"u}ber die miRNA-abh{\"a}ngigen Genregulationen in DCs, die auf eine Infektion mit A. fumigatus oder C. albicans reagieren, bekannt. Um alle durch A. fumigatus und C. albicans regulierten miRNAs zu identifizieren, wurden DCs mit A. fumigatus und C. albicans ko-kultiviert und anschließend eine Komplettsequenzierung der kurzen RNAs durchgef{\"u}hrt. Die Pilz-spezifische Induktion der miRNA-Regulation wurde zudem mit der miRNA-Regulation durch den bakteriellen Zellwandbestandteil Lipopolysaccharid verglichen. Durch die Stimulation mit Keimschl{\"a}uchen von A. fumigatus wurden die miRNAs miR-132-3p/5p, miR-155-5p, miR129-2-3p, miR-129-5p, miR-212-3p/5p und miR-9-5p in DCs induziert. Diese wurden ebenfalls durch C. albicans induziert, zudem noch die miRNAs miR-147a und miR-147b. Spezifisch f{\"u}r A. fumigatus war die Regulation der miR-129-2-3p. Neben dem miRNA-Profiling wurde auch das mRNA-Transkriptom {\"u}ber Microarrays analysiert und dadurch 18 potentielle Zielgene der Pilz-induzierten miRNAs identifiziert. Neben den Elementen der Translationsregulation wurden auch die Transkriptionsfaktoren untersucht. Als einziger unter den 60 regulierten Transkriptionsfaktoren zeigte KLF4 eine ver{\"a}nderte Expressionsrichtung in DCs, die mit Pilzen oder LPS behandelt waren. W{\"a}hrend die Stimulation mit LPS die Expression von KLF4 induzierte, wurde es durch die Pilze A. fumigatus und C. albicans reprimiert. In einer Untersuchung der unterschiedlichen A. fumigatus-Rezeptoren, wurde deren Einfluss auf die KLF4-Regulation gezeigt. W{\"a}hrend TLR4-Liganden KLF4 induzierten, f{\"u}hrten Liganden, die an die Rezeptoren TLR2/TLR1 und Dectin-1 binden, zu einer Reduktion von KLF4. Nach einem erfolgreich etablierten KLF4-knock-down mittels RNA-Interferenz wurden KLF4-Zielgene untersucht. W{\"a}hrend kein bzw. nur ein geringer Effekt auf die Genexpression von CCL2, RANTES, CXCL10 und TNF beobachtet wurde, sorgte der KLF4 knock-down f{\"u}r eine hoch signifikante Reduktion der IL6-Genexpression in LPS-stimulierten DCs. Um die KLF4-Regulation weiter zu untersuchen, wurde zudem eine weitere Zellpopulation des angeborenen Immunsystems, die Makrophagen, verwendet. Auch hier wurde die Immunantwort gegen A. fumigatus analysiert. Zudem wurde die Rolle der Thrombozyten als Immunmediatoren betrachtet. Zuerst wurde ein Zytokinprofil des pl{\"a}ttchenreichen Plasmas (PRP), das mit A. fumigatus stimuliert wurde, erstellt. In diesem konnte nur RANTES in hoher Konzentration nachgewiesen werden. Daraufhin wurde der Einfluss von PRP auf die Reifung von DCs, die Phagozytosef{\"a}higkeit von Makrophagen und DCs sowie der Einfluss von DCs und Makrophagen auf die metabolische Aktivit{\"a}t von A. fumigatus in An- und Abwesenheit von pl{\"a}ttchenreichem Plasma untersucht. Es konnte eine gering verst{\"a}rkte Reifung der DCs durch PRP gezeigt werden. Isolierte Thrombozyten konnten die Phagozytose von DCs steigern, w{\"a}hrend Makrophagen durch PRP verst{\"a}rkt Konidien phagozytierten. In einem genomweiten Transkriptomprofiling wurde die Immunantwort von DCs und Makrophagen verglichen. Zudem wurde untersucht, wie PRP die Immunantwort dieser Immunzellen beeinflusst. Es wurden 2 bzw. 24 Gene identifiziert, die signifikant in A. fumigatus-stimulierten DCs und Makrophagen reguliert waren. Hierbei wurde gezeigt, dass KLF4 durch die Zugabe von PRP herabreguliert wurde. Das zuvor beschriebene Zielgen IL6 wurde durch PRP in A. fumigatus-stimulierten DCs gegen{\"u}ber stimulierten DCs ohne PRP deutlich reduziert, wodurch sich eine immunmodulatorische F{\"a}higkeit des PRP zeigte. Die Induktion von IL-6, weiteren Zytokinen und der Reifemarker durch A. fumigatus in DCs wurden zudem in einem Booleschen Modell simuliert. Dieses Modell soll in Zukunft Vorhersagen {\"u}ber experimentelle Ergebnisse und dadurch eine optimale Versuchsvorbereitung erm{\"o}glichen.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Butters2007,
  author    = {Butters, Marlene},
  title     = {Etablierung und Evaluierung von quantitativen RT-PCR- und ELISA-Verfahren zur Bestimmung muriner Zytokinspiegel bei der Immunantwort gegen{\"u}ber Aspergillus fumigatus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-38890},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {In unserer Studie sollte die Genauigkeit der PCR zur Bestimmung von Zytokinspiegeln ermittelt werden. Mittels Blutproben von mit A. Fumigatus infizierten M{\"a}usen, sollte eine Aussage bez{\"u}glich der Immunantwort getroffen werden. Wir griffen TNF\&\#945;, IL-12p40 und IL-10 heraus, um einsch{\"a}tzen zu k{\"o}nnen, ob die Immunantwort eher humoral oder zellvermittelt abl{\"a}uft. Zur m{\"o}glichen Bestimmung der Sensitivit{\"a}t und Genauigkeit, wurden die crossing points der Standardverd{\"u}nnungsreihen jeweils einmal in einem Lauf dreifach, ausserdem jeweils in drei unabh{\"a}ngigen L{\"a}ufen von einander einfach eingesetzt, und miteinander verglichen. Unsere Ergebnisse decken sich mit den Ergebnissen aktueller Literatur und Etablierungen anderer Zytokine. Die Etablierung des ELISAs sollte dem Vergleich zwischen mRNA-Ebene und Proteinebene dienen. Zur richtigen Einordnung unserer Arbeiten mit dem Immunoassay m{\"u}ssen die Limitierungen der Ergebnisse beachtet werden. Die Versuche zur Quantifizierung der mRNA murinen TNF\&\#945;s aus den Versuchsserien misslang. Auch die erzielten Ergebnisse mit Protein-basierten Nachweisverfahren konnten letztendlich nicht suffizient beurteilt werden. Die großen Schwankungen in der Konzentration und die Widerspr{\"u}chlichkeit im Vergleich der Ergebnisse aktueller Literatur, machen eine Verf{\"a}lschung durch Kontamination mit Proteinen aus lysierten Zellen sehr wahrscheinlich. Die erzielten Ergebnisse der RT-PCR anhand der Inter- und Intra-Assay- Vergleiche jedoch k{\"o}nnen nachfolgenden Projekten dazu dienen, haupts{\"a}chlich das Instrument LightCycler in seiner Sensitivit{\"a}t und Genauigkeit einsch{\"a}tzen zu k{\"o}nnen, und so die ermittelten Daten besser verarbeiten zu k{\"o}nnen.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Burgert2018,
  author    = {Burgert, Anne},
  title     = {Untersuchung von Sphingolipiden und anderen Membrankonjugaten mittels hochaufl{\"o}sender Fluoreszenzmikroskopie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-145725},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {Methoden der Fluoreszenz-Lokalisationsmikroskopie (engl. single-molecule localization microscopy, SMLM) erm{\"o}glichen es Molek{\"u}le zu quantifizieren und deren Verteilung zu analysieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Membranmolek{\"u}le auf unterschiedlichen eukaryotischen Zellen, aber auch auf Prokaryoten mit dSTORM (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy) oder PALM (engl.: photoactivated localization microscopy) aufgenommen und quantifiziert. Bevor jedoch diese hochaufl{\"o}sende fluoreszenzbasierte Technik f{\"u}r biologische Fragestellungen angewendet werden konnten, mussten zun{\"a}chst potentielle Artefakt-ausl{\"o}sende Quellen identifiziert und Strategien gefunden werden, um diese zu eliminieren. Eine m{\"o}gliche Artefakt-Quelle ist eine zu niedrige Photonenzahl, die von Fluorophoren emittiert wird. Werden zu wenige Photonen detektiert, kann die Lokalisation eines Fluorophors weniger pr{\"a}zise bestimmt werden. Dies kann zu einer falschen Abbildung von Strukturen f{\"u}hren oder zu falschen R{\"u}ckschl{\"u}ssen {\"u}ber die Verteilung von Molek{\"u}len. Eine M{\"o}glichkeit die Anzahl der emittierten Photonen zu erh{\"o}hen, ist chemische Additive als Triplettl{\"o}scher einzusetzen. Sie bewirken, dass die Fluorophore wieder in den Grundzustand relaxieren und somit wieder angeregt werden k{\"o}nnen. Es wurden verschiedene Additive, die in der Literatur als Triplettl{\"o}scher beschrieben sind, getestet. Dazu wurden zun{\"a}chst ihre Auswirkungen auf den Triplettzustand verschiedener Fluorophore (Alexa Fluor (Al) 488, 532 und 647 und Atto655) mit Hilfe von Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) untersucht. Cyclooctatetraen (COT) bewirkte dabei eine Abnahme der Triplettausbeute von Al488, Al532 und Al647 um ~ 40-60\%, bei Atto655 ver{\"a}nderte sie sich nicht. Obwohl die Ergebnisse der FCS-Messungen darauf hindeuten, dass COT in einer erh{\"o}hten Anzahl an emittierten Photonen resultiert, konnte dies bei dSTORM-Messungen nicht best{\"a}tigt werden. Hier hatte COT nur einen gr{\"o}ßeren positiven Effekt auf das Fluorophor Al647 (Zunahme um ~ 60\%). Eine Erkl{\"a}rung f{\"u}r diese Widerspr{\"u}chlichkeit zu den Ergebnissen aus den FCS-Messungen, k{\"o}nnte das Vorhandensein des Schaltpuffers bei dSTORM-Messungen sein. Dieser bewirkt den {\"U}bergang der Fluorophore in den Aus-Zustand bzw. entzieht dem Puffer Sauerstoff. Bei der Zugabe von 5 mM Kaliumiodid (KI) nahm die Triplettamplitude bei FCS-Messungen nur bei Al488 ab (um ~ 80\%). Eine geringe Steigerung (um ~ 10\%) der Intensit{\"a}t von Al488 mit KI konnte bei dSTORM-Messungen mit niedrigen Konzentrationen (~ 0,5 mM) erzielt werden. Bei einer Konzentration von 5 mM sank die Intensit{\"a}t jedoch wieder um 40\%. Deuteriumoxid (D2O) soll, anders als die Triplettl{\"o}scher, eine Verbesserung der Photonenausbeute dadurch bewirken, dass strahlungslose Relaxationsprozesse minimiert werden. Mit dSTORM-Messungen konnte gezeigt werden, dass Atto655 und Al647 in D2O zwar pro An-Zustand mehr Photonen emittieren als in Schaltpuffer ohne D2O, da die Fluorophore hier jedoch schneller bleichen, letztendlich die gleiche Anzahl an Photonen detektiert werden. Um die Anzahl an emittierten Photonen zu erh{\"o}hen, eignet sich also nur COT bei dSTORM-Messungen mit AL647 und KI in sehr geringen Konzentrationen bei Al488. D2O kann eingesetzt werden, wenn eine Probe schnell vermessen werden muss, wie zum Beispiel bei Lebendzellmessungen. Nicht nur eine zu niedrige Photonenzahl, auch eine zu geringe Photoschaltrate kann Artefakte bei dSTORM-Messungen erzeugen. Dies wurde anhand von verschiedenen biologischen Strukturen, die mit unterschiedlichen Anregungsintensit{\"a}ten aufgenommen wurden, deutlich gemacht. Besonders die Aufnahmen von Plasmamembranen sind anf{\"a}llig f{\"u}r die Generierung von Artefakten. Sie weisen viele inhomogene und lokal dichte Regionen auf. Wenn nun mehr als ein Emitter pro µm² gleichzeitig an ist, erzeugt das Auswertungsprogramm große artifizielle Cluster. Die hier durchgef{\"u}hrten Messungen machen deutlich, wie wichtig es ist, dSTORM-Bilder immer auf m{\"o}gliche Artefakte hin zu untersuchen, besonders wenn Molek{\"u}le quantifiziert werden sollen. Daf{\"u}r m{\"u}ssen die unbearbeiteten Rohdaten sorgf{\"a}ltig gesichtet werden und notfalls die Messungen mit einer h{\"o}heren Laserleistung wiederholt werden. Da dSTORM mittlerweile immer mehr zur Quantifizierung eingesetzt wird und Clusteranalysen durchgef{\"u}hrt werden, w{\"a}re es sinnvoll bei Ver{\"o}ffentlichungen die Rohdaten von entscheidenden Aufnahmen der {\"O}ffentlichkeit zur Verf{\"u}gung zu stellen. Die F{\"a}rbemethode ist ein weiterer Punkt, durch den Artefakte bei der Abbildung von Molek{\"u}len mittels SMLM entstehen k{\"o}nnen. H{\"a}ufig werden Antik{\"o}rper zum Markieren verwendet. Dabei sollte darauf geachtet werden, dass m{\"o}glichst kleine Antik{\"o}rper oder Antik{\"o}rperfragmente verwendet werden, besonders wenn Clusteranalysen durchgef{\"u}hrt werden sollen. Anderenfalls leidet die Aufl{\"o}sung darunter, bzw. erh{\"o}ht sich die Gefahr der Kreuzvernetzung von Molek{\"u}len. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, wurden Plasmamembran-Ceramide untersucht. Ceramide geh{\"o}ren zu den Sphingolipiden und regulieren diverse zellul{\"a}re Prozesse. Verschiedene Stimuli bewirken eine Aktivierung von Sphingomyelinasen (SMasen), die Ceramide in der Plasmamembran synthetisieren. Steigt die Konzentration von Ceramiden in der Plasmamembran an, kondensieren diese zu Ceramid-reichen Plattformen (CRPs). Bisher ist noch wenig {\"u}ber die Verteilung der Ceramide und die Gr{\"o}ße der CRPs bekannt. Sie wurden hier {\"u}ber IgG-Antik{\"o}rper in der Plasmamembran von Jurkat-, U2OS-, HBME- und prim{\"a}ren T-Zellen angef{\"a}rbt und erstmals mit dSTORM hochaufgel{\"o}st, um sie dann zu quantifizieren. Unabh{\"a}ngig von der Zelllinie befanden sich 50\% aller Ceramidmolek{\"u}le in ~ 75 nm großen CRPs. Im Mittel bestanden die CRPs aus ~ 20 Ceramiden. Mit Hilfe einer Titrationsreihe konnte ausgeschlossen werden, dass diese Cluster nur durch die Antik{\"o}rper-F{\"a}rbung artifiziell erzeugt wurden. Bei Inkubation der Zellen mit Bacillus cereus Sphingomyelinase (bSMase) stieg die Gesamtkonzentration der Ceramide in der Plasmamembran an, ebenso wie die Ceramidanzahl innerhalb der CRPs, außerdem die Anzahl und Gr{\"o}ße der CRPs. Dies k{\"o}nnte zu einer Ver{\"a}nderung der L{\"o}slichkeit von Membrankomponenten f{\"u}hren, was wiederum eine Akkumulation bestimmter Rezeptoren oder eine Kompartimentierung bestimmter Proteine erleichtern k{\"o}nnte. Die Anh{\"a}ufung der Ceramide in den CRPs k{\"o}nnte ebenfalls die lokale Interaktion mit anderen Membranmolek{\"u}len erleichtern und dadurch m{\"o}glicherweise die Reaktivit{\"a}t von Rezeptoren ver{\"a}ndern. Mittels Azid-modifizierten Ceramidanaloga und kupferfreier Click-Chemie wurden Plasmamembran-Ceramide auch in lebenden Jurkat-Zellen mit Hilfe konfokaler Laser-Raster-Mikroskopie (CLSM, engl. confocal laser scanning microscopy) und Strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM, engl. structured illumination microscopy) untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Fetts{\"a}ure-Kettenl{\"a}nge und die Position des Azids bei den Ceramidanaloga eine entscheidende Rolle spielt, wie hoch das detektierte Signal in der Plasmamembran letztendlich ist. Die Versuche machen auch deutlich, dass die klickbaren Ceramidanaloga lebendzellkompatibel sind, sodass sie eine hervorragende M{\"o}glichkeit darstellen, zellul{\"a}re Reaktionen zu verfolgen. Es wurden hier nicht nur Ceramide in eukaryotischen Zellen analysiert, sondern auch in Bakterien. Neisseria meningitidis (N. meningitidis) sind gramnegative Bakterien, die im Menschen eine Sepsis oder eine Meningitis ausl{\"o}sen k{\"o}nnen. Es wurde mittels immunhistochemischen F{\"a}rbungen mit dem anti-Ceramid IgG-Antik{\"o}rper, aber auch mit den klickbaren Ceramidanaloga, ein Signal in der Membran erhalten, was mit dSTORM hochaufgel{\"o}st wurde. In anderen Bakterien wurden ebenfalls schon Sphingolipide nachgewiesen. Studien zu Ceramiden in N. meningitidis wurden bisher jedoch noch nicht ver{\"o}ffentlicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals Ergebnisse erhalten werden, die darauf hinweisen, dass N. meningitidis ebenfalls Ceramide besitzen k{\"o}nnten. In einem dritten Projekt wurde die Interaktion zwischen NK-Zellen und Aspergillus fumigatus untersucht. Der Schimmelpilz kann eine Invasive Aspergillose in immunsupprimierten Menschen ausl{\"o}sen, was zum Tod f{\"u}hren kann. Verschiedene Studien konnten schon zeigen, dass NK-Zellen eine wichtige Rolle bei der Bek{\"a}mpfung des Pilzes spielen. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass der NK-Zell-Marker CD56 entscheidend f{\"u}r die Pilzerkennung ist. Mit immunhistochemischen F{\"a}rbungen und LSM-, aber auch dSTORM-Messungen, konnte gezeigt werden, dass die normalerweise homogen verteilten CD56-Rezeptoren auf der Plasmamembran von NK-Zellen aktiv an die Interaktionsstelle zu A. fumigatus transportiert werden. Mit der Zeit akkumulieren hier immer mehr CD56-Proteine, w{\"a}hrend das Signal in der restlichen Membran immer weiter abnimmt. Es konnte erstmals CD56 als wichtiger Erkennungsrezeptor f{\"u}r A. fumigatus identifiziert werden. In dem letzten bearbeiteten Projekt, wurde die Bindung von Anti-N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor Enzephalitis Autoantik{\"o}rper an Neuronen untersucht. Bei einer Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis bilden die Patienten Autoantik{\"o}rper gegen die NR1-Untereinheit ihrer eigenen postsynaptischen NMDA-Rezeptoren. Da die Krankheit oft sehr sp{\"a}t erkannt wird und die Behandlungsm{\"o}glichkeiten noch sehr eingeschr{\"a}nkt sind, f{\"u}hrt sie noch oft zum Tod. Sie wurde erst vor wenigen Jahren beschrieben, sodass der genaue Mechanismus noch unbekannt ist. Im Rahmen dieser Arbeit, konnten erste F{\"a}rbungen mit aufgereinigten Antik{\"o}rper aus Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis Patienten an NMDA-Rezeptor-transfizierte HEK-Zellen und hippocampalen Maus-Neuronen durchgef{\"u}hrt und mit dSTORM hochaufgel{\"o}st werden. Mit den Messungen der HEK-Zellen konnte best{\"a}tigt werden, dass die Autoantik{\"o}rper an die NR1-Untereinheit der Rezeptoren binden. Es konnten erstmals auch die Bindung der Antik{\"o}rper an Neuronen hochaufgel{\"o}st werden. Dabei wurde sichtbar, dass die Antik{\"o}rper zum einen dicht gepackt in den Synapsen vorliegen, aber auch d{\"u}nner verteilt in den extrasynaptischen Regionen. Basierend auf der Ripley's H-Funktion konnten in den Synapsen große Cluster von ~ 90 nm Durchmesser und im Mittel ~ 500 Lokalisationen und extrasynaptisch kleinere Cluster mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ~ 70 nm und ~ 100 Lokalisationen ausgemacht werden. Diese ersten Ergebnisse legen den Grundstein f{\"u}r weitere Messungen, mit denen der Mechanismus der Krankheit untersucht werden kann.},
  subject      = {Ceramide},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Blockhaus2010,
  author    = {Blockhaus, Christian},
  title     = {Einfluss von Mycophenolat und Everolimus auf die Immunantwort humaner dendritischer Zellen gegen Aspergillus fumigatus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52593},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {In den letzten Jahren ist die Zahl immunsupprimierter Patienten aufgrund des stetigen Fortschritts in der Medizin stark angestiegen. Die bei diesen Patienten wegen ihrer hohen Mortalit{\"a}t gef{\"u}rchtete, durch A. fumigatus ausgel{\"o}ste invasive Aspergillose (IA) hat trotz der Anwendung verbesserter Antimykotika zugenommen. Die beiden Medikamente Mycophenolat (MPA) und Everolimus (RAD) werden zur Immunsuppression verwendet. Sie wirken durch die Inhibition von B- und T-Zellen. Allerdings wurde auch der direkte Einfluss auf DCs beschrieben. Diese Entdeckung ist insofern von Relevanz, als DCs eine wichtige regulatorische Rolle bei der Abwehr von Erregern, so auch von Pilzen, spielen und als Bindeglied zwischen dem angeborenen und erworbenen Immunsystem fungieren. DCs sind außerdem in den vergangenen Jahren in den Fokus der Wissenschaft geraten, da sie m{\"o}glicherweise als Impfstoffe gegen verschiedenste Krankheiten, darunter auch die IA, eingesetzt werden k{\"o}nnen. Da die IA vor allem Patienten mit geschw{\"a}chtem Immunsystem trifft, ist es von Bedeutung, die Wirkung von Immunsuppressiva auf DCs besser zu verstehen. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von MPA und RAD auf die Entwicklung, die Reifung und die Immunantwort von aus Monozyten differenzierten DCs (moDCs) nach Kontakt mit A. fumigatus untersucht. Hierzu wurden die Medikamente zu verschiedenen Zeitpunkten der DC-Entwicklung hinzugef{\"u}gt. Es konnte gezeigt werden, dass vor allem der Entwicklungsprozess der DCs beeintr{\"a}chtigt wird. Neben einer verminderten Zytokinexpression von DCs nach Kontakt mit A. fumigatus wurde auch eine Ver{\"a}nderung der Oberfl{\"a}chenmarkerstruktur sowohl bei unreifen DCs (iDC) als auch bei reifen DCs (mDC) festgestellt. Des Weiteren wurde die F{\"a}higkeit von DCs zur Phagozytose durch die Medikamente vermindert. Beide Substanzen, vor allem aber RAD, zeigten zudem eine starke Zytotoxizit{\"a}t gegen{\"u}ber den Zellen. Es konnte in dieser Arbeit deutlich gemacht werden, dass sowohl MPA als auch RAD die Entwicklung und Reifung von moDCs beeinflussen, was zu einer Beeintr{\"a}chtigung ihrer Immunantwort gegen A. fumigatus f{\"u}hrt.},
  subject      = {Dendritische Zelle},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Bergmann2011,
  author    = {Bergmann, Anna},
  title     = {Untersuchungen zur Verwertung proteinhaltiger Substrate als m{\"o}gliche Virulenzdeterminante des humanpathogenen Schimmelpilzes Aspergillus fumigatus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67333},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Die asexuellen Sporen von Aspergillus fumigatus sind ubiquit{\"a}r verbreitete Luftkeime. Als Saprophyt ist dieser opportunistisch humanpathogene Pilz darauf spezialisiert, polymere Substanzen aus dem umgebenden Milieu zu zersetzen, um daraus die von ihm ben{\"o}tigten N{\"a}hrstoffe zu generieren und aufzunehmen. Die F{\"a}higkeit, verschiedene Stickstoff- und Kohlenstoffquellen zu verwerten, tr{\"a}gt dabei zu seiner Virulenz bei und hierbei scheint die extrazellul{\"a}re Proteolyse eine wichtige Rolle zu spielen. Sekretierte Proteasen, die das umgebende Gewebe w{\"a}hrend einer Infektion mit A. fumigatus erschließen, k{\"o}nnten somit zu dessen Pathogenit{\"a}t beitragen. Dementsprechend sollte im Rahmen dieser Arbeit die Bedeutung einer Regulation der extrazellul{\"a}ren proteolytischen Aktivit{\"a}t von A. fumigatus f{\"u}r dessen Virulenz untersucht werden. Dies geschah durch Untersuchungen eines konservierten Transkriptionsfaktors, PrtT. Dabei stellte sich heraus, dass PrtT die Expression der drei Hauptproteasen von A. fumigatus, Alp, Mep und Pep stark beeinflusst, in einem murinen Tiermodell der pulmonaren Aspergillose scheint dieser Regulator jedoch keine Rolle f{\"u}r die Pathogenit{\"a}t von A. fumigatus zu spielen. Um einen weiteren Aspekt des pilzlichen Aminos{\"a}urestoffwechsels zu beleuchten, wurde die Biosynthese der aromatischen Aminos{\"a}uren als m{\"o}gliche Virulenzdeterminate untersucht. F{\"u}r den Menschen sind diese Aminos{\"a}uren essentiell, weshalb dieser Syntheseweg ein m{\"o}gliches Ziel f{\"u}r antimykotische Substanzen darstellen k{\"o}nnte. Es konnten mehrere f{\"u}r A. fumigatus essentielle Komponenten des Shikimatweges identifiziert werden, des Weiteren wurden Deletionsmutanten in den Genen aroC und trpA, die f{\"u}r die Chorismatmutase bzw. Anthranilatsynthase der Biosynthese von Phenylalanin und Tyrosin bzw. Tryptophan kodieren, erzeugt und ph{\"a}notypisch charakterisiert. Deren Untersuchung in einem alternativen Tiermodell der Aspergillose zeigte eine deutlich attenuierte Virulenz. Diese Ergebnisse verdeutlichen, wie wichtig die Biosynthese der aromatischen Aminos{\"a}uren f{\"u}r das Wachstum von A. fumigatus ist, und dass ein Eingriff in diesen Syntheseweg eine lohnende Strategie zur Entwicklung neuer Antimykotika sein k{\"o}nnte. Die hier pr{\"a}sentierten Ergebnisse unterstreichen die f{\"u}r den Schimmelpilz A. fumigatus typische Redundanz bez{\"u}glich extrazellul{\"a}rer proteolytischer Enzyme und dass diese nur bedingt hinsichtlich ihres Virulenzbeitrags untersucht werden k{\"o}nnen. Im Gegensatz hierzu lassen sich bestimmte Stoffwechselwege, die oftmals durch einzigartige Genprodukte katalysiert werden, unter Umst{\"a}nden besser als unspezifische aber vielversprechende Virulenzdeterminanten identifizieren.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{BeitzenHeineke2015,
  author    = {Beitzen-Heineke, Antonia},
  title     = {Invariant Natural Killer T cells possess immune-modulating functions during \(Aspergillus\) \(fumigatus\) infection},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-144966},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Aspergillus fumigatus is the most common cause for invasive fungal infections, a disease associated with high mortality in immune-compromised patients. CD1d-restricted invariant Natural Killer T (iNKT) cells compose a small subset of T cells known to impact the immune response towards various infectious pathogens. To investigate the role of human iNKT cells during A. fumigatus infection, we studied their activation as determined by CD69 expression and cytokine production in response to distinct fungal morphotypes in the presence of different CD1d⁺ antigen presenting cells using flow cytometry and multiplex ELISA. Among CD1d⁺ subpopulations, CD1d⁺CD1c⁺ mDCs showed the highest potential to activate iNKT cells on a per cell basis. The presence of A. fumigatus decreased this effect of CD1d⁺CD1c⁺ mDCs on iNKT cells and led to reduced secretion of TNF-α, G-CSF and RANTES. Production of other Th1 and Th2 cytokines was not affected by the fungus, suggesting an immune-modulating function for human iNKT cells during A. fumigatus infection.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Bauer2011,
  author    = {Bauer, Ruth},
  title     = {Interaktionen von humanen Immuneffektorzellpopulationen mit dem humanpathogenen Pilz Aspergillus fumigatus, sowie der Einfluss von40-0-[2-Hydroxyethyl]rapamycin (RAD) auf deren Funktionen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65499},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Durch die Immunsuppression bei Patienten nach Stammzell- oder Organtransplantation erh{\"o}ht sich das Risiko f{\"u}r opportunistische Infektionen wie invasive Aspergillose (IA). IA wird haupts{\"a}chlich durch den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus, der durch die Luft {\"u}bertragen wird, verursacht. Deshalb haben Erkennung und Therapie von IA in den letzten Jahren eine immer gr{\"o}ßere Bedeutung erlangt. F{\"u}r eine erfolgreiche Behandlung sind die Mechanismen des Immunsystems nach Kontaktaufnahme mit dem Pathogen von zentraler Bedeutung. Die Erstinfektion mit A. fumigatus findet in der Lunge statt. Als Bewohner der Alveolen wurden deshalb dendritische Zellen (DCs) auf ihre F{\"a}higkeiten hin untersucht, das Immunsystem anzuregen. DCs besitzen vor allem die wichtigen Aufgaben, das Immunsystem zu modulieren und T-Lymphozyten zur Proliferation anzuregen. Ein Großteil dieser Arbeit befasst sich mit der Analyse des Einflusses des Immunsuppressivums 40-0-[2-Hydroxyethyl]rapamycin (RAD) auf neutrophile Granulozyten und auf die in vitro Generierung von moDCs sowie deren F{\"a}higkeit mit dem Pathogen A. fumigatus zu interagieren. RAD bindet an das zytosolische FK506 bindende Protein (FKBP12), wodurch die Kinase mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibiert und somit die T-Zellantwort unterdr{\"u}ckt wird. Klinische Anwendung findet RAD bereits, um eine Immunsuppression bei Patienten nach Stammzell- oder Organtransplantation zu erhalten. Der oxidative Burst neutrophiler Granulozyten war nach RAD-Behandlung und Konfrontation mit A. fumigatus signifikant verringert. Die Generierung der moDCs aus Monozyten erfolgte {\"u}ber 7 Tage, wobei ab dem Tag der Isolation der Monozyten 10 nM RAD oder EtOH zur Kontrolle hinzugegeben wurde. RAD zeigte vielf{\"a}ltige Effekte auf die Immunfunktion dendritischer Zellen. Obwohl sich keine {\"A}nderung in der Differenzierung der moDCs fand, was durch die Oberfl{\"a}chenmarker CD1a+, CD14- und HLA-DR+ {\"u}berpr{\"u}ft wurde, zeigte sich eine signifikante Reduktion der Rezeptoren TLR4 und Dectin-1 sowie der kostimulatorischen Molek{\"u}le CD40, CD83 und CD86. Nach Konfrontation mit A. fumigatus verblieb CD40 unter RAD Behandlung signifikant reduziert, w{\"a}hrend CD83 genau dieses Schema als Trend aufwies. Ferner wies CD86 sowohl in der Kontrolle als auch mit RAD-Behandlung die gleiche Expression auf. Nach 6 h Konfrontation der moDCs mit A. fumigatus waren die Zytokine IL-12, TNF-α und CCL20 auf Genexpressionsebene unter RAD reduziert, was sich auf Proteinebene teilweise best{\"a}tigen ließ, da sich hier erst nach 12 h eine signifikante Reduktion von IL-12, TNF-α und CCL20 in RAD-behandelten Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen zeigte. Des Weiteren war das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 signifikant reduziert. Die Phagozytose sowohl von FITC-Dextran-Beads als auch von A. fumigatus Konidien und zugleich die Sch{\"a}digung von A. fumigatus Keimschl{\"a}uchen war in unreifen RAD-behandelten moDCs signifikant reduziert. Ob moDCs, die mit RAD behandelt wurden, schlechter in der Lage waren, CD8+-T-Lymphozyten zur Proliferation anzuregen, geht nicht mit Sicherheit aus dieser Studie hervor, da große spenderabh{\"a}ngige Unterschiede auftraten. Es wurde zudem ein Vergleich von in vitro aus Monozyten differenzierten DCs (moDCs) und myeloiden DCs (mDCs) angefertigt. Mittels eines home-made Microarrays, der vor allem Gene mit einschloss, die f{\"u}r Zytokine und Rezeptoren von Immunzellen kodieren, konnten in einem Modell der fr{\"u}hen IA in der Lunge differentiell regulierte Gene nach Konfrontation mit A. fumigatus identifiziert werden. Es wurden insgesamt 30 Gene mehr als 2-fach reguliert, wie zum Beispiel die Interleukine und Chemokine IL-1β, IL-8, CXCL2, CCL3, CCL4 und CCL20, der Immunrezeptor PTX3 und der Transkriptionsfaktor Nf-κB. Generell konnte beobachtet werden, dass moDCs mehr regulierte Gene aufwiesen als mDCs. Zuletzt wurde betrachtet, ob der Knock-down von CXCL10, dessen Fehlen ein erh{\"o}htes Risiko f{\"u}r IA nach sich zieht, einen Einfluss auf moDCs hat, so dass sie schlechter auf A. fumigatus reagieren k{\"o}nnen. Diese Hypothese konnte in dieser Studie nicht best{\"a}tigt werden, da kein Unterschied in der Zytokinproduktion oder Expression kostimulatorischer Molek{\"u}le zwischen Kontroll-moDCs und moDCs, in denen das CXCL10-Gen ausgeschaltet wurde, festgestellt werden konnte. Zusammenfassend l{\"a}sst sich sagen, dass durch die Microarray-Analyse wichtige Gene in moDCs und mDCs identifizierbar waren, die nach Konfrontation mit A. fumigatus reguliert wurden. Zudem fanden sich lediglich minimale Unterschiede zwischen artifiziellen DCs und myeloiden DCs, die direkt aus dem K{\"o}rper isoliert wurden. Eine Behandlung mit RAD erh{\"o}ht das Risiko eines Patienten an invasiver Aspergillose zu erkranken unabh{\"a}ngig von der Eigenschaft des RAD, die Proliferation von T-Lymphozyten zu inhibieren.},
  subject      = {Aspergillus fumigatus},
  language  = {de}
}