@phdthesis{Bermel2006, author = {Bermel, Christina Maria}, title = {Regulation von G-beta-gamma-Untereinheiten durch Phosducin-{\"a}hnliche Proteine (PhLP)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19981}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Phosducin-like protein (PhLP) geh{\"o}rt zur Phosducinfamilie der G-Protein-betagamma-Regulatoren und kommt in zwei Spleißvarianten vor. Die lange Isoform PhLPlong und die kurze Isoform PhLPshort unterscheiden sich allein durch das Vorhandensein des 81 Aminos{\"a}uren langen N-Terminus von PhLPlong. In Versuchen mit gereinigten Proteinen erwies sich PhLPlong als der st{\"a}rkere Gbetagamma-Inhibitor, w{\"a}hrend die Bedeutung von PhLPshort nicht bekannt war. In dieser Arbeit wird gezeigt, daß in transfizierten HEK 293-Zellen PhLPshort die Gbetagamma-vermittelte Signalbildung 20mal st{\"a}rker hemmt als PhLPlong. Da der zus{\"a}tzliche N-Terminus von PhLPlong mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen f{\"u}r die konstitutiv aktive Caseinkinase 2 besitzt, wurde angenommen, daß die lange Spleißvariante in Zellen einer solchen Regulation unterliegt, was sich auf seine Funktion als Gbetagamma-Inhibitor auswirkt. Durch schrittweise Trunkierungen bzw. Serin-/Threonin-Alaninmutationen wurden die potentiellen Phosphorylierungsstellen entfernt, was zur Verbesserung der Gbetagamma-Hemmf{\"a}higkeit f{\"u}hrte. Der N-terminale Aminos{\"a}urenabschnitt Ser-18/Thr-19/Ser-20 wurde dabei als die verantwortliche Stelle identifiziert. In unserer Arbeitsgruppe wurde gezeigt, daß PhLPlong in HEK 293-Zellen im Gegensatz zu PhLPshort einer konstitutiven Phosphorylierung unterliegt und durch die Caseinkinase2 katalysiert wird. In dieser Arbeit werden die Phosphorylierung von PhLPlong durch die Caseinkinase2 anhand von rekombinanten Proteinen sowie ihre Kinetik dargestellt. Das Vorhandensein von mRNA der Caseinkinase2 in HEK 293-Zellen zeigt, daß sie in der Zelle exprimiert und somit aktiv ist, was ihre physiologische Bedeutung herausstellt. Eine direkte Gbetagamma-Bindung konnte durch Immunpr{\"a}zipitation nur f{\"u}r PhLPlong nachgewiesen werden, weswegen f{\"u}r PhLPshort ein alternativer Mechanismus der Gbetagamma-Hemmung angenommen wurde, was in folgenden Arbeiten n{\"a}her untersucht wurde.}, language = {de} } @phdthesis{Behr2006, author = {Behr, Bj{\"o}rn}, title = {Neue Mutanten des humanen beta1-adrenergen Rezeptors zeigen f{\"u}r die Rezeptoraktivierung relevante Aminos{\"a}uren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19074}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Eine durch Aktivierung eines G-Protein gekoppelten Rezeptors induzierte Konfirmations{\"a}nderung resultiert in einer Signaltransduktion durch das G-Protein zu einem Effektorenzym wie der Adenylylcyclase. In dieser Arbeit konnten Aminos{\"a}uren in dem zur G-Protein gekoppelten Rezeptorfamilie zugeh{\"o}rigen beta1-adrenergen Rezeptor identifiziert werden, welche f{\"u}r dessen Aktivierung von Bedeutung sind. Der Analyse von beta1-adrenergen Rezeptormutanten lag die Erkenntnis zu Grunde, dass therapeutisch genutzte Liganden wie Terbutalin, oder das experimentell eingesetzte Broxaterol Agonisten am beta2- und beta3-adrenergen Rezeptor, jedoch Antagonisten am beta1-adrenergen Rezeptor sind. Dieses Verhalten wurde zum Anlass genommen spezifische Aminos{\"a}uren zu identifizieren, welche eine bedeutende Funktion in der Aktivierung von beta -Rezeptorsubtypen haben k{\"o}nnten. Nach einem Aminos{\"a}urevergleich innerhalb der Familie der beta-adrenergen Rezeptoren konnten Aminos{\"a}urepositionen identifiziert werden, die identisch im beta2- bzw. beta3-Rezeptor sind und sich von denen des beta1- Rezeptors unterscheiden und damit das Aktivierungsprofil von Broxaterol und Terbutalin widerspiegeln. Mit zielgerichteten Punktmutationen wurden nun insbesondere im Bereich der Transmembranregionen solche Aminos{\"a}uren im beta1-adrenergen Rezeptor durch die entsprechende des beta2- (beta3-) Rezeptors ersetzt. Obwohl keine der getesteten Mutanten Unterschiede im pharmakologischen Bindungsprofil zeigten, konnten vier Mutanten gefunden werden, welche partiell oder vollst{\"a}ndig durch Broxaterol oder Terbutalin aktiviert wurden. Die beiden Mutanten I185L sowie D212N konnten mit Broxaterol und Terbutalin aktiviert werden, zwei Liganden, die Antagonisten am beta1- Wildtyprezeptor sind. Außerdem konnten zwei weitere Mutanten, V120L und K253R, durch Terbutalin aktiviert werden. Betrachtet man die Struktur von Terbutalin, so ist dieser Ligand den endogenen Katecholaminen {\"a}hnlicher als Broxaterol. Ein Rezeptormodell zeigt, dass die vier relevanten Aminos{\"a}uren außerhalb der Ligandenbindungsregion liegen und somit eine direkte Interaktion mit dem Liganden unwahrscheinlich erscheint. Diese These wird durch das im Vergleich zum Wildtyp nicht ver{\"a}nderte Bindungsprofil der beta1-Rezeptormutanten unterst{\"u}tzt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Aminos{\"a}uren V120, I185, D212 und K253 in der ligandeninduzierten Konfirmations{\"a}nderung des beta1-Rezeptors von Bedeutung sind.}, language = {de} } @phdthesis{Klenk2006, author = {Klenk, Johann Christoph}, title = {Posttranslationale Modifikation von Phosducin durch den small ubiquitin-related modifier "SUMO"}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19140}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Die Rezeptor vermittelte Aktivierung heterotrimerer G-Proteine ist einer der bedeutendsten Signaltransduktionsmechanismen in vielen Organismen. Die Vielzahl unterschiedlicher Rezeptoren und Agonisten macht eine effektive Kontrolle des einzelnen Signals unumg{\"a}nglich. Das zytosolische Protein Phosducin bindet beta-gamma-Untereinheiten aktivierter G-Proteine und hemmt damit sowohl Gbeta-gamma-vermittelte Effekte als auch Galpha-vermittelte Effekte. In der vorliegenden Arbeit wurde neben der bekannten 33 kDa Form von Phosducin eine weitere 47 kDa große Form in der Retina und im Herz identifiziert. Hierbei handelte es sich um Phosducin, welches mit dem small ubiquitin-related modifier, SUMO, modifiziert war. Weiterhin wurde sowohl in vitro als auch in zellul{\"a}ren Sytemen gezeigt, dass Phosducin mit einem Molek{\"u}l SUMO an Lysin 33 modifiziert wird. Durch punktgerichtete Mutation dieser Modifikationsstelle wurde eine SUMOylierungs-defiziente Phosducin-Mutante generiert. Diese Mutante unterliegt einem gesteigerten Turnover im Vergleich zu Wildtyp-Phosducin, welcher auf die verst{\"a}rke Ubiquitinierung und dem damit verbundenen proteasomalen Abbau der Mutante zur{\"u}ckzuf{\"u}hren war. Dies demonstriert, dass SUMOylierung von Phosducin protektive Wirkung auf dieses Protein hat. Dar{\"u}berhinaus behindert die SUMOylierung von Phosducin dessen Bindung an Gbeta-gamma-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine. Diese Beobachtungen erlauben den Schluss, dass SUMOylierung neben der Phosphorylierung ein neuer und wichtiger Mechanismus ist, {\"u}ber den die Verf{\"u}gbarkeit von Phosducin als G-Protein-Regulator kontrolliert wird.}, language = {de} } @phdthesis{Merkle2007, author = {Merkle, Sabine}, title = {Kardiale Caspase-1 ist ein proapoptotischer Induktor f{\"u}r Herzinsuffizienz}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25938}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Herzmuskelschw{\"a}che (Herzinsuffizienz) ist in industralisierten L{\"a}ndern neben malignen Erkrankungen noch immer die zweith{\"a}ufigste Todesursache. Das Zusammenspiel der zu einer Herzmuskelschw{\"a}che f{\"u}hrenden, molekularen Signalwege und die zugrunde liegenden Mechanismen sind trotz intensiver Forschung bisher noch weitgehend unverstanden. Ein detailierteres Verst{\"a}ndnis der Entstehung einer Herzinsuffizienz k{\"o}nnte somit entscheidend zur Entwicklung innovativer Therapiestrategien beitragen. Mit Hilfe eines cDNA Expressions Arrays wurde die differentielle Genexpression in einem murinen Herzinsuffizienzmodell untersucht. Die Cysteinprotease Caspase-1 ist eines der in diesem Array identifizierten Kandidatengene. Die verst{\"a}rkte Expression der Caspase-1 konnte zun{\"a}chst sowohl f{\"u}r die murine als auch die humane Herzinsuffizienz verifiziert werden. Caspasen werden klassischerweise, ihrer Funktion entsprechend, in proinflammatorische und proapoptotische Caspasen unterteilt. In der Literatur ist Caspase-1 als ein {\"u}ber die Generierung von aktivem IL-1? und IL-18 wirkender, proinflammatorischer Mediator beschrieben. IL-? und IL-18 sind proinflammatorische Zytokine und als solche zentrale Mediatoren bei entz{\"u}ndlichen Prozessen. W{\"a}hrend die Funktion der proapoptotischen Caspasen bei Herzmuskelschw{\"a}che weitgehend bekannt ist, ist unklar, welche Bedeutung der verst{\"a}rkten kardialen Expression der Caspase-1 bei der Entstehung und Progression der Herzmuskelschw{\"a}che zukommt. Zur funktionellen Analyse der verst{\"a}rkten Expression der Caspase-1 in vivo wurde die Caspase-1 in einem transgenen Mausmodell kardial {\"u}berexprimiert. Herzen mit verst{\"a}rkter Expression der Caspase-1 entwickelten ab dem vierten Lebensmonat morphologische und funktionelle Ver{\"a}nderungen, die charakteristisch f{\"u}r eine angehende Herzinsuffizienz sind. Dennoch war, trotz progressiver Kardiomyozytenhypertrophie und Myokardfibrose, zu keinem Zeitpunkt des untersuchten Zeitraumes (ein bis vierzehn Monate alt) eine Zunahme des Ventrikelgewichtes evident. Die funktionelle Analyse der Herzfunktion von neun Monate alten Caspase-1-transgenen M{\"a}usen zeigte eine signifikante Einschr{\"a}nkung der Linksherzkontraktilit{\"a}t. Diese Herzinsuffizienz war schließlich auch makroskopisch an einer starken Linksherzdilatation als auch an einer Reduktion der linksventrikul{\"a}ren Wandst{\"a}rke erkennbar. Ist die Induktion einer Herzinsuffizienz durch Caspase-1 als proinflammatorischer Mediator im Herzen zu erkl{\"a}ren? In einer Reihe von Versuchen konnten keine Hinweise auf eine Induktion inflammatorischer Prozesse durch kardiale Caspase-1 festgestellt werden. Weder eine verst{\"a}rkte Bildung der proinflammatorischen Zytokine IL-1? und IL-18, noch eine vermehrte Infiltration von Entz{\"u}ndungszellen oder eine verst{\"a}rkte Proteinexpression weiterer Zytokine waren detektierbar. Ferner waren der oxidative Stresstatus und der nekrotische Gewebeuntergang im linksventrikul{\"a}ren Myokard Caspase-1-transgener M{\"a}use unver{\"a}ndert. Doch besonders im Herzmuskelgewebe junger Caspase-1-transgener M{\"a}use zeigte sich eine deutliche, mit fortschreitendem Alter bestehende Zunahme des apoptotischen Zelltods von Herzmuskelzellen. Diese direkte, proapoptotische Wirkung der kardialen Caspase-1 konnte ebenfalls in isolierten Kardiomyozyten von Caspase-1-transgenen M{\"a}usen ex vivo und in vitro, nach adenoviraler Infektion von neonatalen Rattenkardiomyozyten (NRCM) mit Caspase-1, demonstriert werden. Durch Infektion von NRCM mit dem Caspase-1-exprimierenden Adenovirus (Adv-Casp-1) konnte eine selektive Aktivierung des intrinsischen apoptotischen Signaltransduktionsweges durch Caspase-1 nachgewiesen werden. Ist die endogen exprimierte Caspase-1 ein westenlicher Regulator kardialer Apoptose? In dem Kardiomyozytenapoptose-induzierenden Sch{\"a}digungsmodell der Isch{\"a}mie/Reperfusion waren die Caspase-1-defizienten M{\"a}use durch eine Reduktion der Kardiomyozytenapoptose um nahezu 75\% gegen{\"u}ber der Kontrollgruppe deutlich beg{\"u}nstigt. Des Weiteren zeigte die Ausschaltung der endogenen Caspase-1 in dem Herzinsuffizienzmodell des operativen Herzinfarkts eine deutliche Verminderung der reaktiven Kardiomyozytenhypertrophie und eine geringere Einschr{\"a}nkung der Herzkontraktilit{\"a}t. Diese Verbesserung des kardialen Ph{\"a}notyps spiegelte sich ferner in einer reduzierten Sterblichkeit gegen{\"u}ber der Kontrollgruppe wieder. Eine Inhibition der Caspase-1 stellt somit ein interessantes therapeutisches Target zur Pr{\"a}vention der Entwicklung einer Herzinsuffizienz dar.}, subject = {Herzinsuffizienz}, language = {de} } @phdthesis{Kampfinger2007, author = {Kampfinger, Katja}, title = {Nachweis einer Mismatch-Reparatur-Defizienz in L5178Y Tk+/--3.7.2C-Mauslymphomzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-26023}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Die Entwicklung und Zulassung von Arzneimitteln sowie die Bewertung von Xenobio-tika erfordern eine Reihe von Testsystemen zur Toxizit{\"a}tsermittlung. F{\"u}r die {\"U}berpr{\"u}fung der Gentoxizit{\"a}t stehen eine Vielzahl etablierter Testsysteme zur Verf{\"u}gung, die oft auf Krebszelllinien basieren. Krebszelllinien haben jedoch die Eigenschaft, neben den f{\"u}r die Testung notwendigen Ver{\"a}nderungen weitere Ver{\"a}nderungen zu tragen, die zu Reaktionen f{\"u}hren k{\"o}nnen, wie sie in den Prim{\"a}rzellen des Organismus nicht auftreten. Daher ist die Kenntnis des genetischen Hintergrunds der verwendeten Krebszelllinien wertvoll, um Testergebnisse bewerten und gentoxische Risikopotentiale absch{\"a}tzen zu k{\"o}nnen. Die Mauslymphomzelllinie L5178Y nimmt unter den auf Krebszellen basierenden Testsystemen eine besondere Stellung ein, da sie die weltweit in der Gentoxizi-t{\"a}tspr{\"u}fung am h{\"a}ufigsten eingesetzte Zelllinie ist. In der vorliegenden Arbeit wurde in dieser Zellllinie eine Ver{\"a}nderung nachgewiesen, die das Mismatch-Reparatur-System (MMR-System) betrifft. Bei der MMR handelt es sich um einen Mechanismus, der daran beteiligt ist, die Integrit{\"a}t des Genoms zu gew{\"a}hrleisten. In MMR-profizienten Zellen werden Fehler in der DNA, die bei der Replikation, der homologen Rekombination oder durch {\"a}ußere gentoxische Einwirkungen entstehen, entweder erkannt und repariert, oder die gesch{\"a}digten Zellen werden durch die Induktion von Apoptosen eliminiert. Im Gegensatz dazu {\"u}berleben MMR-defiziente Zellen trotz gravierender DNA-Sch{\"a}den und akkumulieren diese. In der vorliegenden Arbeit wurde die Akkumulierung von Genomsch{\"a}den bei L5178Y-Zellen als Reaktion auf Behandlung mit alkylierenden Agenzien beobachtet, w{\"a}hrend andere Vergleichszelllinien Apoptosen induzierten. Dieses Verhalten der L5178Y-Zellen, das in der Literatur bei MMR-defizienten Zellen f{\"u}r alkylierende Agenzien beschrieben ist, f{\"u}hrte zu der Vermutung, dass die L5178Y-Zellen einen MMR-defizienten Ph{\"a}notyp aufweisen. Dieser MMR-defiziente Ph{\"a}notyp wurde durch gezielte Behandlung von L5178Y-Zellen und Zellen mit bekanntem MMR-Status mit dem alkylierenden Agenz MNNG und dem anschließenden Vergleich der Reaktionen gepr{\"u}ft und best{\"a}tigt. Der Ver-gleich erfolgte durch den Nachweis gentoxischer Effekte im Mikrokern-Test und im Comet Assay. Auf Proteinebene konnte f{\"u}r den gezeigten MMR-defizienten Ph{\"a}notyp bei den drei wichtigsten, in die MMR involvierten Proteine, MLH1, MSH2 und MSH6 keine Ursa-che gefunden werden: Alle untersuchten Proteine zeigten eine Expression, die mit denen der MMR-profizienten Kontrollzelllinien vergleichbar war. Auf DNA-Ebene wurde durch die Analyse aller bekannter, in die MMR involvierter Gene durch die Sequenzierung der kodierenden Bereiche als wichtigste Ver{\"a}nde-rung eine Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 gefunden. Diese f{\"u}hrt nach 260 Aminos{\"a}uren zu einer Leserasterverschiebung und nach 313 Aminos{\"a}uren zu einem Abbruch der Aminos{\"a}uresequenz aufgrund eines Stop-Codons. Zwar ist somit die Information f{\"u}r den N-terminalen Bereich von PMS2, der die DNA-Bindedom{\"a}ne und die ATP-ase aktiven Stellen beinhaltet, vorhanden, die f{\"u}r den C-Terminus hingegen, der f{\"u}r die Dimerisierung mit dem MMR-Protein MLH1 und damit f{\"u}r die Funktion essentiell ist, fehlt. Insgesamt wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die L5178Y-Zelllinie MMR-defizient ist. Mit der Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 wurde eine molekulare Ursache gefunden, die diese Defizienz erkl{\"a}ren kann. Daraus folgt f{\"u}r den Einsatz der L5178Y-Zelllinie in Gentoxizit{\"a}tstests, dass die Ber{\"u}cksichtigung ihrer MMR-Defizienz die M{\"o}glichkeit der Bewertung von Testergebnissen erheblich erweitern kann.}, subject = {Maus}, language = {de} } @phdthesis{Knaus2007, author = {Knaus, Anne Elizabeth}, title = {Pharmacological target proteins of alpha2-agonists in alpha2ABC-deficient mice}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23752}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Clonidine is an agonist at alpha2-adrenergic receptors that mediate a wide variety of the physiological responses to epinephrine and norepinephrine, such as inhibition of neurotransmitter release as well as sedation and analgesia. As with other therapeutically used alpha2-agonists such as moxonidine and rilmenidine, clonidine possesses an imidazoline structure and is believed to lower blood pressure not only via central and peripheral alpha2-receptors, but perhaps even more so by acting on central "imidazoline I1 receptors" in the brain stem. The molecular structure of these hypothetical "imidazoline I1 receptors" has not yet been identified. In order to test whether ligands with an imidazoline structure elicit pharmacological effects via alpha2-adrenergic receptors or via "imidazoline receptors", mice were generated with a targeted deletion of all three alpha2-adrenergic receptor subtypes (alpha2ABC-KO). These alpha2ABC-KO mice were an ideal model in which to examine the pharmacological effects of the centrally acting antihypertensives clonidine, moxonidine and rilmenidine in the absence of alpha2-adrenergic receptors. As expected, sedative and analgesic actions of clonidine were completely absent in alpha2ABC-KO mice, confirming the sole role of alpha2-receptors in these properties of clonidine. Clonidine significantly lowered heart rate in anesthetized alpha2ABC-KO and wild-type mice by up to 150 beats/min. A similar bradycardic effect of clonidine was observed in isolated spontaneously beating right atria from alpha2ABC-KO mice. After treatment with the specific If inhibitor ZD 7288, clonidine was no longer able to lower spontaneous beating frequency, suggesting a common site of action. Furthermore, in HEK293 cells stably transfected with HCN2 and HCN4, it could be shown that clonidine inhibits the If current via blockade of pacemaker channels with similar affinity as in isolated alpha2ABC-KO and wild-type atria. This inhibition was demonstrated again in isolated sinoatrial node (SAN) cells from alpha2ABC-KO mice and was identical in potency and efficacy to clonidine inhibition observed in isolated wild-type SAN cells, confirming that inhibition of atrial HCN channels constitutes the alpha2-independent bradycardic action of clonidine. Direct inhibition of cardiac HCN pacemaker channels contributes to the bradycardic effects of clonidine in gene-targeted mice. Thus clonidine-like drugs represent novel structures for future HCN channel inhibitors.}, language = {en} } @phdthesis{Schober2007, author = {Schober, Tilmann}, title = {Erh{\"o}hte Calcium-Empfindlichkeit der kardialen Myofilamente - ein Mechanismus bei der Entstehung von Herzrhythmusst{\"o}rungen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-33298}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Die vorliegende Studie zeigt erstmals, dass eine erh{\"o}hte Ca2+-Empfindlichkeit der kardialen Myofilamente im Tiermodell einen selbstst{\"a}ndigen Risikofaktor bei der Entstehung von Herzrhythmusst{\"o}rungen darstellt. Dies konnte sowohl f{\"u}r chronische Erh{\"o}hung der Ca2+-Empfindlichkeit im Rahmen einer Famili{\"a}ren Hypertrophen Kardiomyopathie (FHK) als auch f{\"u}r eine akute Erh{\"o}hung mit Hilfe eines Ca2+-Sensitizers gezeigt werden. Die Ergebnisse der Arbeit bieten so eine m{\"o}gliche Erkl{\"a}rung f{\"u}r pl{\"o}tzlichen Herztod bei bestimmten Patienten mit FHK. Sie schr{\"a}nken weiterhin den Einsatz von Ca2+-Sensitizern ein. Schließlich beleuchten sie einen bisher kaum untersuchten Aspekt in der Arrhythmogenese von Herzinsuffizienz und nach einem Myokard-Infarkt. Auf zellul{\"a}rer Ebene findet sich ein ver{\"a}nderter Ca2+-Zyklus mit erniedrigten und verlangsamten Transienten. Diese Ver{\"a}nderungen sind wahrscheinlich eine direkte Konsequenz der erh{\"o}hten Bindungsaffinit{\"a}t f{\"u}r Ca2+. Die Myofilamente sind „klebriger" f{\"u}r Ca2+, w{\"a}hrend der Systole wird mehr Ca2+ gebunden, w{\"a}hrend der Diastole hingegen dissoziiert es langsamer. Bei adrenerger Stimulation und schnellen Herzfrequenzen mit entsprechender Verk{\"u}rzung der Diastole kommt es zu erh{\"o}htem diastolischem [Ca2+]i und zu erh{\"o}hten Ca2+-Inhalt des Sarkoplasmatischen Retikulums. Der so ver{\"a}nderte Ca2+-Zyklus f{\"u}hrt wahrscheinlich mit Hilfe des Na+/Ca2+-Austauschers zu Ver{\"a}nderungen der Repolarisation des Aktionspotentials. Bei schnellen Herzfrequenzen treten Aktionspotential-Verl{\"a}ngerung, Ca2+-abh{\"a}ngige Nachdepolarisationen und getriggerte Schl{\"a}ge auf. Auf Organ-Ebene findet sich eine verk{\"u}rzte Refrakt{\"a}rzeit. Damit sind sowohl ein Trigger als auch ein arrhythmogenes Substrat f{\"u}r die beobachteten ventrikul{\"a}ren Arrhythmien gegeben.}, subject = {Herzrhythmusst{\"o}rung}, language = {de} } @phdthesis{Sevastiadis2007, author = {Sevastiadis, Emmanouil}, title = {Mikrokernfrequenz peripherer Lymphozyten bei Dialyse- und Pr{\"a}dialysepatienten sowie bei gesunden Probanden nach in vitro Behandlung mit Methylmethansulfonat}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-33283}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Nierenerkrankungen und die dazu geh{\"o}rige Nierenersatztherapien spiegeln im Verlauf der letzten f{\"u}nfzig Jahren die rasanten Entwicklungen der heutigen hochtechnisierten Medizin wider. Durch die zunehmende Lebenserwartung der Patienten unter langj{\"a}hrigen Blutreinigungsverfahren werden Probleme sichtbar, die vorher nicht zu erwarten waren, insbesondere ist hier die schwerwiegende Problematik der erh{\"o}hten Malignominzidenz in dieser Bev{\"o}lkerungspopulation hervorzuheben. Die Ursachenforschung und die Pr{\"a}vention dieser erh{\"o}hten Malignominzidenz wird immer wichtiger. Die Zahl der Betroffenen steigt kontinuierlich. "Moderne" Erkrankungen wie Diabetes mellitus und arterielle Hypertonie, die zur terminalen Niereninsuffizienz f{\"u}hren, haben die Dimension von Volkserkrankungen erreicht. Die Entstehung von Mikrokernen im Zellplasma neben dem eigentlichen Zellkern steht im dringendem Verdacht, dass sie einen Schritt in der Mutationsinduktion und Kanzerogenese darstellen und/oder diese Entwicklung anzeigen. Die Mikrokernfrequenz wird auch als Marker f{\"u}r eine akzidentelle oder chronische Sch{\"a}digung des Genmaterials (z.B. nach beruflicher Exposition) genutzt. Auf zellul{\"a}rer Ebene ist die Mikrokerninduktion auch Zeichen einer herabgesetzten Funktion der DNA-Repairmechanismen. Defekte dieser Mechanismen beg{\"u}nstigen nachgewiesenermaßen die Entstehung von Malignomen aller Art. Ziel der Arbeit war zu zeigen ob die in vivo beobachtete erh{\"o}hte Malignominzidenz bei Patienten unter H{\"a}modialyse auch in Mikrokernfrequenzen abgebildet werden kann. Hier wurde die in vitro Behandlung mit einer bekannten kanzerogenen Substanz verwendet, um eine eventuell ver{\"a}nderte zellul{\"a}re Antwort in Form von gesteigerter Mikrokernfrequenzen in vitro zu provozieren. Dies wird als indirektes Zeichen der DNA-Repairf{\"a}higkeit angesehen. Als Substanz wurde Methylmethansulfonat verwendet. Die daf{\"u}r modifizierte Methodik mit der Zusatz des kanzerogenen Methylmethansulfonat in Konzentrationen von 10, 20 und 40 µg/ml war ein zus{\"a}tzlicher Stress f{\"u}r die Zellkulturen. Diese ließ aber in ausreichendem Maße die Vermehrung und Induktion von doppelkernigen Lymphozyten zu, so dass die Registrierung der Mikrokerne glaubhaft und repr{\"a}sentativ war. Es wurden drei Gruppen von Probanden untersucht: Personen unter Dialyse, Patienten in einem Pr{\"a}dialysestadium und nierengesunde Probanden als Kontrollgruppe. Die H{\"a}modialysepatienten zeigten keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zu den Kontrollpatienten. Tendenziell erh{\"o}hte Mikrokernraten zeigten die Pr{\"a}dialysepatienten in allen Kategorien. Erwartungsgem{\"a}ß war bei {\"a}lteren Personen-Subgruppen eine gesteigterte Rate an in vitro induzierten Mikrokernen nach Erh{\"o}hung der kanzerogenen Substanzkonzentration zu finden. Es m{\"u}ssen sicherlich weitere Faktoren identifiziert werden, um den genetischen Schaden durch die verminderte DNA-Repairkapazit{\"a}t in Form von Mikrokernen zuverl{\"a}ssig abbilden zu k{\"o}nnen. Hier k{\"o}nnten eine Mindestdauer der Dialyse von 10 Jahren sowie ein Kreatininwert von {\"u}ber 5 mg/dl eine entscheidende Rolle spielen.}, subject = {H{\"a}modialyse}, language = {de} } @phdthesis{Adelhardt2007, author = {Adelhardt, Melanie}, title = {Einfluß der Dialysetherapie auf den Genomschaden von Nierenpatienten in einer prospektiven Studie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23123}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz haben im Vergleich zur Normalbev{\"o}lkerung eine deutlich erh{\"o}hte Inzidenz maligner Erkrankungen. Fr{\"u}here Untersuchungen zeigten, dass periphere Blutlymphozyten dieser Patienten einen h{\"o}heren genetischen Schaden aufweisen, wodurch das Risiko einer malignen Entartung steigt. In dieser Arbeit wurde der genetische Schaden mithilfe zweier Testverfahren, Comet Assay und Mikrokerntest, untersucht. Es handelte sich um eine prospektive Studie mit zwei Patientenkollektiven. Die erste Gruppe bestand aus Patienten, die aufgrund einer terminalen Niereninsuffizienz innerhalb der n{\"a}chsten Monate eine Dialysetherapie mittels konventioneller H{\"a}modialyse beginnen mußten. Die zweite Gruppe bildeten Dialysepatienten, die im Verlauf von konventioneller Dialyse auf H{\"a}modiafiltration umgestellt wurden. Bei allen Patienten wurde der genetische Schaden der peripheren Blutlymphozyten in den Monaten vor und nach Therapiebeginn bzw. Therapieumstellung regelm{\"a}ßig untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass 4 der 10 Pr{\"a}dialysepatienten nach Beginn der Dialyse einen niedrigeren genetischen Schaden hatten, 2 Patienten hatten unterschiedliche Werte in Comet Assay und Mikrokerntest und bei 2 Patienten ergab sich im Verlauf eine h{\"o}here DNA-Sch{\"a}digung. Die verbliebenen 2 Patienten mußten aufgrund einer konstant bleibenden Niereninsuffizienz nicht mit der Dialysetherapie beginnen. Bei Zusammenfassung aller Einzelwerte zeigte sich, dass das Kollektiv der Pr{\"a}dialysepatienten insgesamt vom Beginn der Behandlung profitiert hat. In der Gruppe der Dialysepatienten hatte 2 von 7 Patienten nach Umstellung auf H{\"a}modiafiltration eine geringere DNA-Sch{\"a}digung, 2 Patienten zeigten unterschiedliche Ergebnisse im Comet Assay und Mikrokerntest und 2 weitere Patienten wiesen eine h{\"o}heren genetischen Schaden in den Lymphozyten auf. Ein Patient konnte bei fehlenden Vorwerten nicht ber{\"u}cksichtigt werden. Im Gruppenvergleich zeigte sich f{\"u}r alle Dialysepatienten ein gleichbleibender DNA-Schaden, gemessen mithilfe des Comet Assays bei leicht erh{\"o}hten Mikrokernraten. Jedoch hatte sich die Zellproliferation ebenfalls etwas verbessert. Zusammenfassend ergibt sich somit in beiden Gruppen kein eindeutiges Ergebnis, woraus neue Therapieempfehlungen f{\"u}r Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz abzuleiten w{\"a}ren. Um weiter Einflußvariablen auf die H{\"o}he des genetischen Schadens festzustellen, sind weiter Untersuchungen mit gr{\"o}ßeren Patientenkollektiven erforderlich.}, language = {de} } @phdthesis{Brink2007, author = {Brink, Andreas}, title = {The biological significance of chemically-induced DNA adducts in relation to background DNA damage}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23850}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {No abstract available}, subject = {DNS-Sch{\"a}digung}, language = {en} } @phdthesis{Winkler2007, author = {Winkler, Michaela}, title = {Einfluss einer fortgesetzten Benfotiamintherapie auf die Konzentration zirkulierender Advanced Glycation Endproducts, proinflammatorischer Zytokine und DNA-L{\"a}sionen bei H{\"a}modialysepatienten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27563}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Der Einsatz der Vitamin B 1 Vorstufe Benfotiamin hat sich im Tiermodell durch Verhinderung oder gar Aufhebung typischer diabetischer Folgesch{\"a}den wie Ne- phropathie, Retinopathie und Neuropathie ausgezeichnet. Diese Wirkung wird unter anderem der Aktivit{\"a}tssteigerung des Enzyms Transketolase zugeschrie- ben, welches auch bei Dialysepatienten ohne diabetische Grunderkrankung sup- primiert ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Auswirkungen einer ora- len Benfotiaminsubstitution auf den Stoffwechsel von Langzeith{\"a}modialysepati- enten zu untersuchen. Die 15 rekrutierten Patienten mit und ohne Diabetes mel- litus erhielten {\"u}ber einen Zeitraum von 2 Monaten eine Dosis von 300 mg/d Benfotiamin, die in den folgenden 2 Monaten bis maximal 450 mg/d gesteigert wurde. Um einen Eindruck {\"u}ber den Verlauf der Entz{\"u}ndungssituation und des oxidativen Stresses zu gewinnen, wurden im Patientenvollblut AGEs und pro- inflammatorische Zytokine gemessen. Außerdem wurden peripheren Lympho- zyten mit Hilfe des alkaline Comet-Assay und des Mikrokerntestes auf DNA- Sch{\"a}digungen analysiert. In beiden Patientengruppen l{\"a}sst die Senkung der Mi- krokernraten den Schluss zu, dass Benfotiamin DNA-Sch{\"a}den und somit eventu- ell das Krebsrisiko reduziert. Dieses vielversprechende Ergebnis korreliert jedoch nicht mit dem Resultat des Comet-Assay. Da hier der relative DNA-Schaden ten- dentiell ansteigt, sollte es Ziel weiterer Studien sein, diesen Sachverhalt an ei- nem gr{\"o}ßeren Patientenkollektiv mit Kontrollgruppen zu {\"u}berpr{\"u}fen. Eventuell ist letzteres Testsystem wegen seiner hohen Sensitivit{\"a}t in diesem Fall nicht op- timal geeignet. Außerdem sollte gezielt auf die beobachtete schnellere und st{\"a}r- kere Mikrokernsenkung der diabetischen Patienten eingegangen werden, da die- se in der vorliegenden Studie zahlenm{\"a}ßig unterrepr{\"a}sentiert waren. Positiv zu bewerten ist der leichte CRP-Abfall sowie der Anstieg des Gesamtproteins und Albumin im Serum, was auf eine Reduktion der Mikroinflammation und oder eine verbesserte Ern{\"a}hrungssituation hinweist. Andererseits spricht der Anstieg des Neopterin- und Interleukin 6-Spiegels gegen die Ver{\"a}nderung des Inflamma- tionsstatus. Entgegen der Erwartung ließ sich in dieser Studie keine Reduktion der zirkulierenden AGEs und AOPPs im Serum erzielen. Um eine Reduktion des oxidativen Stresses besser beurteilen zu k{\"o}nnen, sollten in Folgestudien direkte und leicht ver{\"a}nderliche Marker wie der Glutathionspiegel verwendet werden. Zusammenfassend reduzierte Benfotiamin bei H{\"a}modialysepatienten mit und ohne Diabetes mellitus DNA-Sch{\"a}den in peripheren Lymphozyten bei unver- {\"a}nderter Inflammationssituation und steigerte die Plasmaproteinkonzentration. Dies wurde eventuell durch Reduktion von oxidativem Stress und oder Beein- flussung seiner Ursachen wie Reduktion von Ur{\"a}mietoxinen erreicht.Weitere kli- nische Studien sind notwendig, um dieses vielversprechende Medikament in der t{\"a}glichen Praxis einsetzen zu k{\"o}nnen. Besonders vorteilhaft ist seine gute Vertr{\"a}g- lichkeit auch in hoher Dosierung. Dar{\"u}ber hinaus soll das Pr{\"a}parat auch neuro- patische Schmerzen reduzieren, die sich bei Dialysepatienten h{\"a}ufig manifestie- ren, und wirkt somit multikausal.}, subject = {Benfotiamin}, language = {de} } @phdthesis{Hommers2008, author = {Hommers, Leif}, title = {Modulation der Einw{\"a}rtsgleichrichrichtung von GIRK-Kan{\"a}len durch G-Protein Untereinheiten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-40388}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {G-Protein-gekoppelte einw{\"a}rtsgleichrichtende Kalium-Kan{\"a}le sind durch zwei Eigenschaften gekennzeichnet: (I) Die Leitf{\"a}higkeit f{\"u}r K+-Ionen ist positiv des Kalium-Gleichgewichtspotentials reduziert und (II) die Kanal-Aktivit{\"a}t wird durch Bindung von G betagamma-Dimere heterotrimerer Gi/o-Proteine reguliert. In der Literatur wurde die Aktivierung von GIRK-Kan{\"a}len als eine Zunahme ihrer Offenwahrscheinlichkeit unabh{\"a}ngig vom Membranpotential beschrieben. Die vorliegenden Untersuchungen zeigten, dass es bei starker Aktivierung des GIRK-Kanals durch G betagamma-Dimere auch zu einer Abschw{\"a}chung der Einw{\"a}rtsgleichrichtung kommt. Im heterologen Expressionssystem konnte bei Rezeptor-Stimulation mit Agonist die Einw{\"a}rtsgleichrichtung von GIRK-Kan{\"a}len abh{\"a}ngig von der St{\"a}rke der Koexpression von G betagamma-Dimeren geschw{\"a}cht werden. Dieser Effekt entstand nicht durch eine Ver{\"a}nderung der Affinit{\"a}t, mit der Polyamine und Mg2+-Ionen den GIRK-Kanal membranpotentialabh{\"a}ngig blockieren. Die Kinetik, mit der Polyamine den GIRK-Kanal blockieren, war nicht ver{\"a}ndert; eine Erh{\"o}hung der intrazellul{\"a}ren Mg2+-Konzentration um den Faktor 20 konnte eine Abschw{\"a}chung der Einw{\"a}rtsgleichrichtung nicht mindern. Es wurde vermutet, dass eine {\"A}nderung der Konformation von Strukturen nahe des Selektivit{\"a}tsfilters die Abschw{\"a}chung der Einw{\"a}rtsgleichrichtung verursacht. Gest{\"u}tzt wurde diese Vermutung zum einen dadurch, dass Ba2+- und Cs+-Ionen, die von extrazellul{\"a}rer Seite her den Kanal an Strukturen nahe des Selektivit{\"a}tsfilters blockieren k{\"o}nnen, unter schwach einw{\"a}rtsgleichrichtenden Bedingungen eine geringere Bindungsaffinit{\"a}t hatten und zum anderen dadurch, dass das relative Ausmaß des GIRK-Kanal-Blocks durch Cs+-Ionen mit der St{\"a}rke der Einw{\"a}rtsgleichrichtung korrelierte.}, subject = {GIRK}, language = {de} } @phdthesis{Schickinger2008, author = {Schickinger, Stefanie}, title = {Funktionsanalyse alpha2-adrenerger Rezeptoren auf molekularer und transgener Ebene}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-31667}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {alpha2-adrenerge Rezeptoren, von denen drei verschiedene Subtypen (alpha2A, alpha2B, alpha2C) kloniert wurden, geh{\"o}ren zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und vermitteln vielf{\"a}ltige physiologische Funktionen der Transmitter Adrenalin und Noradrenalin. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Rezeptorsubtypen, die subzellul{\"a}re Lokalisation von Rezeptoren oder der Differenzierungsstatus einer Zelle f{\"u}r die funktionelle Diversit{\"a}t der alpha2-Rezeptor-Effekte in vivo verantwortlich sind. Im ersten Teil des Projektes wurde ein transgenes Mausmodell untersucht, bei dem selektiv alpha2A-Rezeptoren unter Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase Promotors in adrenergen Neuronen exprimiert wurden. In diesem Modell sollte getestet werden, ob ein einzelner Rezeptorsubtyp in den verschiedenen Neuronen des sympathischen Nervensystems in vivo identische Funktionen hat. Transgene alpha2A-Rezeptoren hemmten in vivo zwar die Freisetzung von Noradrenalin aus sympathischen Nervenfasern nicht aber die Exozytose von Adrenalin aus dem Nebennierenmark. Deshalb stellte sich die Frage, ob die Rezeptorfunktion von der Morphologie, dem Differenzierungsstatus der Zellen oder von der subzellul{\"a}ren Lokalisation der Rezeptoren abh{\"a}ngt. Hierf{\"u}r wurden alpha2A-Rezeptoren durch Varianten des gr{\"u}n fluoreszierenden Proteins markiert und mittels FRET-Fluoreszenzmikroskopie untersucht. In PC12 Ph{\"a}ochromozytomzellen, die durch NGF zum Auswachsen neuronaler Forts{\"a}tze stimuliert wurden, waren die Agonist-bedingten Konformations{\"a}nderungen von alpha2A-Rezeptoren jedoch weder vom Differenzierungsstatus der Zellen noch von deren subzellul{\"a}rer Lokalisation abh{\"a}ngig. Lediglich in transient transfizierten Zellen waren im Vergleich zu stabil transfizierten Zellen h{\"o}here Agonist-Konzentrationen zur Rezeptoraktivierung erforderlich. Diese Befunde zeigen, dass zus{\"a}tzlich zur Diversit{\"a}t der Rezeptorsubtypen auf Proteinebene der zellul{\"a}re Kontext, in dem ein Rezeptor exprimiert wird, eine ganz wesentliche Rolle f{\"u}r dessen Funktion spielt.}, subject = {Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer}, language = {de} } @phdthesis{Fink2008, author = {Fink, Kristin}, title = {Toxins in Renal Disease and Dialysis Therapy : Genotoxic Potential and Mechanisms}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-31082}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {In patients suffering from end-stage renal disease who are treated by hemodialysis genomic damage as well as cancer incidence is elevated. One possible cause for the increased genomic damage could be the accumulation of genotoxic substances in the blood of patients. Two possible sources for those toxins have to be considered. The first possibility is that substances from dialysers, the blood tubing system or even contaminated dialysis solutions may leach into the blood of the patients during dialysis. Secondly, the loss of renal filtration leads to an accumulation of substances which are normally excreted by the kidney. If those substances possess toxic potential, they are called uremic toxins. Several of these uremic toxins are potentially genotoxic. Within this thesis several exemplary uremic toxins have been tested for genotoxic effects (homocysteine, homocysteine-thiolactone,leptine, advanced glycated end-products). Additionally, it was analysed whether substances are leaching from dialysers or blood tubing and whether they cause effects in in vitrotoxicity testing. The focus of chemical analytisis was on bisphenol A (BPA), the main component of plastics used in dialysers and dialyser membranes.}, subject = {Bisphenol A}, language = {en} } @phdthesis{Nickel2008, author = {Nickel, Florian}, title = {UCP2 und DIPP2alpha als differentiell exprimierte Kandidatengene in einem murinen Modell der Herzinsuffizienz}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-34502}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Die Herzinsuffizienz ist eine der f{\"u}hrenden Todesursachen weltweit. Eine auf die neurohumorale Aktivierung zugeschnittene Therapie mit ACE-Hemmern bzw. Angiotensin-Rezeptorantagonisten, Betablockern, Aldosteronantagonisten und Diuretika verbessert zwar die Symptomatik und Prognose. Letztere ist bei Diagnosestellung jedoch immer noch schlechter als die vieler maligner Erkrankungen einzusch{\"a}tzen. Ziel ist daher die Entwicklung von Medikamenten, die den Krankheitsverlauf des Syndroms Herzinsuffizienz aufhalten bzw. umkehren. Ein Ansatz ist dabei die Analyse sogenannter Kandidatengene, die im kranken Herzen differentiell exprimiert werden und potentiell medikament{\"o}s beeinflussbar sind. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei solcher Kandidatengene charakterisiert. M{\"a}use mit kardialer {\"U}berexpression b1-adrenerger Rezeptoren entwickeln eine Herzinsuffizienz mit kardialer Hypertrophie und Fibrose. In Gen Arrays mit 21000 Maus-ESTs zeigten sich unter anderem die Gene des Uncoupling Protein 2 (UCP2) und der Diphosphoinositol-Polyphosphat-Phosphohydrolase 2 alpha (DIPP2a) aktiviert. Diese Befunde wurden zun{\"a}chst mittels RNase Protection Assay und RT-PCR best{\"a}tigt. Auch andere murine Herzinsuffizienzmodelle wurden untersucht. So ließ sich ebenfalls im druckinduzierten Herzinsuffizienzmodell nach artifizieller Aortenstenose sowie im b2-AR {\"u}berexprimierenden Herzen eine erh{\"o}hte Konzentration von UCP2- und DIPP2a-mRNA messen. Um zu pr{\"u}fen, ob diese differentielle mRNA-Expression delet{\"a}re oder protektive Effekte vermittelt, wurden jeweils transgene Mauslinien mit herzspezifischer {\"U}berexpression von UCP2 und DIPP2a generiert. Die Linie UCP2-TG1 mit hoher {\"U}berexpression sowie ein Gr{\"u}nder-Tier der UCP2-transgenen M{\"a}use entwickelten eine Herzinsuffizienz mit vergr{\"o}ßertem Herzen, linksventrikul{\"a}rem Pumpversagen, interstitieller Fibrose und typischen Ver{\"a}nderungen der molekularen Marker ANF und SERCA. Zudem fanden sich dilatierte Vorh{\"o}fe sowie eine bradykarde Herzrhythmusst{\"o}rung. UCP2 ist ein Entkoppler der oxidativen Phosphorylierung im Mitochondrium. Im energieintensiven Stoffwechsel des Myokards k{\"o}nnte eine durch UCP2 reduzierte ATP-Synthese zu den genannten Ver{\"a}nderungen f{\"u}hren. F{\"u}r UCP2 wurden auch protektive Eigenschaften durch das Abfangen freier Radikale beschrieben. Die Linie UCP2-TG3 mit niedrigerem {\"U}berexpressionsniveau und ohne kardialen Ph{\"a}notyp wurde deshalb einem Aortic banding unterzogen, wo sich in der {\"U}berlebenskurve kein protektiver oder delet{\"a}rer Effekt einer moderat vermehrten Entkopplung im Vergleich zum Wildtyp zeigte. In drei unabh{\"a}ngigen Linien transgener M{\"a}use mit herzspezifischer {\"U}berexpression von DIPP2a ließ sich morphometrisch eine kardiale Hypertrophie nachweisen. Die Linie DIPP2a-TG9 mit dem h{\"o}chsten {\"U}berexpressionsniveau zeigte zudem eine kardiale Fibrose sowie unter Dobutamin eine verminderte kardiale Kontraktilit{\"a}tsreserve im Vergleich zum Wildtypen. DIPP-Proteine hydrolysieren Inositolphosphate und Nukleosiddiphosphate und greifen so in zentrale Stoffwechselvorg{\"a}nge ein, die im einzelnen noch nicht gekl{\"a}rt sind. Es konnte hier im Mausmodell gezeigt werden, dass UCP2 und DIPP2a zwei f{\"u}r die Entwicklung einer Herzinsuffizienz relevante Zielproteine darstellen. Geplant ist die weitere Aufkl{\"a}rung der beteiligten Mechanismen, um diese letztlich auch therapeutisch beeinflussen zu k{\"o}nnen.}, subject = {UCP2-Protein}, language = {de} } @phdthesis{Wagner2008, author = {Wagner, Silvia}, title = {Identifizierung von Biomarkern mittels LC-MS-basiertem Metabonomics - Merkapturs{\"a}uren als Indikatoren f{\"u}r die Bildung toxischer Intermediate}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35760}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Metabonomics bildet das Ende der Omics-Kaskade und stellt eine top-down-Strategie zur Erfassung und Interpretation des Metaboloms, d. h. der Gesamtheit aller niedermolekularen Metaboliten in einem intakten Organismus, dar. Ziel der Technik ist es, mittels geeigneter ungerichteter Screeningverfahren in nicht-invasiv zu gewinnenden biologischen Proben wie Urin oder Blut charakteristische Metabolitenprofile zu bestimmen. Im Kontext des Metabonomics wurde in Anlehnung an den Geno- bzw. Ph{\"a}notyp hierf{\"u}r der Begriff „Metabotyp" gepr{\"a}gt. Durch biostatistische Methoden, die auf Mustererkennung (pattern recognition) basieren, k{\"o}nnen Signaturen gegen{\"u}bergestellt und auf diesem Weg gruppenspezifische Metaboliten, d. h. Biomarker bzw. Metabolitenmuster, extrahiert werden. Metabonomics kann folglich als Fusion klassischer bioanalytischer und biostatistischer Verfahren aufgefasst werden. Seit der Einf{\"u}hrung im Jahr 1999 hat sich das Konzept des Metabonomics in mehrere Richtungen weiterentwickelt. So gab es Bestrebungen, die Technik, die urspr{\"u}nglich zur Pr{\"a}diktion von toxischen Effekten bei der Arzneistoffentwicklung etabliert wurde, auf Fragestellungen zu {\"u}bertragen, die den Menschen im Mittelpunkt haben. Neben pr{\"a}klinischen Anwendungen verfolgt man mit Metabonomics zunehmend das Ziel, einer personalisierten Medizin und Ern{\"a}hrung einen Schritt n{\"a}her zu kommen. Da sich die urspr{\"u}nglich eingesetzte NMR-Technik als zu unempfindlich und die resultierenden Metabolitenprofile als zu anf{\"a}llig gegen{\"u}ber biologischen und analytischen Einflussgr{\"o}ßen (Confoundern) erwiesen haben, wurde parallel auf sensitivere Verfahren wie die Massenspektrometrie gesetzt. Insbesondere die Kopplung mit der Hochdruckfl{\"u}ssigchromatographie erwies sich hierbei f{\"u}r das Metabolitenscreening als geeignet. Schnell wurde allerdings klar, dass aus den klassischen full scan/TOF-Methoden Datens{\"a}tze resultierten, die h{\"a}ufig zu komplex waren, um mit nachgeschalteten chemometrischen Verfahren die „Spreu vom Weizen trennen" zu k{\"o}nnen. Da sich Metabolitendatenbanken bisher noch im Aufbau befinden, ist die Identifizierung der Marker mit zus{\"a}tzlichen Schwierigkeiten verbunden und bedarf aufw{\"a}ndiger analytischer Verfahren. Eine Strategie stellt daher die Beschr{\"a}nkung auf ein Metabolitensubset dar. Indem man sich auf Metabolitenklassen fokussiert, die einen Bezug zum untersuchten Mechanismus haben, k{\"o}nnen die Erfolgsaussichten bei der Identifizierung charakteristischer Biomarker deutlich erh{\"o}ht werden. Aufgrund zahlreicher exogener und endogener Faktoren (Arzneistoffe, Industriechemikalien, Nahrungsbestandteile, Tabakrauchbestandteile, Produkte der Lipidperoxidation etc.) ist der menschliche Organismus stets einer Vielzahl an elektrophilen Verbindungen ausgesetzt. Oxidative Sch{\"a}digungen an Strukturen wie der DNA, Proteinen und Lipiden werden mit einer Reihe von Krankheitsbildern in Zusammenhang gebracht, darunter Parkinson, Alzheimer, Krebs und Volkskrankheiten wie Arteriosklerose, Allergien und koronare Herzerkrankungen. Mit dem Glutathionsystem verf{\"u}gt der K{\"o}rper {\"u}ber einen wirksamen Detoxifizierungsmechanismus. Das Tripeptid Glutathion reagiert als Nukleophil mit den exogen oder endogen gebildeten elektrophilen Intermediaten. Endprodukte sind Merkapturs{\"a}uren (N-Acetyl-L-Cystein-Addukte) bzw. deren Sulfoxide, die in erster Linie mit dem Urin ausgeschieden werden. Folglich besteht zwischen diesen Merkapturs{\"a}urederivaten und der elektrophilen Belastung eines Organismus ein direkter Zusammenhang. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der Arbeit, einen nicht-invasiven Metabonomicsansatz zur Anwendung am Menschen zu entwickeln. Durch die Fokussierung des Metabolitenscreenings auf die Effekt-, Dosis- und Suszeptibilit{\"a}tsmarkerklasse der Merkapturs{\"a}uren sollten hierbei die Erfolgsaussichten im Hinblick auf die Identifizierung potentieller Biomarker f{\"u}r diverse toxikologische sowie medizinische Endpunkte erh{\"o}ht werden.}, subject = {Metabolom}, language = {de} } @phdthesis{Kellert2008, author = {Kellert, Marco}, title = {Untersuchungen zum Metabolismus von Furan in Ratte und Maus, sowie zur Reaktivit{\"a}t und Gentoxizit{\"a}t von cis-2-Buten-1,4-dial in vitro und in Zellkultur}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28716}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Furan wird in einer Vielzahl von Speisen durch Hitzebehandlung gebildet und ist kanzerogen in der Leber von Ratte und Maus. Durch die hohe Fl{\"u}chtigkeit von Furan ist eine Expositionsabsch{\"a}tzung auf Basis der Kontamination von Lebensmitteln nur bedingt m{\"o}glich. Ein alternativer Ansatz dazu ist die Identifizierung von Furanmetaboliten als Expositions­biomarker. Nach der Aufnahme wird Furan zun{\"a}chst zum Dialdehyd cis-2-Buten-1,4-dial oxidiert. cis-2-Buten-1,4-dial besitzt mehrere elektrophile Strukturelemente, welche eine Reaktion mit Protein und DNS wahrscheinlich machen und damit zur bekannten Toxizit{\"a}t von Furan beitragen k{\"o}nnen. Es stellt sich in diesem Zusammenhang die Frage, ob eine Reaktion mit Protein die Reaktion mit der DNS verhindern kann und somit keine direkt gentoxischen Effekte auftreten. F{\"u}r ein kanzerogenes Agens ohne direkte gentoxische Wirkung kann eine Schwellendosis unterhalb derer kein DNS-Schaden auftritt diskutiert werden. F{\"u}r eine fundierte Risikobewertung bez{\"u}glich der Aufnahme von Furan {\"u}ber die Nahrung ist dies unabdingbar. In der vorliegenden Arbeit wurde nach der oralen Gabe von Furan im Urin von Fischer 344 Ratten nach Metaboliten gesucht. Eine Kontrollgruppe erhielt nur die Tr{\"a}gersubstanz {\"O}l. Das vor und nach Exposition {\"u}ber jeweils zwei 24 Stunden Perioden gesammelte Urin wurde mittels einer Tandemmassenspektrometrie-Methode analysiert. Die Methode bestand aus einem Full-Scan und einer dar{\"u}ber gesteuerten Aufzeichnung eines Fragmentionenspektrums. Die Full-Scan-Daten wurden mit Hilfe der Hauptkomponentenanalyse untersucht. In der ersten Sammelperiode nach der Behandlung konnten durch die erste Hauptkomponente die behandelten von den unbehandelten Tieren getrennt werden. Aus den f{\"u}r die Trennung relevanten Verbindungen konnten f{\"u}nf Biomarker strukturell aufgekl{\"a}rt werden. In einer weiteren Tierstudie an Ratten und M{\"a}usen wurde die Kinetik und die Dosis-Wirkungs-Beziehung der identifizierten Biomarker untersucht. Die gezielte LC-MS/MS-Analyse der Urine auf die identifizierten Biomarker hin zeigte, dass in der Ratte alle und in der Maus alle bis auf einen dosisabh{\"a}ngig anstiegen. Die Kinetik der Ausscheidung lieferte wertvolle Hinweise auf die Entstehung der Biomarker. Die Ausscheidung der Biomarker mit Lysinstruktur erfolgte {\"u}ber mehr als 72 Stunden. Dies war ein Hinweis auf eine Freisetzung aus Protein. Die Ausscheidung der restlichen Verbindungen erfolgte ausschließlich in den ersten 24 Stunden. Die in der Literatur vorhandenen Daten zur Gentoxizit{\"a}t von Furan und cis-Buten-1,4-dial sind unschl{\"u}ssig und unvollst{\"a}ndig. In der vorliegenden Arbeit wurde cis-2-Buten-1,4-dial im Ames Stamm TA104 und in L5178Y Mauslymphomzellen auf Mutagenit{\"a}t und Gentoxizit{\"a}t untersucht. Durch starke Zytotoxizit{\"a}t war der Konzentrationsbereich auf 4.5 µmol/Platte limitiert. Innerhalb dieses Bereich konnte mit der Vorinkubationsvariante des Ames-Tests keine Mutagenit{\"a}t beobachtet werden. Die L5178Y Mauslymphomzellen wurden mit Standardprotokollen f{\"u}r den Mikrokern-Test, Kometen-Test und den Thymidinkinase-Test untersucht. Der Konzentrationsbereich von cis-2-Buten-1,4-dial erstreckte sich bis 100 µM, konnte aber auf Grund der starken Zytotoxizit{\"a}t nur bis 25 µM ausgewertet werden. Dennoch konnte bereits in diesem Bereich ein 1.7- bzw. 2.2-facher Anstieg im Kometen- bzw. Thymidinkinase-Test beobachtet werden. Verglichen mit der Positivkontrolle Methylmethansulfonat hatte cis-2-Buten-1,4-dial bei einer deutlich h{\"o}heren Zytotoxizit{\"a}t eine {\"a}hnliche Potenz bez{\"u}glich der Mutagenit{\"a}t und Gentoxizit{\"a}t. Um das DNS-vernetzende Potential von cis-2-Buten-1,4-dial zu bestimmen wurde eine Variante des Kometen-Tests verwendet. Es wurde dabei untersucht, ob die Vorbehandlung von Zellen mit cis-2-Buten-1,4-dial die durch \&\#947;-Strahlung induzierbaren Kometen reduzieren kann. W{\"a}hrend die Positivkontrolle Glutaraldehyd die Kometen tats{\"a}chlich verringerte, blieb dieser Effekt bei cis-2-Buten-1,4-dial aus. Im Gegenteil, bei einer Konzentration von \&\#8805;100 mM konnte durch die Zunahme von Zellen mit beginnender Apoptose ein Anstieg der Kometen beobachtet werden. Obwohl cis-2-Buten-1,4-dial sehr deutliche gentoxische und mutagene Effekte zeigte, beschr{\"a}nkte die hohe Zytotoxizit{\"a}t den auswertbaren Bereich. M{\"o}glicherweise kann diese Problematik einen Teil der unschl{\"u}ssigen Ergebnisse erkl{\"a}ren, sicher ist jedoch, dass f{\"u}r die Untersuchung der Mechanismen der Toxizit{\"a}t und Kanzerogenit{\"a}t ein Beitrag von nicht gentoxischen Effekten diskutiert werden muss.}, subject = {Metabolismus}, language = {de} } @phdthesis{Triebel2008, author = {Triebel, Sven}, title = {Induktion einer dilatativen Kardiomyopathie am Modell der Lewis-Ratte durch Antik{\"o}rper gegen die zweite extrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne des humanen Beta1-adrenergen Rezeptors}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29580}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Vor etwas mehr als 20 Jahren wurden erstmals an das Myokard bindende beta1-Rezeptorantik{\"o}rper im Zusammenhang mit der Chagas-Krankheit beschrieben. Die Arbeiten der beiden folgenden Jahrzehnte konnten zeigen, dass solche beta1-Rezeptorantik{\"o}rper mit einer Pr{\"a}valenz von ca. 30 bis 95\% (in Abh{\"a}ngigkeit vom verwendeten Nachweisverfahren) v.a. auch bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie (DCM) nachgewiesen werden k{\"o}nnen. Insbesondere Antik{\"o}rper gegen die zweite extrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne des beta1-adrenergen Rezeptors (beta1-ECII) scheinen dabei in der Lage zu sein, den Rezeptor funktionell zu beeinflussen und zu aktivieren. Beta1-ECII wurde in der Folge als potentes Autoantigen mit T- und B-Zell-Epitopen identifiziert. Erste klinische Untersuchungen an Patienten mit DCM haben gezeigt, dass das Vorhandensein zirkulierender b1-ECII-Antik{\"o}rper mit einer schlechteren linksventrikul{\"a}ren Funktion, dem Auftreten ventrikul{\"a}rer Arrhythmien sowie mit einer erh{\"o}hten kardiovaskul{\"a}ren Mortalit{\"a}t verbunden ist. Der Verdacht, dass beta1-Antik{\"o}rper bei der DCM nicht nur ein Epiph{\"a}nomen, sondern bei einem Teil der betroffenen Patienten auch m{\"o}gliche Krankheitsursache darstellen k{\"o}nnten, verst{\"a}rkten dann in j{\"u}ngster Zeit die Bestrebungen, ein Tiermodell f{\"u}r die Antik{\"o}rper-induzierte Genese einer Kardio-myopathie zu generieren. So fanden 1997 Matsui et al. im Kaninchenmodell nach Immunisierung mit einem beta1-ECII-homologen Peptid {\"u}ber 12 Monate eine biventrikul{\"a}re Dilatation und kompensatorische Hochregulation der beta-Adrenozeptoren im Myokard. Im Gegensatz dazu fanden Iwata et al. wenige Jahre sp{\"a}ter im gleichen Tiermodell nach 6-monatiger Immunisierung eine linksventrikul{\"a}re Hypertrophie bei beta1-ECII-Antik{\"o}rper-positiven Tieren und eine Downregulation der beta-Rezeptoren. Diese Diskrepanzen ließen das Kaninchenmodell daher als fraglich geeignet erscheinen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Arbeit wurde die Lewis-Ratte zur Generierung eines Kardiomyopathiemodells gew{\"a}hlt, da die beta1-ECII-Sequenz bei Ratte und Mensch 100\% homolog ist. Zur Immunisierung verwendeten wir ein Fusionsprotein aus GST und der humanen beta1-ECII-Sequenz. Der Schwerpunkt des Vorhabens lag auf der Charakterisierung der durch die Immunisierung induzierten morphologischen und funktionellen Ver{\"a}nderungen am Herzen der Versuchstiere. Echokardiographisch konnte bei immunisierten Tieren bereits nach 9 Monaten eine linksventrikul{\"a}re Erweiterung nachgewiesen werden, die sich nach 12 bzw. 15 Immunisierungsmonaten durch das Auftreten einer progredienten linksventrikul{\"a}ren Dysfunktion (Echokardiographie/Herzkatheteruntersuchung) auch funktionell manifestierte. Makroskopisch-morphometrisch ließ sich an Paraffinschnitten eine Erweiterung des linken Ventrikels bei relativer Abnahme der Wanddicke nachweisen und best{\"a}tigte somit histologisch die echokardiographischen Messungen. Die mikroskopische Analyse zeigte eine relative Vergr{\"o}ßerung der Kardiomyozytenkerne ohne signifikante Zellhypertrophie. Durch Radioligandenbindungsversuche konnte zudem in beta1-ECII-immunisierten Tieren eine Downregulation der kardialen beta1-Rezeptoren nachgewiesen werden. Durch die Immunisierung mit beta1-ECII-Antigen konnte der Ph{\"a}notyp einer DCM somit erstmals in der Ratte induziert werden. Dieser Ph{\"a}notyp ist vermutlich {\"u}berwiegend auf die agonist-{\"a}hnliche funktionelle Aktivit{\"a}t der durch spezifische Immunisierung induzierten beta1-Rezeptorantik{\"o}rper zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Das vorgestellte Tiermodell erf{\"u}llt dabei einerseits die immunologischen Kriterien des 1. Koch'schen Postulats f{\"u}r den „indirekten" Nachweis einer Kardiomyopathieinduktion durch Antik{\"o}rper, die gegen die zweite extrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne des b1-adrenergen Rezeptors gerichtet sind. Andererseits lieferte es im Anschluss auch die direkte Evidenz f{\"u}r eine kausale Rolle solcher Antik{\"o}rper bei der Induktion einer Autoimmunkardiomyopathie durch den Transfer induzierter Antik{\"o}rper auf genetisch identische, herzgesunde Ratten (Nachahmen von Rezeptor-Autoantik{\"o}rpern). Zuk{\"u}nftig k{\"o}nnte dieses Tiermodell auch dazu dienen, weitere immunologische Faktoren, die an der Entwicklung einer Autoimmunkardiomyopathie durch beta1-Rezeptor-antik{\"o}rper beteiligt sind, zu untersuchen. Ferner k{\"o}nnen mit diesem Modell neue therapeutische Ans{\"a}tze f{\"u}r die Behandlung der Rezeptorantik{\"o}rper-positiven Kardiomyopathie entwickelt werden, mit dem Ziel einer sp{\"a}teren Anwendung im Tiermodell erprobter Strategien auch bei Antik{\"o}rper-positiven Patienten.}, subject = {Beta-1-Rezeptor}, language = {de} } @phdthesis{Schmid2008, author = {Schmid, Ursula}, title = {Protection against oxidative DNA damage by antioxidants, hormone-receptor blockers and HMG-CoA-reductase inhibitors}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28379}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {In the course of this study, several endogenous compounds and model substances were used to mimic the conditions in patients suffering from hypertension. As endogenous compounds, angiotensin II and aldosterone were chosen. As model substances, 4-nitroquinoline-1-oxide (NQO), hydrogen peroxide and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) were selected. Benfotiamine as well as \&\#945;-tocopherol proved in the course of the experiments to be able to prevent angiotensin II-induced formation of oxidative DNA strand breaks and micronuclei. This could be due to a prior inhibition of the release of reactive oxygen species and is in contrast to results which were achieved using thiamine. Furthermore, experiments in which cells were pre-incubated with benfotiamine followed by incubation with NQO showed that benfotiamine was not able to prevent the induction of oxidative stress. The hypothesis that benfotiamine has, like \&\#945;-tocopherol, direct antioxidative capacity was fortified by measurements in cell free systems. In brief, a new working mechanism for benfotiamine in addition to the ones already known could be provided. In the second part of the study, angiotensin II was shown to be dose-dependently genotoxic. This effect is mediated via the angiotensin II type 1 receptor (AT1R) which. Further experiments were extended from in vitro settings to the isolated perfused kidney. Here it could be shown that angiotensin II caused vasoconstriction and DNA strand breaks. Co-perfusion of kidneys with angiotensin II and candesartan prevented vasoconstriction and formation of strand breaks. DNA strand break formation due to mechanical stress or hypoxia could be ruled out after additional experiments with the thromboxane mimetic U 46619. Detailed investigation of the DNA damage in vitro revealed that angiotensin II induces single strand breaks, double strand breaks and 8-hydroxydeoxyguanosine (8-oxodG)-adducts as well as abasic sites. Investigations of the effects of aldosterone-treatment in kidney cells showed an increase of oxidative stress, DNA strand breaks and micronuclei which could be prevented by the steroidal mineralocorticoid receptor antagonist eplerenone. Additional experiments with the non-steroidal mineralocorticoid receptor antagonist (S)-BR-4628 revealed that this substance was also able to prevent oxidative stress and genomic damage and proved to be more potent than eplerenone. In vivo, hyperaldosteronism was imitated in rats by aid of the deoxycorticosteroneacetate (DOCA) salt model. After this treatment, levels of DNA strand breaks and chromosomal aberrations in the kidney could be observed. Furthermore, an increase in the release of ROS could be measured. Treatment of these animals with spironolactone , BR-4628 and enalaprile revealed that all antagonists were effective BR-4628 was the most potent drug. Finally, rosuvastatin was investigated. In HL-60 cells phorbol 12-myristate 13-acetate caused oxidative stress. Rosuvastatin was able to prevent the release of ROS and subsequent oxidative DNA damage when co-incubated with PMA. Furthermore, not only an inhibition of PMA-induced oxidative stress but also inhibition of the unspecific release of ROS induced by hydrogen peroxide was observable. Addition of farnesyl pyrophosphate (FPP), geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), and mevalonate, intermediates of the cholesterol pathway, caused only a marginal increase of oxidative stress in cells treated simultaneously with PMA and rosuvastatin, thus indicating the effect of rosuvastatin to be HMG-CoA-reductase-independent. Investigation of the gene expression of subunits of NAD(P)H oxidase revealed a down-regulation of p67phox following rosuvastatin-treatment. Furthermore, it could be shown that rosuvastatin treatment alone or in combination with PMA increased total glutathione levels probably due to an induction of the gene expression and enzyme activity of \&\#947;-glutamylcysteine synthetase (\&\#947;-GCS).}, subject = {Oxidativer Stress}, language = {en} } @phdthesis{Tiedge2008, author = {Tiedge, Oliver}, title = {Kombinationswirkungen nicht linearer Dosis-Wirkungsbeziehungen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28522}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Um realistische Risikoabsch{\"a}tzungen von karzinogenen und genotoxischen Expositionen besser bewerten zu k{\"o}nnen, bedarf es Untersuchungen von Kombinationen welche sich von der Einzellstoffbetrachtung losl{\"o}st. Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit bestand darin, herauszufinden, ob die Gentoxizit{\"a}t einer Kombination in ihrer St{\"a}rke vom erwarteten Effekt der normalen Additivit{\"a}t abweicht, wenn die Kurven der Dosis - Wirkungsbeziehung der Einzelkomponenten nicht lineare Verl{\"a}ufe zeigen. Dabei muss zwischen Dosisaddition und Wirkaddition der Kombinationen unterschieden werden, das heißt ob die Einzelkomponenten einen untereinander {\"a}hnlichen oder unabh{\"a}ngigen Wirkmechanismus verfolgen. F{\"u}r nicht lineare Dosis - Wirkungsbeziehungen differieren also die Kurvenverl{\"a}ufe zwischen Dosisaddition und Wirkaddition und bilden einen m{\"o}glichen Bereich der Additivit{\"a}t zwischen ihnen (auch: „H{\"u}lle der Additivit{\"a}t"). Nur Reaktionen welche außerhalb dieses Bereiches ablaufen, d{\"u}rfen als synergistische oder antagonistische Effekte bezeichnet werden. Diese {\"U}berlegungen wurden {\"u}berpr{\"u}ft mit der Analysierung von Mikrokernen, induziert in L5178Y Maus - Lymphom - Zellen durch die methylierenden Substanzen Methylmethansulfonat (MMS) und Methyl-Nitroso-Urea (MNU), sowie dem Topoisomerase II Inhibitor Genistein (GEN). Alle drei Chemikalien erzeugen reproduzierbare sublineare Dosis - Wirkungsbeziehungen. F{\"u}r die Analyse der Kombinationseffekte wurden diese Substanzen in drei bin{\"a}ren Mixturen miteinander gemischt. F{\"u}r MMS + MNU war der Effekt vereinbar mit Dosisaddition und lag signifikant h{\"o}her als der vorkalkulierte Effekt der Netto - Wirkung. F{\"u}r MMS + GEN lag der gemessene Effekt {\"u}ber der Wirkaddition, jedoch unter der Dosisaddition. F{\"u}r MNU + GEN lag der gemessene Effekt unterhalb der Wirkaddition und deutete damit auf einen echten Antagonismus hin. In Unkenntnis des sublinearen Dosis - Wirkungsverhaltens der Einzelsubstanzen w{\"a}re ein synergistischer Effekt von MMS mit beiden Substanzen MNU und GEN f{\"a}lschlicherweise vorausgesagt worden. Der beobachtete Unterschied zwischen MMS und MNU und deren jeweiligen Kombination mit GEN w{\"a}re mit einer stark vereinfachten Interpretation der DNA - Methylierung nicht vorausgesagt worden. Ursachen k{\"o}nnten eine doch zu unterschiedliche Form der DNA - Methylierung und / oder epigentische Faktoren sein. Zusammenfassend kann man sagen, dass Kenntnisse der Nichtlinearit{\"a}t von Dosis - Wirkungskurven der einzelnen Substanzen ausschlaggebend f{\"u}r die Analyse von Synergismus oder Antagonismus in deren Kombinationen ist. Weiterhin ist ein Vorwissen {\"u}ber tiefere mechanistische Vorg{\"a}nge hilfreich f{\"u}r eine Vorhersage von {\"a}hnlichen oder unabh{\"a}ngigen Wirkprozessen.}, subject = {Kleinkern}, language = {de} } @phdthesis{Jonas2008, author = {Jonas, Ren{\´e}}, title = {Arsen-induzierte Zyto- und Gentoxizit{\"a}t sowie deren Modulation}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28772}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Arsen ist daf{\"u}r bekannt, dass es mutagen und kanzerogen wirkt und ein gentoxisches Potential besitzt. Die Mechanismen, durch die diese Effekte ausge{\"u}bt werden, sind noch nicht vollst{\"a}ndig aufgekl{\"a}rt. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass Parameter, die mit der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), z.B. Superoxiddismutaseaktivit{\"a}t und H{\"a}moxygenase-Genexpression, und Ver{\"a}nderungen des epigenetischen Musters der DNA, z.B. Depletion von S-Adenosylmethionin, in Zusammenhang stehen, durch Arsen beeinflusst werden. In dieser Studie wurde versucht, das gentoxische Potential von Arsen mit Hilfe des Comet Assay, eines Standard-Gentoxizit{\"a}tstests, zu charakterisieren sowie zu pr{\"u}fen, ob dieser Test eine geeignete Messmethode f{\"u}r die gentoxische Wirkung von Arsen darstellt. Dies wurde unter Heranziehung verschiedener additiver Messgr{\"o}ßen wie der Vitalit{\"a}t und der Proliferation sowie der parallelen Quantifizierung der Mitose-, C-Mitose-, Mikrokern- und Apoptosefrequenzen der verwendeten murinen L5178Y-Zellen durchgef{\"u}hrt. Des Weiteren wurde der den Arsen-bedingten DNA-Sch{\"a}den zugrundeliegende Mechanismus genauer beleuchtet. Unter Zuhilfenahme verschiedener Modulatoren wurden durch Arsen induzierter oxidativer Stress und durch Arsen induzierte Ver{\"a}nderung der epigenetischen DNA-Struktur untersucht. Ferner wurde gepr{\"u}ft, inwieweit die Inhibition von oxidativem Stress und Hypomethylierung der DNA zur Verringerung von potenziellen Folgen wie der Entstehung unnat{\"u}rlicher Mitosemorphologien und chromosomaler Aberrationen beitragen k{\"o}nnen, die wiederum eventuell in der Entstehung von Karzinomen resultieren k{\"o}nnen. F{\"u}r die Modulation der Freisetzung von ROS wurden als prooxidative Substanz 4-Nitrochinolin-1-Oxid und als Antioxidantien Benfotiamin (Vitamin-B1-Prodrug), N-Acetylcystein (NAC) und \&\#945;-Tocopherol (Vitamin E) ausgew{\"a}hlt. Das Methylierungs¬muster der DNA sollte durch das hypomethylierende Agens 5-Azacytidin und durch die potenziell hypermethylierenden Verbindungen S-Adenosylmethionin (SAM) und Folat beeinflusst werden. Die Untersuchungen bez{\"u}glich des gentoxischen Potentials von Arsen und die Eignung des Comet Assay f{\"u}r dessen Quantifizierung ergaben, dass unter Miteinbeziehung der erw{\"a}hnten additiven Parameter und der Quantifizierung nach Behandlung mit unterschiedlichen Arsen-Konzentrationen nach unterschiedlich langen Behandlungszeiten die im Comet Assay erzielten Werte als korrekt und zuverl{\"a}ssig angesehen werden k{\"o}nnen. Des Weiteren zeigten die Untersuchungen der Freisetzung von ROS und der Ver{\"a}nderung des DNA-Methylierungsmusters mit Hilfe von Modulatoren, dass beide Mechanismen an den Arsen-induzierten Effekten beteiligt sind. Nicht nur konnte mit Hilfe der Modulatoren jeweils die Inhibition der Freisetzung von ROS und der DNA-Hypomethylierung erreicht werden, es konnte zudem gezeigt werden, dass die Substanzen auch die Reduktion der erh{\"o}hten Anzahl unnat{\"u}rlicher Mitosemorphologien und chromosomaler Aberrationen bewirkten. Dieser Zusammenhang konnte in dieser Studie zum ersten Mal aufgezeigt werden und k{\"o}nnte im Hinblick auf die potenzielle Erniedrigung der Krebsinzidenzen durch Supplementierung der Bev{\"o}lkerung in Gebieten mit Arsen-belastetem Trinkwasser mit den genannten Modulatoren von Bedeutung sein.}, subject = {Oxidativer Stress}, language = {de} } @phdthesis{Kopp2009, author = {Kopp, Eva Katharina}, title = {Biotransformation and Toxicokinetics of Acrylamide in Humans}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37273}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {The widely used chemical acrylamide (AA) has been classified as a probable human carcinogen. This classification was based on positive results in rodent carcinogenicity studies as well as on a number of in vitro mutagenicity assays. In 2002, AA was discovered to be formed during the preparation of starch-containing foods. According to the latest FDA exposure assessment (2006), the average daily intake has been estimated from AA levels in foodstuffs and from nutritional habits to be around 0.4 µg/kg b.w. with a 90th percentile of 0.95 µg/kg b.w.. In children and adolescents however, the daily AA intake is about 1.5 times higher, due to lower body weight and differing consumption patterns. Apart from the diet, humans may be exposed to AA during the production or handling of monomeric AA, from AA residues in polyacrylamides, and from cigarette smoke. After oral administration, AA is readily absorbed and distributed throughout the organism. AA is metabolized to the reactive epoxide glycidamide (GA) via the CYP 450 isoenzyme CYP 2E1. Both, AA and GA are conjugated with glutathione. After enzymatic processing, the mercapturic acids N-Acetyl-S-(2-carbamoylethyl)-L-cysteine (AAMA) as well as the regioisomers N-Acetyl-S-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)-L-cysteine (GAMA) and N-Acetyl-S-(1-carbamoyl-2-hydroxy-ethyl)-L-cysteine (iso-GAMA) are excreted with urine. An additional pathway for the metabolic conversion of GA is the epoxide hydrolase mediated hydrolysis to the diol compound glyceramide. Following administration of AA at doses exceeding the daily dietary intake by a factor of 1000 - 6000 to human subjects, a new urinary metabolite was found, which could be identified as the S-oxide of AAMA (AAMA-sulfoxide). In general, data from animal studies are used for risk assessment of (potential) human carcinogens. However, inter-species differences in toxicodynamics or toxicokinetics, e.g. in biotransformation may lead to under- or overestimation of human risk. The objective of this work was to establish a highly specific and sensitive analytical method to quantify the major urinary metabolites of AA. Other aims apart from measurements concerning the human background exposure were the evaluation of biotransformation and toxicokinetics of AA in humans and rats after oral administration of 13C3-AA. The obtained data was intended to help avoid linear extrapolation from animal models for future risk assessments of AA carcinogenicity.}, subject = {Acrylamid}, language = {en} } @phdthesis{Klenk2009, author = {Klenk, Johann Christoph}, title = {Effekte von Parathormon auf die Struktur und Komplexierung des Parathormonrezeptors 1}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-47288}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Der Parathormonrezeptor Typ 1 (PTHR) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor der Gruppe 2 und wichtigster Regulator des Kalziumstoffwechsels. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neuartige posttranslationale Modifikation des PTHR in Form einer proteolytischen Spaltung der Ektodom{\"a}ne identifiziert, charakterisiert und deren Regulation beschrieben. Nach langanhaltender Stimulation des Rezeptors mit Agonisten - aber nicht mit Antagonisten - wurde eine Massen- und Mengenzunahme des Rezeptorproteins beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor unter basalen Bedingungen einer Spaltung unterliegt. Der Massenunterschied entsteht durch die proteolytische Spaltung der Ektodom{\"a}ne des PTHR, was nachfolgend die Stabilit{\"a}t des Rezeptors beeintr{\"a}chtigt. Die Spaltung erfolgte innerhalb einer unstrukturierten Schleife der Ektodom{\"a}ne, welche die Bereiche f{\"u}r die Ligandenbindung miteinander verbindet. Hierbei handelt es sich um eine Region, die im Vergleich zu anderen Gruppe 2-Rezeptoren spezifisch f{\"u}r den PTHR ist. Das durch die Spaltung entstandene N-terminale Fragment bleibt durch eine Disulfidbr{\"u}cke mit dem Transmembranteil des Rezeptors verbunden. Durch Versuche mit verschiedenen Proteaseinhibitoren konnte die verantwortliche Protease der Familie der zinkabh{\"a}ngigen extrazellul{\"a}ren Proteasen zugeordnet werden. Diese Ergebnisse beschreiben einen Mechanismus wie die Homo{\"o}stase des PTHR reguliert sein k{\"o}nnte. In einem zweiten Abschnitt wurde die Interaktion der Adapterproteine NHERF1 und beta-Arrestin2 mit dem PTHR untersucht. Beide Proteine interagierten unabh{\"a}ngig mit dem Rezeptor, wobei NHERF1 {\"u}ber eine PDZ-Dom{\"a}ne konstitutiv an den C-Terminus des Rezeptors bindet. beta-Arrestin2 hingegen bindet nach Aktivierung des Rezeptors und f{\"u}hrt zur Desensitisierung des Rezeptors. Mittels biochemischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass beide Proteine gemeinsam einen tern{\"a}ren Komplex mit dem PTHR bilden, welcher durch die direkte Interaktion zwischen NHERF1 und beta-Arrestin2 vermittelt wird. Dies hat zur Folge, dass beta-Arrestin im basalen Zustand durch NHERF1 an den Rezeptor gekoppelt wird. Durch Analyse der Assoziationskinetik mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Messungen zeigte sich, dass diese Kopplung zu einer zweifach erh{\"o}hten Rekrutierungsgeschwindigkeit von beta-Arrestin2 an den PTHR f{\"u}hrt. Somit stellt unterst{\"u}tzt NHERF1 die beta-Arrestin2-vermittelte Desensitisierung des PTHR.}, subject = {Parathormon}, language = {de} } @phdthesis{Sieber2009, author = {Sieber, Maximilian}, title = {Evaluation of 1H-NMR and GC/MS-based metabonomics for the assessment of liver and kidney toxicity}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-43052}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {For the assessment of metabonomics techniques for the early, non-invasive detection of toxicity, the nephrotoxins gentamicin (s.c. administration of 0, 60 and 120 mg/kg bw 2x daily for 8 days), ochratoxin A (p.o. administration of 0, 21, 70 and 210 µg/kg bw 5 days/week for 90 days) and aristolochic acid (p.o. administration of 0, 0.1, 1.0 and 10 mg/kg bw for 12 days) were administered to rats and urine samples were analyzed with 1H-NMR and GC/MS. Urine samples from the InnoMed PredTox project were analyzed as well, thereby focusing on 1H-NMR analysis and bile duct necrosis as histopathological endpoint. 1H-NMR analysis used water supression with the following protocol: 1 M phosphate buffer, D2O as shift lock reagent, D4-trimethylsilyl­propionic acid as chemical shift reference, noesygppr1d pulse sequence (Bruker). For multivariate data analysis, spectral intensity was binned into 0.04 ppm wide bins. GC/MS analysis of urine was carried out after protein precipitation with methanol, drying, derivatization with methoxyamine hydrochloride in pyridine and with methyl(trimethylsilyl)­trifluoroacetamide on a DB5-MS column using EI ionization. The chromatograms were prepared for multivariate data analysis using the R-program based peak picking and alignment software XCMS version 2.4.0. Principal component analysis (PCA) to detect and visualize time-point and dose-dependent differences between treated animals and controls and orthogonal projection to latent structures discriminant analysis (OPLS-DA) for identification of potential molecular markers of toxicity was carried out using SIMCA P+ 11.5 1H-NMR-based markers were identified and quantified with the Chenomx NMR Suite, GC/MS based markers were identified using the NIST Mass Spectral Database and by co-elution with authentic reference standards. PCA of urinary metabolite profiles was able to differentiate treated animals from controls at the same time as histopathology. An advantage over classical clinical chemistry parameters regarding sensitivity could be observed in some cases. Metabonomic analysis with GC/MS and 1H-NMR revealed alterations in the urinary profile of treated animals 1 day after start of treatment with gentamicin, correlating with changes in clinical chemistry parameters and histopathology. Decreased urinary excretion of citrate, 2-oxoglutarate, hippurate, trigonelline and 3-indoxylsulfate increased excretion of 5-oxoproline, lactate, alanine and glucose were observed. Ochratoxin A treatment caused decreased excretion of citrate, 2-oxoglutarate and hippurate and and increased excretion of glucose, myo-inositol, N,N-dimethylglycine, glycine, alanine and lactate as early as 2 weeks after start of treatment with 210µg OTA/kg bw, correlating with changes in clinical chemistry parameters and histopathology. Integration of histopathology scores increased confidence in the molecular markers discovered. Aristolochic acid treatment resulted in decreased urinary excretion of citrate, 2-oxoglutarate, hippurate and creatinine as well as increased excretion of 5-oxoproline, N,N-dimethylglycine, pseudouridine and uric acid. No alterations in clinical chemistry parameters or histopathology were noted.Decreased excretion of hippurate indicates alterations in the gut microflora, an effect that is expected as pharmacological action of the aminoglycoside antibiotic gentamicin and that can also be explained by the p.o. administration of xenobiotica. Decreased Krebs cycle intermediates (citrate and 2-oxoglutarate) and increased lactate is associated with altered energy metabolism. Increased pseudouridine excretion is associated with cell proliferation and was observed with aristolochic acid and ochratoxin A, for which proliferative processes were observed with histopathology. 5-oxoproline and N,N-dimethylglycine can be associated with oxidative stress. Glucose, a marker of renal damage in clinical chemistry, was observed for all three nephrotoxins studied. Single study analysis with PCA of GC/MS chromatograms and 1H-NMR spectra of urine from 3 studies conducted within the InnoMed PredTox project showing bile duct necrosis revealed alterations in urinary profiles with the onset of changes in clinical chemistry and histopathology. Alterations were mainly decreased Krebs cycle intermediates and changes in the aromatic gut flora metabolites, an effect that may result as a secondary effect from altered bile flow. In conclusion, metabonomics techniques are able to detect toxic lesions at the same time as histopathology and clinical chemistry. The metabolites found to be altered are common to most toxicities and are not organ-specific. A mechanistic link to the observed toxicity has to be established in order to avoid confounders such as body weight loss, pharmacological effects etc. For pattern recognition purposes, large databases are necessary.}, subject = {Toxikologie}, language = {en} } @phdthesis{Werthmann2009, author = {Werthmann, Ruth}, title = {Echtzeit-Untersuchungen zur Thrombin-abh{\"a}ngigen {\"A}nderung der cAMP-Konzentration in lebenden Endothelzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-46066}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Das Endothel bildet eine einschichtige Zellbarriere zwischen Blut und interstitiellem Gewebe, deren Durchl{\"a}ssigkeit entscheidend durch die sekund{\"a}ren Botenstoffe Ca2+ und cAMP reguliert wird. W{\"a}hrend Ca2+ durch eine verst{\"a}rkte Kontraktion der Endothelzellen die Permeabilit{\"a}t erh{\"o}ht, f{\"o}rdert cAMP die Adh{\"a}sion der Zellen und unterst{\"u}tzt somit die Barrierefunktion. Es ist bekannt, dass Thrombin durch einen Anstieg der intrazellul{\"a}ren Ca2+-Konzentration und vermutlich auch durch eine Hemmung der cAMP-Konzentration zu einer Permeabilit{\"a}tserh{\"o}hung f{\"u}hrt. Ziel dieser Arbeit war es, Thrombin-induzierte {\"A}nderungen der cAMP-Konzentration in Echtzeit in lebenden Endothelzellen mittels Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer (FRET) zu untersuchen. Hierf{\"u}r wurden Human-Umbilical-Vein-Endothelial-Cells (HUVECs) mit dem FRET-basierten cAMP-Sensor Epac1-camps transfiziert. Die Bindung von cAMP an Epac1-camps f{\"u}hrt zu einer Konformations{\"a}nderung des Sensors und damit zu einer Abschw{\"a}chung des FRET. Mit Hilfe dieses Sensors kann die cAMP-Konzentration mit hoher zeitlicher Aufl{\"o}sung in einzelnen lebenden Zellen gemessen werden. Untersucht wurde der Effekt von Thrombin auf die cAMP-Konzentration in Endothelzellen, deren cAMP-Konzentration durch Stimulierung endogener \&\#946;-Rezeptoren erh{\"o}ht war. Thrombin erniedrigte Ca2+-abh{\"a}ngig die cAMP-Konzentration um ca. 30 \%. Dieser Abfall der cAMP-Konzentration folgte zeitlich verz{\"o}gert dem Thrombin-induzierten Ca2+-Signal. Die cAMP-Konzentration erreichte ca. 30 s nach der Thrombinzugabe ein Minimum und stieg danach wieder an. Durch die Herunterregulierung der durch Ca2+ direkt inhibierten Adenylatzyklase 6 (AC6) mittels siRNA wurde die Thrombin-induzierte Abnahme der cAMP-Konzentration vollst{\"a}ndig aufgehoben. Dies best{\"a}tigte, dass Thrombin durch die Ca2+-vermittelte Inhibierung der AC6 eine Abnahme der cAMP-Konzentration verursacht. Ohne \&\#946;-adrenerge Stimulation f{\"u}hrte die Applikation von Thrombin zu einem langsamen Anstieg der cAMP-Konzentration, der mehrere Minuten anhielt. Dieser cAMP-Konzentrationsanstieg beruhte auf der Ca2+-abh{\"a}ngigen Aktivierung der Phospholipase A2 (PLA2). Diese setzt Arachidons{\"a}ure aus Membranphospholipiden frei, die als Substrat f{\"u}r die Synthese verschiedener Prostaglandine dient. Durch die pharmakologische Beeinflussung von Zyklooxygenasen und Prostazyklinrezeptoren konnte gezeigt werden, dass die Synthese von Prostazyklin und die anschließende Stimulation Gs-gekoppelter Prostazyklinrezeptoren zum Thrombin-induzierten Anstieg der cAMP-Konzentration f{\"u}hrte. Da die Physiologie der Endothelzellen im Gef{\"a}ß stark von Faktoren aus der unmittelbaren Umgebung beeinflusst wird, ist die Messung der {\"A}nderungen der cAMP-Konzentration in Endothelzellen, die sich innerhalb eines Gewebes befinden, von sehr großer Bedeutung. Deshalb war die Generierung transgener M{\"a}use mit einer gewebespezifischen Expression des FRET-Sensors Epac1-camps in Endothelzellen ein weiteres Ziel dieser Arbeit. Durch Anwendung eines Cre-Rekombinase/loxP-Ansatzes konnten transgene M{\"a}use generiert werden, die Epac1-camps spezifisch in Endothelzellen exprimierten. An isolierten pulmon{\"a}ren Endothelzellen konnte die Funktionalit{\"a}t des transgen exprimierten Sensors Epac1-camps nachgewiesen werden. Die Echtzeitmessung der Thrombin-induzierten {\"A}nderungen der cAMP-Konzentration verdeutlichte ein zeitlich sehr komplexes Wechselspiel zwischen Ca2+- und cAMP-Signalen, das die Barrierefunktion des Endothels maßgeblich beeinflussen wird. Die transgene Expression von Epac1-camps in Endothelzellen erm{\"o}glicht in Zukunft die Untersuchung der Thrombin-verursachten {\"A}nderungen der cAMP-Konzentration und der Permeabilit{\"a}t innerhalb eines intakten Gef{\"a}ßes.}, subject = {Cyclo-AMP}, language = {de} } @phdthesis{Zuern2009, author = {Z{\"u}rn, Alexander}, title = {Spezifische Markierungsverfahren von Rezeptoren mit kleinen Fluorophoren zur Analyse der Rezeptoraktivierung mittels FRET}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35961}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Es gibt viele Hinweise, dass G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bei ihrer Aktivierung durch einen Agonisten ligandenselektive Konformationen eingehen. Ein tats{\"a}chlichen Beleg hierf{\"u}r konnte bisher in lebenden Zellen noch nicht erbracht werden. Zu diesem Zweck wurde in dieser Arbeit ein Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-basierter Ansatz gew{\"a}hlt, um ligandenselektive Konformationen in der dritten intrazellul{\"a}ren Schleife des \&\#945;2a-adrenergen Rezeptors (\&\#945;2a-AR) in lebenden Zellen darzustellen. Dazu wurden Rezeptorsensoren erstellt, welche jeweils ein CFP am Ende des C-Terminus trugen und in der dritten intrazellul{\"a}ren Schleife an verschiedenen Stellen mit einem Tetracysteinmotiv versehen wurden. Drei Konstrukte wurden verglichen, die das Tetracysteinmotiv N-terminal in der N{\"a}he der Transmembrandom{\"a}ne V (I3-N), in der Mitte der dritten intrazellul{\"a}ren Schleife (I3-M) beziehungsweise C-terminal in der N{\"a}he der Transmembrandom{\"a}ne VI (I3-C) trugen. Die drei Rezeptorsensoren unterschieden sich hinsichtlich ihrer Ligandenbindung sowie ihrer G-Proteinaktivierung nicht vom Wildtyp \&\#945;2a-AR. Durch das Tetracysteinmotiv ist es m{\"o}glich, den Rezeptor spezifisch mit dem niedermolekularen Fluorophor FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) zu markieren, welcher als Akzeptor f{\"u}r den Donor CFP in FRET-Experimenten dient. Die {\"A}nderung des FRET-Signals zwischen den beiden Fluorophoren, das durch den vollen Agonist Norepinephrin ausgel{\"o}st wurde, war bei allen drei Rezeptorsensoren vergleichbar. Der starke partielle Agonist Clonidin war ebenfalls in der Lage, in allen drei Konstrukten ein {\"a}hnliches FRET-Signal hervorzurufen. Dagegen zeigte der partielle Agonist Dopamin an dem Konstrukt I3-N ein signifikant schw{\"a}cheres Signal, als an I3-C. Die schwachen partiellen Agonisten Octopamin und Norphenephrin konnten an den Konstrukten I3-N und I3-M keine {\"A}nderung des FRET-Signals bewirken, wobei an I3-C eine deutliche Signal{\"a}nderung detektiert wurde. Dies legt nahe, dass die Transmembrandom{\"a}ne V bei der Aktivierung des Rezeptors eine kleinere Bewegung eingeht als die Transmembrandom{\"a}ne VI, und best{\"a}tigt damit ein auf R{\"o}ntgenstrukturanlysen basierendes Modell der Rezeptorbewegung. Außerdem wurden die Aktivierungskinetiken f{\"u}r die Agonisten Norepinephrin und Dopamin verglichen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die durch Norepinephrin ausgel{\"o}ste Bewegung an allen beobachteten Punkten gleich schnell war. Im Gegensatz dazu aktivierte Dopamin I3-C und I3-M ca. 1,5-mal langsamer, als Norepinephrin. F{\"u}r das I3-N Konstrukt wurde sogar eine 3-mal langsamere Aktivierung gemessen. Diese Daten zeigen, dass unterschiedliche Agonisten in der dritten intrazellul{\"a}ren Schleife spezifische Konformationen ausl{\"o}sen k{\"o}nnen. Die Untersuchungen zur Rezeptorbewegung im ersten Teil dieser Arbeit wurde mit dem kleinen Fluorophor FlAsH in Kombination mit einer großen GFP-Variante durchgef{\"u}hrt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, bei der es m{\"o}glich ist Proteine spezifisch mit beiden kleinen Fluorophoren FlAsH und ReAsH in einer lebenden Zelle zu markieren. Hierf{\"u}r wurden zwei Tetracysteinmotive, CCPGCC und FLNCCPGCCMEP, gew{\"a}hlt, an die beide kleine Fluorophore kovalent binden. Durch Verdr{\"a}ngungsexperimente mit BAL konnte gezeigt werden, dass FlAsH f{\"u}r beide Motive eine dreifach h{\"o}here Affinit{\"a}t besitzt, als ReAsH. Dabei besitzt das FLNCCPGCCMEP-Motiv jedoch eine dreifach h{\"o}here Affinit{\"a}t zu dem jeweiligen Fluorophor besitzt als CCPGCC. Durch Ausnutzung dieser Affinit{\"a}tsunterschiede konnte ein Protokoll entwickelt werden, mit dem es m{\"o}glich ist, beide Motive in einer Zelle zu markieren. Dabei werden zun{\"a}chst beide Motive mit ReAsH markiert. Durch anschließendes Waschen mit einer geeigneten Konzentration von BAL wird das ReAsH ausschließlich von der CCPGCC-Sequenz verdr{\"a}ngt, wohingegen die FLNCCPGCCMEP-Sequenz mit ReAsH markiert bleibt. Die nun unbesetzte CCPGCC-Sequenz kann dann anschließend mit FlAsH markiert werden, ohne dabei die Bindung des ReAsH an die FLNCCPGCCMEP-Sequenz zu beeinflussen. Um die Funktionalit{\"a}t dieses Protokolls zu {\"u}berpr{\"u}fen, sollten zwei verschiedene Proteine mit unterschiedlicher subzellul{\"a}rer Lokalisation in einer lebenden Zelle spezifisch mit jeweils einem kleinen Fluorophor markiert werden. Hierzu wurden ein PTH-Rezeptor, in dem im C-Terminus die FLNCCPGCCMEP-Sequenz eingebracht wurde, mit ReAsH und ein \&\#946;-Arrestin-2, dem die CCPGCC-Sequenz eingebracht wurde, in Zellen co-exprimiert und gem{\"a}ß dem Protokoll mit FlAsH und ReAsH markiert. Beide Proteine konnten spezifisch markiert werden, wobei der mit ReAsH markierte PTH-Rezeptor eine deutliche Lokalisation in der Zellmembran zeigte. Durch sequentielle Exzitation konnte in der gleichen Zelle das zytosolisch lokalisierte, mit FlAsH markierte \&\#946;-Arrestin-2 detektiert werden. Wurden die so markierten Zellen mir 1 µM PTH stimuliert, wurde das FlAsH-markierte \&\#946;-Arrestin-2 an die Zellmembran rekrutiert. Somit konnte durch die Entwicklung dieses Protokolls eine duale spezifische Markierung von Proteinen mit zwei kleinen Fluorophoren zu innerhalb einer Zelle erreicht werden.}, subject = {Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer}, language = {de} } @phdthesis{Rached2009, author = {Rached, Eva Katharina}, title = {Neue Ans{\"a}tze zur Entwicklung von Alternativmethoden zur Pr{\"u}fung auf chronische Nierentoxizit{\"a}t}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-47812}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Die Niere ist eines der wichtigsten Zielorgane f{\"u}r Toxizit{\"a}t, allerdings stellt die fr{\"u}hzeitige Erkennung einer Nierensch{\"a}digung und/oder kanzerogenen Wirkung infolge einer wiederholten Exposition gegen{\"u}ber toxischen Verbindungen ein großes Problem dar, da traditionelle Marker f{\"u}r Nierenfunktionsst{\"o}rungen wenig empfindlich sind. Daher ist es notwendig, verbesserte Testmethoden (Alternativmethoden) zur Pr{\"u}fung auf chronische Nierentoxizit{\"a}t zu entwickeln. Ziel dieser Arbeit war es daher, m{\"o}gliche Alternativmethoden zur Pr{\"u}fung auf Nephrotoxizit{\"a}t nach wiederholter Exposition zu untersuchen. Zum einen wurden dazu in einem in vivo-Modell f{\"u}r chronische Nierentoxizit{\"a}t neue Biomarker f{\"u}r Stress und Gewebesch{\"a}digung untersucht, deren erh{\"o}hte Genexpression in mehreren Modellen f{\"u}r akute Sch{\"a}digung des Nierengewebes gezeigt wurde, einschließlich kidney injury molecule-1 (KIM-1), Lipocalin-2 (LCN2), Clusterin (CLU), Osteopontin (OPN), tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1), Vimentin (VIM) und H{\"a}moxygenase-1 (HO-1). Diese Marker wurden nachfolgend auch in einem zellkulturbasierten in vitro-Modell untersucht. Ein weiterer Teil der Arbeit befasste sich mit Ver{\"a}nderungen der Zellteilung als m{\"o}glicher Marker f{\"u}r die Fr{\"u}herkennung kanzerogener Effekte. Das in vivo-Modell bestand in einer Studie in m{\"a}nnlichen F344/N-Ratten, die 14, 28 oder 90 Tage oral mit 0, 21, 70 oder 210 µg/kg K{\"o}rpergewicht (KG) Ochratoxin A (OTA) behandelt wurden. OTA ist ein Mykotoxin, das in Ratten bei wiederholter Gabe eine Nierensch{\"a}digung und Nierenkrebs verursacht. Die Analyse der mRNA-Expression der neuen Biomarker in Nierengewebe zeigte bei Tieren, die mit 70 oder 210 µg/kg KG behandelt wurden, eine fr{\"u}hzeitige, zeit- und dosisabh{\"a}ngige Induktion von KIM-1, LCN2, TIMP-1, OPN und CLU, die mit histopathologischen Ver{\"a}nderungen in Form von Zelldegeneration und Regeneration einherging und das Fortschreiten der Sch{\"a}digung gut widerspiegelte. Auch die mRNA-Expression von HO 1 und VIM wurde durch OTA moduliert, allerdings war eine Erh{\"o}hung nicht zu allen Zeitpunkten zu messen bzw. trat nicht so fr{\"u}h auf wie bei den anderen Markern. Effekte auf traditionelle Marker f{\"u}r Nephrotoxizit{\"a}t (Serum-Kreatinin, N-Acetyl-\&\#946;-D-glucosaminidase und \&\#947;-Glutamyltransferase im Urin) wurden im Vergleich zu den neuen Markern zu einem sp{\"a}teren Zeitpunkt und zumeist nur in der Hochdosisgruppe festgestellt. Zus{\"a}tzlich zu den Effekten auf die Genexpression konnte in den Zielzellen von OTA im proximalen Tubulusepithel eine erh{\"o}hte Proteinexpression von KIM-1, CLU, OPN und VIM gezeigt werden; nur f{\"u}r KIM-1 wurde allerdings auch im Urin eine erh{\"o}hte Konzentration nachgewiesen, die mit den Effekten auf die mRNA- und Proteinkonzentration im Gewebe korrelierte. Damit stellt KIM-1 in dieser Studie hinsichtlich Empfindlichkeit und Messbarkeit den empfindlichsten Biomarker f{\"u}r Nephrotoxizit{\"a}t dar. Die Untersuchung der Zellteilung nach wiederholter Gabe von OTA zeigte einen dramatischen, zeit- und dosisabh{\"a}ngigen Anstieg der Proliferation von proximalen Tubulusepithelzellen in Nieren von Tieren, die mit 70 oder 210 µg/kg KG behandelt wurden. Dagegen wurden nach wiederholter Exposition gegen{\"u}ber 21 µg/kg KG {\"u}ber 90 Tage keine OTA-abh{\"a}ngigen Effekte auf die renale Zellproliferation festgestellt. Somit korrelieren die Ver{\"a}nderungen der Zellteilung in der Niere in der 90-Tages-Studie sehr gut mit dem Ergebnis der 2-Jahres-Kanzerogenit{\"a}tsstudie mit OTA, in der Nierentumoren nur nach Behandlung mit 70 oder 210 µg/kg KG auftraten. Ausgehend von den verschiedenen Endpunkten f{\"u}r Toxizit{\"a}t, die in der Studie untersucht wurden, liegt der no-observed-adverse-effect-level (NOAEL) bei 21 µg/kg KG OTA. Dies entspricht dem NOAEL der 2-Jahres-Kanzerogenit{\"a}tsstudie. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden die neuen in vivo-Biomarker f{\"u}r Nephrotoxizit{\"a}t in NRK 52E-Zellen als in vitro-Modell ausgetestet. Allerdings konnte eine erh{\"o}hte mRNA-Expression von KIM-1, einem sensitiven Marker in vivo, nach 24 oder 48 Stunden Behandlung mit verschiedenen nephrotoxischen Modellverbindungen (OTA, Kaliumbromat (KBrO3), Cisplatin oder Cadmiumchlorid (CdCl2)) in den Zellen nicht nachgewiesen werden. Die mRNA-Expression anderer Marker (VIM, CLU, TIMP-1, LCN2, OPN) war dagegen in unbehandelten Zellen bereits so hoch, dass die Behandlung mit Nephrotoxinen zu keiner weiteren Induktion f{\"u}hrte. Allein die Gen- und Proteinexpression von HO-1 wurde durch CdCl2, KBrO3 und OTA induziert und k{\"o}nnte daher einen potentiellen Marker f{\"u}r screening-Studien in vitro darstellen. Insgesamt war der Nachweis zytotoxischer Wirkungen jedoch der empfindlichste Endpunkt in der Zellkultur. Die Ergebnisse st{\"u}tzen somit die Verwendung der neuen in vivo-Biomarker als gewebespezifische Marker f{\"u}r Nephrotoxizit{\"a}t in vitro nicht.}, subject = {Niere}, language = {de} } @phdthesis{Dorsch2009, author = {Dorsch, Sandra}, title = {Rezeptor-Rezeptor-Interaktion ß-adrenerger Rezeptoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-39712}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Viele Membranrezeptoren liegen als {\"u}ber Disulfidbr{\"u}cken-verbundene Dimere vor. Ein Nachweis der Dimerisierung ist in diesen F{\"a}llen methodisch klar und einfach zu erbringen. F{\"u}r die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren dagegen ist weder die Existenz von Di- oder Oligomeren noch deren Funktion eindeutig belegt. Meist wurden Methoden wie Coimmunopr{\"a}zipitation und Resonanz-Energie-Transfer-Verfahren wie BRET oder FRET verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen. Trotz ihrer hohen Sensitivit{\"a}t besitzen diese Methoden einige Grenzen und k{\"o}nnen je nach experimentellem Ansatz und Verwendung verschiedener Kontrollen, unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich des Vorliegens einer Protein-Protein-Interaktion liefern. Weder die Stabilit{\"a}t der Interaktion, noch die Fraktion der interagierenden Proteine kann mittels Resonanz-Energie-Transfer-Assays zuverl{\"a}ssig ermittelt werden. Auch die Gr{\"o}ße der Komplexe ist nicht oder nur technisch aufwendig bestimmbar. Deshalb wurde in dieser Arbeit eine neue, unabh{\"a}ngige Methode entwickelt, um Rezeptor-Rezeptor-Interaktionen in lebenden Zellen genauer untersuchen zu k{\"o}nnen. Diese auf „Fluorescence Recovery after Photobleaching" basierende Mikroskopie-Methode erlaubt die Mobilit{\"a}t von Proteinen zu bestimmen. Um Homointeraktionen zwischen Proteinen messen zu k{\"o}nnen, m{\"u}ssen zwei Protein-Fraktionen mit unterschiedlicher Mobilit{\"a}t vorliegen. Deshalb wurde eine Rezeptor-Fraktion extrazellul{\"a}r mit YFP markiert und mit Hilfe polyklonaler Antik{\"o}rper gegen YFP spezifisch immobilisiert. Die andere Rezeptorfraktion wurde intrazellul{\"a}r mit CFP oder Cerulean markiert und wurde deshalb nicht von extrazellul{\"a}ren Antik{\"o}rpern erkannt. So konnten mittels Zwei-Farben-FRAP potenzielle Interaktionen zwischen den immobilisierten extrazellul{\"a}r-markierten Rezeptoren und den intrazellul{\"a}r-markierten Rezeptoren durch eine Mobilit{\"a}ts{\"a}nderung letzterer detektiert werden. Diese Methode wurde mittels eines monomeren (CD86) und kovalent dimeren (CD28) Rezeptors validiert. Es zeigte sich, dass eine spezifische Immobilisierung extrazellul{\"a}r-markierter Proteine nur durch polyklonale, nicht aber durch monoklonale Antik{\"o}rper gegen YFP erreicht werden konnte. Intrazellul{\"a}r-markierte Proteine wurden hierbei in ihrer Mobilit{\"a}t nicht durch die extrazellul{\"a}ren Antik{\"o}rper beeinflusst. Bei Immobilisierung des extrazellul{\"a}r-markierten CD86 war das coexprimierte, intrazellul{\"a}r-markierte CD86-CFP weiterhin voll mobil. Außerdem zeigte das Monomer CD86 eine vom relativen CFP-YFP-Expressionsverh{\"a}ltnis unabh{\"a}ngige Mobilit{\"a}t. Dieses Ergebnis ließ den Schluss zu, dass extra- und intrazellul{\"a}r-markiertes CD86 nicht miteinander interagieren und als Monomer vorliegen. Die Mobilit{\"a}t des kovalenten Dimers CD28 war dagegen abh{\"a}ngig vom CFP-YFP-Expressionsverh{\"a}ltnis und stimmte gut mit theoretisch erwarteten Werten f{\"u}r ein Dimer {\"u}berein. Die Anwendung der Zwei-Farben-Methode zur Untersuchung von Interaktionen zwischen ß1- und ß2-adrenergen Rezeptoren zeigte Unterschiede zwischen beiden Rezeptor-Subtypen. ß1-AR zeigte eine spezifische transiente Interaktion, ß2-AR dagegen lagen als stabile Oligomere h{\"o}herer Ordnung vor. Die transiente Interaktion zwischen ß1-AR und die stabile Oligomerisierung von ß2-AR wurde nicht nur in HEK 293T-Zellen sondern auch in neonatalen Rattenkardiomyozyten und bei 37 °C beobachtet. Ferner hatte der Aktivierungszustand des jeweiligen Rezeptors keinen Einfluß auf das Ausmaß der Interaktion. Zwischen ß1- und ß2-AR wurde nur eine sehr schwache und instabile Heterointeraktion mittels der Zwei-Farben-FRAP-Methode beobachtet. Um zu {\"u}berpr{\"u}fen, ob eine direkte Interaktion zwischen den adrenergen Rezeptoren vorliegt, wurde die BRET-Methode verwendet. Mittels BRET wurde eine direkte Interaktion zwischen ß2-AR festgestellt, jedoch konnte nicht zwischen Dimeren und Oligomeren h{\"o}herer Ordnung unterschieden werden. Bei ß1-AR fand bei h{\"o}heren YFP-Rluc-Expressionsverh{\"a}ltnissen ein spezifischer Energietransfer statt. Bei niedrigeren Expressionsverh{\"a}ltnissen lag das Signal jedoch im unspezifischen Bereich. Auch bei Untersuchung der Heterointeraktion zwischen ß1- und ß2-AR konnte keine klare Aussage {\"u}ber eine spezifische Interaktion zwischen beiden Rezeptor-Subtypen getroffen werden.}, subject = {Dimerisierung}, language = {de} } @phdthesis{Humrich2009, author = {Humrich, Jan}, title = {G-Protein betagamma-Regulation durch Phosducin-like Proteine}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-40059}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Phosducin-like Protein existiert in zwei Splicevarianten: PhLPLONG (PhLPL) und PhLPSHORT (PhLPS). Sie unterscheiden sich in der L{\"a}nge ihres N-Terminus und in ihrem Expressionsmusters: Die lange Form (PhLPL) wird ubiquit{\"a}r exprimiert und bindet G-Protein-betagamma-Untereinheiten (Gbetagama), was zur Hemmung von Gbetagamma-abh{\"a}ngigen Funktionen f{\"u}hrt. Der um 83 Aminos{\"a}uren verl{\"a}ngerte N-Terminus besitzt ein hoch konserviertes Motiv, welches f{\"u}r die Gbetagamma-Bindung und Regulation von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz hierzu besitzt die kurzen Spliceform PhLPS, deren Expression in verschiedenen Gewebetypen deutlich geringer ist, diese hoch konservierte Region nicht. In der vorliegenden Arbeit wurde nun erstmals die Rolle von PhLPL und PhLPS bei der Gbetagamma-Regulation in intakten Zellen untersucht. Hierbei konnte {\"u}berraschenderweise gefunden werden, dass PhLPS der potentere und effizientere Regulator f{\"u}r Gbetagamma-abh{\"a}ngige Signale war. PhLPL hingegen schien in seiner Gbetagamma-regulierenden F{\"a}higkeit limitiert zu werden. Die Ursache dieser Limitierung von PhLPL in intakten Zellen wurde auf eine konstitutive Phosphorylierung seines verl{\"a}ngerten N-Terminus durch die ubiquit{\"a}re Casein Kinase 2 (CK2) zur{\"u}ckgef{\"u}hrt. Die verantwortlichen Phosphorylierungsstellen (S18, T19, S20) wurde identifiziert und die Mutation der CK2-Phosphorylierungsstellen (PhLPLA18-20) f{\"u}hrte zu einer Verbesserung der hemmenden Funktion von PhLPL in Zellen. In vitro-Assays zur Bindungsf{\"a}higkeit von rekombinantem PhLPL (vor und nach CK2-Phosphorylierung) zeigten allerdings: die Phosphorylierung beeinflusste die Affinit{\"a}t nicht. Eine genaue Analyse der N-terminalen Strukuren von PhLPL zeigte indes, dass die Regulationsf{\"a}higkeit von PhLPL in intakten Zellen vor allem in dem konservierten Gbetagamma-Bindungsmotiv zu suchen war. Die Mutation einer einzigen Aminos{\"a}ure (W66V) war ausreichend, um sowohl die Gbetagamma-Bindungsf{\"a}higkeit, als auch die F{\"a}higkeit zur funktionellen Hemmung in intakten Zellen zu verlieren. Was war also der Mechanismus der Hemmung von Gbetagamma durch PhLPS und die phophorylierungsdefiziente Mutante von PhLPL? Ein erster Hinweis hierauf kam von der Beobachtung, dass die Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten in Anwesenheit von PhLPS in ihrem Proteingehalt deutlich reduziert vorlagen (wie in Western Blots gezeigt). Dieser Mechanismus schien von proteasomalen Abbauwegen abzuh{\"a}ngen (gezeigt durch Effekte des spezifischen Proteasominhibitors Lactazystin). Allerdings schien eine Stabilisierung der Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten (durch N-terminale Fusion mit einem Protein zur vitalen Proteinf{\"a}rbung) nicht die Funktionsf{\"a}higkeit von Gbetagamma in Anwesenheit von PhLPS bewahren zu k{\"o}nnen. Ganz im Gegenteil, es wurde gezeigt, dass Gbeta und Ggamma hierbei nicht mehr zu einem funktionellen Dimer assoziierten. Dies war ein Hinweis darauf, dass m{\"o}glicherweise Proteinfaltungsmechanismen bei der Regulation essentiell sein k{\"o}nnten. Eine postulierte Rolle bei der Faltung von WD40-Repeatproteinen wie der Gbeta-Untereinheit wurde dem Chaperonin-Komplex CCT (chaperonin containing TCP) zugedacht. Folgerichtig konnte PhLPS mit seinen funktionell aktiven Dom{\"a}nen an endogenes TCP-1alpha (einer Untereinheit von CCT) binden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Hemmung des CCT-Komplexes durch RNA-Interferenz mit TCP-1alpha ebenso wie PhLPS zur spezifischen Reduktion von Gbetagamma f{\"u}hrte. In dieser Arbeit wurde also ein neuartiger Mechanismus der G-Protein-Regulation durch Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma beschrieben. Ein Schaltmechanismus zwischen direkter Gbetagamma-Bindung (induziert durch CK2-Phosphorylierung von PhLPL) und Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma (induziert durch alternatives Splicen oder durch Dephosphorylierung von PhLP) wird postuliert.}, subject = {G-Proteine}, language = {de} } @phdthesis{Baumann2009, author = {Baumann, Klaus}, title = {Modulierende Effekte von Kaffee auf die Induktion von Mikrokernen durch mutagene Substanzen in Mauslymphomzellen L5178Y}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-36996}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Kaffee, die in der westlichen Welt am h{\"a}ufigsten verwendete psychoaktive Substanz, erwies sich im Mikrokern-Testes an Maus-Lymphomzellen L 5178Y als modulierend auf bekannte mutagene Agentien. In dieser Arbeit wurde meist Instantkaffee verwendet, der gegen N-Methyl-N-Nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG), Mitomycin C (MMC), Genistein, und Methylmethansulfonat getestet wurde. Bei MMC und Genistein erwies sich Kaffee als antimutagen. Bei MNNG hatte Kaffee keinen klaren Einfluss auf die Gentoxizit{\"a}t, ebenso blieb die Kaffee-Wirkung bez{\"u}glich MMS unklar. Kaffee minderte dosisabh{\"a}ngig das Wachstum und die {\"U}berlebensrate von L 5178Y - Zellen. Es wurde die Frage nach den Ursachen der modulierenden Effekte diskutiert. Insbesondere wurde die Hypothese er{\"o}rtert, dass f{\"u}r die Richtung der Modulation nicht so sehr die Konzentration des Kaffees, sondern die mutagene Potenz der koinkubierten Substanz eine entscheidende Rolle spielen k{\"o}nnte. Ggf. wirkt Kaffee - im Sinne eines "abh{\"a}rtenden" Effektes - bei schwach mutagenen Substanzen anitmutagen, bei stark mutagenen Substanzen hingegen synergistisch mutagen.}, subject = {Kaffee}, language = {de} } @phdthesis{Treutlein2009, author = {Treutlein, Anna-Teresa}, title = {Genomprotektive Wirkung der Vitamine Fols{\"a}ure und Vitamin B12 in Dialysepatienten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-36028}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Bei Dialysepatienten sind vermehrte Genomsch{\"a}den bekannt, sie unterliegen auch einer erh{\"o}hten Karzinominzidenz. Erh{\"o}hte Genomsch{\"a}den k{\"o}nnen in vivo durch die Substitution von Fols{\"a}ure reduziert werden, unter Gabe von Vitamin B12 sinkt die Empfindlichkeit gegen{\"u}ber genotoxischen Agentien. 27 Dialysepatienten nahmen an dieser Studie teil. Die 9 Patienten der Substitutions-gruppe Fols{\"a}ure erhielten dreimal w{\"o}chentlich 15 mg Fols{\"a}ure intraven{\"o}s, den 10 Patienten der Substitutionsgruppe Fols{\"a}ure + Vitamin B12 wurde zus{\"a}tzlich einmal w{\"o}chentlich 1000 µg Vitamin B12 intraven{\"o}s verabreicht. 8 Dialysepatienten und 7 nicht dialysepflichtige Probanden dienten als Kontrolle. Zu drei Zeitpunkten vor und drei Zeitpunkten nach Substitutionsbeginn wurden die Mikrokernfrequenzen in peripheren, doppelkernigen Lymphozyten bestimmt. Mikro-kerne dienen als Marker f{\"u}r Genomsch{\"a}den, die Methode ist gut erprobt und es ist ein Zusammenhang zwischen erh{\"o}hten Mikrokernfrequenzen und einer prospektiv erh{\"o}hten Karzinominzidenz beschrieben. Weiterhin wurden die Homocystein-Plasmaspiegel vor und nach Substitutionsbeginn gemessen. Homocystein z{\"a}hlt zu den Ur{\"a}mietoxinen, in vitro steigt bei erh{\"o}hten Homocysteinwerten dosisabh{\"a}ngig der Genomschaden in Form von Mikrokernen an. Vor Substitutionsbeginn wiesen die Dialysepatienten um ein mehrfaches gegen{\"u}ber den Referenzwerten erh{\"o}hte Mikrokernfrequenzen auf, wobei die Mikrokernfrequenzen der Frauen deutlich {\"u}ber denen der M{\"a}nner lagen. Mit zunehmender Dialysedauer kam es zu einer Reduktion der Mikrokernfrequenz, wobei diese immer noch gegen{\"u}ber den Referenzwerten erh{\"o}ht blieb. Unter Gabe von Fols{\"a}ure + Vitamin B12 kam es zu einem signifikant st{\"a}rkeren R{\"u}ckgang der Mikrokernfrequenz als unter alleiniger Fols{\"a}uregabe. Dieser R{\"u}ckgang unter Vitaminsubstitution nahm mit zunehmendem Dialysealter zun{\"a}chst zu, bei einer Dialysedauer von l{\"a}nger als 10 Jahren nahm er wieder ab. Die Homocysteinspiegel waren vor Substitutionsbeginn deutlich erh{\"o}ht. Unter kombinierter Gabe von Fols{\"a}ure und Vitamin B12 kam es zu einer signifikanten Reduktion der Homocysteinwerte, so dass diese sogar unterhalb der im Normbereich liegenden Homocysteinwerte der nicht dialysepflichtigen Kontrollgruppe lagen. Ob die in der Studie vielversprechende kombinierte Substitution von Fols{\"a}ure und Vitamin B12 tats{\"a}chlich das Krebsrisiko von Dialysepatienten beeinflussen kann, wird nur durch prospektive Langzeitstudien zu kl{\"a}ren sein. Ebenfalls werden weitere Studien n{\"o}tig sein, um die optimale Dosis, welche m{\"o}glicherweise in Abh{\"a}ngigkeit von Alter, Geschlecht, Dialysedauer und Grunderkrankung variieren kann, zu ermitteln. Weitere Vorteile einer therapeutischen Gabe von Fols{\"a}ure und Vitamin B12 liegen sicherlich einerseits in den vergleichsweise geringen Kosten und andererseits in der guten Vertr{\"a}glichkeit, welche f{\"u}r die Compliance der Patienten von großer Bedeutung ist.}, subject = {Fols{\"a}ure}, language = {de} } @phdthesis{Schuster2009, author = {Schuster, Paul Xaver}, title = {Biotransformation of trans-1,1,1,3-tetrafluoropropene, 2,3,3,3-tetrafluoropropene and 1,2,3,3,3-pentafluoropropene}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-43716}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {trans-1,1,1,3-Tetrafluoropropene (HFO-1234ze) and 2,3,3,3-tetrafluoropropene (HFO-1234yf) are non-ozone-depleting fluorocarbon replacements with low global warming potentials and short atmospheric lifetimes. They are developed as foam blowing agent and refrigerant, respectively. Investigations on biotransformation in different test species and in vitro systems are required to assess possible health risks of human exposure and needed for commercial development. The biotransformation of HFO-1234ze and HFO-1234yf was therefore investigated after inhalation exposure. Male Sprague-Dawley rats were exposed to air containing 2 000; 10,000; or 50,000 ppm (n=5/concentration) HFO-1234ze or HFO-1234yf. Male B6C3F1 mice were only exposed to 50,000 ppm HFO-1234ze or HFO-1234yf. Due to lethality observed in a developmental study with rabbits after exposure to high concentrations of HFO-1234yf, the metabolic fate of the compound was tested by whole body inhalation exposure of female New Zealand White rabbits to air containing 2 000; 10,000; or 50,000 ppm (n=3/concentration) HFO-1234yf. All inhalation exposures were conducted for 6 h in a dynamic exposure chamber. After the end of the exposures, animals were individually housed in metabolic cages and urines were collected at 6 or 12 h intervals for 48 h (rats and mice) or 60 h (rabbits). For metabolite identification, urine samples were analyzed by 1H-coupled and 1H-decoupled 19F-NMR and by LC/MS-MS or GC/MS. Metabolites were identified by 19F-NMR chemical shifts, signal multiplicity, 1H-19F coupling constants and by comparison with synthetic reference compounds. Biotransformation of HFO-1234ze in rats exposed to 50,000 ppm yielded S-(3,3,3-trifluoro-trans-propenyl)mercaptolactic acid as the predominant metabolite which accounted for 66\% of all integrated 19F-NMR signals in urines. No 19F-NMR signals were found in spectra of rat urine samples collected after inhalation exposure to 2 000 or 10,000 ppm HFO-1234ze likely due to insufficient sensitivity. S-(3,3,3-Trifluoro-trans-propenyl)-L-cysteine, N-acetyl-S-(3,3,3-trifluoro-trans-propenyl)-L-cysteine, 3,3,3-trifluoropropionic acid and 3,3,3-trifluorolactic acid were also present as metabolites in urine samples of rats and mice at the 50,000 ppm level. A presumed amino acid conjugate of 3,3,3-trifluoropropionic acid was the major metabolite of HFO-1234ze in urine samples of mice exposed to 50,000 ppm and related to 18\% of total integrated 19F-NMR signals. Quantitation of three metabolites in urines of rats and mice was performed, using LC/MS-MS or GC/MS. The quantified amounts of the metabolites excreted with urine in both mice and rats, suggest only a low extent (<<1\% of dose received) of biotransformation of HFO-1234ze and 95\% of all metabolites were excreted within 18 h after the end of the exposures (t1/2 approx. 6 h). Due to its low boiling point of \&\#8722;22 °C, most of the inhaled HFO-1234ze is expected to be readily exhaled. Moreover, steric and electronic factors may decrease the reactivity of the parent compound with soft nucleophiles such as glutathione. The obtained results suggest that HFO-1234ze is subjected to an addition-elimination reaction with glutathione and to a cytochrome P450-mediated epoxidation at low rates. The extent of a direct addition reaction of HFO-1234ze with glutathione is negligible, compared to that of the observed addition-elimination reaction. The results of in vivo testing of HFO-1234ze could not be supported by in vitro investigations, since HFO-1234ze was not metabolized in incubations with either liver microsomes or subcellular fractions from rat and human. Regarding the structures delineated in the biotransformation scheme of HFO-1234ze, 1,1,1,3-tetrafluoroepoxypropane and 3,3,3-trifluoropropionic acid are toxic intermediates which, however, are not supposed to display toxicity in the species after exposure to HFO-1234ze, due to the low extent of formation and an efficient detoxification of the epoxide by hydrolysis and glutathione conjugation. The findings of biotransformation of HFO-1234ze in rats and mice correlate with the absence of adverse effects in the toxicity testings and indicate their innocuousness to a human exposure. Biotransformation of HFO-1234yf yielded N-acetyl-S-(3,3,3-trifluoro-2-hydroxypropanyl)-L-cysteine as predominat metabolite which accounted for approx. 44, 90 and 32\% (50,000 ppm) of total 19F-NMR signal intensities in urine samples from rabbits, rats and mice, respectively. S-(3,3,3-Trifluoro-2-hydroxypropanyl)mercaptolactic acid and the sulfoxides of mercapturic acid and mercaptolactic acid S-conjugate were identified as minor metabolites of HFO-1234yf in urine samples from rabbits, rats and mice, whereas trifluoroacetic acid, 3,3,3-trifluorolactic acid and 3,3,3-trifluoro-1-hydroxyacetone were present as minor metabolites only in urine samples from rats and mice. The absence of these metabolites in rabbit urine samples...}, subject = {Biotransformation}, language = {en} } @article{SchuppHeidlandStopper2010, author = {Schupp, Nicole and Heidland, August and Stopper, Helga}, title = {Genomic Damage in Endstage Renal Disease - Contribution of Uremic Toxins}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-68653}, year = {2010}, abstract = {Patients with end-stage renal disease (ESRD), whether on conservative, peritoneal or hemodialysis therapy, have elevated genomic damage in peripheral blood lymphocytes and an increased cancer incidence, especially of the kidney. The damage is possibly due to accumulation of uremic toxins like advanced glycation endproducts or homocysteine. However, other endogenous substances with genotoxic properties, which are increased in ESRD, could be involved, such as the blood pressure regulating hormones angiotensin II and aldosterone or the inflammatory cytokine TNF-. This review provides an overview of genomic damage observed in ESRD patients, focuses on possible underlying causes and shows modulations of the damage by modern dialysis strategies and vitamin upplementation.}, subject = {Toxin}, language = {en} } @phdthesis{Bieber2010, author = {Bieber, Daniela}, title = {Der A2B-Adenosinrezeptor und MAP-Kinase Aktivit{\"a}t in MDA-MB-231 Brustkrebszellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65707}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Sowohl MAPK als auch Adenosin werden mit Tumorproliferation und Angiogenese in Verbindung gebracht. MDA-MB-231 {\"O}strogenrezeptor-negative Brustkrebszellen zeigen eine sehr starke Expression des A2BAR, der außerdem der einzige von dieser Zelllinie exprimierte Adenosinrezeptor ist. Es konnte gezeigt werden, dass MDA-MB-231-Brustkrebszellen eine hohe basale MAPK-Aktivit{\"a}t aufweisen, welche durch Stimulation mit FCS nicht weiter gesteigert werden kann. Diese hohe basale MAPK-Aktivit{\"a}t wird durch die src-Kinase und Her2 verursacht, da eine Inhibition dieser beiden Tyrosinkinasen eine Hemmung der basalen ERK-Phosphorylierung induziert. Interessanterweise f{\"u}hrt die Stimulation des A2BAR der MDA-MB-231-Brustkrebszellen mit dem unselektiven Agonisten NECA zu einer zeitanh{\"a}ngigen Inhibition der ERK-1/2-Phosphorylierung. Eine Behandlung der Brustkrebszelllinie mit 10 µM CGS 21680 zeigten keinen Einfluss auf die ERK-Aktivit{\"a}t, weshalb davon ausgegangen werden kann, dass die zeitabh{\"a}ngige Inhibition der ERK-1/2-Phosphorylierung durch den A2BAR vermittelt wird. Eine Beteiligung von cAMP an der MAPK-Signaltransduktion des A2BAR scheint insofern wahrscheinlich, als sowohl eine Behandlung der Zellen mit Forskolin als auch der Kombination aus cAMP-AM und dem PDE4-Inhibitor Rolipram eine zeitabh{\"a}ngige Hemmung der ERK-1/2-Phosphorylierung induzieren. Jedoch scheint weder die PKA noch die PI3K an dieser Signaltransduktion des A2BAR beteiligt zu sein, da die A2BAR-vermittelte Inhibition der MAPK auch in Anwesenheit von PKA- und PI3K-Inhibitoren bestehen bleibt. Auch scheinen cAMP-GEFs wie beispielsweise Epac in diesem Zusammenhang keine Rolle zu spielen. In Gegenwart des PLC-Inhibitors U-73122 und des Ca2+-Chelators BAPTA verschwand die NECA-induzierte Hemmung der ERK-1/2-Phosphorylierung, was f{\"u}r eine Beteiligung der PLC und des Ca2+ an der A2BAR-vermittelten Hemmung der MAPK-Aktivit{\"a}t spricht. Letzten Endes konnte jedoch kein Mechanismus eruiert werden, welcher diese A2BAR-vermittelte, Ca2+-abh{\"a}ngige MAPK-Hemmung mediiert, da weder eine Inhibition der PKC, der CamKII oder des Calcineurins Einfluss auf die NECA-induzierte MAPK-Hemmung hatten. Was Wachstum und Proliferation der {\"O}strogenrezeptor-negativen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 anbelangt, so konnte gezeigt werden, dass der unselektive Agonist NECA zu einer signifikanten Wachstumshemmung dieser Brustkrebszelllinie f{\"u}hrt. Allerdings kommt es aufgrund einer Desensitisierung der A2BAR in MDA-MB-231-Brustkrebszellen lediglich zu einem transienten proliferationshemmenden Effekt nach Stimulation mit NECA.}, subject = {Adenosinrezeptor}, language = {de} } @phdthesis{Blankenburg2010, author = {Blankenburg, Robert}, title = {Longitudinale Untersuchungen der kardialen Morphologie von knockin-M{\"a}usen mit humanen Myosinmutationen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71417}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Longitudinale Untersuchungen der kardialen Morphologie von knockin-M{\"a}usen mit humanen Myosinmutationen}, subject = {Kardiomyopathie}, language = {de} } @phdthesis{Fischer2010, author = {Fischer, Thomas Horst}, title = {Die transkriptionelle Regulation der microRNA-21 im Herzen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-50702}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {MicroRNAs sind kleine, nicht kodierende RNA-Molek{\"u}le, die posttranskriptionell die Genexpression regulieren. Sie binden hierf{\"u}r spezifisch an 3'-UTRs von messenger-RNAs und f{\"u}hren entweder direkt zu deren Abbau oder inhibieren deren Translation. {\"U}ber die Mechanismen, die die Expression von microRNAs regulieren, ist jedoch noch wenig bekannt. Die Tatsache, dass sie als lange Vorl{\"a}ufermolek{\"u}le (pri-microRNAs) durch die RNA-Polymerase-II transkribiert werden, legt die Existenz eines Promotorbereiches nahe, der dem proteinkodierender Gene {\"a}hnelt. Mit Hilfe von microRNA-Arrays konnten wir im linksventrikul{\"a}ren Myokard mehrere bei Herzinsuffizienz deutlich ver{\"a}ndert exprimierte microRNAs identifizieren. Die microRNA-21 ist dabei bereits im Fr{\"u}hstadium der Herzinsuffizienz verst{\"a}rkt exprimiert (Northern Blot). Auch in prim{\"a}ren, kardialen Zellen (Fibroblasten, Kardiomyozyten) wird die microRNA-21 nach Induktion einer Hypertrophie verst{\"a}rkt exprimiert. Weiterf{\"u}hrendes Ziel dieser Arbeit war es nun, diejenigen Mechanismen aufzukl{\"a}ren, die der starken Induktion der microRNA-21 im erkrankten Myokard zu Grunde liegen. Durch bioinformatische Analyse des zugeh{\"o}rigen Promotorbereiches (Trans-Spezies-Konservierung) und Klonierung danach ausgerichteter Fragmente in Luciferase-basierte Reporter-Plasmide konnte ein 118 Basen langer Bereich identifiziert werden, der maßgeblich die Expression der microRNA-21 im Herzen bedingt. Durch Deaktivierung einzelner cis-Elemente konnte die kardiale Expression auf zwei essentielle Transkriptionsfaktorbindungsstellen zur{\"u}ckgef{\"u}hrt werden. Es handelt sich dabei um Erkennungssequenzen f{\"u}r die im Herz bedeutsamen Transkriptionsfaktoren CREB und SRF. Sie liegen in enger r{\"a}umlicher Nachbarschaft ungef{\"a}hr 1150 bp vor der Transkriptionsstartstelle. Die Suppression der Expression dieser beiden Transkriptionsfaktoren mittels geeigneter siRNAs f{\"u}hrte jeweils zu einer signifikanten Aktivit{\"a}tsminderung des microRNA-21-Promotors und konnte somit die vorangehenden Ergebnisse validieren. Durch Generierung einer transgenen Tierlinie, die lacZ unter der Kontrolle des microRNA-21-Promotors exprimiert, werden in naher Zukunft n{\"a}here Aufschl{\"u}sse {\"u}ber die gewebsspezifische Verteilung der microRNA-21-Expresssion in vivo m{\"o}glich sein. Zusammenfassend beschreiben wir hier erstmals den Mechanismus der transkriptionellen Regulation der microRNA-21 im Herzen. Dieser Mechanismus bedingt wahrscheinlich die starke Induktion dieser microRNA bei kardialer Hypertrophie und Herzinsuffizienz.}, subject = {Small RNA}, language = {de} } @phdthesis{Queisser2010, author = {Queisser, Nina}, title = {Oxidative and nitrosative stress induced by the mineralocorticoid aldosterone - Mechanism of induction and role of signal transduction pathways and transcription factors}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-53566}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Several epidemiological studies found that hypertensive patients have an increased risk to develop kidney cancer. Hyperaldosteronism frequently results in arterial hypertension and contributes to the development and progression of kidney injury, with reactive oxygen species (ROS) playing an important role. ROS are thought to be associated with many pathological conditions such as cancer and other disorders, like cardiovascular complications , which often go along with hypertension. The aim of the present work was to investigate whether the effects of elevated aldosterone concentrations might be involved in the increased cancer incidence of hypertensive individuals. First, the potential capacity of aldosterone to induce oxidative stress and DNA damage was investigated in vitro and in vivo. In LLC-PK1 porcine kidney cells and MDCK canine kidney cells the significant formation of ROS, and especially of superoxide (O2˙ˉ) was assessed. With two genotoxicity tests, the comet assay and the micronucleus frequency test, the DNA damaging potential of aldosterone was quantified. In both genotoxicity tests a dose-dependent increase in aldosterone-induced structural DNA damage was observed. Oxidative stress and DNA damage were prevented by antioxidants, suggesting ROS as a major cause of DNA damage. Furthermore, the oxidatively modified DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydro-2´-deoxyguanosine (8-oxodG), was found to be significantly elevated. In kidneys of rats with desoxycorticosterone acetate (DOCA)/salt-induced hypertension, which is a model of severe mineralocorticoid-dependent hypertension, elevated levels of ROS and superoxide were found, compared to kidneys of sham rats. Also DNA strand breaks, measured with the comet assay and double strand breaks, visualized with antibodies against the double strand break-marker gamma-H2AX were significantly elevated in kidneys of DOCA/salt-treated rats. In addition, significantly increased amounts of 8-oxodG were detected. Proliferation of kidney cells was found to be increased, which theoretically enables the DNA damage to manifest itself as mutations, since the cells divide. Second, the effects of aldosterone on the activation of transcription factors and signaling pathways were investigated. A significant activation of the potentially protective transcription factor Nrf2 was observed in LLC-PK1 cells. This activation was triggered by an increase of ROS or reactive nitrogen species (RNS). In response to oxidative stress, glutathione synthesis and detoxifying enzymes, such as the subunits of the glutathione-cysteine-ligase or heme oxygenase 1 were rapidly induced after 4 h. Nevertheless, after 24 h a decrease of glutathione levels was observed. Since ROS levels were still high after 24 h, but Nrf2 activation decreased, this adaptive survival response seems to be transient and quickly saturated and overwhelmed by ROS/RNS. Furthermore, Nrf2 activation was not sufficient to protect cells against oxidative DNA damage, because the amounts of double strand breaks and 8-oxodG lesions steadily rose up to 48 h of aldosterone treatment. The second transcription factor that was time- and dose-dependently activated by aldosterone in LLC-PK1 and MDCK cells was NF-kappaB. Furthermore, a significant cytosolic and nuclear activation of ERK was detected. Aldosterone induced the phosphorylation of the transcription factors CREB, STAT1 and STAT3 through ERK. Third, the underlying mechanisms of oxidant production, DNA damage and activation of transcription factors and signaling pathways were studied. Aldosterone exclusively acted via the MR, which was proven by the MR antagonists eplerenone, spironolactone and BR-4628, whereas the glucocorticoid receptor (GR) antagonist mifepristone did not show any effect. Furthermore, aldosterone needed cytosolic calcium to exert its negative effects. Calcium from intracellular stores and the influx of calcium across the plasma membrane was involved in aldosterone signaling. The calcium signal activated on the one hand, the prooxidant enzyme complex NAD(P)H oxidase through PKC, which subsequently caused the generation of O2˙ˉ. On the other hand, nitric oxide synthase (NOS) was activated, which in turn produced NO. NO and O2˙ˉ can react to the highly reactive species ONOO- that can damage the DNA more severely than the less reactive O2˙ˉ. In the short term, the activation of transcription factors and signaling pathways could be a protective response against aldosterone-induced oxidative stress and DNA damage. However, a long-term NF-B and ERK/CREB/STAT activation by persistently high aldosterone levels could unfold the prosurvival activity of NF-kappaB and ERK/CREB/STAT in aldosterone-exposed cells. DNA damage caused by increased ROS might become persistent and could be inherited to daughter cells, probably initiating carcinogenesis. If these events also occur in patients with hyperaldosteronism, these results suggest that aldosterone could be involved in the increased cancer incidence of hypertensive individuals.}, subject = {Aldosteron}, language = {en} } @phdthesis{Duraphe2010, author = {Duraphe, Prashant}, title = {Identification and characterization of AUM, a novel human tyrosine phosphatase}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-44256}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Protein Phosphatasen werden aufgrund der Aminos{\"a}uresequenzen ihrer aktiven Zentren in drei große Familien unterteilt. In einer neu entdeckten Familie von Phosphatasen ist das aktive Zentrum durch die Sequenz DXDX(T/V) charakterisiert. Diese Aspartat-abh{\"a}ngigen Phosphatasen geh{\"o}ren zu der Superfamilie der Hydrolasen vom Haloazid Dehalogenase(HAD)-Typ, einer evolution{\"a}r konservierten und ubiquit{\"a}r verbreiteten Enzymfamilie. Bislang konnten 58 menschliche HAD Enzyme durch Datenbankanalysen identifiziert werden. Ihre Funktionen sind jedoch nach wie vor nur rudiment{\"a}r verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zun{\"a}chst das Komplement aller menschlichen HAD Phosphatasen durch Datenbank-Recherchen erfasst. Zusammen mit phylogenetischen Analysen gelang es, eine zum damaligen Zeitpunkt unbekannte, putative Phosphatase zu identifizieren, die eine vergleichsweise hohe Sequenz-Homologie zu der Zytoskelettregulierenden HAD Phosphatase Chronophin aufweist. Dieses neuartige Enzym wurde kloniert und mit biochemischen und zellbiologischen Methoden charakterisiert. Auf der Basis dieser Befunde bezeichnen wir dieses neuartige Protein als AUM (actin remodeling, ubiquitously expressed, magnesium-dependent HAD phosphatase).Mittels Northern blot, real-time PCR und Western blot Analysen konnte gezeigt werden, dass AUM in allen untersuchten menschlichen und murinen Geweben exprimiert wird. Die h{\"o}chste Expression konnte in Hodengewebe nachgewiesen werden. Durch immunohistochemische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass AUM spezifisch in reifenden Keimzellen mit einem Expressionsmaximum zum Zeitpunkt der Spermiogenese exprimiert wird. Um die Substratpr{\"a}ferenz von AUM zu charakterisieren, wurde zun{\"a}chst ein peptidbasierter in vitro Phosphatase-Substrat-Screen durchgef{\"u}hrt. Hierbei wurden 720 aus menschlichen Phosphoproteinen abgeleitete Phosphopeptide untersucht. Interessanterweise dephosphorylierte AUM ausschließlich Phosphotyrosin (pTyr)-enthaltende Peptide. Nur 17 pTyr-Peptide (~2\% aller untersuchten Peptide) fungierten als AUM-Substrate. Diese Daten legen eine hohe Substratspezifit{\"a}t von AUM nahe. Zu den putativen AUM Substraten geh{\"o}ren Proteine, die in die Dynamik der Zytoskelett-Reorganisation sowie in Tyrosin Kinasevermittelte Signalwege eingebunden sind. In {\"U}bereinstimmung mit den Ergebnissen dieses Phosphopeptid-Screens konnte mittels Phosphatase overlay assays sowie in Zellextrakten aus Pervanadat-behandelten HeLa Zellen demonstriert werden, dass AUM eine begrenzte Anzahl Tyrosin-phosphorylierter Proteinen dephosphorylieren kann.In zellul{\"a}ren Untersuchungen wurde die m{\"o}gliche Rolle von AUM im Rahmen der durch den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ausgel{\"o}sten Tyrosin-Phosphorylierung in einer Spermatogonien Zelllinie (GC-1 spg-Zellen) analysiert. So konnte nachgewiesen werden, dass die {\"U}berexpression von AUM zu einer moderaten Abnahme Tyrosin phosphorylierter Proteine nach EGF-Stimulation f{\"u}hrte. Im Gegensatz dazu l{\"o}ste jedoch die durch RNAInterferenz vermittelte Depletion von endogenem AUM einen robusten Anstieg Tyrosinphosphorylierter Proteine aus, zu denen auch der EGF-Rezeptor selbst z{\"a}hlt. Zus{\"a}tzlich zu dem EGF-Rezeptor wurde die Src-Kinase im Zuge des Phosphopeptid- Screens als m{\"o}gliches AUM Substrat identifiziert. Daher wurden in vitro Kinase/Phosphatase-Assays mit gereinigtem Src und AUM durchgef{\"u}hrt. Mit diesem Ansatz konnte erstmals gezeigt werden, dass AUM in der Lage ist, die Src-Kinase zu aktivieren, w{\"a}hrend Src AUM phosphoryliert und die AUM Phosphatase-Aktivit{\"a}t blockiert. Diese Ergebnisse deuten auf eine gekoppelte, wechselseitige Regulation von AUM und Src hin. Obwohl die Details dieser Regulation derzeit noch unklar sind, zeigen unsere initialen Ergebnisse, dass AUM die Src-Aktivit{\"a}t unabh{\"a}ngig von seiner Phosphatase Aktivit{\"a}t steigert, w{\"a}hrend Src die AUM Phosphatase-Aktivit{\"a}t Kinase-abh{\"a}ngig vermindert. Auf zellul{\"a}rer Ebene sind AUM-depletierte Zellen durch Ver{\"a}nderungen der Aktin- Zytoskelett-Dynamik und der Zelladh{\"a}sion charakterisiert. So weisen AUM-defiziente Zellen stabilisierte Aktin Streßfasern und vergr{\"o}ßerte fokale Adh{\"a}sionen auf. Weiterhin sind AUMdepletierte Zellen durch ein beschleunigtes spreading auf Fibronektin gekennzeichnet. Wir haben mit AUM ein bisher nicht beschriebenes Mitglied der Familie Aspartat-abh{\"a}ngiger Phosphatasen entdeckt. In dieser Arbeit ist es gelungen, AUM phylogenetisch, biochemisch und zellbiologisch zu charakterisieren. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass AUM einen wichtigen, neuartigen Regulator der Src-vermittelten Zytoskelett-Dynamik im Rahmen der Zelladh{\"a}sion und Migration darstellt.}, subject = {Tyrosin}, language = {en} } @phdthesis{vonHayn2010, author = {von Hayn, Kathrin}, title = {Untersuchungen zur Ca2+-abh{\"a}ngigen Regulation von cAMP in intakten vaskul{\"a}ren Myocyten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-47709}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Die Regulation des Tonus glatter Muskelzellen wird entscheidend von den beiden antagonistisch wirkenden second messengern cAMP und Ca2+ beeinflusst. Ein Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob diese beiden Botenstoffe auch direkten Einfluss aufeinander haben k{\"o}nnen und welche Enzyme in diesem Fall an den Prozessen beteiligt sind. cAMP-Signale in intakten Zellen konnten wir in Echtzeit mit Hilfe des FRET-basierten cAMP-Sensors Epac1-camps beobachten; Ca2+-Signale durch Markieren der Zellen mit Fura-2. Anstiege der intrazellul{\"a}ren Ca2+-Konzentration in VSMCs wurden durch Aktivierung von endogen exprimierten, Gq-gekoppelten P2Y6-Rezeptoren mit Uridindiphosphat (UDP) ausgel{\"o}st. Durch eine zus{\"a}tzliche in-vitro Kalibrierung des Epac1-camps konnten dar{\"u}ber hinaus absolute cAMP-Konzentrationen in einzelnen lebenden Zellen berechnet werden. W{\"a}hrend ein Anstieg der Ca2+-Konzentration auf nicht vorstimulierte VSMCs keinen signifikante Einfluss auf die intrazellul{\"a}ren cAMP-Konzentrationen hatte, bewirkte die Aktivierung der purinergen Rezeptoren einen deutlichen R{\"u}ckgang der intrazellul{\"a}ren cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs. Dieser Effekt konnte sowohl durch die Komplexierung von Ca2+ mit BAPTA-AM als auch durch die {\"U}berexpression der Ca2+-insensitiven AC4 antagonisiert werden. Adenylatcyclase-Aktivit{\"a}ts-Assays in VSMC-Membranen zeigten ebenfalls einen R{\"u}ckgang der Cyclaseaktivit{\"a}t nach Zugabe von 2 und 5 \&\#956;M freiem Ca2+. Die Hemmung der einzigen Ca2+-regulierbaren PDE1 mit dem selektiven PDE1-Inhibitor 8-Methoxymethyl-IBMX (8-MM-IBMX) hatte im Gegensatz dazu keinen Einfluss auf die durch UDP verursachte {\"A}nderung der cAMP-Konzentration in vorstimulierten VSMCs. Schließlich bewirkte die Herunterregulation der Ca2+-inhibierbaren AC5 und 6 mit siRNA einen signifikante Hemmung des durch UDP verursachten Effekts. Fasst man alle diese Ergebnisse zusammen, so l{\"a}sst sich folgende Schlussfolgerung ziehen: Der durch purinerge Stimulation verursachte R{\"u}ckgang der cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs wird durch eine Hemmung der Ca2+-hemmbaren AC5 und 6 vermittelt. Dadurch sind zwei f{\"u}r die Regulation des Tonus wichtige Signalwege in VSMCs miteinander verbunden, die sich somit gegenseitig entscheidend beeinflussen k{\"o}nnen. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Entwicklung eines transgenen Mausmodells, das glattmuskelspezifisch den cAMP-Sensor Epac1-camps exprimiert. Mit Hilfe eines solchen Tiermodells k{\"o}nnten in Zukunft cAMP-{\"A}nderungen in intakten Geweben und vielleicht sogar in lebenden Tieren beobachtet werden. Durch Anwendung des Cre-loxP-Rekombinationssystems gelang es eine glatt¬muskelspezifische, f{\"u}r den Epac1-camps transgene Mauslinie zu generieren. Mit isolierten VSMCs dieser Tiere konnten bereits erste FRET-Messungen durchgef{\"u}hrt und agonistinduzierte cAMP-{\"A}nderungen beobachtet werden.}, subject = {Glatte Muskulatur}, language = {de} } @phdthesis{Hoffmann2010, author = {Hoffmann, Dana}, title = {Neue Biomarker zum Nachweis von Nierentoxizit{\"a}t}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48562}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Der Prozess von der Entdeckung und Entwicklung eines potentiellen Arzneistoffs bis zu dessen Zulassung ist extrem kosten\&\#8208; und zeitintensiv und eine Vielzahl dieser Stoffe kann aufgrund toxischer Nebenwirkungen in pr{\"a}klinischen Studien nicht weiterentwickelt werden. Dabei ist die Niere eines der Hauptziele von Xenobiotika\&\#8208;induzierter Organtoxizit{\"a}t, jedoch ist eine fr{\"u}he Detektion von Nierensch{\"a}den schwierig. Den derzeitig verwendeten klinischen Parameter, wie Blutharnstoff (BUN) und Serumkreatinin fehlt es an Sensitivit{\"a}t und Spezifit{\"a}t, da sie Fremdstoff\&\#8208;induzierte Toxizit{\"a}t meist erst aufzeigen, wenn schon ein erheblicher Teil der Nierenfunktion beeintr{\"a}chtigt ist. Daher ist es notwendig, empfindlichere und zuverl{\"a}ssigere Biomarker zu identifizieren und zu validieren, welche kleinste Nierensch{\"a}digungen fr{\"u}her als traditionelle Parameter erkennen. In den letzten Jahren wurden in der Literatur aber auch von verschiedenen Projekten eine Reihe neuer gen\&\#8208;basierender und Urinbiomarker (Kim\&\#8208;1, Clusterin, Lipocalin\&\#8208;2, Timp\&\#8208;1) identifiziert. Ziel dieser Dissertation war es die Aussagekraft dieser Marker im Vergleich zu traditionellen Endpunkten, einschließlich klinische Chemie und Histopathologie an Gewebe\&\#8208;, Urin\&\#8208; und Serumproben von m{\"a}nnlichen Ratten, welche mit Modellsubstanzen f{\"u}r Nephrotoxizit{\"a}t (Aristolochias{\"a}ure und Gentamicin) oder nephrotoxischen Arzneistoffkandidaten (PredTox Projekt) behandelt wurden, mittels qRT\&\#8208;PCR, Immunhistochemie und ELISA zu untersuchen. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Effekte auf Ebene der Gen\&\#8208; und Proteinexpression generell sehr gut mit den histopathologischen Ver{\"a}nderungen korrelieren. Sie konnten meist fr{\"u}her oder in niedrigeren Dosierungen als die traditionellen Nierenmarker BUN und Serumkreatinin detektiert werden. Eine erh{\"o}hte Expression und Exkretion von Kim\&\#8208;1 zeigte sich in allen Studien als eine der fr{\"u}hesten Antworten auf Sch{\"a}digung der proximalen Tubuli und stellt somit den empfindlichsten Biomarker dar. Die erh{\"o}hte Ausscheidung von Clusterin konnte teilweise vor einer ver{\"a}nderten Gen\&\#8208; und Proteinexpression im Gewebe detektiert werden und unterst{\"u}tzen die Verwendung von Clusterin als nicht\&\#8208;invasiven Biomarker. Obwohl eine gesteigerte Exkretion von Lipocalin\&\#8208;2 sehr fr{\"u}h nach Sch{\"a}digung des proximalen Tubulus detektiert werden konnte, ist diese nicht spezifisch f{\"u}r einen Nierenschaden. Dennoch k{\"o}nnte die vermehrte Expression/Ausscheidung von Lipocalin\&\#8208;2 als fr{\"u}he Antwort auf eine Entz{\"u}ndung oder einen Gewebeschaden eine sinnvolle Erg{\"a}nzung der routinem{\"a}ßigen Testung auf Toxizit{\"a}t darstellen. Ebenfalls konnte ein dosis\&\#8208; und zeitabh{\"a}ngiger Konzentrationsanstieg von einem Großteil der potentiellen Biomarker des „WideScreen™ Rat Kidney Toxicity Panels 1 and 2" im Urin beobachtet werden. Da jedoch die potentiellen Biomarker unterschiedliche Empfindlichkeiten besitzen und unter Umst{\"a}nden auch vom Mechanismus der Toxizit{\"a}t von Verbindungen abh{\"a}ngen, erscheint eine Kombination von verschiedenen Biomarkern zur fr{\"u}hzeitigen Erkennung von proximalen Nierensch{\"a}den sowie zur Verlaufskontrolle von Nierenerkrankungen sinnvoll. Durch die einfache Probenahme und leichte Bestimmung ist die Messung der neuen potentiellen Nierenbiomarker im Urin neben der Bestimmung der traditionellen Parameter der klinischen Chemie sowie der Histopathologie sinnvoll f{\"u}r die Identifizierung von Nierensch{\"a}digungen in pr{\"a}klinischen Studien.}, subject = {Biomarker}, language = {de} } @phdthesis{Fazeli2010, author = {Fazeli, Gholamreza}, title = {Signaling in the induction of genomic damage by endogenous compounds}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55634}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Reactive oxygen species (ROS) are continuously generated in cells and are involved in physiological processes including signal transduction but also their damaging effects on biological molecules have been well described. A number of reports in the literature implicate excessive oxidative stress and/or inadequate antioxidant defense in the pathogenesis of cancer, atherosclerosis, chronic and age related disorders. Several studies have indicated that activation of the renin-angiotensin-aldosterone-system can lead to the formation of ROS. Epidemiological studies have revealed higher renal cell cancer incidences and also higher cancer mortalities in hypertensive individuals. Recently, our group has shown that perfusion of the isolated mouse kidney with Ang II or treatment of several cell lines with Ang II leads to formation of DNA damage and oxidative base modifications. Here, we tried to scrutinize the pathway involved in genotoxicity of Ang II. We confirmed the genotoxicity of Ang II in two kidney cell lines of human origin. Ang II treatment led to the production of superoxide anions which we could hinder when we used the membrane permeable superoxide dismutase (SOD) mimetic TEMPOL. One of the enzymes which is activated in the cells after Ang II treatment and is able to produce ROS is NADPH oxidase. We demonstrated the activation of NADPH oxidase in response to Ang II by upregulation of its p47 subunit using RT-PCR. Also, pPhosphorylation of p47 subunit of NADPH oxidase after Ang II treatment was enhanced. Using two inhibitors we showed that NADPH oxidase inhibition completely prevents DNA damage by Ang II treatment. To differentiate between Nox2 and Nox4 isoforms of NADPH oxidase subunits in the genotoxicity of Ang II, we performed siRNA inhibition and found a role only for Nox4, while Nox2 was not involved. Next, we investigated PKC as a potential activator of NADPH oxidase. We showed that PKC becomes phosphorylated after Ang II treatment and also that inhibition of PKC hinders Ang II from damaging the cells. Our results from using several inhibitors of different parts of the pathway revealed that PKC activation in this pathway is dependent on the action of PLC on membrane phospholipids and production of IP3. IP3 binds to its receptor at endoplasmic reticulum (ER), opening a channel which allows calcium efflux into the cytoplasm. In this manner, both ER calcium stores and extracellular calcium cooperate so that Ang II can exert its genotoxic effect. PLC is activated by AT1R stimulation. We could also show that the genotoxicity of Ang II is mediated via AT1R signaling using the AT1R antagonist candesartan. In conclusion, here we have shown that Ang II is able to damage genomic damage in cell lines of kidney origin. The observed damage is associated with production of ROS. A decrease in Ang II-induced DNA damage was observed after inhibition of G-proteins, PLC, PKC and NADPH oxidase and interfering with intra- as well as extracellular calcium signaling. This leads to the following preliminary model of signaling in Ang II-induced DNA damage: binding of Ang II to the AT1 receptor activates PLC via stimulation of G-proteins, resulting in the activation of PKC in a calcium dependent manner which in turn, activates NADPH oxidase. NADPH oxidase with involvement of its Nox4 subunit then produces reactive oxygen species which cause DNA damage. Dopamine content and metabolism in the peripheral lymphocytes of PD patients are influenced by L-Dopa administration. The PD patients receiving a high dose of L-Dopa show a significantly higher content of dopamine in their lymphocytes compared to PD patients who received a low dose of L-Dopa or the healthy control. Central to many of the processes involved in oxidative stress and oxidative damage in PD are the actions of monoamine oxidase (MAO), the enzyme which is responsible for the enzymatic oxidation of dopamine which leadsing to production of H2O2 as a by-product. We investigated whether dopamine oxidation can cause genotoxicity in lymphocytes of PD patents who were under high dose L-Dopa therapy and afterward questioned the occurrence of DNA damage after dopamine treatment in vitro and tried to reveal the mechanism by which dopamine exerts its genotoxic effect. The frequency of micronuclei in peripheral blood lymphocytes of the PD patients was not elevated compared to healthy age-matched individuals, although the formation of micronuclei revealed a positive correlation with the daily dose of L-Dopa administration in patients who received L-Dopa therapy together with dopamine receptor agonists. In vitro, we describe an induction of genomic damage detected as micronucleus formation by low micromolar concentrations in cell lines with of different tissue origins. The genotoxic effect of dopamine was reduced by addition of the antioxidants TEMPOL and dimethylthiourea which proved the involvement of ROS production in dopamine-induced DNA damage. To determine whether oxidation of dopamine by MAO is relevant in its genotoxicity, we inhibited MAO with two inhibitors, trans-2-phenylcyclopropylamine hydrochloride (PCPA) and Ro 16-6491 which both reduced the formation of micronuclei in PC-12 cells. We also studied the role of the dopamine transporter (DAT) and dopamine type 2 receptor (D2R) signaling in the genotoxicity of dopamine. Inhibitors of the DAT, GBR-12909 and nomifensine, hindered dopamine-induced genotoxicity. These results were confirmed by treatment of MDCK and MDCK-DAT cells, the latter containing the human DAT gene, with dopamine. Only MDCK-DAT cells showed elevated chromosomal damage and dopamine uptake. Although stimulation of D2R with quinpirole in the absence of dopamine did not induce genotoxicity in PC-12 cells, interference with D2R signaling using D2R antagonist and inhibition of G-proteins, phosphoinositide 3 kinase and extracellular signal-regulated kinases reduced dopamine-induced genotoxicity and affected the ability of DAT to take up dopamine. Furthermore, the D2R antagonist sulpiride inhibited the dopamine-induced migration of DAT from cytosol to cell membrane. Overall, the neurotransmitter dopamine causes DNA damage and oxidative stress in vitro. There are also indications that high dose L-Dopa therapy might lead to oxidative stress. Dopamine exerts its genotoxicity in vitro upon transport into the cells and oxidization oxidation by MAO. Transport of dopamine by DAT has the central role in this process. D2R signaling is involved in the genotoxicity of dopamine by affecting activation and cell surface expression of DAT and hence modulating dopamine uptake. We provided evidences for receptor-mediated genotoxicity of two compounds with different mechanism of actions. The involvement of these receptors in many human complications urges more investigations to reveal whether abnormalities in the endogenous compounds-mediated signaling can play a role in the initiation of new conditions like carcinogenesis.}, subject = {Angiotensin II}, language = {en} } @article{FoertschHuppMaetal.2011, author = {F{\"o}rtsch, Christina and Hupp, Sabrina and Ma, Jiangtao and Mitchell, Timothy J. and Maier, Elke and Benz, Roland and Iliev, Asparouh I.}, title = {Changes in Astrocyte Shape Induced by Sublytic Concentrations of the Cholesterol-Dependent Cytolysin Pneumolysin Still Require Pore-Forming Capacity}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-69084}, year = {2011}, abstract = {Streptococcus pneumoniae is a common pathogen that causes various infections, such as sepsis and meningitis. A major pathogenic factor of S. pneumoniae is the cholesterol-dependent cytolysin, pneumolysin. It produces cell lysis at high concentrations and apoptosis at lower concentrations. We have shown that sublytic amounts of pneumolysin induce small GTPase-dependent actin cytoskeleton reorganization and microtubule stabilization in human neuroblastoma cells that are manifested by cell retraction and changes in cell shape. In this study, we utilized a live imaging approach to analyze the role of pneumolysin's pore-forming capacity in the actin-dependent cell shape changes in primary astrocytes. After the initial challenge with the wild-type toxin, a permeabilized cell population was rapidly established within 20-40 minutes. After the initial rapid permeabilization, the size of the permeabilized population remained unchanged and reached a plateau. Thus, we analyzed the non-permeabilized (non-lytic) population, which demonstrated retraction and shape changes that were inhibited by actin depolymerization. Despite the non-lytic nature of pneumolysin treatment, the toxin's lytic capacity remained critical for the initiation of cell shape changes. The non-lytic pneumolysin mutants W433F-pneumolysin and delta6-pneumolysin, which bind the cell membrane with affinities similar to that of the wild-type toxin, were not able to induce shape changes. The initiation of cell shape changes and cell retraction by the wild-type toxin were independent of calcium and sodium influx and membrane depolarization, which are known to occur following cellular challenge and suggested to result from the ion channel-like properties of the pneumolysin pores. Excluding the major pore-related phenomena as the initiation mechanism of cell shape changes, the existence of a more complex relationship between the pore-forming capacity of pneumolysin and the actin cytoskeleton reorganization is suggested.}, subject = {Toxikologie}, language = {en} } @phdthesis{Moro2011, author = {Moro, Sabrina}, title = {Identification of target proteins of furan reactive metabolites in rat liver}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-57617}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Furan was recently found to be present in a variety of food items that undergo heat treatment. It is known to act as a potent hepatotoxin and liver carcinogen in rodents. In a 2-year bioassay, chronic furan administration to rats was shown to cause hepatocellular adenomas and carcinomas and very high incidences of cholangiocarcinomas even at the lowest furan dose tested (2.0 mg/kg bw). However, the mechanisms of furan-induced tumor formation are poorly understood. Furan is metabolized by cytochrome P450 (CYP) enzymes, predominantly CYP2E1, to its major metabolite cis-2-butene-1,4-dial (BDA). BDA is thought to be the key mediator of furan toxicity and carcinogenicity and was shown to react with cellular nucleophiles such as nucleosides and amino acid residues in vitro. It is well known that covalent protein binding may lead to cytotoxicity, but the cellular mechanisms involved remain to be elucidated. Since covalent binding of reactive intermediates to a target protein may result in loss of protein function and subsequent damage to the cell, the aim of this study was to identify furan target proteins to establish their role in the pathogenesis of furan-associated liver toxicity and carcinogenicity. In order to identify target proteins of furan reactive metabolites, male F344/N rats were administered [3,4-14C]-furan. Liquid scintillation counting of protein extracts revealed a dose-dependent increase of radioactivity covalently bound to liver proteins. After separation of the liver protein extracts by two-dimensional gel electrophoresis and subsequent detection of radioactive spots by fluorography, target proteins of reactive furan intermediates were identified by mass spectrometry and database search via Mascot. A total of 61 putative target proteins were consistently found to be adducted in 3 furan-treated rats. The identified proteins represent - among others - enzymes, transport proteins, structural proteins and chaperones. Pathway mapping tools revealed that target proteins are predominantly located in the cytosol and mitochondria and participate in glucose metabolism, mitochondrial β-oxidation of fatty acids, and amino acid degradation. These findings together with the fact that ATP synthase β subunit was also identified as a putative target protein strongly suggest that binding of furan reactive metabolites to proteins may result in mitochondrial injury, impaired cellular energy production, and altered redox state, which may contribute to cell death. Moreover, several proteins involved in the regulation of redox homeostasis represent putative furan target proteins. Loss of function of these proteins by covalent binding of furan reactive metabolites may impair cellular defense mechanisms against oxidative stress, which may also result in cell death. Besides the potential malfunction of whole pathways due to loss of functions of several participating proteins, loss of function of individual proteins which are involved in various cellular processes such as transport processes across the mitochondrial membranes, cell signaling, DNA methylation, blood coagulation, and bile acid transport may also contribute to furan-induced cytotoxicity and carcinogenicity. Covalent binding of reactive metabolites to cellular proteins may result in accumulation of high amounts of unfolded or damaged proteins in the endoplasmic reticulum (ER). In response to this ER stress, the cell can activate the unfolded protein response (UPR) to repair or degrade damaged proteins. To address whether binding of furan reactive metabolites to cellular proteins triggers activation of the UPR, semiquantitative PCR and TaqMan® real-time PCR were performed. In the case of UPR activation, semiquantitative PCR should show enhanced splicing of X-box binding protein-1 (XBP1) mRNA (transcription factor and key regulator of the UPR) and TaqMan® real-time PCR should determine an increased expression of UPR target genes. However, our data showed no evidence for activation of the UPR in the livers of rats treated either with a single hepatotoxic dose or with a known carcinogenic dose for 4 weeks. This suggests either that furan administration does not induce ER stress through accumulation of damaged proteins or that activation of the UPR is disrupted. Consistent with the latter, glucose-regulated protein 78 (GRP78), identified as a target protein in our study, represents an important mediator involved in activation of the UPR whose inhibition was shown to impair induction of the UPR. Thus, adduct formation and inactivation of GRP78 by furan metabolites may disturb activation of the UPR. In addition to impaired activation of UPR, protein repair and degradation functions may be altered, because several proteins involved in these processes also represent target proteins of furan and thus may show impaired functionality. Taken together...}, subject = {Furan}, language = {en} } @phdthesis{Hommers2011, author = {Hommers, Leif}, title = {{\"U}ber die Interaktion aktivierter G-Proteine mit G-Protein gekoppelten Rezeptoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-56576}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Aktivierte G-Protein gekoppelte Rezeptoren aktivieren heterotrimere GProteine, in dem sie den Austausch von GDP zu GTP am G-Protein katalysieren. Theoretische Untersuchungen mittels eines vereinfachten kinetischen Modells des Gi/o-Protein Zyklus legen nahe, dass nicht nur GDP-,sondern auch GTP-gebundene Gi/o-Proteine mit aktivierten α2A-adrenergen Rezeptoren (α2A-AR) interagieren k{\"o}nnen. Demgem{\"a}ß sollten aktivierte Gi/o-Proteine mit aktivierten α2A-AR vermehrt interagieren, wenn mehr α2A-AR aktiviert werden als f{\"u}r eine maximale G-Protein Aktivierung n{\"o}tig sind. Dies sollte zu einer paradoxen Deaktivierung von Gi/o-Proteinen und deren Effektorproteinen, z.B. dem G-Protein gekoppelten, einw{\"a}rtsgleichrichtenden Kaliumkanal (GIRK-Kanal) f{\"u}hren. Mittels FRET l{\"a}sst sich in lebenden und in permeabilisierten Zellen unter Kontrolle der intrazellul{\"a}ren Nukleotide die Aktivierung von α2A-AR, die Interaktion von Gi/o-Proteinen mit α2A-AR und die Aktivierung von Gi/o-Proteinen bestimmen. Die Arbeit zeigt auf mehreren Ebenen, dass Go-Proteine mit aktivierten α2A-AR interagieren und im nukleotidfreiem Zustand sequestriert werden k{\"o}nnen: (I) Go-Proteine,irreversibel durch GTPγS aktiviert werden abh{\"a}ngig von der Rezeptor Aktivierung in Abwesenheit von Nukleotiden deaktiviert, (II) Go-Proteine interagieren in Gegenwart niedriger Nukleotidkonzentrationen in wesentlich gr{\"o}ßer Fraktion mit aktivierten α2A-AR als in Gegenwart hoher Nukleotidkonzentrationen, (III) Go Proteine k{\"o}nnen in Gegenwart niedriger GTP und GTPγS-Konzentrationen bei Aktivierung des α2A-AR inaktiviert werden. Die Arbeit zeigt exemplarisch an der Signalkaskade des α2A-AR und Go, dass der G-Protein Zyklus in lebenden Zellen reversibel ist, woraus eine Deaktivierung aktivierter G-Proteine und aktivierter G-Protein Effektoren resultieren kann. Dies erkl{\"a}rt paradoxe Befunde zur Deaktivierung von GIRK-Kan{\"a}len in Myozyten durch A1-Rezeptoren.}, subject = {G-Protein gekoppelte Rezeptoren}, language = {de} } @phdthesis{Vogl2011, author = {Vogl, Silvia}, title = {Investigation of individual differences in the metabolic elimination of drugs by the polymorphic enzymes CYP2C9, 2C19 and 2D6 based on metabolite profiling by LC-MS/MS}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67216}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Mit der vorliegenden Studie sollte zu dem wichtigen Forschungsfeld der Pharmakogenetik beigetragen werden, indem zum einen eine einfache und sichere kombinierte Ph{\"a}notypisierung der drei zuvor erw{\"a}hnten CYPs (CYP2D6, CYP2C9 und CYP2C19) entwickelt, und zum anderen die Vorhersagekraft des Genotyps f{\"u}r den gemessenen Ph{\"a}notyp n{\"a}her untersucht werden sollte. Es ist uns gelungen eine sichere, einfache, schnelle und kombinierte Ph{\"a}notypisierung der beiden wichtigen Monooxygenasen CYP2D6 und CYP2C9 zu etablieren. Zun{\"a}chst wurden dazu Wechselwirkungsstudien mit den ausgew{\"a}hlten Testsubstanzen Dextromethorphan (DEX, CYP2D6), Flurbiprofen (FLB, CYP2C9) und Omeprazole (OME, CYP2C19) durchgef{\"u}hrt. Es konnte gezeigt werden, dass DEX und FLB als Kombination verabreicht werden k{\"o}nnen. Die Gabe von OME gemeinsam mit FLB ver{\"a}ndert jedoch das Ergebnis der CYP2C9 Ph{\"a}notypisierung. Dies ist eine neue Erkenntnis, denn noch 2004 wurde ein Ph{\"a}notypisierungscocktail ver{\"o}ffentlicht, der die Kombination von FLB und OME enthielt. Bei der genannten Studie wurden jedoch, unseres Wissens nach, keine Wechselwirkungsstudien zu den einzelnen Testsubstanz-Kombinationen durchgef{\"u}hrt. Die von uns entwickelte Ph{\"a}notypisierungsmethode wurde durch Wechselwirkungsstudien verifiziert. Sie ist jedoch auch in anderen Bereichen den bisher ver{\"o}ffentlichten ph{\"a}notypisierungscocktails {\"u}berlegen. Zum einen wurden nur sehr kleine Dosen sicherer Testsubstanzen verwendet. Dies wurde durch Entwicklung neuer, sensitiver LC-MS/MS Methoden erm{\"o}glicht. Zum anderen ist diese neue Prozedur schnell und nicht-invasiv durchf{\"u}hrbar. Nach Verabreichung der Testsubstanz muss der Urin nur f{\"u}r zwei Stunden gesammelt werden. Zudem weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass die normalerweise durchgef{\"u}hrte, aufwendige Glucuronidspaltung des CYP2D6 abh{\"a}ngigen DEX-Metaboliten, Dextrorphan, vermutlich vernachl{\"a}ssigt werden kann. Die wichtigsten Ergebnisse dieser Studie sind jedoch die Einblicke, die in die Vorhersagekraft der CYP2D6 und CYP2C9 Genotypen f{\"u}r die entsprechenden Ph{\"a}notypen gewonnen werden konnten. Fast 300 ph{\"a}notypisierte Kaukasier wurden auch in Hinsicht auf die wichtigsten varianten Allele von CYP2D6, CYP2C9 und CYP2C19 mithilfe bekannter und neu etablierter Methoden genotypisiert. Aufgrund der parallelen Ph{\"a}no- und Genotypisierung konnten Geno- und Ph{\"a}notyp direkt korreliert werden. Mit linearen Modellen war es m{\"o}glich, allen detektierten varianten CYP2D6- und CYP2C9-Allelen Aktivit{\"a}tskoeffizienten zuzuweisen. Diese k{\"o}nnen nun verwendet werden, um den Beitrag der einzelnen Allele zur resultierenden Enzymaktivit{\"a}t zu bestimmen, wodurch sich die Vorhersage dieser Aktivit{\"a}t ausgehend vom Genotyp verbessern lassen sollte. Besonders f{\"u}r CYP2D6 erm{\"o}glicht das neue Korrelationsmodel pr{\"a}zisere Vorhersagen des Ph{\"a}notyps als bisher ver{\"o}ffentlichte Modelle. Zusammengefasst leistet diese Studie durch die Entwicklung eines sicheren und einfachen Ph{\"a}notypisierungsprozesses f{\"u}r CYP2D6 und CYP2C9 und durch die Bestimmung von Aktivit{\"a}tskoeffizienten f{\"u}r alle einbezogenen CYP2D6 und CYP2C9 Allele und der damit verbundenen pr{\"a}ziseren Vorhersage des Ph{\"a}notyps ausgehend vom Genotyp einen wesentlichen Beitrag zum Forschungsfeld der Pharmakogenetik.}, subject = {Pharmakogenetik}, language = {en} } @phdthesis{Hintzsche2011, author = {Hintzsche, Henning}, title = {Gentoxizit{\"a}t nichtionisierender Strahlung - Auswirkungen von Mobilfunk- und Terahertzstrahlung auf das Genom}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-57684}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, ob nichtionisierende elektromagnetische Strahlung verschiedener Frequenzbereiche Genomschaden hervorrufen kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Biomonitoring-Studie zu dieser Thematik konzipiert und durchgef{\"u}hrt. Es wurden 131 Probanden detailliert zu ihrer Mobilfunknutzung befragt. Anschließend wurden Mundschleimhautzellen entnommen und f{\"u}r eine mikroskopische Untersuchung aufbereitet und angef{\"a}rbt. In den Zellen wurden Mikrokerne und andere Kernanomalien quantifiziert. Es zeigte sich keine Erh{\"o}hung der Mikrokernfrequenz in Abh{\"a}ngigkeit von der Dauer der Mobiltelefonnutzung. Auch die anderen abgefragten Parameter hatten keinen Einfluss auf die H{\"o}he des Genomschadens. Als Positivkontrollen wurden vier Patienten, die eine lokale Strahlentherapie (ionisierende Strahlung) erhielten, eingeschlossen. Hier zeigte sich eine deutliche Erh{\"o}hung der Mikrokernfrequenz. Um festzustellen, ob die Mikrokerninduktion erst bei h{\"o}heren Leistungsflussdichten als denen, die beim Mobilfunk verwendet werden, auftritt, wurden in-vitro-Versuche durchgef{\"u}hrt, bei denen verschiedene Zelllinien einer Strahlung von 900 MHz ausgesetzt wurden. Nach Exposition und einer Postinkubationsperiode wurden die Zellen fixiert und die Mikrokernfrequenz bestimmt. Neben den Leistungen wurden hier auch die Expositionszeiten und die Postinkubationsperioden variiert. In keinem Fall konnte eine Erh{\"o}hung der Mikrokernfrequenz festgestellt werden. Insgesamt konnte ein Einfluss elektromagnetischer Strahlung auf das Genom weder am Menschen im Rahmen einer Biomonitoring-Studie noch an verschiedenen Zelllinien im Rahmen von in-vitro-Versuchen festgestellt werden. Terahertzstrahlung ist elektromagnetische Strahlung im Bereich von 0,1 bis 10 THz, d. h. sie liegt zwischen Mikrowellen und Infrarotlicht. Derzeit wird sie haupts{\"a}chlich f{\"u}r spektroskopische Untersuchungen und zur Qualit{\"a}tskontrolle im Herstellungs-prozess verschiedener Produkte verwendet. Anwendungen in der Sicherheitstechnik (z. B. Ganzk{\"o}rperscanner) und in der Medizintechnik (z. B. Bildgebung) stehen kurz vor der Markteinf{\"u}hrung bzw. sind bereits etabliert. Diese Anwendungen bringen eine Exposition der betroffenen Menschen mit sich. Außerdem wird an weiteren Techniken wie etwa der Daten{\"u}bertragung gearbeitet. Die Wirkungen auf biologische Systeme sind im Gegensatz zum Mobilfunkbereich bisher nur unzureichend untersucht. Da bisher keine vollst{\"a}ndigen Literatur{\"u}bersichten vorlagen, wurde eine umfassende Literaturrecherche durchgef{\"u}hrt. Ziel war es, alle bisher durchgef{\"u}hrten Studien zu diesem Thema aufzulisten. Um diese Datenbasis zu verbreitern wurden in-vitro-Versuche bei verschiedenen Frequenzen durchgef{\"u}hrt. Als Strahlungsquellen wurden eine Frequenzvervielfacherkaskade (0,106 THz), ein R{\"u}ckw{\"a}rtswellen-Oszillator (0,380 THz) und ein Ferninfrarot-Laser (2,520 THz) eingesetzt. Die Strahlung wurde in einen modifizierten Inkubator gef{\"u}hrt, so dass die Expositionen bei definierter Temperatur und konstantem CO2-Gehalt durchgef{\"u}hrt werden konnten. Da Terahertzstrahlung durch Wasser sehr stark absorbiert wird, sind bei einer Exposition des Menschen prim{\"a}r die obersten Hautschichten betroffen. Aus diesem Grund wurden prim{\"a}re Hautfibroblasten und HaCaT-Zellen, eine Keratinozyten-Zelllinie, als biologische Systeme verwendet. Die Zellen wurden f{\"u}r unterschiedliche Zeitperioden mit verschiedenen Leistungsflussdichten exponiert. Anschließend wurden die Zellen f{\"u}r den Comet Assay aufbereitet und analysiert. Der Comet Assay ist eine Methode zur Quantifizierung von Einzel- und Doppelstrangbr{\"u}chen der DNA. Weiterhin wurden die Zellen nach einer Postinkubationsperiode f{\"u}r den Mikrokerntest aufbereitet. Neben unbehandelten Kontrollen und Sham-Expositionen wurden auch Positivkontrollen durchgef{\"u}hrt. Es konnte keine Erh{\"o}hung der Anzahl der DNA-Strangbr{\"u}che bzw. der Mikrokernfrequenz festgestellt werden. Da bekannt war, dass im Mobilfunkbereich unter bestimmten Bedingungen St{\"o}rungen der Mitose, nicht aber Erh{\"o}hungen der Mikrokernfrequenz, auftreten, wurden Mitosest{\"o}rungen nach Exposition bei 0,106 THz untersucht. Hierzu wurden AL-Zellen f{\"u}r 30 Minuten exponiert und anschließend ohne Postinkubation direkt fixiert. Analysiert wurden St{\"o}rungen in allen Phasen der Mitose. Es zeigte sich, dass die Frequenz der St{\"o}rungen in der Pro- und Metaphase unver{\"a}ndert blieb. Die St{\"o}rungen in der Ana- und Telophase nahmen dagegen mit steigender Leistungsflussdichte zu. Insgesamt konnte im Terahertzbereich unter den gew{\"a}hlten Expositionsbedingungen kein DNA-Schaden beobachtet werden. Bei 0,106 THz konnten Mitosest{\"o}rungen als Folge der Exposition gezeigt werden. Der Zusammenhang zwischen diesen Mitosest{\"o}rungen und DNA-Sch{\"a}den, insbesondere der Mikrokerninduktion, konnte bisher nicht abschließend gekl{\"a}rt werden und bleibt Gegenstand weiterer Untersuchungen.}, subject = {Mutagenit{\"a}t}, language = {de} } @article{HoffmannSchmidtKeimetal.2011, author = {Hoffmann, Linda S and Schmidt, Peter M and Keim, Yvonne and Hoffmann, Carsten and Schmidt, Harald H H W and Stasch, Johannes-Peter}, title = {Fluorescence Dequenching Makes Haem-Free Soluble Guanylate Cyclase Detectable in Living Cells}, series = {PLOS ONE}, volume = {6}, journal = {PLOS ONE}, number = {8}, doi = {10.1371/journal.pone.0023596}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-139631}, pages = {e23596}, year = {2011}, abstract = {In cardiovascular disease, the protective NO/sGC/cGMP signalling-pathway is impaired due to a decreased pool of NO-sensitive haem-containing sGC accompanied by a reciprocal increase in NO-insensitive haem-free sGC. However, no direct method to detect cellular haem-free sGC other than its activation by the new therapeutic class of haem mimetics, such as BAY 58-2667, is available. Here we show that fluorescence dequenching, based on the interaction of the optical active prosthetic haem group and the attached biarsenical fluorophor FlAsH can be used to detect changes in cellular sGC haem status. The partly overlap of the emission spectrum of haem and FlAsH allows energy transfer from the fluorophore to the haem which reduces the intensity of FlAsH fluorescence. Loss of the prosthetic group, e. g. by oxidative stress or by replacement with the haem mimetic BAY 58-2667, prevented the energy transfer resulting in increased fluorescence. Haem loss was corroborated by an observed decrease in NO-induced sGC activity, reduced sGC protein levels, and an increased effect of BAY 58-2667. The use of a haem-free sGC mutant and a biarsenical dye that was not quenched by haem as controls further validated that the increase in fluorescence was due to the loss of the prosthetic haem group. The present approach is based on the cellular expression of an engineered sGC variant limiting is applicability to recombinant expression systems. Nevertheless, it allows to monitor sGC's redox regulation in living cells and future enhancements might be able to extend this approach to in vivo conditions.}, language = {en} } @phdthesis{Saxena2011, author = {Saxena, Ambrish}, title = {Role of the novel protein tyrosine phosphatase AUM for cell adhesion}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65503}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Cell adhesion and migration are essential for development and homeostasis. Adhesion to the extracellular matrix occurs at specialized plasma membrane domains where transmembrane adhesion receptors, signaling proteins such as kinases and phosphatases, and a large number of adaptor proteins interact with the cytoskeleton in a tightly regulated and synchronized fashion. Whereas altered cell adhesion and migration are known to be important in cardiovascular disease and malignant tumors, the target proteins and molecular interactions that regulate these complex processes still remain incompletely understood. Whereas numerous kinases are known to regulate cell adhesion dynamics, information about the involved protein phosphatases is still very limited. A newly emerging phosphatase family contains the unconventional active site sequence DXDX(T/V) and belongs to the haloacid dehalogenase (HAD) superfamily of hydrolases. Our laboratory has recently discovered AUM, a novel phosphatase that belongs to this poorly characterized enzyme family. Initial findings pointed toward a potential involvement of AUM in the regulation of cell adhesion to the extracellular matrix. The objective of the present study was to study the potential role of AUM in cell adhesion. We could show that cells stably depleted of AUM are characterized by accelerated adhesion on immobilized fibronectin. To confirm these findings, we used an siRNA-based approach for the acute depletion of AUM and observed a similar phenomenon. Rescue experiments were performed with stably AUM-depleted cells to ensure that the above mentioned effects are indeed AUM specific. We observed that the re-addition of AUM normalizes cellular adhesion kinetics on fibronectin. These results clearly show that AUM exerts important functions in cell-matrix adhesion. To investigate the molecular basis of these effects, we have characterized integrin expression patterns using flow cytometry. Interestingly, fibronectin-stimulated AUM-depleted cells are characterized by an increase in the cell surface expression of conformationally active 1-integrins. Consistent with the important role of 1-integrins in the regulation of RhoA activity, we also observed a specific increase in RhoA-GTP, but not Rac1-GTP-levels during cell adhesion to fibronectin. Consistent with these findings and with the important role of RhoA for focal adhesion maturation, AUM depleted cells showed more elongated and more centripetally oriented focal adhesions as compared to control cells when spread on fibronectin. Taken together, this study has revealed an important role of AUM for cell-matrix adhesion. Our findings strongly suggest that AUM functions as a negative regulator of 1-integrins and RhoA-dependent cytoskeletal dynamics during cell adhesion.}, subject = {Proteintyrosinphosphatase}, language = {en} } @phdthesis{Schlippverh:Woelfel2011, author = {Schlipp [verh.: W{\"o}lfel], Angela}, title = {Characterization of anti-beta1-adrenoceptor antibodies with F{\"o}rster resonance energy transfer microscopy}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67162}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Dilated cardiomyopathy (DCM) represents an important subgroup of patients suffering from heart failure. The disease is supposed to be associated with autoimmune mechanisms in about one third of the cases. In the latter patients functionally active conformational autoantibodies directed against the second extracellular loop of the β1-adrenergic receptor (AR, β1ECII-aabs) have been detected. Such antibodies chronically stimulate the β1-AR thereby inducing the adrenergic signaling cascade in cardiomyocytes, which, in the long run, contributes to heart failure progression. We analyzed the production of cAMP after aab-mediated β1-AR activation in vitro using a fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay. This assay is based on HEK293 cells stably expressing human β1-AR as well as the cAMP-sensor Epac1-camps. The assay showed a concentration-dependent increase in intracellular cAMP upon stimulation with the full agonist (-) isoproterenol. This response was comparable to results obtained in isolated adult murine cardiomyocytes and was partially blockable by a selective β1-AR antagonist. In the same assay poly- and monoclonal anti-β1ECII-abs (induced in different animals) could activate the adrenergic signaling cascade, whereas isotypic control abs had no effect on intracellular cAMP levels. Using the same method, we were able to detect functionally activating aabs in the serum of heart failure patients with ischemic and hypertensive heart disease as well as patients with DCM, but not in sera of healthy control subjects. In patients with DCM we observed an inverse correlation between the stimulatory potential of anti-β1-aabs and left ventricular pump function. To adopt this assay for the detection of functionally activating anti-β1ECII-aabs in clinical routine we attempted to establish an automated large-scale approach. Neither flow cytometry nor FRET detection with a fluorescence plate reader provided an acceptable signal-to-noise ratio. It was possible to detect (-) isoproterenol in a concentration-dependent manner using two different FRET multiwell microscopes. However, due to focus problems large-scale detection of activating anti-β1ECII-abs could not be implemented. Neutralization of anti-β1-aabs with the corresponding epitope-mimicking peptides is a possible therapeutic approach to treat aab-associated autoimmune DCM. Using our FRET assay we could demonstrate a reduction in the stimulatory potential of anti-β1ECII-abs after in vitro incubation with β1ECII-mimicking peptides. Cyclic (and to a lesser extent linear) peptides in 40-fold molar excess acted as efficient ab-scavengers in vitro. Intravenously injected cyclic peptides in a rat model of DCM also neutralized functionally active anti-β1ECII-abs efficiently in vivo. For a detailed analysis of the receptor-epitope targeted by anti-β1ECII-abs we used sequentially alanine-mutated β1ECII-mimicking cyclic peptides. Our data revealed that the disulfide bridge between the cysteine residues C209 and C215 of the human β1-AR appears essential for the formation of the ab-epitope. Substitution of further amino acids relevant for ab-binding in the cyclic scavenger peptide by alanine reduced its affinity to the ab and the receptor-activating potential was blocked less efficiently. In contrast, the non-mutant cyclic peptide almost completely blocked ab-induced receptor activation. Using this ala-scan approach we were able to identify a "NDPK"-epitope as essential for ab binding to the β1ECII. In summary, neutralization of conformational activating anti-β1ECII-(a)abs by cyclic peptides is a plausible therapeutic concept in heart failure that should be further exploited based on the here presented data.}, subject = {Adrenerger Rezeptor}, language = {en} } @phdthesis{Ramm2012, author = {Ramm, Susanne}, title = {Mechanismen idiosynkratischer Lebertoxizit{\"a}t - Einfluss von Arzneistoff-unabh{\"a}ngigen Stressfaktoren auf die Bildung reaktiver Metaboliten und zellul{\"a}ren Stress}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-74342}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Idiosynkratische Lebersch{\"a}digung durch Arzneimittel (z.B. Diclofenac) stellt trotz ihres seltenen Auftretens eine erhebliche Komplikation in der Arzneimittelentwicklung und -therapie dar. Die zu idiosynkratischen Reaktionen f{\"u}hrenden, komplexen chemischen und biologischen Abl{\"a}ufe sind noch weitgehend unklar. Inzwischen wird jedoch vermutet, dass die Toxizit{\"a}t eines Arzneimittels durch Arzneistoff-unabh{\"a}ngige Risikofaktoren, wie Krankheiten, Entz{\"u}ndungsreaktionen, Co-Medikation oder Alkohol, erh{\"o}ht werden kann. M{\"o}gliche Mechanismen k{\"o}nnten hierbei eine vermehrte Bildung reaktiver Metaboliten bzw. eine ver{\"a}nderte zellul{\"a}re Stress- und Immunantwort sein. Um tiefere Einblicke in die Bedeutung m{\"o}glicher Arzneistoff-unabh{\"a}ngiger Risikofaktoren zu erhalten, wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss drei verschiedener Stressfaktoren auf die Toxizit{\"a}t von Diclofenac (Dcl) untersucht. Bei diesen Stressfaktoren handelte es sich um Lipopolysaccharid (LPS) und Poly I:C (PIC) zur Simulation einer bakteriellen bzw. viralen Entz{\"u}ndung sowie um Buthionin-Sulfoximin (BSO) zur Depletion zellul{\"a}ren Glutathions. Zus{\"a}tzlich wurde getestet, ob eine durch Stressfaktoren ausgel{\"o}ste Erh{\"o}hung der Toxizit{\"a}t von Dcl in Ratten mit Ver{\"a}nderungen in der Biotransformation bzw. mit einer Hochregulation co-stimulatorischer Faktoren (z.B. Zytokine oder Alarmsignale) einhergeht. Die Kombination einer einw{\"o}chigen therapeutisch dosierten Dcl-Behandlung mit einer einmaligen LPS-Dosis erzeugte in den Tieren eine ausgepr{\"a}gte Hepatotoxizit{\"a}t, die mit erh{\"o}hten Aktivit{\"a}ten der Aminotransferasen im Serum einherging. Diese adversen Effekte konnten jedoch nicht durch LPS oder Dcl alleine, bzw. in Kombination mit PIC oder BSO erzeugt werden. Es besteht die Annahme, dass die Bioaktivierung von Diclofenac zu 5-OH-Dcl oder Dcl-Acylglucuronid (AG) sowie die folgende Bildung kovalenter Proteinaddukte zur Entwicklung von Lebertoxizit{\"a}t beitr{\"a}gt. Mittels LC-MS/MS-Messungen konnten wir jedoch nachweisen, dass die Gabe von LPS + Dcl keine erh{\"o}hte Bildung reaktiver Metaboliten oder Dcl-AG-abh{\"a}ngiger Proteinaddukte ausl{\"o}st. Im Einklang damit wurden Enzyme, die f{\"u}r die Bio-aktivierung von Dcl zu reaktiven Metaboliten verantwortlich sind (z.B. Cyp2C11, Cyp2C7 und UGT2B1), sowie die MRP-Effluxtransporter der Leber durch die Co-Behandlung mit LPS in ihrer Genexpression gehemmt. Zus{\"a}tzliche qRT-PCR-Analysen Nrf2-abh{\"a}ngiger Gene, als Sensor f{\"u}r elektrophilen oder oxidativen Stress, zeigten keine Hochregulation zytoprotektiver Faktoren und unterst{\"u}tzen die Schlussfolgerung, dass Arzneistoff-unabh{\"a}ngige Stress-faktoren keine erh{\"o}hte Bildung toxischer Dcl-Metaboliten ausl{\"o}sen. Schließlich ergaben unsere Analysen, dass eine Aktivierung co-stimulatorischer NFκB- und MAPK-Signalwege mit Hochregulation co-stimulatorischer Faktoren (z.B. IL-1β, TNF-α, CINC-1, iNOS) und Akkumulation neutrophiler Granulozyten in der Leber sowohl durch Behandlung mit LPS + Dcl als auch mit PIC + Dcl induziert wurde. Nur die Kombination von LPS und Diclofenac bewirkte jedoch dar{\"u}ber hinaus eine massive Freisetzung pro-inflammatorischer Zytokine, Chemokine sowie toxizit{\"a}tsf{\"o}rdernder Alarmsignale (z.B. IL-1β, TNF-α, CINC-1, HMGB1, LTB4) ins Plasma. Zus{\"a}tzlich waren sch{\"u}tzende negative Feed-back-Mechanismen, wie die Hitzeschockreaktion, in den mit LPS und Dcl behandelten Tieren gehemmt. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass eine metabolische Aktivierung von Dcl bzw. eine Akkumulation reaktiver Dcl-Metaboliten an der Entwicklung idiosynkratischer Lebersch{\"a}digung nicht ausschlaggebend beteiligt ist. Im Gegensatz zu PIC oder BSO f{\"u}hrte in den verabreichten Dosen nur die Gabe von LPS als Stressfaktor zu einer Aktivierung co-stimulatorischer Signalwege sowie zu einer Hemmung protektiver Systeme, wodurch die lebersch{\"a}digende Wirkung von Dcl potenziert wurde.}, subject = {Leber}, language = {de} } @phdthesis{Mueller2012, author = {M{\"u}ller, Stephanie}, title = {Identification of early molecular changes associated with Fumonisin B1-induced carcinogenesis in vivo and in vitro}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71336}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Fumonisin B1 (FB1) is a mycotoxin produced by various Fusarium species and constitutes a major contaminant of maize worldwide. A 2-year carcinogenicity study of the National Toxicology Program (NTP) in Fischer N344 rats showed that male rats were most susceptible to FB1-induced tumor formation in the kidney. Histopathologically, a rare and highly malignant tumor type originating from the proximal tubules of rat kidney with increased potential for invasion and metastasis was identified. However, mechanisms underlying the FB1-induced carcinogenesis in kidneys of male rats are still not clear. Previous studies have shown that FB1-mediated disruption of sphingolipid metabolism via inhibition of ceramide synthase is a primary key event in FB1 toxicity. The disruption of sphingolipid metabolism may cause time- and dose-related changes in the relative balance of various bioactive intermediates. Furthermore, the ability of FB1 to induce renal cell death and subsequent compensatory cell proliferation is well known, but it does not completely explain the invasive growth characteristics and exceptionally high metastatic potential of FB1-induced tumors. Considering the complexity of sphingolipid metabolism and the fact that various sphingolipids (e.g. ceramide, sphingoid bases and their respective 1-phosphates) act on opposing signaling pathways, it is hypothesized that the balance between individual sphingolipids and thus the overall cellular response to FB1 may shift with time and by continuing FB1 exposure, resulting in the disruption of specific cell signaling pathways, which may promote tumor formation in kidney. To identify early FB1-induced gene expression patterns in the kidney, which may be associated with sphingolipid-mediated signaling pathways in cancer, a short-term i.p. study on FB1 in male Sprague Dawley rats was performed and changes in gene expression were analyzed using a qRT-PCR array that comprises 84 relevant genes of 6 pathways pivotally involved in the formation of cancer. Furthermore, apoptosis and cell proliferation as well as changes in specific sphingolipids were investigated in FB1-treated kidneys. As shown by classical histopathology (H\&E) and (immuno)-histochemical staining (TUNEL and BrdU), FB1 caused a time- and dose-dependent increase in tubular apoptosis in the cortex and OSOM of the kidney, which was compensated by the induction of proliferation in the affected areas. HPLC-MS/MS analysis of bioactive sphingolipids demonstrated that FB1 induced a marked elevation of the pro-apoptotic sphingoid bases sphinganine and sphingosine, which paralleled the time- and dose-dependent increase in renal tubular apoptosis. With prolonged exposure to FB1, increased metabolic conversion of the accumulated sphinganine to the sphinganine-1-phosphate, a second messenger with anti-apoptotic and proliferative properties, was observed in kidney. This finding was compliant with the increased regenerative cell proliferation in the cortex and OSOM. In addition to effects on sphingoid bases and their 1-phosphate metabolites, this study, for the first time, demonstrated reduced levels of specific ceramides in rat kidney after FB1 exposure. In particular, C16-ceramide, which is a widespread constituent of membrane-bound complex sphingolipids involved in cell adhesion, was time- and dose-dependently decreased after treatment with FB1. Besides its role as component of the cell membrane, C16-ceramide functions as a signaling molecule for the initiation of apoptosis in response to various stress stimuli. Under conditions of chronic FB1 exposure, a significant reduction in pro-apoptotic C16-ceramide together with markedly increased levels of anti-apoptotic and proliferation-promoting sphingoid base 1-phosphates may thus favor resistance to stress-induced apoptosis and facilitate the survival of abnormal cells with potential to initiate tumor formation. Our study also revealed that early exposure to FB1 resulted in increased expression of a plethora of genes involved in tumor initiation as well as tumor progression. While single FB1 exposure was demonstrated to predominately induce gene expression of proto-oncogenic transcription factors (e.g. Fos, Jun, Myc) and apoptotis-related genes (e.g. members of the tumor-necrosis factor family), repeated exposure resulted in marked upregulation of genes mediating cell survival and cell proliferation (e.g. Bcl-XL, Bcl-2, Nfκb1 and Egfr). Moreover, continued exposure to FB1 initiated increased expression of genes critically involved in tumor migration, adhesion, invasion and metastasis. A close correlation was established between gene expression changes in response to FB1 and known signaling pathways mediated by extracellular or intracellular action of sphingoid base 1-phosphates - bioactive lipids that were markedly increased after FB1 treatment. In particular, genes encoding components of the plasminogen activator system were abundantly upregulated. These mediate invasion and metastasis in response to So1P, and may hence particularly promote the formation of highly aggressive and invasive tumors in kidney as observed after chronic exposure to FB1. Thus, it is conceivable that upregulation of a majority of genes in response to FB1 may be a direct or indirect consequence of increased So1P signaling. Another aim of this study was to identify differences in the organ-specific susceptibility for tumor formation by comparing FB1-mediated effects on apoptosis, cell proliferation, sphingolipids, and selected cancer-related genes in kidney and liver. Collectively, the present results revealed that kidney and liver showed marked differences in several endpoints of FB1 toxicity, which seemed to be primarily associated with their different susceptibility to FB1-mediated alterations in sphingolipid metabolism. The strong correlation between histopathological lesions and alterations in sphingolipid metabolism as well as sphingoid base 1-phosphate accumulation and concomitant S1P receptor expression suggested that tumor formation and progression to highly malignant carcinomas seems to be rather favored in kidney compared to liver. However, genes mostly deregulated by FB1 treatment in kidney (PAI-1, Thbs1 and Itga2) were also found to be induced in liver. To verify FB1-induced gene expression in kidney, normal rat tubular epithelial (NRK-52E) cells were analyzed for FB1-induced expression changes of the same cancer-related genes as in vivo. The results of qRT-PCR analysis revealed that gene expression changes in NRK-52E cells after FB1 treatment strongly correlated with those found in rat kidney and paralleled the marked alterations in sphingolipid metabolism. Furthermore, a good correlation between FB1-induced expression changes of cancer-related genes obtained in vivo and in vitro and those known to be mediated by bioactive sphingoid base 1-phosphates in cancer was established. Moreover, experiments modeling the invasive behavior of NRK-52E cells showed that FB1 may enhance cell invasion, which also correlated with both the increase in invasion- and metastasis-associated genes and bioactive sphingoid base 1-phophates. Importantly, NRK-52E cells basally expressed the S1P receptors S1P2 and S1P3, which are known to be involved in tumor migration and invasion. Since these receptors were also identified as most abundant S1PRs in kidneys of male Sprague Dawley rats, they may present important mediators of gene expression and invasion in response to FB1 in vivo. In summary, FB1-mediated disruption of sphingolipid metabolism and subsequent time- and dose-related increase in intermediates, such as bioactive sphingoid base 1-phosphates, correlate with early changes in genes and signaling pathways that may mediate loss of growth control, replication, evasion of apoptosis, cell motility and invasion, and thus favor renal tumor formation in response to FB1. However, to clarify whether the obtained gene expression changes in cancer-related genes in kidney are specific to the biological action of sphingoid base 1-phosphates and their respective receptors, further mechanistic studies are necessary.}, subject = {Nephrotoxizit{\"a}t}, language = {en} } @phdthesis{Baetz2012, author = {B{\"a}tz, Julia}, title = {FRET-basierte Untersuchungen zur ligandenselektiven Beeinflussung der Rezeptorkonformation durch orthosterische und allosterische Liganden am Beispiel des muskarinischen M2 Acetylcholinrezeptors}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72836}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Zahlreiche experimentelle Befunde lassen vermuten, dass G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) nach ihrer Aktivierung einer ligandenselektiven {\"A}nderung der Rezeptorkonformation unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es dieses Ph{\"a}nomen am Subtyp 2 der muskarinischen Acetylcholinrezeptoren (M2 AChR) zu untersuchen. Muskarinische Acetylcholinrezeptoren (mAChR) k{\"o}nnen in f{\"u}nf Subtypen (M1-M5) unterschieden werden. Durch die Beteiligung der mAChR an zahlreichen physiologischen Prozessen stellen sie wichtige Zielstrukturen pharmakologischer Therapien dar. Da die orthosterische Ligandenbindestelle (= Bindestelle des endogenen Liganden) in allen f{\"u}nf Subtypen hoch konserviert ist, wird ihr pharmakologischer Nutzen derzeit allerdings durch die unselektive Rezeptormodulation und dem damit verbundenen Auftreten unerw{\"u}nschter Arzneimittelwirkungen stark limitiert. Ein Ansatz zur Erzielung subtypselektiver Effekte besteht in der Verwendung allosterischer Modulatoren. Da die allosterische Bindestelle der mAChR eine geringere Sequenzhomologie aufweist, k{\"o}nnen so gezielt einzelne Subtypen der mAChR reguliert werden. Der M2 AChR stellt hinsichtlich allosterischer Modulation ein gut charakterisiertes Modellsystem dar. F{\"u}r ihn wurde bereits eine Vielzahl allosterischer Liganden entwickelt. Auch bitopische Liganden, die sowohl einen allosterischen als auch einen orthosterischen Anteil enthalten, wurden f{\"u}r den M2 AChR bereits beschrieben. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene FRET-Sensoren des M2 AChR generiert und charakterisiert. Als FRET-Paar wurden das cyan fluoreszierende Protein (CFP) und der niedermolekulare fluorescein-basierte Fluorophor FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) gew{\"a}hlt. CFP wurde in den Sensoren am Ende des C-Terminus angef{\"u}gt. Die zur Markierung mit FlAsH n{\"o}tige Tetracysteinsequenz wurde in verschiedenen Bereichen der dritten intrazellul{\"a}ren Rezeptorschleife (IL) eingebracht. Die auf diese Weise erstellten Re-zeptorsensoren trugen das Tetracysteinmotiv in der N terminalen (M2i3-N) bzw. in der C terminalen Region (M2i3-C) von IL 3. Die Charakterisierung der Rezeptorsensoren bez{\"u}glich Ligandenbindung, Gi-Protein Aktivierung und β-Arrestin2 Translokation ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen M2i3-N, M2i3 C und M2CFP oder Wildtyp M2 AChR. Zun{\"a}chst wurden sowohl unterschiedliche orthosterische, als auch allosterische Liganden hinsichtlich ihrer mittleren effektiven Konzentration und ihrer maximalen Wirkst{\"a}rke an den Rezeptorsensoren untersucht. Mit Hilfe von FRET-Messungen konnte ein superago-nistisches Verhalten des orthosterischen Testliganden Iperoxo gezeigt werden. Die Eigenschaften der allosterischen Substanzen wurden durch Messung der Rezeptordeakti-vierungskinetik und des maximalen Hemmeffekts auf einen vorstimulierten Rezeptor charakterisiert. Alle allosterischen Liganden deaktivierten den vorstimulierten M2 AChR mit einer schnelleren Kinetik als Atropin. Die EC50-Werte der unterschiedlichen Substanzen waren unabh{\"a}ngig von der Markierungsposition im verwendeten Rezeptorsensor vergleich-bar. Ausnahmen bildeten die allosterischen Liganden JK 289, JK 338, ½ W84 und EHW 477, die liganden- und sensorabh{\"a}ngig unterschiedliche mittlere effektive Konzentrationen aufwie-sen. Bei der Untersuchung der Konformations{\"a}nderung des M2 AChR konnte kein liganden-selektiver Unterschied zwischen den FRET-Signalen f{\"u}r 19 getestete orthosterische Liganden beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass alle orthosterischen Testliganden eine dem Acetylcholin (ACh) vergleichbare {\"A}nderung der M2 AChR Konformation induzier-ten. Um zu untersuchen, ob f{\"u}r die orthosterischen Testliganden eine Korrelation zwischen ihrer maximalen Wirkst{\"a}rke hinsichtlich Rezeptoraktivierung in FRET-Experimenten und der Aktivierung nachgeschalteter Signalwege besteht, wurde die orthosterisch-vermittelte Translokation von β-Arrestin2 mit Hilfe der Konfokalmikroskopie bestimmt. Bis auf 5-Methyl-furmethiodid translozierten alle orthosterischen Liganden β-Arrestin2 in einem Ausmaß, das mit der maximalen Rezeptoraktivierung vergleichbar war. Dagegen rief 5 Methylfurmethiodid verglichen mit dem endogenen Liganden ACh zwar eine ca. halbmaximale Rezeptorakti-vierung, aber nur eine {\"a}ußerst geringe β-Arrestin2 Translokation hervor. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss verschiedener Allostere auf eine ligandenselektive Konformations{\"a}nderung des M2 AChR untersucht. Die allosterischen Liganden JK 337 und Seminaph beeinflussten den M2i3-C Sensor signifikant st{\"a}rker, als das M2i3-N Konstrukt. Dagegen zeigte EHW 477 eine st{\"a}rkere Beeinflussung der Rezeptorkon-formation des M2i3-N-, als des M2i3-C Sensors. Dies erlaubt die Vermutung, dass JK 337 und Seminaph eine st{\"a}rkere Bewegung unterhalb von Transmembrandom{\"a}ne (TM) 6, als unterhalb von TM 5 hervorriefen. Die Ergebnisse f{\"u}r EHW 477 legen nahe, dass TM 5 eine gr{\"o}ßere Bewegung eingeht, als TM 6. FRET-basierte Untersuchungen der Einfl{\"u}sse der allosterischen Testliganden auf nachgeschaltete Signalwege ergaben, dass sowohl die Akti-vierung des Gi Proteins, als auch die β-Arrestin2 Translokation selektiv durch einzelne allosterische Liganden beeinflusst werden. Auch ein Zusammenhang zwischen Rezeptor-aktivierung und der Regulation nachgeschalteter Signalwege war erkennbar. Allerdings waren auf Grund der Versuchsbedingungen keine quantitativen Aussagen m{\"o}glich. Im Folgenden wurden die bitopischen Liganden Hybrid 1 und 2 (H 1, H 2) hinsichtlich ihres Effekts auf die Konformations{\"a}nderung des M2 AChR untersucht. W{\"a}hrend eine Stimulation mit H 1 vergleichbare FRET-Signale an beiden Sensoren ergab, konnte mit H 2 weder am M2i3-N-, noch an M2i3-C Sensor eine FRET-{\"A}nderung detektiert werden. Um den mangeln-den Effekt der Hybridsubstanzen in FRET-mikroskopischen Untersuchungen aufzukl{\"a}ren, wurden verschiedene Ans{\"a}tze gew{\"a}hlt: Mit kettenverl{\"a}ngerten Derivaten der Hybridsubstanzen konnte in FRET-Messungen eine {\"A}nderung des FRET-Signals detektiert werden. Die Entfernung des allosterischen Bausteins f{\"u}hrte in FRET-Experimenten zu einer verglichen mit dem endogenen Liganden ACh etwa halbmaximalen Aktivierung beider Sensoren. Dagegen resultierte die Mutation der alloste-rischen Bindestelle in nachfolgenden FRET-Untersuchungen mit H 1 und H 2 in keiner Signal{\"a}nderung des FRET-Ratio. Diese Beobachtungen f{\"u}hrten zu der Annahme, dass die Linkerkette, die orthosterischen und allosterischen Baustein der Hybride miteinander verbindet, zu kurz war um eine gleichzeitige Bindung an die allosterische und orthosterische Bindestelle zu erm{\"o}glichen. Ein anderer Erkl{\"a}rungsansatz besteht darin, dass nach Bindung des Orthosters der Kanal zwischen orthosterischer und allosterischer Bindestelle durch die Konformations{\"a}nderung des Rezeptors verschlossen wird, weshalb keine dauerhafte, dualsterische Bindung der Hybridsubstanzen an den M2 AChR m{\"o}glich ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen mittels FRET-Experimenten die Existenz einer ligandenselektiven Rezeptorkonformation des M2 AChR mit allosterischen Liganden nachzuweisen. Dar{\"u}ber hinaus konnte auch ein Bezug zum Auftreten einer funktionellen Selektivit{\"a}t mit allosterischen Liganden hergestellt werden. Die Untersuchung von 19 orthosterischen Liganden hinsichtlich ihres Einflusses auf die Rezeptorkonformation des M2 AChR ergab keinen Hinweis auf eine ligandenselektive Konformations{\"a}nderung. Die Betrachtung der orthosterisch-vermittelten Translokation von β-Arrestin2 zeigte, dass zwischen der Effizienz der orthosterischen Testliganden, den M2 AChR zu aktivieren und dem Ausmaß, in dem sie eine β Arrestin2 Translokation induzierten eine direkte Korrelation besteht. Lediglich 5-Methylfurmethiodid rief eine ungleich geringere β-Arrestin2 Translokation hervor, verglichen mit dem Ausmaß an Rezeptoraktivierung. Diese Beobachtung deutet auf die Existenz eines signaling-bias f{\"u}r diesen Liganden hin. Die Untersuchung der dualsterischen Liganden H 1 und 2 bez{\"u}glich ihrer F{\"a}higkeit zur Rezeptoraktivierung ergab, dass erst durch eine Verl{\"a}ngerung der Linkerkette, durch die orthosterischer und alloste-rischer Baustein miteinander verbunden sind eine Konformations{\"a}nderung des M2 AChR hin zu einer aktiven Konformation erreicht werden kann. Es kann somit angenommen werden, dass in den urspr{\"u}nglichen Hybridsubstanzen H 1 und H 2 eine zu kurze Linkerkette, durch die keine dualsterische Bindung der Hybride an die allosterische und orthosterische Bindestelle m{\"o}glich ist, urs{\"a}chlich f{\"u}r die mangelnde Rezeptoraktivierung des M2 AChR war.}, subject = {Muscarinrezeptor}, language = {de} } @phdthesis{Glaser2012, author = {Glaser, Nina}, title = {Influence of natural food compounds on DNA stability}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72872}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Cancer is one of the leading causes of death all over the world. Malnutrition and toxic contaminations of food with substances such as mycotoxins have been thought to account for a high percentage of cancers. However, human diet can deliver both mutagens and components that decrease the cancer risk. Genomic damage could be reduced by food components through different mechanisms such as scavenging of reactive oxygen species. In the first part of this study we tried to investigate the effects of patulin and resveratrol on DNA stability in V79 cells. Patulin is a mycotoxin, which is frequently found in spoiled apples and other fruits. The WHO has established a safety level of 50 µg/L, which is indeed not observed by all manufacturers. The acute toxicity of patulin in high concentrations is well known, however its potential carcinogenicity is still a matter of debate. Therefore we wanted to investigate further steps in the mechanism of patulin-induced genotoxicity. Patulin caused the formation of micronuclei and nucleoplasmic bridges in a dose-dependent manner. Further analysis revealed that patulin induced both kinetochore-negative and positive micronuclei. Time course of incubation indicate a new mechanism for patulin-induced nucleoplasmic bridge formation. We hypothized a mechanism via cross-linking of DNA, which was confirmed by a modified version of comet assay. Incubations of cells with patulin led to an increased number of multinucleated cells and multipolar mitoses. Cell cytometry revealed a G2 arrest by patulin, which might explain the amplification of centrosomes and patulin-induced aneuploidy. Patulin cause a dose-dependent DNA damage in comet assay which was influenced by the cellular GSH content. However, an induction of oxidative stress was just seen with higher concentrations of patulin. Levels of cellular glutathione were increased after 24 h incubation indicating an adaptive response to patulin-induced stress. There is growing interest in polyphenols such as resveratrol which have shown many positive effects on human health. The beneficial properties are partially attributed to their ability to scavenge reactive oxygen species. Co-incubation of V79 cells with patulin and 10 µM of the antioxidant resveratrol led to a slight reduction of micronucleus frequency compared to cells which were just treated with patulin. However, in higher concentrations resveratrol themselves caused the formation of micronuclei in V79 cells. Kinetochore analysis indicated only clastogenic properties for resveratrol but no disturbance of mitosis. The antioxidant properties of resveratrol were shown in ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay. However, in cellular system resveratrol in higher concentrations revealed also prooxidative properties, as shown in 2,7-dichlordihydrofluorescein (DCF) assay. The increased level of glutathione after resveratrol treatment might reflect an adaptive response to resveratrol-induced oxidative stress. For the second part of this thesis we investigated the effects of an anthocyanin-rich grape extract on hypertensive Ren-2 rats. Ren-2 rats are an accepted genetically modified rat model for the investigation of hypertension and increased oxidative stress. We divided 23 female Ren-2 rats into three groups. One group was fed with an anthocyanin-rich Dacapo grape extract, one group was treated with the angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor ramipril and the third group was kept without medication during the experiment. After one week untreated group showed a clear increase in systolic and diastolic blood pressure compared to the ramipril treated rats. This was in part attenuated in the animals fed with anthocyanin-rich Dacapo grape extract. Effects on blood pressure were also reflected in an increased thirst of untreated and extract fed animals. Comet assay with cells of kidney and liver revealed a slight protective impact of Dacapo extract on DNA damage compared to the other groups. Similar results were obtained after evaluation of ɣ-H2AX-staining of kidney and heart sections. However, in the small intestine oppositional effects were seen, indicating an increased number of double strand breaks probably due to the high local concentration of polyphenols after oral ingestion. Antioxidative properties of the extract were shown in FRAP assay. However, this effect was not reflected in an increased antioxidative capacity in serum or a protective impact in the dihydroethidium (DHE) assay. The extract showed protective effects on DNA damage in comet assay and ɣ-H2AX-staining, but was not able to reduce hypertension back to the control level of ramipril treated animals. High local concentrations could also result in an increased damage of the affected tissue. Therefore, the administration of such concentrated compounds should be handled with care.}, subject = {Patulin}, language = {en} } @phdthesis{Wippel2012, author = {Wippel, Carolin}, title = {Alterations of brain dendrite and synapse structure by the Streptococcus pneumoniae neurotoxin pneumolysin - Insights and pharmacological modulation}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72016}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus) is one of the leading causes of childhood meningitis,pneumonia and sepsis. Despite the availability of childhood vaccination programs and antimicrobial agents, childhood pneumococcal meningitis is still a devastating illness with mortality rates among the highest of any cause of bacterial meningitis. Especially in low-income countries, where medical care is less accessible, mortality rates up to 50 \% have been reported. In surviving patients, neurological sequelae, including hearing loss, focal neurological deficits and cognitive impairment, is reported in 30 to 50 \%. Growing resistance of pneumococci towards conventional antibiotics emphasize the need for effective therapies and development of effective vaccines against Streptococcus pneumoniae. One major virulence factor of Streptococcus pneumoniae is the protein toxin Pneumolysin (PLY). PLY belongs to a family of structurally related toxins, the so-called cholesterol-dependent cytolysins (CDCs). Pneumolysin is produced by almost all clinical isolates of the bacterium. It is expressed during the late log phase of bacterial growth and gets released mainly through spontaneous autolysis of the bacterial cell. After binding to cholesterol in the host cell membranes, oligomerization of up to 50 toxin monomers and rearrangement of the protein structure, PLY forms large pores, leading to cell lysis in higher toxin concentrations. At sub-lytic concentrations, however, PLY mediates several other effects, such as activation of the classic complement pathway and the induction of apoptosis. First experiments with pneumococcal strains, deficient in pneumolysin, showed a reduced virulence of the organism, which emphasizes the contribution of this toxin to the course of bacterial meningitis and the urgent need for the understanding of the multiple mechanisms leading to invasive pneumococcal disease. The aim of this thesis was to shed light on the contribution of pneumolysin to the course of the disease as well as to the mental illness patients are suffering from after recovery from pneumococcal meningitis. Therefore, we firstly investigated the effects of sub-lytic pneumolysin concentrations onto primary mouse neurons, transfected with a GFP construct and imaged with the help of laser scanning confocal microscopy. We discovered two major morphological changes in the dendrites of primary mouse neurons: The formation of focal swellings along the dendrites (so-called varicosities) and the reduction of dendritic spines. To study these effects in a more complex system, closer to the in vivo situation, we established a reproducible method for acute brain slice culturing. With the help of this culturing method, we were able to discover the same morphological changes in dendrites upon challenge with sub-lytic concentrations of pneumolysin. We were able to reverse the seen alterations in dendritic structure with the help of two antagonists of the NMDA receptor, connecting the toxin´s mode of action to a non-physiological stimulation of this subtype of glutamate receptors. The loss of dendritic spines (representing the postsynapse) in our brain slice model could be verified with the help of brain slices from adult mice, suffering from pneumococcal meningitis. By immunohistochemical staining with an antibody against synapsin I, serving as a presynaptic marker, we were able to identify a reduction of synapsin I in the cortex of mice, infected with a pneumococcal strain which is capable of producing pneumolysin. The reduction of synapsin I was higher in these brain slices compared to mice infected with a pneumococcal strain which is not capable of producing pneumolysin, illustrating a clear role for the toxin in the reduction of dendritic spines. The fact that the seen effects weren´t abolished under calcium free conditions clarifies that not only the influx of calcium through the pneumolysin-pore is responsible for the alterations. These findings were further supported by calcium imaging experiments, where an inhibitor of the NMDA receptor was capable of delaying the time point, when the maximum of calcium influx upon PLY challenge was reached. Additionally, we were able to observe the dendritic beadings with the help of immunohistochemistry with an antibody against MAP2, a neuron-specific cytoskeletal protein. These observations also connect pneumolysin´s mode of action to excitotoxicity, as several studies mention the aggregation of MAP2 in dendritic beadings in response to excitotoxic stimuli. All in all, this is the first study connecting pneumolysin to excitotoxic events, which might be a novel chance to tie in other options of treatment for patients suffering from pneumococcal meningitis.}, subject = {Nervenzelle}, language = {en} } @phdthesis{Deiss2012, author = {Deiß, Katharina}, title = {Die Regulation des Kinasemodulators Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP): Einfluss von Phosphorylierung und Dimerisierung auf die Interaktion mit Raf1 und G Protein-gekoppelter Rezeptorkinase 2 (GRK2)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-73884}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {RKIP reguliert Proteinkinasen der Signaltransduktionskaskaden von G Protein-gekoppelten Rezeptoren, der Raf/MEK/ERK-MAPK, des Transkriptionsfaktors NFκB und von GSK3β. Unklar war bisher, wie die spezifische Interaktion von RKIP mit seinen mannigfaltigen Interaktionspartnern erm{\"o}glicht und reguliert wird. Raf1 und GRK2 sind die einzigen bekannten direkten Interaktionspartner von RKIP und wurden deshalb gew{\"a}hlt, um die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dieser Interaktion genauer zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass RKIP nach PKC-vermittelter Phosphorylierung von Serin153 dimerisiert und dass diese Dimerisierung f{\"u}r die RKIP/Raf1-Dissoziation und die RKIP/GRK2-Interaktion essentiell ist. Co-Immunpr{\"a}zipitationsexperimente mit einer phosphorylierungsdefizienten Mutante zeigten, dass f{\"u}r diese Dimerisierung die Phosphorylierung von beiden RKIP-Molek{\"u}len notwendig ist. Als Dimerinteraktionsfl{\"a}che wurden die Aminos{\"a}uren 127-146 von RKIP identifiziert, da das Peptid RKIP127-146 die Dimerisierung von RKIP spezifisch und effizient hemmte. Um die Bedeutung dieser phosphorylierungsinduzierten Dimerisierung von RKIP f{\"u}r seine Interaktion mit Raf1 und GRK2 zu untersuchen, wurden eine phosphomimetische Mutante (RKIPSK153/7EE) und eine Mutante von RKIP generiert, welche bereits unphosphoryliert dimerisiert (RKIP∆143-6). Folgende Ergebnisse legen nahe, dass die Dimerisierung von RKIP f{\"u}r die spezifische Interaktion mit Raf1 bzw. GRK2 entscheidend ist: (i) Die Dimerisierung von phosphoryliertem RKIP ging mit der Dissoziation von RKIP und Raf1 und der Assoziation von RKIP und GRK2 einher; (ii) die Mutanten RKIPSK153/7EE und RKIP∆143-6, die bereits in unstimulierten Zellen eine starke Dimerisierung zeigten, hatten eine h{\"o}here Affinit{\"a}t zu GRK2 als zu Raf1; (iii) die Hemmung der RKIP-Dimerisierung interferierte nur mit der RKIP/GKR2- aber nicht mit der RKIP/Raf1-Interaktion; (iv) in vitro und in Mausherzen konnte ein RKIP- und GRK2-immunreaktiver Komplex nachgewiesen werden; (v) Untersuchungen zur RKIP-vermittelten Hemmung der Kinaseaktivit{\"a}t von GRK2 und Raf implizierten, dass dimerisiertes RKIP nur die Aktivit{\"a}t von GRK2, nicht aber von Raf hemmt. Diese Arbeit zeigt, dass die phosphorylierungsinduzierte Dimerisierung von RKIP die spezifische Interaktion von RKIP mit Raf1 und GRK2 koordiniert. Die Aufkl{\"a}rung dieses Mechanismus erweitert unser Verst{\"a}ndnis der spezifischen Interaktion von Kinasen mit ihren Regulatorproteinen.}, subject = {Signaltransduktion}, language = {de} } @phdthesis{Froelich2012, author = {Fr{\"o}lich, Nadine}, title = {Analyse der µ-Opiatrezeptoraktivierung und Signaltransduktion in lebenden Zellen mittels FRET-Mikroskopie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71009}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer ist ein Ph{\"a}nomen, welches erstmals 1948 von Theodor F{\"o}rster beschrieben wurde. Mit der Entwicklung von Fluoreszenzproteinen konnten in Kombination mit Mikroskopietechniken Einblicke in zellbiologische Vorg{\"a}nge gewonnen werden, die durch biochemische oder physiologische Experimente nicht m{\"o}glich sind. Dabei spielt die hohe zeitliche und r{\"a}umliche Aufl{\"o}sung eine wichtige Rolle. Auf dem Forschungsgebiet der GPCR, welche die gr{\"o}ßte Gruppe von Membranproteinen bei den S{\"a}ugetieren darstellen, wurden insbesondere Erkenntnisse {\"u}ber Konformations{\"a}nderungen der Rezeptoren, die Kinetik der Rezeptoraktivierung und die Interaktion mit intrazellul{\"a}ren Signalproteinen gewonnen. Der µ-Opioidrezeptor geh{\"o}rt zur Familie der GPCR und stellt aufgrund seiner analgetischen Wirkungen eine wichtige pharmakologische Zielstruktur dar. Das Ziel dieser Arbeit war sowohl den Rezeptor als auch seine Signalwege mittels FRET-Mikroskopie zu untersuchen. Zun{\"a}chst sollte ein intramolekularer FRET-Sensor des µ-Opioidrezeptors entwickelt werden, dazu wurden basierend auf den Kenntnissen {\"u}ber die Terti{\"a}rstruktur und dem Aufbau bereits bekannter GPCR-Sensoren verschiedene Rezeptorkonstrukte kloniert. Bei den Konstrukten wurden entweder zwei Fluoreszenzproteine oder ein Fluoreszenzprotein und ein Fluorophor-bindendes Tetracysteinmotiv kombiniert. Auch die Positionen der eingef{\"u}gten Sequenzen wurden in den intrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen variiert, da der Rezeptor auf die Modifikationen mit beeintr{\"a}chtigter Membranlokalisation reagierte. Durch die Optimierung wurden Rezeptoren konstruiert, die an der Zellmembran lokalisiert waren. Jedoch zeigte keines der Rezeptorkonstrukte Funktionalit{\"a}t im Hinblick auf die Rezeptoraktivierung. Im zweiten Teil wurden die pharmakologischen Effekte der Metabolite von Morphin am humanen µ-Opioidrezeptor systematisch analysiert. Dazu wurde die F{\"a}higkeit der Metabolite, Gi-Proteine zu aktivieren und β-Arrestin2 zu rekrutieren, mittels FRET-basierter Messungen an lebenden Zellen untersucht. Außerdem wurde die Affinit{\"a}t der Metabolite zum humanen µ Opioidrezeptor anhand der Verdr{\"a}ngung eines radioaktiven Liganden analysiert. Meine Experimente identifizierten eine Gruppe mit stark agonistischen und eine mit schwach agonistischen Eigenschaften. Die starken Partialagonisten aktivieren den Rezeptor bereits bei nanomolaren Konzentrationen, w{\"a}hrend die schwachen Metabolite den Rezeptor erst bei Konzentrationen im mikromolaren Bereich aktivieren. Die Metabolite Normorphin, Morphin-6-Glucuronid und 6-Acetylmorphin zeigen geringere Potenz als Morphin bei der Gi-Aktivierung aber {\"u}berraschenderweise h{\"o}here Potenz und Effizienz f{\"u}r die β-Arrestin-Rekrutierung. Dies deutet auf eine bevorzugte Aktivierung von β-Arrestin2 hin. Die aus diesen Studien gewonnenen Ergebnisse liefern Hinweise darauf, welche Metabolite bei der Signalverarbeitung am µ Opioidrezeptor in vivo beteiligt sind.}, subject = {Opiatrezeptor}, language = {de} } @phdthesis{Hupp2012, author = {Hupp, Sabrina}, title = {Modulation of Actin Dynamics by the Cholesterol-Dependent Cytolysin Pneumolysin - a novel mechanism beyond pore formation}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-70889}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Streptococcus pneumoniae is one of the major causes of bacterial meningitis, which mainly affects young infants in the developing countries of Africa, Asia (esp. India) and South America, and which has case fatality rates up to 50\% in those regions. Bacterial meningitis comprises an infection of the meninges and the sub-meningeal cortex tissue of the brain, whereat the presence of pneumolysin (PLY), a major virulence factor of the pneumococcus, is prerequisite for the development of a severe outcome of the infection and associated tissue damage (e. g. apoptosis, brain edema, and ischemia). Pneumolysin belongs to the family of pore forming, cholesterol-dependent cytolysins (CDCs), bacterial protein toxins, which basically use membrane-cholesterol as receptor and oligomerize to big aggregates, which induce cell lysis and cell death by disturbance of membrane integrity. Multiple recent studies, including this work, have revealed a new picture of pneumolysin, whose cell-related properties go far beyond membrane binding, pore formation and the induction of cell death and inflammatory responses. For a long time, it has been known that bacteria harm the tissues of their hosts in order to promote their own survival and proliferation. Many bacterial toxins aim to rather hijack cells than to kill them, by interacting with cellular components, such as the cytoskeleton or other endogenous proteins. This study was able to uncover a novel capacity of pneumolysin to interact with components of the actin machinery and to promote rapid, actin-dependent cell shape changes in primary astrocytes. The toxin was applied in disease-relevant concentrations, which were verified to be sub-lytic. These amounts of toxin induced a rapid actin cortex collapse in horizontal direction towards the cell core, whereat membrane integrity was preserved, indicating an actin severing function of pneumolysin, and being consistent with cell shrinkage, displacement, and blebbing observed in live cell imaging experiments. In contrast to neuroblastoma cells, in which pneumolysin led to cytoskeleton remodeling and simultaneously to activation of Rac1 and RhoA, in primary astrocytes the cell shape changes were seen to be primarily independent of small GTPases. The level of activated Rac1 and RhoA did not increase at the early time points after toxin application, when the initial shape changes have been observed, but at later time points when the actin-dependent displacement of cells was slower and less severe, probably presenting the cell's attempt to re-establish proper cytoskeleton function. A GUV (giant unilamellar vesicle) approach provided insight into the effects of pneumolysin in a biomimetic system, an environment, which is strictly biochemical, but still comprises cellular components, limited to the factors of interest (actin, Arp2/3, ATP, and Mg2+ on one side, and PLY on the other side). This approach was able to show that the wildtype-toxin, but not the Δ6 mutant (mutated in the unfolding domain, and thus non-porous), had the capacity to exhibit its functions through a membrane bilayer, meaning it was able to aggregate actin, which was located on the other side of the membrane, either via direct interaction with actin or in an Arp2/3 activating manner. Taking a closer look at these two factors with the help of several different imaging and biochemical approaches, this work unveiled the capacity of pneumolysin to bind and interact both with actin and Arp2 of the Arp2/3 complex. Pneumolysin was capable to slightly stabilize actin in an actin-pyrene polymerization assay. The same experimental setup was applied to show that the toxin had the capacity to lead to actin polymerization through activation of the Arp2/3 complex. This effect was additionally confirmed with the help of fluorescent microscopy of rhodamine (TRITC)-tagged actin. Strongest Arp2/3 activation, and actin nucleation/polymerization is achieved by the VCA domain of the WASP family proteins. However, addition of PLY to the Arp2/3-VCA system led to an enhanced actin nucleation, suggesting a synergistic activation function of pneumolysin. Hence, two different effects of pneumolysin on the actin cytoskeleton were observed. On the one hand an actin severing property, and on the other hand an actin stabilization property, both of which do not necessarily exclude each other. Actin remodeling is a common feature of bacterial virulence strategies. This is the first time, however, that these properties were assigned to a toxin of the CDC family. Cytoskeletal dysfunction in astrocytes leads to dysfunction and unregulated movement of these cells, which, in context of bacterial meningitis, can favor bacterial penetration and spreading in the brain tissue, and thus comprises an additional role of pneumolysin as a virulence factor of Streptococcus pneumonia in the context of brain infection.}, subject = {Hirnhautentz{\"u}ndung}, language = {en} } @phdthesis{Foertsch2012, author = {F{\"o}rtsch, Christina}, title = {Pneumolysin: the state of pore-formation in context to cell trafficking and inflammatory responses of astrocytes}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-70892}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Pneumolysin, a protein toxin, represents one of the major virulence factors of Streptococcus pneumoniae. This pathogen causes bacterial meningitis with especially high disease rates in young children, elderly people and immunosuppressed patients. The protein toxin belongs to the family of cholesterol-dependent cytolysins, which require membrane cholesterol in order to bind and to be activated. Upon activation, monomers assemble in a circle and undergo conformational change. This conformational change leads to the formation of a pore, which eventually leads to cell lysis. This knowledge was obtained by studies that used a higher concentration compared to the concentration of pneumolysin found in the cerebrospinal fluid of meningitis patients. Thus, a much lower concentration of pneumolysin was used in this work in order to investigate effects of this toxin on primary mouse astrocytes. Previously, a small GTPase activation, possibly leading to cytoskeletal changes, was found in a human neuroblastoma cell line. This led to the hypothesis that pneumolysin can lead to similar cytoskeletal changes in primary cells. The aim of this work was to investigate and characterise the effects of pneumolysin on primary mouse astrocytes in terms of a possible pore formation, cellular trafficking and immunological responses. Firstly, the importance of pore-formation on cytoskeletal changes was to be investigated. In order to tackle this question, wild-type pneumolysin and two mutant variants were used. One variant was generated by exchanging one amino acid in the cholesterol recognising region, the second variant was generated by deleting two amino acids in a protein domain that is essential for oligomerisation. These variants should be incapable of forming a pore and were compared to the wild-type in terms of lytic capacities, membrane binding, membrane depolarisation, pore-formation in artificial membranes (planar lipid bilayer) and effects on the cytoskeleton. These investigations resulted in the finding that the pore-formation is required for inducing cell lysis, membrane depolarisation and cytoskeletal changes in astrocytes. The variants were not able to form a pore in planar lipid bilayer and did not cause cell lysis and membrane depolarisation. However, they bound to the cell membrane to the same extent as the wild-type toxin. Thus, the pore-formation, but not the membrane binding was the cause for these changes. Secondly, the effect of pneumolysin on cellular trafficking was investigated. Here, the variants showed no effect, but the wild-type led to an increase in overall endocytotic events and was itself internalised into the cell. In order to characterise a possible mechanism for internalisation, a GFP-tagged version of pneumolysin was used. Several fluorescence-labelled markers for different endocytotic pathways were used in a co-staining approach with pneumolysin. Furthermore, inhibitors for two key-players in classical endocytotic pathways, dynamin and myosin II, were used in order to investigate classical endocytotic pathways and their possible involvement in toxin internalisation. The second finding of this work is that pneumolysin is taken up into the cell via dynamin- and caveolin-independent pinocytosis, which could transfer the toxin to caveosomes. From there, the fate of the toxin remains unknown. Additionally, pneumolysin leads to an overall increase in endocytotic events. This observation led to the third aim of this work. If the toxin increases the overall rate of endocytosis, the question arises whether toxin internalisation favours bacterial tissue penetration of the host or whether it serves as a defence mechanism of the cell in order to degrade the protein. Thus, several proinflammatory cytokines were investigated, as previous studies describe an effect of pneumolysin on cytokine production. Surprisingly, only interleukin 6-production was increased after toxin-treatment and no effect of endocytotic inhibitors on the interleukin 6-production was observed. The conclusion from this finding is that pneumolysin leads to an increase of interleukin 6, which would not depend on the endocytotic uptake of pneumolysin. The production of interleukin 6 would enhance the production of acute phase proteins, T-cell activation, growth and differentiation. On the one hand, this activation could serve pathogen clearance from infected tissue. On the other hand, the production of interleukin 6 could promote a further penetration of pathogen into host tissue. This question should be further investigated.}, subject = {Streptococcus pneumoniae}, language = {en} } @article{ChenGassnerBoerneretal.2012, author = {Chen, Wen and Gaßner, Birgit and B{\"o}rner, Sebastian and Nikolaev, Viacheslav O. and Schlegel, Nicolas and Waschke, Jens and Steinbronn, Nadine and Strasser, Ruth and Kuhn, Michaela}, title = {Atrial natriuretic peptide enhances microvascular albumin permeability by the caveolae-mediated transcellular pathway}, series = {Cardiovascular Research}, volume = {93}, journal = {Cardiovascular Research}, number = {1}, doi = {10.1093/cvr/cvr279}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-126562}, pages = {141-151}, year = {2012}, abstract = {Aims Cardiac atrial natriuretic peptide (ANP) participates in the maintenance of arterial blood pressure and intravascular volume homeostasis. The hypovolaemic effects of ANP result from coordinated actions in the kidney and systemic microcirculation. Hence, ANP, via its guanylyl cyclase-A (GC-A) receptor and intracellular cyclic GMP as second messenger, stimulates endothelial albumin permeability. Ultimately, this leads to a shift of plasma fluid into interstitial pools. Here we studied the role of caveolae-mediated transendothelial albumin transport in the hyperpermeability effects of ANP. Methods and results Intravital microscopy studies of the mouse cremaster microcirculation showed that ANP stimulates the extravasation of fluorescent albumin from post-capillary venules and causes arteriolar vasodilatation. The hyperpermeability effect was prevented in mice with conditional, endothelial deletion of GC-A (EC GC-A KO) or with deleted caveolin-1 (cav-1), the caveolae scaffold protein. In contrast, the vasodilating effect was preserved. Concomitantly, the acute hypovolaemic action of ANP was abolished in EC GC-A KO and Cav-1-/- mice. In cultured microvascular rat fat pad and mouse lung endothelial cells, ANP stimulated uptake and transendothelial transport of fluorescent albumin without altering endothelial electrical resistance. The stimulatory effect on albumin uptake was prevented in GC-A- or cav-1-deficient pulmonary endothelia. Finally, preparation of caveolin-enriched lipid rafts from mouse lung and western blotting showed that GC-A and cGMP-dependent protein kinase I partly co-localize with Cav-1 in caveolae microdomains. Conclusion ANP enhances transendothelial caveolae-mediated albumin transport via its GC-A receptor. This ANP-mediated cross-talk between the heart and the microcirculation is critically involved in the regulation of intravascular volume.}, language = {en} } @article{KlotzMentrupRegensburgeretal.2012, author = {Klotz, Barbara and Mentrup, Birgit and Regensburger, Martina and Zeck, Sabine and Schneidereit, Jutta and Schupp, Nicole and Linden, Christian and Merz, Cornelia and Ebert, Regina and Jakob, Franz}, title = {1,25-Dihydroxyvitamin D3 Treatment Delays Cellular Aging in Human Mesenchymal Stem Cells while Maintaining Their Multipotent Capacity}, series = {PLoS ONE}, volume = {7}, journal = {PLoS ONE}, number = {1}, doi = {10.1371/journal.pone.0029959}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-133392}, pages = {e29959}, year = {2012}, abstract = {1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25D3) was reported to induce premature organismal aging in fibroblast growth factor-23 (Fgf23) and klotho deficient mice, which is of main interest as 1,25D3 supplementation of its precursor cholecalciferol is used in basic osteoporosis treatment. We wanted to know if 1,25D3 is able to modulate aging processes on a cellular level in human mesenchymal stem cells (hMSC). Effects of 100 nM 1,25D3 on hMSC were analyzed by cell proliferation and apoptosis assay, beta-galactosidase staining, VDR and surface marker immunocytochemistry, RT-PCR of 1,25D3-responsive, quiescence-and replicative senescence-associated genes. 1,25D3 treatment significantly inhibited hMSC proliferation and apoptosis after 72 h and delayed the development of replicative senescence in long-term cultures according to beta-galactosidase staining and P16 expression. Cell morphology changed from a fibroblast like appearance to broad and rounded shapes. Long term treatment did not induce lineage commitment in terms of osteogenic pathways but maintained their clonogenic capacity, their surface marker characteristics (expression of CD73, CD90, CD105) and their multipotency to develop towards the chondrogenic, adipogenic and osteogenic pathways. In conclusion, 1,25D3 delays replicative senescence in primary hMSC while the pro-aging effects seen in mouse models might mainly be due to elevated systemic phosphate levels, which propagate organismal aging.}, language = {en} } @article{VandenbergChahoudHeindeletal.2012, author = {Vandenberg, Laura N. and Chahoud, Ibrahim and Heindel, Jerrold J. and Padmanabhan, Vasantha and Paumgartten, Francisco J. R. and Sch{\"o}nfelder, Gilbert}, title = {Urinary, Circulating, and Tissue Biomonitoring Studies Indicate Widespread Exposure to Bisphenol A}, series = {Ci{\^e}ncia \& Sa{\´u}de Coletiva}, volume = {17}, journal = {Ci{\^e}ncia \& Sa{\´u}de Coletiva}, number = {2}, doi = {10.1289/ehp.0901716}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-134332}, pages = {407-434}, year = {2012}, abstract = {Bisphenol A (BPA) is one of the highest-volume chemicals produced worldwide, and human exposure to BPA is thought to be ubiquitous. Thus, there are concerns that the amount of BPA to which humans are exposed may cause adverse health effects. We examined many possibilities for why biomonitoring and toxicokinetic studies could come to seemingly conflicting conclusions. More than 80 published human biomonitoring studies that measured BPA concentrations in human tissues, urine, blood, and other fluids, along with two toxicokinetic studies of human BPA metabolism were examined. Unconjugated BPA was routinely detected in blood (in the nanograms per milliliter range), and conjugated BPA was routinely detected in the vast majority of urine samples (also in the nanograms per milliliter range). In stark contrast, toxicokinetic studies proposed that humans are not internally exposed to BPA. Available data from biomonitoring studies clearly indicate that the general population is exposed to BPA and is at risk from internal exposure to unconjugated BPA. The two toxicokinetic studies that suggested human BPA exposure is negligible have significant deficiencies, are directly contradicted by hypothesis-driven studies, and are therefore not reliable for risk assessment purposes.}, language = {en} } @phdthesis{Brand2012, author = {Brand, Susanne}, title = {Oxidativer Stress und DNA-Sch{\"a}den induziert durch das Peptidhormon Angiotensin II in vivo : Identifizierung des AT1-Rezeptors und reaktiver Sauerstoffspezies als urs{\"a}chliche Faktoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-77573}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) reguliert den Blutdruck und den Wasser- und Elektrolythaushalt des K{\"o}rpers. Angiotensin II (Ang II), das aktive Peptid des RAAS, bewirkt eine Vasokonstriktion und in h{\"o}heren Konzentrationen Bluthochdruck. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass eine Verbindung zwischen Hypertonie und dem geh{\"a}uften Auftreten von Krebs besteht. Eine Metaanalyse von 13 Fall-Kontroll-Studien konnte einen Zusammenhang zwischen Hypertonie und einem erh{\"o}hten Risiko, an einem Nierenzellkarzinom zu erkranken nachweisen. In vitro-Studien und Studien an der isolierten Niere konnten bereits genotoxische Effekte des blutdruckregulierenden Hormons Ang II zeigen. Zielsetzung dieser Arbeit war es, zun{\"a}chst in vivo zu pr{\"u}fen, ob steigende Ang II-Konzentrationen einen Einfluss auf die genomische Stabilit{\"a}t von Nieren- und Herzzellen besitzen. Hierzu wurden im Dosisversuch m{\"a}nnliche C57BL/6-M{\"a}use mit osmotischen Minipumpen ausgestattet, die Ang II in vier verschiedenen Konzentrationen zwischen 60 ng/kg min und 1 µg/kg min {\"u}ber einen Zeitraum von 28 Tagen abgeben sollten. W{\"a}hrend des Versuchszeitraums fanden regelm{\"a}ßige, nicht-invasive Blutdruckmessungen an der Maus statt. Die Behandlung mit Ang II f{\"u}hrte zu einem signifikanten Anstieg des Blutdrucks und zu histopathologischen Ver{\"a}nderungen der Glomeruli und des Tubulussystems, was sich in einer verschlechterten Albumin-Ausscheidung wiederspiegelte. Außerdem induzierte die Behandlung mit Ang II die dosisabh{\"a}ngige Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies, DNA-Doppelstrangbr{\"u}chen und oxidativer DNA-Sch{\"a}den. Diese Parameter waren bereits in Tieren erh{\"o}ht, die keinen Bluthochdruck entwickelten und stiegen mit der h{\"o}chsten Ang II-Konzentration noch an, obwohl hier im Vergleich zur Vorg{\"a}ngergruppe, die eine geringere Ang II-Konzentration erhielt, kein h{\"o}herer Blutdruck vorlag. Diese Beobachtung deutet auf eine m{\"o}gliche Unabh{\"a}ngigkeit des entstandenen Schadens vom Bluthochdruck hin und lenkt die Aufmerksamkeit auf Ang II als genomsch{\"a}digenden Faktor. Der folgende Interventionsversuch sollte Aufschluss {\"u}ber die m{\"o}gliche blutdruckunabh{\"a}ngige genomsch{\"a}digende Wirkung von Ang II geben. Dazu wurden C57BL/6-M{\"a}use neben der Ang II-Behandlung in einer Konzentration von 600 ng/kg min zus{\"a}tzlich {\"u}ber einen Zeitraum von 28 Tagen mit 5 verschiedenen Substanzen behandelt: Candesartan, Ramipril, Hydralazin, Eplerenon und Tempol. Candesartan ist ein Ang II-Rezeptor-Antagonist, der selektiv den AT1-Rezeptor blockiert. Ramipril wirkt als Hemmer des Angiotensin-Konversions-Enzyms und verhindert die Bildung von endogenem Ang II aus Ang I. Hydralazin, als Vasodilatator, greift nicht in das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System ein. Eplerenon blockiert als selektiver Aldosteronantagonist den Mineralkortikoidrezeptor. Tempol wirkt als Antioxidans. Die Behandlung mit Ang II in einer Konzentration von 600 ng/kg min im Interventionsversuch f{\"u}hrte zur Hochregulierung der NADPH-Oxidase 4 und zur Produktion reaktiver Sauerstoffspezies in der Niere und im kardiovaskul{\"a}ren Gewebe. Der entstandene oxidative Stress f{\"u}hrte wiederum zu DNA-Sch{\"a}den und einer Aktivierung der Transkriptionsfaktoren Nrf2 und NF-B. Nrf2-vermittelt wurde die Induktion antioxidativer Gene ausgel{\"o}st, was allerdings nicht ausreichend war, um vor Ang II-induzierten ROS und DNA-Sch{\"a}den zu sch{\"u}tzen. Eine l{\"a}ngerfristige NF-B-Aktivierung durch hohe Ang II-Spiegel kann das {\"U}berleben und die Proliferation von Zellen, die DNA-Sch{\"a}den in Form von Doppelstrangbr{\"u}chen tragen, f{\"o}rdern, was eine Tumor-initiierende Wirkung haben k{\"o}nnte. Die beschriebenen Effekte erh{\"o}hter Ang II-Spiegel konnten durch die Intervention mit dem AT1-Rezeptorblocker Candesartan verhindert werden, was die Beteiligung des Rezeptors nachweist. Eine blutdruckunabh{\"a}ngige, genomsch{\"a}digende Wirkung von Ang II konnte leider durch die Intervention mit Hydralazin nicht verdeutlicht werden, da die erw{\"u}nschte langfristige Blutdrucksenkung ausblieb. Allerdings zeigte die Intervention mit Tempol eine Abnahme an oxidativem Stress und DNA-Sch{\"a}den trotz ausbleibender Blutdrucksenkung. Die Bedeutung von ROS in der Bildung von DNA-Sch{\"a}den und die Unabh{\"a}ngigkeit dieser Sch{\"a}den vom Blutdruck konnten somit hervorgehoben werden. Die Tatsache, dass die Intervention mit Ramipril den Blutdruck nicht senken konnte, der oxidative Stress und die DNA-Sch{\"a}den durch m{\"o}gliche antioxidative Eigenschaften aber vermindert wurden, unterst{\"u}tzt diese Beobachtung. Die Intervention mit Eplerenon f{\"u}hrte zum Teil zu einer Verminderung an ROS und DNA-Sch{\"a}den, brachte diese Parameter aber nicht auf Kontrollniveau zur{\"u}ck. Somit ist eine Beteiligung von Aldosteron nicht auszuschließen.}, subject = {Oxidativer Stress}, language = {de} } @phdthesis{Kaempf2012, author = {K{\"a}mpf, Anne Kristina}, title = {Does methylphenidate cause a cytogenetic effect in children with attention deficit hyperactivity disorder?}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-77652}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {MPH wird seit {\"u}ber 50 Jahren zur Therapie des ADHS eingesetzt. Gerade in den letzten Jahren wurde deutlich, dass der Einsatz ohne fundierte Kenntnis {\"u}ber m{\"o}gliche Langzeit-effekte erfolgte, da zum Zeitpunkt der Zulassung aufgrund der begrenzten technischen M{\"o}glichkeiten weniger strenge und weniger umfassende Einschr{\"a}nkungen beachtet wer-den mussten (Walitza, Werner et al. 2007). Da in den letzten Jahren die Anzahl der verschrieben Tagesdosen MPH sprunghaft anstiegen, ist es wichtig, auch die langfristigen Nebenwirkungen von MPH zu untersuchen (Janhsen 2007). Eine Studie von El-Zein et al. von 2005 brachte die Frage auf, ob MPH eventuell Genomsch{\"a}den hervorrufe. Bei 11 von 12 untersuchten Kindern wurde unter der Therapie mit MPH um das 2,4fache erh{\"o}hte Mikrokernfrequenzen gefunden (El-Zein, Abdel-Rahman et al. 2005). Dies beunruhig-te vor allem im Hinblick auf das mit erh{\"o}hten Mikrokernfrequenzen korrelierte erh{\"o}hte Karzinomrisiko. Eine daraufhin von Walitza et al. durchgef{\"u}hrte Studie, die ebenfalls Mikrokernfrequenzen in peripheren Blutzellen untersuchte (Walitza, Werner et al. 2007), konnte keine Hinweise auf eine Genomsch{\"a}digung durch MPH erbringen. Zahlreiche weitere Untersuchungen zur potentiellen Genomsch{\"a}digung durch MPH konnten die Ergebnisse durch in vivo- oder in vitro-Studien nicht best{\"a}tigen und kritisierten die ge-ringe Stichprobengr{\"o}ße sowie mangelnde Transparenz der Arbeit von El-Zein (Preston, Kollins et al. 2005; El-Zein, Hay et al. 2006; Holtmann, Kaina et al. 2006; Suter, Martus et al. 2006). Da jedoch keine weitere Studie sich konkret mit zytogenetischen Effekten in peripheren Blutzellen befasste, soll die vorliegende Arbeit dazu dienen, den Verdacht einer Genomsch{\"a}digung endg{\"u}ltig auszur{\"a}umen (Walitza, Kampf et al. 2009). Dazu wurde eine gr{\"o}ßere Gruppe von Kindern eingeschlossen, sowie Untersuchungen zu verschiedenen Zeitpunkten w{\"a}hrend der MPH-Einnahme, bis hin zu Untersuchungen nach einem Zeitraum von 12 Monaten der MPH- Einnahme, durchgef{\"u}hrt. Mit Hilfe eines Mikrokerntestes wurden in der vorliegenden Studie versucht, DNS-Sch{\"a}den an periphe-ren Lymphozyten zu bestimmen, um daraus auf ein potentiell erh{\"o}htes Krebsrisiko schließen zu k{\"o}nnen. Im Vergleich mit einer gesunden Kontrollgruppe waren die Werte von ADHS-Kindern ohne MPH-Therapie sowie nach 3 und 12 Monaten MPH-Therapie zwar signifikant er-h{\"o}ht, diese gesunde Kontrollgruppe wies jedoch im Vergleich mit internationalen Refe-renzwerten eine extrem niedrige Mikrokernfrequenz auf, so dass davon ausgegangen werden muss, dass diese Vergleiche nur begrenzte Aussagekraft haben. In keiner der verschiedenen mit MPH therapierten Gruppen konnten {\"u}ber die Dauer der Einnahme eine signifikant Erh{\"o}hung der Mikrokernfrequenzen im Vergleich zu den Werten vor Einnahmebeginn nachgewiesen werden, was den Schluss zul{\"a}sst, dass eine Therapie mit Methylphenidat in therapie{\"u}blichen Dosen bei Kindern das Erbgut nicht zu sch{\"a}digen scheint. Dieses Ergebnis best{\"a}tigen inzwischen auch weitere Studien. Der Mikrokerntest erfasst Genomsch{\"a}den, nicht jedoch etwaige tumorpromovierende Eigenschaften des verabreichten Medikaments. Damit ist unklar, ob MPH auf andere Art als {\"u}ber eine Sch{\"a}digung des Genoms das Karzinomrisiko erh{\"o}hen k{\"o}nnte. Erste epidemiologische Studien sehen jedoch keinen Hinweis auf eine wie auch immer entstandene erh{\"o}hte Karzinominzidenz unter der Therapie mit MPH (Selby, Friedman et al. 1989; Oestreicher, Friedman et al. 2007). Hier scheinen jedoch weitere epidemiologische Studien, die m{\"o}g-lichst große Zeitspannen umfassen, n{\"o}tig zu sein}, subject = {Methylphenidat}, language = {en} } @article{HintzscheJastrowKleineOstmannetal.2012, author = {Hintzsche, Henning and Jastrow, Christian and Kleine-Ostmann, Thomas and K{\"a}rst, Uwe and Schrader, Thorsten and Stopper, Helga}, title = {Terahertz electromagnetic fields (0.106 THz) do not induce manifest genomic damage in vitro}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-76268}, year = {2012}, abstract = {Terahertz electromagnetic fields are non-ionizing electromagnetic fields in the frequency range from 0.1 to 10 THz. Potential applications of these electromagnetic fields include the whole body scanners, which currently apply millimeter waves just below the terahertz range, but future scanners will use higher frequencies in the terahertz range. These and other applications will bring along human exposure to these fields. Up to now, only a limited number of investigations on biological effects of terahertz electromagnetic fields have been performed. Therefore, research is strongly needed to enable reliable risk assessment. Cells were exposed for 2 h, 8 h, and 24 h with different power intensities ranging from 0.04 mW/cm2 to 2 mW/cm2, representing levels below, at, and above current safety limits. Genomic damage on the chromosomal level was measured as micronucleus formation. DNA strand breaks and alkali-labile sites were quantified with the comet assay. No DNA strand breaks or alkali-labile sites were observed as a consequence of exposure to terahertz electromagnetic fields in the comet assay. The fields did not cause chromosomal damage in the form of micronucleus induction.}, subject = {Toxikologie}, language = {en} } @phdthesis{EmamiNemini2012, author = {Emami-Nemini, Alexander Darius}, title = {Differential parathyroid hormone receptor signaling directed by adaptor proteins}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72369}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {The superfamily of G protein-coupled receptors (GPCR) regulates numerous physiological and pathophysiological processes. Hence GPCRs are of significant interest for pharmacological therapy. Embedded into cytoplasmic membranes, GPCRs represent the core of large signaling complexes, which are critical for transduction of exogenous stimuli towards activation of downstream signaling pathways. As a member of the GPCR family B, the parathyroid hormone receptor (PTHR) activates adenylyl cyclases, phospholipases C β as well as mitogen-activated protein kinase-dependent signaling pathways, thereby mediating endocrine and paracrine effects of parathyroid hormone (PTH) and parathyroid hormone-related peptide (PTHrP), respectively. This regulates, calcium homeostasis, bone metabolism and bone development. Paradoxically, PTH is able to induce both catabolic and anabolic bone metabolism. The anabolic effect of PTH is successfully applied in the therapy of severe osteoporosis. Domination of anabolic or catabolic bone-metabolism is entailed by temporal and cell-type specific determinants. The molecular bases are presumably differential arrangements of adaptor proteins within large signaling complexes that may lead to differential activation of signaling pathways, thereby regulating physiological effects. The molecular mechanisms are largely unclear; thus, there is significant interest in revealing a better understanding of PTHR-related adaptor proteins. To identify novel adaptor proteins which direct PTHR signaling pathways, a proteomic screening approach was developed. In this screening, vav2, a guanine-nucleotide exchange factor (GEF) for small GTPases which regulates cytoskeleton reorganization, was found to interact with intracellular domains of PTHR. Evidence is provided that vav2 impairs PTH-mediated phospholipase C β (PLCβ) signaling pathways by competitive interactions with G protein αq subunits. Vice versa, PTH was shown to regulate phosphorylation and subsequent GEF activity of vav2. These findings may thus shed new light on the molecular mechanisms underlying the effects of PTH on bone metabolism by PLC-signaling, cell migration and cytoskeleton organization. In addition to the understanding of intracellular molecular signaling processes, screening for ligands is a fundamental and demanding prerequisite for modern drug development. To this end, ligand binding assays represent a fundamental technique. As a substitution for expensive and potentially harmful radioligand binding, fluorescence-based ligand-binding assays for PTHR were developed in this work. Based on time-resolved fluorescence, several assay variants were established to facilitate drug development for the PTHR.}, subject = {G-Protein gekoppelte Rezeptoren}, language = {en} } @article{KannenHintzscheZanetteetal.2012, author = {Kannen, Vinicius and Hintzsche, Henning and Zanette, Dalila L. and Silva Jr., Wilson A. and Garcia, Sergio B. and Waaga-Gasser, Anna Maria and Stopper, Helga}, title = {Antiproliferative Effects of Fluoxetine on Colon Cancer Cells and in a Colonic Carcinogen Mouse Model}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-75879}, year = {2012}, abstract = {The antidepressant fluoxetine has been under discussion because of its potential influence on cancer risk. It was found to inhibit the development of carcinogen-induced preneoplastic lesions in colon tissue, but the mechanisms of action are not well understood. Therefore, we investigated anti-proliferative effects, and used HT29 colon tumor cells in vitro, as well as C57BL/6 mice exposed to intra-rectal treatment with the carcinogen N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) as models. Fluoxetine increased the percentage of HT29 cells in the G0/G1 phase of cell-cycle, and the expression of p27 protein. This was not related to an induction of apoptosis, reactive oxygen species or DNA damage. In vivo, fluoxetine reduced the development of MNNG-induced dysplasia and vascularization-related dysplasia in colon tissue, which was analyzed by histopathological techniques. An anti-proliferative potential of fluoxetine was observed in epithelial and stromal areas. It was accompanied by a reduction of VEGF expression and of the number of cells with angiogenic potential, such as CD133, CD34, and CD31-positive cell clusters. Taken together, our findings suggest that fluoxetine treatment targets steps of early colon carcinogenesis. This confirms its protective potential, explaining at least partially the lower colon cancer risk under antidepressant therapy.}, subject = {Medizin}, language = {en} } @phdthesis{Pollinger2012, author = {Pollinger, Thomas}, title = {Spatiotemporale Organisation der Interaktion von Gq Protein-Untereinheiten und der Phospholipase Cβ3}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71884}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Die G-Protein vermittelte Aktivierung der Phospholipase Cβ (PLCβ) stellt einen prim{\"a}ren Mechanismus dar, um eine Vielzahl von physiologischen Ereignissen zu regulieren, z.B. die Kontraktion glatter Muskelzellen, Sekretion oder die Modulation der synaptischen Transmission. Sowohl Gαq- als auch Gβγ-Untereinheiten sind daf{\"u}r bekannt mit PLCβ Enzymen zu interagieren und diese zu aktivieren. {\"U}ber die Dynamik dieser Interaktion und den relative Beitrag der G-Protein Untereinheiten ist jedoch nur wenig bekannt. Unter Verwendung Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)- basierter Methoden in lebenden Zellen, wurde die Kinetik der Rezeptor-induzierten Interaktion zwischen Gβγ und Gαq Untereinheiten, die Interaktion von sowohl der Gαq als auch der Gβγ-Untereinheit mit der PLCβ3 und die Interaktion des regulator of G-Protein signaling 2 (RGS2) mit Gαq-Untereinheiten untersucht. Um die Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion auf die Zellmembran zu beschr{\"a}nken, wurde die Total-Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie angewandt. Zeitlich hoch aufl{\"o}sendes, ratiometrisches FRET-Imaging offenbarte eine deutlich schnellere Dissoziation von Gαq und PLCβ3 nach Entzug purinerger Agonisten verglichen mit der Deaktivierung von Gq Proteinen in der Abwesenheit der PLCβ3. Dieser offensichtliche Unterschied in der Kinetik kann durch die GTPase-aktivierende Eigenschaft der PLCβ3 in lebenden Zellen erkl{\"a}rt werden. Weiterhin zeigte es sich, dass PLCβ3 die Gq Protein Kinetik in einem {\"a}hnlich Ausmaß beeinflusst wie RGS2, welches in vitro deutlich effizienter darin ist, die intrinsische GTPase Aktivit{\"a}t der Gαq-Untereinheit zu beschleunigen. Als Antwort auf die Rezeptorstimulation wurde sowohl eine Interaktion von Gαq-Untereinheiten als auch von Gq-abstammende Gβγ-Untereinheiten mit der PLCβ3 beobachtet. Dar{\"u}ber hinaus zeigte sich auch eine Agonist-abh{\"a}ngige Interaktion von Gαq und RGS2. In Abwesenheit einer Rezeptorstimulation konnte kein spezifisches FRET-Signal zwischen Gq Proteinen und der PLCβ3 oder RGS2 detektiert werden. Zusammengefasst erm{\"o}glichte das ratiometrische FRET-Imaging in der TIRF Mikroskopie neue Einsichten in die Dynamik und Interaktionsmuster des Gq-Signalwegs.}, subject = {TIRF}, language = {de} } @article{HuppFoertschWippeletal.2013, author = {Hupp, Sabrina and F{\"o}rtsch, Christina and Wippel, Carolin and Ma, Jiangtao and Mitchell, Timothy J. and Iliev, Asparouh I.}, title = {Direct Transmembrane Interaction between Actin and the Pore-Competent, Cholesterol-Dependent Cytolysin Pneumolysin}, series = {Journal of Molecular Biology}, volume = {425}, journal = {Journal of Molecular Biology}, number = {3}, doi = {10.1016/j.jmb.2012.11.034}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-132297}, pages = {636-646}, year = {2013}, abstract = {The eukaryotic actin cytoskeleton is an evolutionarily well-established pathogen target, as a large number of bacterial factors disturb its dynamics to alter the function of the host cells. These pathogenic factors modulate or mimic actin effector proteins or they modify actin directly, leading to an imbalance of the precisely regulated actin turnover. Here, we show that the pore-forming, cholesterol-dependent cytolysin pneumolysin (PLY), a major neurotoxin of Streptococcus pneumoniae, has the capacity to bind actin directly and to enhance actin polymerisation in vitro. In cells, the toxin co-localised with F-actin shortly after exposure, and this direct interaction was verified by F{\"o}rster resonance energy transfer. PLY was capable of exerting its effect on actin through the lipid bilayer of giant unilamellar vesicles, but only when its pore competence was preserved. The dissociation constant of G-actin binding to PLY in a biochemical environment was 170-190 nM, which is indicative of a high-affinity interaction, comparable to the affinity of other intracellular actin-binding factors. Our results demonstrate the first example of a direct interaction of a pore-forming toxin with cytoskeletal components, suggesting that the cross talk between pore-forming cytolysins and cells is more complex than previously thought.}, language = {en} } @article{WippelMaurerFortschetal.2013, author = {Wippel, Carolin and Maurer, Jana and Fortsch, Christina and Hupp, Sabrina and Bohl, Alexandra and Ma, Jiangtao and Mitchell, Timothy J. and Bunkowski, Stephanie and Br{\"u}ck, Wolfgang and Nau, Roland and Iliev, Asparouh I.}, title = {Bacterial Cytolysin during Meningitis Disrupts the Regulation of Glutamate in the Brain, Leading to Synaptic Damage}, series = {PLoS Pathogens}, volume = {9}, journal = {PLoS Pathogens}, number = {6}, doi = {10.1371/journal.ppat.1003380}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-130462}, pages = {e1003380}, year = {2013}, abstract = {Abstract Streptococcus pneumoniae (pneumococcal) meningitis is a common bacterial infection of the brain. The cholesterol-dependent cytolysin pneumolysin represents a key factor, determining the neuropathogenic potential of the pneumococci. Here, we demonstrate selective synaptic loss within the superficial layers of the frontal neocortex of post-mortem brain samples from individuals with pneumococcal meningitis. A similar effect was observed in mice with pneumococcal meningitis only when the bacteria expressed the pore-forming cholesterol-dependent cytolysin pneumolysin. Exposure of acute mouse brain slices to only pore-competent pneumolysin at disease-relevant, non-lytic concentrations caused permanent dendritic swelling, dendritic spine elimination and synaptic loss. The NMDA glutamate receptor antagonists MK801 and D-AP5 reduced this pathology. Pneumolysin increased glutamate levels within the mouse brain slices. In mouse astrocytes, pneumolysin initiated the release of glutamate in a calcium-dependent manner. We propose that pneumolysin plays a significant synapto- and dendritotoxic role in pneumococcal meningitis by initiating glutamate release from astrocytes, leading to subsequent glutamate-dependent synaptic damage. We outline for the first time the occurrence of synaptic pathology in pneumococcal meningitis and demonstrate that a bacterial cytolysin can dysregulate the control of glutamate in the brain, inducing excitotoxic damage. Author Summary Bacterial meningitis is one of the most devastating brain diseases. Among the bacteria that cause meningitis, Streptococcus pneumoniae is the most common. Meningitis predominantly affects children, especially in the Third World, and most of them do not survive. Those that do survive often suffer permanent brain damage and hearing problems. The exact morphological substrates of brain damage in Streptococcus pneumoniae meningitis remain largely unknown. In our experiments, we found that the brain cortex of patients with meningitis demonstrated a loss of synapses (the contact points among neurons, responsible for the processes of learning and memory), and we identified the major pneumococcal neurotoxin pneumolysin as a sufficient cause of this loss. The effect was not direct but was mediated by the brain neurotransmitter glutamate, which was released upon toxin binding by one of the non-neuronal cell types of the brain - the astrocytes. Pneumolysin initiated calcium influx in astrocytes and subsequent glutamate release. Glutamate damaged the synapses via NMDA-receptors - a mechanism similar to the damage occurring in brain ischemia. Thus, we show that synaptic loss is present in pneumococcal meningitis, and we identify the toxic bacterial protein pneumolysin as the major factor in this process. These findings alter our understanding of bacterial meningitis and establish new therapeutic strategies for this fatal disease.}, language = {en} } @article{CapraBusnelliPerennaetal.2013, author = {Capra, Val{\´e}rie and Busnelli, Marta and Perenna, Alessandro and Ambrosio, Manuela and Accomazzo, Maria Rosa and Gal{\´e}s, Celine and Chini, Bice and Rovati, G. Enrico}, title = {Full and Partial Agonists of Thromboxane Prostanoid Receptor Unveil Fine Tuning of Receptor Superactive Conformation and G Protein Activation}, series = {PLoS ONE}, volume = {8}, journal = {PLoS ONE}, number = {3}, doi = {10.1371/journal.pone.0060475}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-131013}, pages = {e60475}, year = {2013}, abstract = {The intrahelical salt bridge between \(E/D^{3.49}\) and \(R^{3.50}\) within the E/DRY motif on helix 3 (H3) and the interhelical hydrogen bonding between the E/DRY and residues on H6 are thought to be critical in stabilizing the class A G protein-coupled receptors in their inactive state. Removal of these interactions is expected to generate constitutively active receptors. This study examines how neutralization of \(E^{3.49/6.30}\) in the thromboxane prostanoid (TP) receptor alters ligand binding, basal, and agonist-induced activity and investigates the molecular mechanisms of G protein activation. We demonstrate here that a panel of full and partial agonists showed an increase in affinity and potency for E129V and E240V mutants. Yet, even augmenting the sensitivity to detect constitutive activity (CA) with overexpression of the receptor or the G protein revealed resistance to an increase in basal activity, while retaining fully the ability to cause agonist-induced signaling. However, direct G protein activation measured through bioluminescence resonance energy transfer (BRET) indicates that these mutants more efficiently communicate and/or activate their cognate G proteins. These results suggest the existence of additional constrains governing the shift of TP receptor to its active state, together with an increase propensity of these mutants to agonist-induced signaling, corroborating their definition as superactive mutants. The particular nature of the TP receptor as somehow "resistant" to CA should be examined in the context of its pathophysiological role in the cardiovascular system. Evolutionary forces may have favored regulation mechanisms leading to low basal activity and selected against more highly active phenotypes.}, language = {en} } @phdthesis{KannenCardoso2013, author = {Kannen Cardoso, Vinicius}, title = {The role of Fluoxetine against preneoplastic lesions and tumors in colon tissue}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-77589}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Introduction: Colon cancer is one of the major human malignancies worldwide, and much effort has been applied to understand the process of colon carcinogenesis, as well as the role of potential treatments and co-therapeutical agents against it. A growing body of evidence suggests that the use of fluoxetine (FLX), an antidepressant belonging to the selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs), may be associated with a reduced colon cancer risk. However, controversial opinions have been published and an identification of the mechanisms of the activity of FLX on colon cells would help in the clarification of this controversy. Objectives: Using several in vitro and in vivo-based methods and analyses, we aimed to verify whether FLX has antioxidant, pro-oxidant or DNA-damaging potential in standard toxicological assays; to check whether and how FLX could prevent and reduce colon preneoplastic lesions; to ascertain whether FLX has any oncostatic potential against colon tumors; and, to investigate whether FLX activity could be comparable with a known and current applied chemotherapeutic agent against colon cancer. Results: FLX did not have any antioxidant potential in our experiments. Although it did not induce reactive oxygen species (ROS) generation or DNA-damage in fibroblast and colon tumor cell lines, FLX reduced dysplasia and proliferation in two different carcinogen models. Further, a significant decrease in colon stromal reactivity and angiogenesis was found in both carcinogen-induced preneoplasia models. In a xenograft model of colon cancer, FLX shrank tumors, reduced tumor proliferation, arrested cancer cells at the G0/G1 cell-cycle phase, and took ROS generation under control. Such effects were detected together with an intracellular acidification and loss of mitochondrial membrane potential in FLX-treated cells. Modulating mitochondrial respiratory chain, HIF-1 expression and Akt/mTOR signaling pathway, FLX was found to reduce colon tumors similar to the widely used chemotherapeutic agent 5-Fluoracil activity. Conclusion: Our collective data suggest that FLX is a remarkable chemopreventive and oncostatic agent against colon preneoplastic lesions and tumors, acting without DNA-damage or ROS generation.}, subject = {Fluoxetin}, language = {en} } @phdthesis{Heinlein2013, author = {Heinlein, U-Ju}, title = {Adenosinrezeptoren auf Ovarialkarzinomzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-81920}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Seit der Entdeckung, dass Adenosin auch als Botenstoff dient, besch{\"a}ftigen sich Forschungsgruppen mit Adenosinrezeptoren und ihrer m{\"o}glichen therapeutischen Modulation, insbesondere in Zusammenhang mit Krebserkrankungen. Bislang sind die Rezeptoren auf diversen Krebszellen nachgewiesen worden. So konnten beispielsweise in einer Brustkrebszelllinie A2B Adenosinrezeptoren nachgewiesen werden, deren Stimulation zu einer Hemmung der wachstumsf{\"o}rdernden MAP Kinase f{\"u}hrt. Pharmaka zur weitgehend selektiven Aktivierung oder Hemmung einzelner Adenosinrezeptor-Subtypen stehen ebenfalls zur Verf{\"u}gung. Beim Ovarialkarzinom mit seiner leider meist erst sp{\"a}t auftretenden Symptomatik besteht derzeit noch keine M{\"o}glichkeit zur fr{\"u}hen Diagnosestellung, sodass die Prognose ausgesprochen ung{\"u}nstig ausf{\"a}llt und die Erkrankung bei Frauen eine der h{\"a}ufigsten krebsbedingten Todesursachen darstellt. Daher war es ein Ziel dieser Arbeit herauszufinden, ob Adenosinrezeptoren auf diesen Zellen einen m{\"o}glichen therapeutischen Angriffspunkt bieten. Dazu untersuchten wir die vier Ovarialkarzinomzelllinien OVCAR-3, SK-OV-3, PA-1 und OAW-42 auf eine m{\"o}gliche Expression von allen vier Adenosinrezeptorsubtypen. Zun{\"a}chst wurden mit radioaktiv markierten Liganden ([3H]CCPA, [3H]NECA und [3H]HEMADO) Bindungsstudien f{\"u}r den A1-, A2A- und A3-Subtyp durchgef{\"u}hrt. Die Expression des A2B-Rezeptors wurde mithilfe eines funktionellen Nachweises, der Stimulation der Adenylylcyclase mithilfe von NECA (einem unspezifischen Adenosinrezeptoragonisten) analysiert. Im Anschluss daran untersuchten wir an OAW-42 und SK-OV-3 Zellen, ob sich ihr Proliferationsverhalten durch eine Stimulation mit NECA ver{\"a}ndern ließe und ob sich das Ansprechen auf g{\"a}ngige Chemotherapeutika bzw. einen Todesliganden {\"a}ndern w{\"u}rde. Trotz des erfolgreichen Nachweises von Adenosinrezeptoren auf allen Zelllinien waren die Ergebnisse der Proliferationsstudien aber nicht eindeutig. OAW-42 und SK-OV-3 Zellen reagierten zwar auf eine NECA-Stimulation mit sinkendem BrdU-Einbau, OAW-42 Zellen zeigten aber nach Behandlung mit NECA eine leicht erh{\"o}hte Resistenz gegen{\"u}ber Cisplatin. NECA-behandelte SK-OV-3 Zellen reagierten hingegen etwas sensitiver auf Doxorubicin und Fas-Ligand. Die Unterschiede waren aber insgesamt sehr gering und wurden daher von uns als nicht entscheidender Effekt gewertet. Auch Untersuchungen zur Expression der Adenosin-generierenden Enzyme CD39 und CD73 vor und nach NECA-Stimulation blieben ohne erkennbare Ver{\"a}nderung. Insofern ergaben unsere Untersuchungen keine Hinweise darauf, dass Adenosinrezeptoren eine m{\"o}gliche therapeutische Zielstruktur darstellen k{\"o}nnten. Zuk{\"u}nftige Studien k{\"o}nnen aber die gewonnenen Daten als Grundlage und Ausgangspunkt n{\"u}tzen, um auch andere Tumorzellarten zu untersuchen und im Kampf gegen den Krebs nach neuen potenziellen pharmakologischen Angriffspunkten zu suchen.}, subject = {Eierstockkrebs}, language = {de} } @phdthesis{Vidal2013, author = {Vidal, Marie}, title = {b-adrenergic receptors and Erk1/2-mediated cardiac hypertrophy}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-83671}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Chronische Aktivierung von b-Adrenorezeptoren (b-ARs) durch Katecholamine ist ein Stimulus f{\"u}r kardiale Hypertrophie und Herzinsuffizienz. Ebenso f{\"u}hrt die Expression von b1-ARs oder Gas-Proteinen in genetisch modifizierten M{\"a}usen zu Hypertrophie und Herzinsuffizienz. Allerdings f{\"u}hrt die direkte Aktivierung dem Gas nachgeschalteten Komponenten des b-adrenergen Signalwegs wie z.B. die Aktivierung der Adenylylcyclase (AC) oder der Proteinkinase A (PKA) nicht im signifikanten Ausmaß zur Herzhypertrophie. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zus{\"a}tzlich zu dem klassischen Signalweg, auch weitere durch Gas-Proteine aktivierte Komponenten in die b-adrenerg vermittelte Hypertrophieentwicklung involviert sind. Interessanterweise wurde vor kurzem ein hypertropher Signalweg beschrieben, der eine direkte Involvierung von Gbg-Untereinheiten bei der Induktion von Herzhypertrophie durch die extrazellul{\"a}r-regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) zeigt: Nach Aktivierung Gaq-gekoppelter Rezeptoren binden Gbg-Untereinheiten an die aktivierte Raf/Mek/Erk Kaskade. Die Bindung der freigesetzten Gbg-Untereinheiten an Erk1/2 f{\"u}hrt zu einer Autophosphorylierung von Erk1/2 an Threonin 188 (bzw. Thr208 in Erk1; im folgenden ErkThr188-Phosphorylierung genannt), welche f{\"u}r die Vermittlung kardialer Hypertrophie verantwortlich ist. In dieser Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass auch die Aktivierung von b-ARs in M{\"a}usen sowie von isolierten Kardiomyozyten zur Induktion von ErkThr188-Phosphorylierung f{\"u}hrt. Dar{\"u}berhinaus f{\"u}hrte die {\"U}berexpression von Erk2 Mutanten (Erk2T188S und Erk2T188A), die nicht an Threonin 188 phosphoryliert werden k{\"o}nnen, zu einer deutlich reduzierten Hypertrophieantwort von Kardiomyozyten auf Isoproterenol. Auch die kardiale Expression der Erk2T188S Mutante im M{\"a}usen verminderte die Hypertrophieantwort auf eine 2-w{\"o}chige Isoproterenol-Behandlung deutlich: Die linksventrikul{\"a}re Wanddicke, aber auch interstitielle Fibrose und Herzinsuffizienzmarker wie z.B. BNP waren signifikant reduziert. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass tats{\"a}chlich ein Zusammenspiel von Ga und Gbg-vermittelten Signalen zur Induktion von ErkThr188-Phosphorylierung und damit zur Induktion von b-adrenerg vermittelter Hypertrophie notwendig ist. W{\"a}hrend die Hemmung von Gbg-Signalen mit dem C-Terminus der GRK2 oder die Hemmung von Adenylylzyklase eine ErkThr188-Phosphorylierung und eine Hypertrophieantwort nach Isoprenalingabe effektiv reduzierten, f{\"u}hrt die alleinige Aktivierung von Adenylylzyklase nicht zu einer Hypertrophieantwort. Diese Ergebnisse k{\"o}nnten bei der Entwicklung neuer m{\"o}glicher therapeutischen Strategien zur Therapie b-adrenerg induzierter Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz helfen.}, subject = {Adrenerger Rezeptor}, language = {en} } @phdthesis{Schmidt2013, author = {Schmidt, Tobias}, title = {Biotransformation of trans-1-chloro-3,3,3-trifluoropropene and 2,3,3,3-tetrafluoropropene}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-78579}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {The novel refrigerant 2,3,3,3-tetrafluoropropene (HFO-1234yf) as well as the novel foam blowing and precision cleaning agent trans-1-chloro-3,3,3-trifluoropropene (trans-HCFO-1233zd) are both chlorofluorocarbon replacements with low GWPs and a short atmospheric life time. Whereas the hydrofluoroolefin HFO-1234yf has no negative effect on stratospheric ozone due to the lack of chlorine in its structure, the hydrochlorofluoroolefine trans-HCFO-1233zd exhibits a very low potential for ozone depletion (ODP). This is approximately 100 times lower than the ozone depletion potential of precursor compounds such as 1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane (CFC-113). Principle aims of this thesis were to investigate the unknown metabolism of the new solvent trans-HCFO-1233zd and to further investigate a possible biotransformation based toxicity of HFO-1234yf observed in rabbits. Therefore study specimens of different in vitro and in vivo studies with trans-HCFO-1233zd and HFO-1234yf were analyzed for metabolites using 19FNMR spectroscopy, LC-MS/MS spectrometry and GC/MS spectrometry. Metabolites were identified by comparison with purchased or synthesized standard substances. Excretion kinetics of the predominant metabolites were determined by LC-MS/MS quantification,inorganic fluoride was determined by potentiometry. Moreover cytochrome P-450 2E1 and 3A4 liver enzyme activities were measured in a multi-exposure study with HFO-1234yf. ...}, subject = {Propenderivate}, language = {en} } @phdthesis{Eman2013, author = {Eman, Maher Othman Sholkamy}, title = {In Vitro and In Vivo Analysis of Insulin-Induced Oxidative Stress and DNA Damage}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-69274}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Hyperinsulinemia, a condition with excessively high insulin blood levels, is related to an increased cancer incidence. Diabetes mellitus, metabolic syndrome, obesity and polycystic ovarian syndrome are the most common of several diseases accompanied by hyperinsulinemia. Since an elevated cancer risk especially for colon and kidney cancers, was reported for those patients, we investigated for the first time the induction of genomic damage by insulin mainly in HT29 (human colon cells), LLC-PK1 (pig kidney cells), HK2 (human kidney cells) and peripheral lymphocytes, and to confirm the genotoxicity of insulin in other cells from different tissues. To ascertain that the insulin effects were not only limited to permanent cell lines, rat primary colon, kidney, liver and fatty tissue cells were also studied. To connect the study and the findings to in vivo conditions, two in vivo models for hyperinsulinemia were used; Zucker diabetic fatty rats in a lean and diabetic state infused with different insulin concentrations and peripheral lymphocytes from type 2 diabetes mellitus patients. First, the human colon adenocarcinoma cells (HT29) showed significant elevation of DNA damage using comet assay and micronucleus frequency analysis upon treatment with 5 nM insulin in standard protocols. Extension of the treatment to 6 days lowered the concentration needed to reach significance to 0.5-1 nM. Insulin enhanced the cellular ROS production as examined by the oxidation of the dyes 2´,7´-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA) and dihydroethidium (DHE). The FPG modified comet assay and the reduction of damage by the radical scavenger tempol connected the insulin-mediatedDNA damage to ROS production. To investigate the sources of ROS upon insulin stimulation, apocynin and VAS2870 as NADPH oxidase inhibitors and rotenone as mitochondrial inhibitor were applied in combination with insulin and all of them led to a reduction of the genomic damage. Investigation of the signaling pathway started by evaluation of the binding of insulin to its receptor and to the IGF-1 receptor. The results showed the involvement of both receptors in the signaling mechanism. Following the activation of both receptors, PI3K activation occurs leading to phosphorylation of AKT which in turn activates two pathways for ROS production, the first related to mitochondria and the second through activation of Rac1 , resulting in the activation of Nox1. Both pathways could be activated through AKT or through the mitochondrial ROS which in turn could activates Nox1. Studying another human colon cancer cell line, Caco-2 and rat primary colon cells in vitro confirmed the effect of insulin on cellular chromatin. We conclude that pathophysiological levels of insulin can cause DNA damage in colon cells, which may contribute to the induction or progression of colon cancer. Second, in kidney cells, insulin at a concentration of 5 nM caused a significant increase in DNA damage in vitro. This was associated with the formation of reactive oxygen species (ROS). In the presence of antioxidants, blockers of the insulin and IGF-1 receptors, and a phosphatidylinositol 3-kinases (PI3K) inhibitor, the insulin mediated DNA damage was reduced. Phosphorylation of AKT was increased and p53 accumulated. Inhibition of the mitochondrial and NADPH oxidase related ROS production reduced the insulin mediated damage. In primary rat cells insulin also induced genomic damage. HK2 cells were used to investigate the mechanistic pathway in the kidney The signaling is identical to the one in the colon cells untill the activation of the mitochondrial ROS production, because after the activation of PI3K activation of Nox4 occurs at the same time across talk between mitochondria and Nox4 activation has been suggested and might play a role in the observed effects. In the in vivo model, kidneys from healthy, lean ZDF rats, which were infused with insulin to yield normal or high blood insulin levels, while keeping blood glucose levels constant, the amounts of ROS and p53 were elevated in the high insulin group compared to the control level group. ROS and p53 were also elevated in diabetic obese ZDF rats. The treatment of the diabetic rats with metformin reduced the DNA oxidation measured as 8-oxodG as well as the ROS production in that group. HL60 the human premyelocytic cells and cultured lymphocytes as models for the hemopoietic system cells showed a significant induction for DNA damage upon treatment with insulin. The diabetic patients also exhibited an increase in the micronucleus formation over the healthy individuals. In the present study, we showed for the first time that insulin induced oxidative stress resulting in genomic damage in different tissues, and that the source of the produced ROS differs between the tissues. If the same mechanisms are active in patients, hyperinsulinemia might cause genomic damage through the induction of ROS contributing to the increased cancer risk, against which the use of antioxidants as well as mitochondrial and NADPH oxidase inhibitors might exert protective effects with cancer preventive potential under certain conditions. Normal healthy human plasma insulin concentrations are in the order of 0.04 nM after overnight fasting and increase to less than about 0.2 nM after a meal. Pathophysiological levels can reach 1 nM and can stay above 0.2 nM for the majority of the daytime yielding condictions close to the insulin concentrations determined in the present study. Whether the observed effects also occur in vivo and whether they actually initiate or promote tumor formation remains to be determined. However, if proof of that can be obtained, our experiments with inhibitors indicate chances for pharmacological intervention applying antioxidants or enzyme inhibitors. It will not be the aim to reduce ROS in any case or as much as possible because ROS have now been recognized as important signaling molecules and participatants in immune defense, but a reduction to physiological levels instead of pathophysiological levels in the context of a disease associated with ROS overproduction might be beneficial.}, subject = {Insulin}, language = {en} } @phdthesis{Merkl2013, author = {Merkl, Martin}, title = {Immunologische Effekte der Therapie mit rezeptor-homologen Peptiden im Rattenmodell der antik{\"o}rper-induzierten dilatativen Immunkardiomyopathie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85161}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Unsere Arbeitsgruppe verfolgt im Rattenmodell der Antik{\"o}rper-induzierten DiCM einen Antik{\"o}rper-spezifischen Therapieansatz durch die Gabe eines synthetischen β1-ECII homologen zyklischen „F{\"a}nger"-Peptids. Die Applikation dieses Peptids f{\"u}hrte zu einer deutlichen Verbesserung wichtiger Herzparameter wie z.B. des Durchmessers des linken Ventrikels (LV) sowie der LV-Verk{\"u}rzungsfraktion und des kardialen Indexes. Des Weiteren kam es unter der Peptid-Therapie zu einer signifikanten Reduktion des anti-β1-ECII Antik{\"o}rpertiters trotz kontinuierlich durchgef{\"u}hrter Immunisierungen mit dem die Erkrankung induzierenden Antigen. Es lag daher nahe, dass durch die Peptid-Therapie auch eine Art immunologischer Toleranz induziert wird, der eine Depletion bzw. funktionelle Beeintr{\"a}chtigung von Zellen des Immunsystems, die an der Produktion von anti-β1-ECII Antik{\"o}rpern beteiligt sind, zugrunde liegen k{\"o}nnte. Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit war es daher Aufgabe, die verschiedenen Zellkomponenten der humoralen und zellul{\"a}ren Immunantwort zu untersuchen, um den immunologischen Effekt der Peptid-Applikation besser zu verstehen. So scheinen in unserem Modell die β1-ECII-spezifischen CD4+T-Zellen durch die Peptid-Therapie nicht beeinflusst zu werden; ebenso konnten unsere Experimente keinen Zyklopeptideffekt auf die langlebigen Plasmazellen nachweisen. Die erzielten Ergebnisse sprechen jedoch daf{\"u}r, dass die R{\"u}ckbildung des DiCM Ph{\"a}notyps und der Abfall des anti-β1-ECII Antik{\"o}rpertiters trotz kontinuierlicher Immunisierung zum einen auf der direkten Neutralisierung der anti-β1-ECII Antik{\"o}rper durch die Ring-Peptide (Scavenger-Effekt)und zum anderen auf einer Depletion bzw. funktionellen Beeintr{\"a}chtigung der β1-ECII-spezifischen Memory B-Zellen beruhen k{\"o}nnte. Der f{\"u}r die Reduktion der Memory B-Zellen letztlich verantwortliche molekulare Mechanismus muss jedoch noch in weiteren Experimenten untersucht werden. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse tragen aber wesentlich zum besseren Verst{\"a}ndnis der Wirkungsweise dieses neuartigen Therapiekonzepts zur Behandlung der immuninduzierten Kardiomyopathie bei.}, subject = {Peptidtherapie}, language = {de} } @article{SchuppAliBeegametal.2013, author = {Schupp, Nicole and Ali, Badreldin H. and Beegam, Sumyia and Al-Husseni, Isehaq and Al-Shukaili, Ahmed and Nemmar, Abderrahim and Schierling, Simone and Queisser, Nina}, title = {Effect of gum arabic on oxidative stress and inflammation in adenine-induced chronic renal failure in rats}, series = {PLoS One}, journal = {PLoS One}, doi = {10.1371/journal.pone.0055242}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-95787}, year = {2013}, abstract = {Inflammation and oxidative stress are known to be involved in the pathogenesis of chronic kidney disease in humans, and in chronic renal failure (CRF) in rats. The aim of this work was to study the role of inflammation and oxidative stress in adenine-induced CRF and the effect thereon of the purported nephroprotective agent gum arabic (GA). Rats were divided into four groups and treated for 4 weeks as follows: control, adenine in feed (0.75\%, w/w), GA in drinking water (15\%, w/v) and adenine+GA, as before. Urine, blood and kidneys were collected from the rats at the end of the treatment for analysis of conventional renal function tests (plasma creatinine and urea concentration). In addition, the concentrations of the pro-inflammatory cytokine TNF-a and the oxidative stress markers glutathione and superoxide dismutase, renal apoptosis, superoxide formation and DNA double strand break frequency, detected by immunohistochemistry for c-H2AX, were measured. Adenine significantly increased the concentrations of urea and creatinine in plasma, significantly decreased the creatinine clearance and induced significant increases in the concentration of the measured inflammatory mediators. Further, it caused oxidative stress and DNA damage. Treatment with GA significantly ameliorated these actions. The mechanism of the reported salutary effect of GA in adenine-induced CRF is associated with mitigation of the adenine-induced inflammation and generation of free radicals.}, language = {en} } @phdthesis{Makiol2014, author = {Makiol, Christian}, title = {Die Rolle der durch NADPH-Oxidasen produzierten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Pathophysiologie von Hypertonie und Alterung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-109901}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Reaktive Sauerstoffradikale spielen eine große Rolle bei der Entstehung von Karzinomen, im Alterungsprozess und bei kardiovaskul{\"a}ren Erkrankungen (Valko et al., 2007). Solche Sauerstoffradikale k{\"o}nnen unter anderem durch die NADPH-Oxidase gebildet werden (Finkel and Holbrook, 2000). Ziel der Arbeit war es, die Rolle von ROS im Alterungsprozess und bei Bluthochdruck aufzuzeigen. Daf{\"u}r wurden zwei Tiermodelle, eines mit einer geringen ROS-Konzentration und eines mit einer hohen ROS-Konzentration, verwendet. Zum einen handelt es sich um ein p47-Knockout-Mausmodell f{\"u}r die geringere ROS-Konzentration, im Vergleich zu alten und jungen Wildtyp-Tieren. F{\"u}r die Rolle von ROS bei der Alterung wurden junge mit alten Wildtyp-Tieren verglichen. Um die Rolle der NOX2 in den ROS-Spiegeln der Organe zu ermitteln wurden gleichaltrige Wildtyp- mit p47-Knockout-Tieren verglichen. Zum anderen nutzten wir ein ren2-Tiermodell f{\"u}r die hohe ROS-Konzentration. Hierbei handelt es sich um ein Bluthochdruckmodell, in dem der Blutdruck mit Medikamenten normalisiert werden kann. Die Tiere wurden daher mit Ramipril (ACE-Inhibitor), Apocynin (NADPH-Oxidase-Inhibitor) und Tempol (Radikalf{\"a}nger) behandelt. Als Maß f{\"u}r die ROS-Konzentration wurden die Superoxidionenspiegel mithilfe einer Dihydroethidium-F{\"a}rbung ermittelt. Die DNA-Doppelstrangbr{\"u}che wurden mit einer γH2AX-Antik{\"o}rper-F{\"a}rbung nachgewiesen und die Expression von Sirtuin1 und Hsp70, welche als Anti-Aging Proteine bekannt sind, mittels Western Blot bestimmt.}, subject = {Reaktive Sauerstoffspezies}, language = {de} } @phdthesis{Mandel2014, author = {Mandel, Philipp}, title = {Entstehung von oxidativen Stressmarkern in DNA und RNA nach der Behandlung mit den Hormonen Angiotensin II und Aldosteron in vitro und in vivo : Vergleich von drei Analysemethoden zum Nachweis von 8-Oxo-2'-desoxyguanosin in LLC-PK1-Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-111190}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {The detection of oxidative stress markers has gained increasing importancy in the early investigation of diseases like diabetes, cancer or hypertension. 8 oxo 2' deoxyguanosine (8-oxodG) is the main marker, which is used for the intracellular detection of oxidative stress levels. However, the oxidative stress markers 8 oxoguanine (8-oxoGua), a product of the DNA base excision repair and 8 oxoguanosine (8-oxoGuo), a marker for oxidative damaged RNA have received less attention up to now. The renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) plays an important role in the regulation processes of the blood pressure system. During hypertension angiotensin II (Ang II) and aldosterone (Aldo) are released in high concentrations over a longer period leading to non-physiological effects of the RAAS hormones. Subsequently, an increase of the intracellular oxidative stress level in kidney cells can be measured. The aim of this thesis is the in vitro and in vivo detection of the oxidative damage in DNA and RNA by measuring oxidative stress markers, especially 8-oxodG which is triggered by Ang II and Aldo. In vitro experiments were carried out in LLC-PK1, a cell line originated from porcine kidney cells. It could been shown that Ang II and Aldo led to a dose-dependent increase of DNA damage in the cells. A time-dependent increase was detected for the first 30 minutes of the treatment. For the rest of the experimental set up (4 h) the level of detected DNA damage remained constant. The FPG comet assay and the immunocytochemical staining showed a significant increase of 8-oxodG in the cells, whereas the HPLC-MS/MS measurement only detected a small increase of 8-oxodG in the DNA. The FPG enzyme, which recognises also other oxidized purines besides 8-oxodG, which led to an overestimation of 8-oxodG in the comet assay. Also, the 8 oxodG antibody, which was used in the immunocytochemical analysis, detected higher amounts of 8-oxodG most likely due to its side reactions with other oxidized DNA structures. One of the main advantages of the last mentioned methods is the direct measurement in damaged cells, whereas the HPLC-MS/MS requires an isolation of the DNA. During this isolation process the oxidative stress markers can be oxidized and the detection can become imprecise. The main purpose of the in vivo experiments was the detection of the oxidative stress marker 8-oxoGua, 8-oxodG and 8-oxoGuo in the urine of test animals. The treatment of C57BL/6 mice and Sprague Dawley (SD) rats with the RAAS hormones led to an increase of the blood pressure, higher DNA damage due to oxidative stress as well as an increased excretion rate of oxidative stress markers. The inhibition of the angiotensin II type 1- or mineralocorticoid receptor and a mutation of the AT1a gene could show, that the DNA damage is independent from the hypertension. In addition, it was shown that the NOX4 is not alone responsible for the oxidative stress. Other NADPH oxidases must contribute to the induction of oxidative stress inside the cell. Moreover, the activation of the Nrf2 pathway has an influence on the effect of Aldo in SD rats. The excretion rate of the oxidative stress markers in the 20 h urine of the treated animals showed how the equilibrium between the DNA repair and the oxidative stress level was changing over time. The measurement of 8-oxoGuo became more and more popular, because up to the fact that 80 \% of the DNA is translated into RNA. Overall, the detection of 8-oxodG and 8-oxoGuo is feasible for monitoring the disease or the healing process, because the measurement is non-invasive. The detection of 8-oxodG and 8-oxoGuo in nucleic acids is a first step into the field of basic research methods, because it reveals a snapshot of the nucleic acid damage in the cell at a specific time point. Usually, there will be an overestimation of the oxidative stress marker resulting from the analytical method. Although, it is possible to detect an underestimation of oxidative stress markers in tissue samples if not all cell types are damaged equally. Therefore, a primary goal should be the detection of a stable oxidation product of guanine to insure a reliable detection strategy and for a better understanding of the equilibrium of DNA oxidation and repair.}, subject = {Oxidativer Stress}, language = {de} } @article{RychlikHumpfMarkoetal.2014, author = {Rychlik, Michael and Humpf, Hans-Ulrich and Marko, Doris and D{\"a}nicke, Sven and Mally, Angela and Berthiller, Franz and Klaffke, Horst and Lorenz, Nicole}, title = {Proposal of a comprehensive definition of modified and other forms of mycotoxins including "masked" mycotoxins}, series = {Mycotoxin Research}, volume = {30}, journal = {Mycotoxin Research}, number = {4}, doi = {10.1007/s12550-014-0203-5}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-121240}, pages = {197-205}, year = {2014}, abstract = {As the term "masked mycotoxins" encompasses only conjugated mycotoxins generated by plants and no other possible forms of mycotoxins and their modifications, we hereby propose for all these forms a systematic definition consisting of four hierarchic levels. The highest level differentiates the free and unmodified forms of mycotoxins from those being matrix-associated and from those being modified in their chemical structure. The following lower levels further differentiate, in particular, "modified mycotoxins" into "biologically modified" and "chemically modified" with all variations of metabolites of the former and dividing the latter into "thermally formed" and "non-thermally formed" ones. To harmonize future scientific wording and subsequent legislation, we suggest that the term "modified mycotoxins" should be used in the future and the term "masked mycotoxins" to be kept for the fraction of biologically modified mycotoxins that were conjugated by plants.}, language = {en} } @article{CalebiroMaiellaro2014, author = {Calebiro, Davide and Maiellaro, Isabella}, title = {cAMP signaling microdomains and their observation by optical methods}, series = {Frontiers in Cellular Neuroscience}, volume = {8}, journal = {Frontiers in Cellular Neuroscience}, issn = {1662-5102}, doi = {10.3389/fncel.2014.00350}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-118252}, pages = {350}, year = {2014}, abstract = {The second messenger cyclic AMP (cAMP) is a major intracellular mediator of many hormones and neurotransmitters and regulates a myriad of cell functions, including synaptic plasticity in neurons. Whereas cAMP can freely diffuse in the cytosol, a growing body of evidence suggests the formation of cAMP gradients and microdomains near the sites of cAMP production, where cAMP signals remain apparently confined. The mechanisms responsible for the formation of such microdomains are subject of intensive investigation. The development of optical methods based on fluorescence resonance energy transfer (FRET), which allow a direct observation of cAMP signaling with high temporal and spatial resolution, is playing a fundamental role in elucidating the nature of such microdomains. Here, we will review the optical methods used for monitoring cAMP and protein kinase A (PKA) signaling in living cells, providing some examples of their application in neurons, and will discuss the major hypotheses on the formation of cAMP/PKA microdomains.}, language = {en} } @phdthesis{Ruebeling2014, author = {R{\"u}beling, Karsten}, title = {Identifizierung und pharmakologische Charakterisierung von Adenosinrezeptoren in humanen Melanomzelllinien}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-115137}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Adenosin steuert seine physiologische Funktionen {\"u}ber die vier G-Protein gekoppelten Adenosinrezeptoren A1, A2A, A2B und A3 und kann enormen Einfluss auf die Zellphysiologie und das Immunsystem haben. Hohe Adenosinkonzentrationen in Tumorgeweben haben das Interesse vieler Forschungsgruppen geweckt und den Nachweis von AR und dessen tumorf{\"o}rdernde sowie -hemmende Wirkung auf diverse Krebszellen nach sich gezogen. Melanome sind f{\"u}r 90\% der letal ausgehenden Hautkrebsformen verantwortlich, da bereits kleinste Formen metastasieren k{\"o}nnen und vielmals eine rein chirurgische Therapie keine Heilung verspricht. Bei ung{\"u}nstiger Prognose schr{\"a}nken adjuvante und systemische Therapieerg{\"a}nzungen die Lebensqualit{\"a}t erheblich ein. Auf der Suche nach gezielteren und schonenderen Therapieans{\"a}tzen gilt es, die Rolle des Adenosins im Tumorgeschehen weiter aufzukl{\"a}ren, was den Nachweis und die Charakterisierung von AR und deren rezeptorspezifisch-gekoppelte Effekte voraussetzt. Daher sollten in der hier vorliegenden Arbeit die f{\"u}nf humanen Melanomzelllinien A375, Brown, MV3, SK MEL23 und MEL2A auf die Expression von AR untersucht werden. Zu Beginn wurden die Zellen mit Hilfe von Bindungsexperimenten unter Einsatz radioaktiv markierter Liganden ([3H]HEMADO, [3H]CCPA, [3H]NECA und [3H]ZM 241385) auf das Vorliegen der vier AR-Subtypen untersucht. A1- und A3-AR wurden nach Bindungsstudien mit [3H]CCPA bzw. [3H]HEMADO ausgeschlossen und nicht weiter untersucht. Durch Bindungsstudien mit [3H]ZM 241385 konnten in den Zellen Brown, MV3, SK-MEL23 und MEL2A geringe Mengen von A2B-Rezeptoren detektiert werden. Es folgten funktionelle Untersuchungen zur Stimulation der AC mit den Liganden NECA und CGS 21680 unter besonderem Blick auf die Differenzierung zwischen einer A2A- oder A2B vermittelten Stimulation. Ein NECA vermittelter Anstieg des c[32P]AMP im AC-Versuch best{\"a}tigte die Anwesenheit von A2B-Rezeptoren in den Zellen A375, Brown, MV3 und SK-MEL23. Durch CGS 21680 kam es hingegen zu keiner AC-Stimulation, was eine A2A-AR-Beteiligung ausschloss. Zur Best{\"a}tigung einer A2B gekoppelten AC-Aktivit{\"a}t wurde zum Abschluss der Versuche die Wirkung von drei selektiven Antagonisten (DPCPX, SCH 58261 und MRE 3008 F20) auf ein NECA induziertes cAMP-Signal {\"u}berpr{\"u}ft. Mit den drei Antagonisten konnte an den Zelllinien A375, Brown und MV3 die f{\"u}r A2B-AR zu erwartende Wirkung nachgewiesen und damit die Expression von A2B-AR in diesen Zellen best{\"a}tigt werden. Die gewonnenen Daten k{\"o}nnen als Ausgangspunkt weiterf{\"u}hrender Untersuchungen genutzt werden, um die Rolle von AR in Krebszellen besser zu verstehen. Sie k{\"o}nnten als Grundlage f{\"u}r die Suche nach potenziellen Angriffspunkten f{\"u}r neue Therapieans{\"a}tze dienen und so einen Beitrag f{\"u}r Fortschritte in der Behandlung von Tumoren leisten.}, subject = {Adenosin}, language = {de} } @phdthesis{Riese2014, author = {Riese, Thorsten}, title = {Analysen zur potentiellen Gentoxizit{\"a}t von Terahertzstrahlung in vitro}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-116469}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Im Rahmen dieser Arbeit wurden immortalisierte humane Keratinozyten (HaCaT-Zelllinie) {\"u}ber eine Dauer von 24 Stunden mit Terahertzstrahlung der Frequenz 0,106 THz und einer Leistungsflussdichte von 2 mW/cm² behandelt und anschließend mittels „cytokinesis-block micronucleus cytome assay" ausgewertet. Ferner wurden Proben der gleichen Zelllinie {\"u}ber einen Zeitraum von 24 Stunden Temperaturen zwischen 37 °C und 42 °C ausgesetzt und zum einen auf Hinweise f{\"u}r Gentoxizit{\"a}t mit Hilfe des Mikrokerntests untersucht und zum anderen mittels Western Blot die Expressionsrate von Hitzeschockproteinen der 70 kDa Familie bestimmt. Die der Terahertzstrahlung ausgesetzten Zellen zeigten gegen{\"u}ber den Kontrollen keine signifikanten Ver{\"a}nderungen der Marker f{\"u}r chromosomale Aberrationen oder der Zellteilung. Die der erh{\"o}hten Temperatur ausgesetzten Zellen zeigten einen signifikanten Anstieg der Mikrokernraten und weiterer Marker f{\"u}r Gentoxizit{\"a}t sowie eine damit korrelierende Zunahme der synthetisierten Proteinmenge der Hsp70 Proteine im Rahmen der Hitzeschockreaktion.}, subject = {Terahertzbereich}, language = {de} } @article{AgarwalYangRiceetal.2014, author = {Agarwal, Shailesh R. and Yang, Pei-Chi and Rice, Monica and Singer, Cherie A. and Nikolaev, Viacheslav O. and Lohse, Martin J. and Clancy, Colleen E. and Harvey, Robert D.}, title = {Role of Membrane Microdomains in Compartmentation of cAMP Signaling}, series = {PLOS ONE}, volume = {9}, journal = {PLOS ONE}, number = {4}, issn = {1932-6203}, doi = {10.1371/journal.pone.0095835}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-116673}, pages = {e95835}, year = {2014}, abstract = {Spatially restricting cAMP production to discrete subcellular locations permits selective regulation of specific functional responses. But exactly where and how cAMP signaling is confined is not fully understood. Different receptors and adenylyl cyclase isoforms responsible for cAMP production are not uniformly distributed between lipid raft and non-lipid raft domains of the plasma membrane. We sought to determine the role that these membrane domains play in organizing cAMP responses in HEK293 cells. The freely diffusible FRET-based biosensor Epac2-camps was used to measure global cAMP responses, while versions of the probe targeted to lipid raft (Epac2-MyrPalm) and non-raft (Epac2-CAAX) domains were used to monitor local cAMP production near the plasma membrane. Disruption of lipid rafts by cholesterol depletion selectively altered cAMP responses produced by raft-associated receptors. The results indicate that receptors associated with lipid raft as well as non-lipid raft domains can contribute to global cAMP responses. In addition, basal cAMP activity was found to be significantly higher in non-raft domains. This was supported by the fact that pharmacologic inhibition of adenylyl cyclase activity reduced basal cAMP activity detected by Epac2-CAAX but not Epac2-MyrPalm or Epac2-camps. Responses detected by Epac2-CAAX were also more sensitive to direct stimulation of adenylyl cyclase activity, but less sensitive to inhibition of phosphodiesterase activity. Quantitative modeling was used to demonstrate that differences in adenylyl cyclase and phosphodiesterase activities are necessary but not sufficient to explain compartmentation of cAMP associated with different microdomains of the plasma membrane.}, language = {en} } @article{BrandAmannMandeletal.2014, author = {Brand, Susanne and Amann, Kerstin and Mandel, Philipp and Zimnol, Anna and Schupp, Nicole}, title = {Oxidative DNA Damage in Kidneys and Heart of Hypertensive Mice Is Prevented by Blocking Angiotensin II and Aldosterone Receptors}, series = {PLOS ONE}, volume = {9}, journal = {PLOS ONE}, number = {12}, issn = {1932-6203}, doi = {10.1371/journal.pone.0115715}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-118011}, pages = {e115715}, year = {2014}, abstract = {INTRODUCTION: Recently, we could show that angiotensin II, the reactive peptide of the blood pressure-regulating renin-angiotensin-aldosterone-system, causes the formation of reactive oxygen species and DNA damage in kidneys and hearts of hypertensive mice. To further investigate on the one hand the mechanism of DNA damage caused by angiotensin II, and on the other hand possible intervention strategies against end-organ damage, the effects of substances interfering with the renin-angiotensin-aldosterone-system on angiotensin II-induced genomic damage were studied. METHODS: In C57BL/6-mice, hypertension was induced by infusion of 600 ng/kg • min angiotensin II. The animals were additionally treated with the angiotensin II type 1 receptor blocker candesartan, the mineralocorticoid receptor blocker eplerenone and the antioxidant tempol. DNA damage and the activation of transcription factors were studied by immunohistochemistry and protein expression analysis. RESULTS: Administration of angiotensin II led to a significant increase of blood pressure, decreased only by candesartan. In kidneys and hearts of angiotensin II-treated animals, significant oxidative stress could be detected (1.5-fold over control). The redox-sensitive transcription factors Nrf2 and NF-κB were activated in the kidney by angiotensin II-treatment (4- and 3-fold over control, respectively) and reduced by all interventions. In kidneys and hearts an increase of DNA damage (3- and 2-fold over control, respectively) and of DNA repair (3-fold over control) was found. These effects were ameliorated by all interventions in both organs. Consistently, candesartan and tempol were more effective than eplerenone. CONCLUSION: Angiotensin II-induced DNA damage is caused by angiotensin II type 1 receptor-mediated formation of oxidative stress in vivo. The angiotensin II-mediated physiological increase of aldosterone adds to the DNA-damaging effects. Blocking angiotensin II and mineralocorticoid receptors therefore has beneficial effects on end-organ damage independent of blood pressure normalization.}, language = {en} } @phdthesis{Sumski2014, author = {Sumski, Anna Magdalena}, title = {Adenosinrezeptoren auf Zervix-, Uterus- und Mammakarzinomzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-99332}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Adenosinrezeptoren werden auf nahezu allen K{\"o}rperzellen exprimiert und {\"u}bernehmen dort vielf{\"a}ltige und wichtige Funktionen. Auch auf diversen Tumorzelllinien konnten bereits Adenosinrezeptoren nachgewiesen und - je nach Subtyp - mit Pro- oder Anti-tumor-Effekten in Zusammenhang gebracht werden. In dieser Arbeit wurden Geb{\"a}rmutterhalskrebszellen sowie endometriale und triple-negative Brustkrebszellen auf Expression und m{\"o}gliche Funktionen von Adenosinrezep-toren untersucht. Da spezifische Antik{\"o}rper bis heute nicht verf{\"u}gbar sind, wurde ein pharmakologischer Ansatz mit subtypspezifischen Agonisten und Antagonisten gew{\"a}hlt. In Radioliganden-Bindungsassays, konnte nachgewiesen werden, dass sich auf der Zer-vixkarzinom-Zelllinie SiHa und der Brustkrebs-Zelllinie HCC1806 Adenosinrezeptoren des Subtyps A1 befinden. Die endometrialen Krebszelllinien Ishikawa und HEC-1-A exprimieren Rezeptoren vom Subtyp A1 und A2A. A3-Adenosinrezeptoren wurden auf keiner der untersuchten Zelllinien gefunden. Der Nachweis von A2B-Rezeptoren kann mit dem Radioliganden-Bindungsassay nicht erbracht werden, da bislang kein Radioligand bekannt ist, der eine ausreichende Affini-t{\"a}t besitzt, um diesen Subtyp zweifelsfrei nachweisen zu k{\"o}nnen. Obwohl die Mehrheit der untersuchten Zelllinien Adenosinrezeptoren exprimiert, konnte ein signifikanter Effekt auf die Adenylatcyclase bei Stimulation der auf den Zellen vorhandenen Adenosinrezeptoren nur bei den HEC-1-A-Zellen festgestellt werden. Auch auf funktionelle A2B-Rezeptoren fand sich im Adenylatcyclaseassy kein Hinweis. Im durchgef{\"u}hrten Kristallviolettassay zeigte sich ein proapoptotischer Effekt auf Ishi-kawa- und HEC-1-A-Zellen bei hohen Adenosin-Konzentrationen (100 µM). Die im BrdU-Assay gemessene Proliferationsrate hingegen {\"a}nderte sich nach Vorbehandlung mit Adenosin nicht. Das metabolisch stabilere NECA (in Kombination mit ADA) hatte im Kristallviolettassay einen st{\"a}rkeren Einfluss auf die Apoptoserate der jeweiligen Zelllinie als Adenosin und auch im BrdU-Assay sank die Menge an inkorporiertem BrdU. Ein Synergismus zwischen Stimulation von Adenosinrezeptoren und diversen Todesliganden bzw. Chemotherapeutika konnte nicht nachgewiesen werden. Freies extrazellul{\"a}res Adenosin kann auch aus dem Abbau von ATP generiert werden, wenn Zellen die Ektonukleotidasen CD39 und CD73 exprimieren. Aufgrund der im-munsuppressiven Wirkung von Adenosin k{\"o}nnen diese Enzyme T-Zell- und NK-Zellantworten im Mikromilieu von Tumoren hemmen. Die durchflusszytometrische Analyse von HEC-1-A- und Ishikawa-Zellen zeigte zwar, dass die Expression von CD39 und CD73 nach Stimulation der Adenosinrezeptoren unver{\"a}ndert blieb. Die Ex-pression von Enzymen, l{\"a}sst aber vermuten, dass die Zellen in vivo von Adenosin profi-tieren k{\"o}nnten. Angesichts der in vitro Daten, die allenfalls einen wachstumshemmen-den Effekt von Adenosin zeigten, k{\"o}nnte die vorrangige Wirkung von Adenosin im Tumormikromilieu tats{\"a}chlich auf der Inhibition von Immunantworten beruhen. M{\"o}g-licherweise w{\"u}rden die Rezeptoren dann in erster Linie als Sensoren dienen. Weitere Forschungsarbeit wird helfen, die Rolle der Adenosinrezeptoren im Tumorge-schehen vollst{\"a}ndig zu verstehen und m{\"o}glicherweise f{\"u}r die Krebstherapie nutzbar zu machen.}, subject = {Adenosinrezeptor}, language = {de} } @phdthesis{Mueller2014, author = {M{\"u}ller, Markus}, title = {Effekte kardioprotektiver Zyklopeptide auf Funktion und Morphometrie des Herzens im Rattenmodell der dilatativen Immunkardiomyopathie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-101935}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Kardiomyopathien sind Erkrankungen des Herzmuskels, die mit einer kardialen Funktionsst{\"o}rung einhergehen. Formen, die ohne erkennbare Ursache zu einer progredienten Dilatation und Reduktion der Kontraktilit{\"a}t des linken Ventrikels f{\"u}hren, werden als idiopathische dilatative Kardiomyopathie (DCM) bezeichnet. Sie ist der Hauptgrund f{\"u}r schwere Herzinsuffizienz und die damit assoziierten Einschr{\"a}nkungen der Lebensqualit{\"a}t bei jungen Erwachsenen. Neben der beeintr{\"a}chtigten kardialen Funktion weisen diese Patienten oftmals auch Ver{\"a}nderungen im Bereich der humoralen und zellul{\"a}ren Immunit{\"a}t auf. Ein Teil der Patienten entwickelt Autoantik{\"o}rper, die sich gegen den kardialen β1-adrenergen Rezeptor richten und ihn {\"a}hnlich wie der nat{\"u}rliche Ligand Adrenalin aktivieren. Hieraus resultiert eine chronische {\"U}berstimulation des Rezeptors, die {\"u}ber eine initiale Hypertrophie dann zu einer eingeschr{\"a}nkten Pumpfunktion f{\"u}hrt. Nachdem sich die Therapie der Antik{\"o}rper-vermittelten Immunkardiomyopathie bisher auf die Behandlung der Herzinsuffizienz und die Kontrolle der Herz-insuffizienzsymptome beschr{\"a}nkt, k{\"o}nnten β1-ECII-homologe Peptide als Antik{\"o}rper-F{\"a}nger bei Antik{\"o}rper-positiven Patienten nun einen kausalen Therapieansatz darstellen. In diesem Zusammenhang wurden ein aus 25 Aminos{\"a}uren bestehendes zyklisches Peptid, eine aus 18 Aminos{\"a}uren bestehende Zyklopeptid-Mutante und ihre jeweiligen linearen {\"A}quivalente im Rattenmodell auf Antik{\"o}rper-neutralisierende Effekte und potentielle therapeutische Wirksamkeit getestet. Das Rattenmodell ist hierf{\"u}r besonders geeignet, da die Aminos{\"a}uresequenz der funktionell wichtigen zweiten extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne des β1-adrenergen Rezeptors (β1-ECII) bei Mensch und Ratte absolut identisch ist. Auf immunologischer Ebene konnte der Titer der krankheitsinduzierenden β1-ECII-Antik{\"o}rper bereits nach der ersten Applikation zyklischer Peptide relevant gesenkt werden und nahm im weiteren Verlauf der Behandlung kontinuierlich ab. Nach Zyklopeptidgabe kam es am Herzen zu einer Reduktion des linksventrikul{\"a}ren Durchmessers und zu einer fast vollst{\"a}ndigen Normalisierung der anatomischen Proportionen. Auf die Morphologie der Myozyten selbst und auch den Kollagengehalt des Gewebes hatte die Zyklopeptidtherapie keinen wesentlichen Einfluss. Die funktionellen Eigenschaften des Herzens ließen sich durch die Neutralisation stimulatorischer β1-ECII-Antik{\"o}rper mittels intraven{\"o}ser Zyklopeptidapplikation deutlich verbessern: Die Verk{\"u}rzungsfraktion des linken Ventrikels und der Herzindex als Parameter f{\"u}r die kardiale Leistungsf{\"a}higkeit konnten durch die Behandlung wieder weitgehend normalisiert werden. Diese im Tiermodell erzielten Ergebnisse lassen einen therapeutischen Effekt der Zyklopeptide vermuten. Der Ansatz einer spezifisch gegen Antik{\"o}rper gerichteten Therapie zur Behandlung von Patienten mit β1-Antik{\"o}rper-positiver Herzinsuffizienz erscheint daher vielversprechend.}, subject = {Dilatative Kardiomyopathie}, language = {de} } @article{VoglLutzSchoenfelderetal.2015, author = {Vogl, Silvia and Lutz, Roman W. and Sch{\"o}nfelder, Gilbert and Lutz, Werner K.}, title = {CYP2C9 genotype vs. metabolic phenotype for individual drug dosing - a correlation analysis using flurbiprofen as probe drug}, series = {PLoS ONE}, volume = {10}, journal = {PLoS ONE}, number = {3}, doi = {10.1371/journal.pone.0120403}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-148783}, pages = {e0120403}, year = {2015}, abstract = {Currently, genotyping of patients for polymorphic enzymes responsible for metabolic elimination is considered a possibility to adjust drug dose levels. For a patient to profit from this procedure, the interindividual differences in drug metabolism within one genotype should be smaller than those between different genotypes. We studied a large cohort of healthy young adults (283 subjects), correlating their CYP2C9 genotype to a simple phenotyping metric, using flurbiprofen as probe drug. Genotyping was conducted for CYP2C9*1, *2, *3. The urinary metabolic ratio MR (concentration of CYP2C9-dependent metabolite divided by concentration of flurbiprofen) determined two hours after flurbiprofen (8.75 mg) administration served as phenotyping metric. Linear statistical models correlating genotype and phenotype provided highly significant allele-specific MR estimates of 0.596 for the wild type allele CYP2C9*1, 0.405 for CYP2C9*2 (68 \% of wild type), and 0.113 for CYP2C9*3 (19 \% of wild type). If these estimates were used for flurbiprofen dose adjustment, taking 100 \% for genotype *1/*1, an average reduction to 84 \%, 60 \%, 68 \%, 43 \%, and 19\% would result for genotype *1/*2, *1/*3, *2/*2, *2/*3, and *3/*3, respectively. Due to the large individual variation within genotypes with coefficients of variation >= 20\% and supposing the normal distribution, one in three individuals would be out of the average optimum dose by more than 20 \%, one in 20 would be 40\% off. Whether this problem also applies to other CYPs and other drugs has to be investigated case by case. Our data for the given example, however, puts the benefit of individual drug dosing to question, if it is exclusively based on genotype.}, language = {en} } @phdthesis{Bellwon2015, author = {Bellwon, Patricia}, title = {Kinetic assessment by in vitro approaches - A contribution to reduce animals in toxicity testing}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-122693}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2015}, abstract = {The adoption of directives and regulations by the EU requires the development of alternative testing strategies as opposed to animal testing for risk assessment of xenobiotics. Additionally, high attrition rates of drugs late in the discovery phase demand improvement of current test batteries applied in the preclinical phase within the pharmaceutical area. These issues were taken up by the EU founded 7th Framework Program "Predict-IV"; with the overall goal to improve the predictability of safety of an investigational product, after repeated exposure, by integration of "omics" technologies applied on well established in vitro approaches. Three major target organs for drug-induced toxicity were in focus: liver, kidney and central nervous system. To relate obtained dynamic data with the in vivo situation, kinetics of the test compounds have to be evaluated and extrapolated by physiologically based pharmacokinetic modeling. This thesis assessed in vitro kinetics of the selected test compounds (cyclosporine A, adefovir dipivoxil and cisplatinum) regarding their reliability and relevance to respective in vivo pharmacokinetics. Cells were exposed daily or every other day to the test compounds at two concentration levels (toxic and non-toxic) for up to 14 days. Concentrations of the test compounds or their major biotransformation products were determined by LC-MS/MS or ICP-MS in vehicle, media, cells and plastic adsorption samples generated at five different time-points on the first and the last treatment day. Cyclosporine A bioaccumulation was evident in primary rat hepatocytes (PRH) at the high concentration, while efficient biotransformation mediated by CYP3A4 and CYP3A5 was determined in primary human hepatocytes (PHH) and HepaRG cells. The lower biotransformation in PRH is in accordance with observation made in vivo with the rat being a poor model for CYP3A biotransformation. Further, inter-assay variability was noticed in PHH caused by biological variability in CYP3A4 and CYP3A5 activity in human donors. The inter-assay variability observed for PRH and HepaRG cells was a result of differences between vehicles regarding their cyclosporine A content. Cyclosporine A biotransformation was more prominent in HepaRG cells due to stable and high CYP3A4 and CYP3A5 activity. In addition, in vitro clearances were calculated and scaled to in vivo. All scaled in vitro clearances were overestimated (PRH: 10-fold, PHH: 2-fold, HepaRG cells: 2-fold). These results should be proven by physiologically-based pharmacokinetic modeling and additional experiments, in order to verify that these overestimations are constant for each system and subsequently can be diminished by implementation of further scaling factors. Brain cell cultures, primary neuronal culture of mouse cortex cells and primary aggregating rat brain cells, revealed fast achieved steady state levels of cyclosporine A. This indicates a chemical distribution of cyclosporine A between the aqueous and organic phases and only minor involvement of biological processes such as active transport and biotransformation. Hence, cyclosporine A uptake into cells is presumably transport mediated, supported by findings of transporter experiments performed on a parallel artificial membrane and Caco-2 cells. Plastic adsorption of cyclosporine A was significant, but different for each model, and should be considered by physiologically based pharmacokinetic modeling. Kinetics of adefovir dipivoxil highlights the limits of in vitro approaches. Active transporters are required for adefovir uptake, but were not functional in RPTECT/TERT1. Therefore, adefovir uptake was limited to passive diffusion of adefovir dipivoxil, which itself degrades time-dependently under culture conditions. Cisplatinum kinetics, studied in RPTEC/TERT1 cells, indicated intracellular enrichment of platinum, while significant bioaccumulation was not noted. This could be due to cisplatinum not reaching steady state levels within 14 days repeated exposure. As shown in vivo, active transport occurred from the basolateral to apical side, but with lower velocity. Hence, obtained data need to be modeled to estimate cellular processes, which can be scaled and compared to in vivo. Repeated daily exposure to two different drug concentrations makes it possible to account for bioaccumulation at toxic concentrations or biotransformation/extrusion at non-toxic concentrations. Potential errors leading to misinterpretation of data were reduced by analyses of the vehicles as the applied drug concentrations do not necessarily correspond to the nominal concentrations. Finally, analyses of separate compartments (medium, cells, plastic) give insights into a compound's distribution, reduce misprediction of cellular processes, e.g. biotransformation, and help to interpret kinetic data. On the other hand, the limits of in vitro approaches have also been pointed out. For correct extrapolation to in vivo, it is essential that the studied in vitro system exhibits the functionality of proteins, which play a key role in the specific drug induced toxicity. Considering the benefits and limitations, it is worth to validate this long-term treatment experimental set-up and expand it on co-culture systems and on organs-on-chips with regard to alternative toxicity testing strategies for repeated dose toxicity studies.}, subject = {Zellkultur}, language = {en} } @phdthesis{ZinkgebSondergeld2015, author = {Zink [geb. Sondergeld], Thomas Gerd}, title = {Der Cofilin-Signalweg im Glioblastoma multiforme - Ursachen f{\"u}r den Verlust von Chronophin und Einfluss von LIM-Kinase-Inhibitoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-127065}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2015}, abstract = {Das invasive Potential maligner Gliome beeinflusst maßgeblich die schlechte Prognose dieser Tumorentit{\"a}t. Migration und Invasion von Tumorzellen werden entscheidend durch die Cofilin-vermittelte Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts gepr{\"a}gt, die durch die Aktivit{\"a}t antagonistischer Cofilin-Kinasen und -Phosphatasen reguliert wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte ein progressiver Expressionsverlust der Cofilin-Phosphatase Chronophin mit ansteigendem Malignit{\"a}tsgrad astrozyt{\"a}rer Gliome aufgezeigt werden, der mit einer Zunahme der Phosphorylierung von Cofilin einhergeht. In den entsprechenden Gewebeproben gelang gleichzeitig der Nachweis einer gesteigerten Expression der Cofilin-Kinase LIMK-2. Genetische und epigenetische Analysen des Chronophin-Locus konnten eine Hypermethylierung im Bereich der Promotorregion der Phosphatase identifizieren, die m{\"o}glicherweise dem Verlust von Chronophin in Glioblastom-Gewebeproben zugrunde liegt. In Glioblastom-Zelllinien, die unterschiedliche Expressionsmuster von Chronophin aufwiesen, konnten hingegen keine molekularen Alterationen festgestellt werden. Untersuchungen des Einflusses von ROCK- und LIMK-Inhibitoren auf Glioblastomzellen konnten ausgepr{\"a}gte Ver{\"a}nderungen der Zellmorphologie dokumentieren, wobei erstmals die Induktion eines stellate cell-Ph{\"a}notyps unter Einfluss des LIMK-Inhibitors BMS-5 beschrieben wird. W{\"a}hrend ROCK- und LIMK-Inhibitoren keinen Einfluss auf die 2D-Motilit{\"a}t der Tumorzellen hatten, wiesen die Glioblastomzellen in Abh{\"a}ngigkeit ihrer basalen Cofilin-Aktivit{\"a}t eine verst{\"a}rkte bzw. verminderte 3D-Invasivit{\"a}t auf. Die Erkenntnisse dieser Arbeit unterstreichen die Bedeutung des Cofilin-Signalweges f{\"u}r die Migration und Invasion von Gliomzellen, zeigen neue Angriffspunkte in der Therapie maligner Gliome auf und warnen zugleich vor einem unkritischen Einsatz neuer Wirkstoffe.}, subject = {Cofilin}, language = {de} } @article{BoivinBeyersdorfPalmetal.2015, author = {Boivin, Val{\´e}rie and Beyersdorf, Niklas and Palm, Dieter and Nikolaev, Viacheslav O. and Schlipp, Angela and M{\"u}ller, Justus and Schmidt, Doris and Kocoski, Vladimir and Kerkau, Thomas and H{\"u}nig, Thomas and Ertl, Georg and Lohse, Martin J. and Jahns, Roland}, title = {Novel Receptor-Derived Cyclopeptides to Treat Heart Failure Caused by \(Anti-β_1-Adrenoceptor\) Antibodies in a Human-Analogous Rat Model}, series = {PLoS One}, volume = {10}, journal = {PLoS One}, number = {2}, doi = {10.1371/journal.pone.0117589}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-126028}, pages = {e0117589}, year = {2015}, abstract = {Despite recent therapeutic advances the prognosis of heart failure remains poor. Recent research suggests that heart failure is a heterogeneous syndrome and that many patients have stimulating auto-antibodies directed against the second extracellular loop of the \(β_1\) adrenergic receptor \((β_1EC2)\). In a human-analogous rat model such antibodies cause myocyte damage and heart failure. Here we used this model to test a novel antibody-directed strategy aiming to prevent and/or treat antibody-induced cardiomyopathy. To generate heart failure, we immunised n = 76/114 rats with a fusion protein containing the human β1EC2 (amino-acids 195-225) every 4 weeks; n = 38/114 rats were control-injected with 0.9\% NaCl. Intravenous application of a novel cyclic peptide mimicking \(β_1EC2\) (\(β_1EC2-CP\), 1.0 mg/kg every 4 weeks) or administration of the \(β_1-blocker\) bisoprolol (15 mg/kg/day orally) was initiated either 6 weeks (cardiac function still normal, prevention-study, n = 24 (16 treated vs. 8 untreated)) or 8.5 months after the 1st immunisation (onset of cardiomyopathy, therapy-study, n = 52 (40 treated vs. 12 untreated)); n = 8/52 rats from the therapy-study received \(β_1EC2-CP/bisoprolol\) co-treatment. We found that \(β_1EC2-CP\) prevented and (alone or as add-on drug) treated antibody-induced cardiac damage in the rat, and that its efficacy was superior to mono-treatment with bisoprolol, a standard drug in heart failure. While bisoprolol mono-therapy was able to stop disease-progression, \(β_1EC2-CP\) mono-therapy -or as an add-on to bisoprolol- almost fully reversed antibody-induced cardiac damage. The cyclo¬peptide acted both by scavenging free \(anti-β_1EC2-antibodies\) and by targeting \(β_1EC2\)-specific memory B-cells involved in antibody-production. Our model provides the basis for the clinical translation of a novel double-acting therapeutic strategy that scavenges harmful \(anti-β_1EC2-antibodies\) and also selectively depletes memory B-cells involved in the production of such antibodies. Treatment with immuno-modulating cyclopeptides alone or as an add-on to \(β_1\)-blockade represents a promising new therapeutic option in immune-mediated heart failure.}, language = {en} } @phdthesis{Stumpf2015, author = {Stumpf, Anette D.}, title = {Development of fluorescent FRET receptor sensors for investigation of conformational changes in adenosine A1 and A2A receptors}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-125469}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2015}, abstract = {Adenosine receptors that belong to the rhodopsin-like G protein-coupled receptors (GPCRs) are involved in a lot of regulatory processes and are widely distributed throughout the body which makes them an attractive target for drugs. However, pharmacological knowledge of these receptors is still limited. A big advance regarding the structural knowledge of adenosine receptors was the development of the first crystal structure of the adenosine A2A receptor in 2008. The crystal structure revealed the amino acids that form the ligand binding pocket of the receptor and depicted the endpoint of receptor movement in the ligand binding process. Within the scope of this work two members of the adenosine receptor family were investigated, namely the adenosine A1 and the A2A receptor (A1R, A2AR). A1R was generated on base of the previously developed A2AR. Receptors were tagged with fluorophores, with the cyan fluorescent protein (CFP) at the C-terminal end of receptor and the Fluorescein Arsenical Hairpin binder (FlAsH) binding sequence within the third intracellular loop of receptors. Resulting fluorescent receptor sensors A1 Fl3 CFP and A2A Fl3 CFP were investigated with help of Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) measurements within living cells. FRET experiments enable the examination of alteration in the distance of two fluorophores and thus the observation of receptor dynamical movements. For comparison of A1R and A2AR regarding receptor dynamical movement upon ligand binding, fluorescent receptor sensors A1 Fl3 CFP and A2A Fl3 CFP were superfused with various ligands and the outcomes of FRET experiments were compared regarding signal height of FRET ratio evoked by the distinct ligand that is correlated to the conformational change of receptor upon ligand binding. Beside the different direction of FRET ratio upon ligand binding at A1R and A2AR sensor, there were differences observable when signal height and association and dissociation kinetics of the various ligands investigated were compared to each other. Differences between the adenosine receptor subtypes were especially remarkable for the A1R subtype selective agonist CPA and the A2AR subtype selective agonist CGS 21680. Another part of the project was to investigate the influence of single amino acids in the ligand binding process within the fluorescent A1R sensor. Amino acid positions were derived from the crystal structure of the A2AR forming the ligand binding pocket and these amino acids were mutated in the A1R structure. Investigation of the A1R sensor and its mutants regarding confocal analysis showed involvement of some amino acids in receptor localization. When these amino acids were mutated receptors were not expressed in the plasma membrane of cells. Some amino acids investigated were found to be involved in the ligand binding process in general whereas other amino acids were found to have an influence on the binding of distinct structural groups of the ligands investigated. In a further step, A1R and A2AR were N-terminally tagged with SNAP or CLIP which allowed to label receptor sensors with multiple fluorophores. With this technique receptor distribution in cells could be investigated with help of confocal analysis. Furthermore, ligand binding with fluorescent adenosine receptor ligands and their competition with help of a non-fluorescent antagonist was examined at the SNAP tagged A1R and A2AR. Finally the previously developed receptor sensors were combined to the triple labeled receptor sensors SNAP A1 Fl3 CFP and SNAP A2A Fl3 CFP which were functional regarding FRET experiments and plasma membrane expression was confirmed via confocal analysis. In the future, with the help of this technique, interaction between fluorescent ligand and SNAP tagged receptor can be monitored simultaneously with the receptor movement that is indicated by the distance alteration between FlAsH and CFP. This can lead to a better understanding of receptor function and its dynamical movement upon ligand binding which may contribute to the development of new and more specific drugs for the A1R and A2AR in the future.}, subject = {Adenosinrezeptor}, language = {en} } @phdthesis{Spiegel2015, author = {Spiegel, Silvana}, title = {Mikrokernfrequenzanalyse unter dem Einfluss von Methylphenidat und chronischem Stress bei adultem ADHS}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-139387}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2015}, abstract = {Einleitung: Methylphenidat (MPH) als Medikament der ersten Wahl bei Patienten mit einem Aufmerksamkeitsdefizit- /Hyperaktivit{\"a}tssyndrom (ADHS) ist f{\"u}r die Therapie von Kindern aber auch von Erwachsenen weit verbreitet. Weil es immer noch Sicherheitsbedenken gegen dieses Medikament gibt, wurde in der vorliegenden Studie untersucht, ob die Langzeiteinnahme von MPH unsch{\"a}dlich hinsichtlich eines zytogenetischen Effektes ist. Ein weiteres Ziel war die Beurteilung von chronischer psychosozialer Stressbelastung von Patienten im Vergleich zu Kontrollprobanden und zu beurteilen ob die Medikation einen Einfluss auf die H{\"o}he des Stresses hat. Nicht zuletzt war das dritte Ziel der Studie zu untersuchen, ob Stress selbst zu zytogenetischen Sch{\"a}den f{\"u}hrt. Material und Methoden: Lymphozyten von 72 (42 ADHS- und 28 gesunde Kontrollprobanden) geschlechts- und altersgematchte Probanden im Alter von 18-28 Jahren, wurden aus ven{\"o}sem Blut f{\"u}r den Mikronukleusassay isoliert. Hauptendpunkt der Studie war die Mikrokernanzahl in binukle{\"a}ren Zellen. Die psychosoziale Stressbelastung der letzten drei Monate wurde mit dem Trier Inventar zum chronischen Stress (TICS) gemessen. Zus{\"a}tzlich wurden Speichelproben f{\"u}r eine Cortisolmessung gesammelt. Ergebnisse: Ein Einfluss der MPH-Einnahme auf die Mikrokernfrequenz konnte nicht gefunden. ADHS-Patienten wiesen eine signifikant h{\"o}here Stressbelastung im Vergleich zu den Kontrollprobanden auf. Ein signifikanter positiver Einfluss auf das chronische Stresserleben unter MPH-Einnahme konnte bei Einnahme von mehr als 1 Jahr beobachtet werden. Die Stressbelastung der ADHS-Patienten und Kontrollprobanden zeigte keine Korrelation zu zytogenetischen Endpunkten. Eine kleine Untergruppe, ADHS-Patienten mit Komorbidit{\"a}t Depression, zeigte jedoch signifikante erh{\"o}hte Mikrokernfrequenzanzahlen unter stark erh{\"o}htem chronischen Stress. Aussichten: Aus unserer Sicht kann MPH auch in der Langzeittherapie sicher hinsichtlich eines Krebsrisikos in gewichts- und symptomadaptierter Dosis eingesetzt werden. Weitere Studien sind n{\"o}tig um das Krebsrisiko bei chronischer erh{\"o}hter Stressbelastung abzusch{\"a}tzen.}, subject = {ADHS}, language = {de} } @article{FedericoRedentiSturleseetal.2015, author = {Federico, Stephanie and Redenti, Sara and Sturlese, Mattia and Ciancetta, Antonella and Kachler, Sonja and Klotz, Karl-Norbert and Cacciari, Barbara and Moro, Stefano and Spalluto, Giampiero}, title = {The Influence of the 1-(3-Trifluoromethyl-Benzyl)-1H-Pyrazole-4-yl Moiety on the Adenosine Receptors Affinity Profile of Pyrazolo[4,3-e][1,2,4]Triazolo[1,5-c]Pyrimidine Derivatives}, series = {PLoS One}, volume = {10}, journal = {PLoS One}, number = {12}, doi = {10.1371/journal.pone.0143504}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-137133}, pages = {e0143504}, year = {2015}, abstract = {A new series of pyrazolo[4,3-e][1,2,4]triazolo[1,5-c]pyrimidine (PTP) derivatives has been developed in order to explore their affinity and selectivity profile at the four adenosine receptor subtypes. In particular, the PTP scaffold was conjugated at the C2 position with the 1-(3-trifluoromethyl-benzyl)-1H-pyrazole, a group believed to confer potency and selectivity toward the human (h) A\(_{2B}\) adenosine receptor (AR) to the xanthine ligand 8-(1-(3-(trifluoromethyl) benzyl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,3-dimethyl-1H-purine-2,6(3H, 7H)-dione (CVT 6975). Interestingly, the synthesized compounds turned out to be inactive at the hA\(_{2B}\) AR but they displayed affinity at the hA\(_3\) AR in the nanomolar range. The best compound of the series (6) shows both high affinity (hA\(_3\) AR K\(_i\) = 11 nM) and selectivity (A\(_1\)/A\(_3\) and A\(_{2A}\)/A\(_3\) > 9090; A\(_{2B}\)/A\(_3\) > 909) at the hA\(_3\) AR. To better rationalize these results, a molecular docking study on the four AR subtypes was performed for all the synthesized compounds. In addition, CTV 6975 and two close analogues have been subjected to the same molecular docking protocol to investigate the role of the 1-(3-trifluoromethyl-benzyl)-1H-pyrazole on the binding at the four ARs.}, language = {en} } @phdthesis{Leyh2015, author = {Leyh, Annekathrin}, title = {In vitro Untersuchungen zur Genotoxizit{\"a}t von Insulin}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-131986}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2015}, abstract = {Insulin ist ein essentielles Hormon im menschlichen K{\"o}rper, welches f{\"u}r die Senkung der Blutglukosekonzentration, die Bildung von Energiespeichern und das Zellwachstum verantwortlich ist. Eine mit der Fehlregulation der Insulinproduktion einhergehenden Krankheit ist der Diabetes mellitus. F{\"u}r diese Arbeit spielt der Typ 2 dieser Erkrankung eine wichtige Rolle. Es entwickelt sich bei Patienten mit diesem Typ des Diabetes mellitus langsam eine Insulinresistenz, die zun{\"a}chst durch eine kompensatorische {\"U}berproduktion von Insulin charakterisiert ist. Dieser Zustand der Hyperinsulin{\"a}mie kann Jahre bis Jahrzehnte andauern, ehe es zu einem Versagen der ß-Zellen des Pankreas und somit zu einer Hypoinsulin{\"a}mie kommt. In dieser Arbeit war es Ziel herauszufinden, ob diese lange Zeit herrschende Hyperinsulin{\"a}mie einen Einfluss auf die menschliche DNA hat. Die Genotoxizit{\"a}t von hohen Insulinkonzentrationen wurde in Hep-G2 Zellen, HT29 Zellen, sowie prim{\"a}ren humanen peripheren Lymphozyten mithilfe des Comet Assays und des Mikrokerntests nachgewiesen. Oxidativer Stress bzw. dessen Reduzierung durch Antioxidantien und Inhibitoren wurde in HT29 Zellen mithilfe der DHE-F{\"a}rbung detektiert. Diese Arbeit belegt dass sich Insulin sch{\"a}digend auf das menschliche Genom in vitro auswirken kann. Eine besondere Relevanz haben die durchgef{\"u}hrten Experimente mit prim{\"a}ren menschlichen Lymphozyten. Denn bei ihnen handelt es sich um Zellen, die im Gegensatz zu der auch genutzten humanen Leberkarzinomzelllinie Hep-G2 und der humanen Kolonkarzinomzelllinie HT29 nicht transformiert sind. Eine weitere wesentliche Erkenntnis dieser Arbeit ist, dass schon pathophysiologisch vorliegende Insulinkonzentrationen in der Lage sind Genomsch{\"a}digungen in vitro zu induzieren. HT29 Zellen zeigten bei Kurzzeitbehandlung mit nur 1nM Insulin eine signifikante Erh{\"o}hung der DNA-Sch{\"a}digung. Bei Langzeitexposition von 6 Tagen konnten schon 0,5nM signifikante DNA-Sch{\"a}den hervorrufen. Diese durch Insulin hervorgerufenen Sch{\"a}den k{\"o}nnten, falls sie so auch in vivo entstehen, bei Versagen von Reparaturmechanismen zur Entstehung von Mutationen und sich daraus entwickelnden Karzinomen beitragen. Aus diesem Grund war ein weiteres Ziel dieser Arbeit herauszufinden, ob bestimmte Antioxidantien oder Inhibitoren in der Lage sind die Insulin-induzierten Genomsch{\"a}digungen zu verringern. Hierf{\"u}r wurde Tempol, Apocynin, Plumbagin, VAS2870, Rotenone, PPP, HNMPA-(AM)3 und Wortmannin genutzt. Tats{\"a}chlich sind diese Substanzen in der Lage die durch Insulin hervorgerufene Sch{\"a}digung zu reduzieren. Die positiven Ergebnisse dieser Arbeit k{\"o}nnten einen ersten Hinweis auf eine m{\"o}gliche pharmakologische Intervention bei Hyperinsulin{\"a}mie mit dem Ziel der Senkung des erh{\"o}hten Krebsrisikos geben. Eine wichtige Erkenntnis aus den Ergebnissen meiner Arbeit ist, dass die Reduzierung des oxidativen Stresses eine Reduzierung der Genomsch{\"a}digung bewirkt. Die genutzten Substanzen Apocynin, Tempol, VAS2870 und Rotenone bewirkten in HT29 Zellen eine signifikante Reduzierung des durch Insulin ausgel{\"o}sten oxidativen Stresses. Um aber genauere Aussagen {\"u}ber M{\"o}glichkeiten der Therapie bei Hyperinsulin{\"a}mie zu treffen, sollten Folgestudien auch in vivo folgen, welche die in dieser Arbeit beschriebenen Effekte best{\"a}tigen.}, subject = {Insulin}, language = {de} } @article{IlinKulmanovNersesyanetal.2015, author = {Ilin, Alexander and Kulmanov, Murat and Nersesyan, Armen and Stopper, Helga}, title = {Genotoxic activity of the new pharmaceutical FS-1 in Salmonella/microsome test and mouse lymphoma L5178Y cells}, series = {Journal of BUON}, volume = {20}, journal = {Journal of BUON}, number = {2}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-143769}, pages = {595-601}, year = {2015}, abstract = {Purpose: The purpose of this study was to determine possible genotoxic effects of a new very promising antibacterial/ antiviral drug FS-1. Methods: The drug was tested in TA98, TA100, TA102, TA 1535 and TA1537 strains of Salmonella (Ames test) with and without metabolic activation, and also in mouse lymphoma L5178Y cells by means of micronucleus and comet assays. In microbes the drug was tested at concentrations up to 500 \(\mu\)g/plate and in mouse lymphoma cells up to 2,000 \(\mu\)g/ml. Results: In both test-systems in all experiments completely negative results were obtained although FS-1 was tested at maximum tolerated doses. Conclusions: The drug is not genotoxic. This is advantageous because many antibacterial/antiviral drugs possess such activity.}, language = {en} } @article{DekantBridges2016, author = {Dekant, Wolfgang and Bridges, James}, title = {Assessment of reproductive and developmental effects of DINP, DnHP and DCHP using quantitative weight of evidence}, series = {Regulatory Toxicology and Pharmacology}, volume = {81}, journal = {Regulatory Toxicology and Pharmacology}, doi = {10.1016/j.yrtph.2016.09.032}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-186750}, pages = {397-406}, year = {2016}, abstract = {Quantitative weight of evidence (QWoE) methodology utilizes detailed scoring sheets to assess the quality/reliability of each publication on toxicity of a chemical and gives numerical scores for quality and observed toxicity. This QWoE-methodology was applied to the reproductive toxicity data on diisononylphthalate (DINP), di-n-hexylphthalate (DnHP), and dicyclohexylphthalate (DCHP) to determine if the scientific evidence for adverse effects meets the requirements for classification as reproductive toxicants. The scores for DINP were compared to those when applying the methodology DCHP and DnHP that have harmonized classifications. Based on the quality/reliability scores, application of the QWoE shows that the three databases are of similar quality; but effect scores differ widely. Application of QWoE to DINP studies resulted in an overall score well below the benchmark required to trigger classification. For DCHP, the QWoE also results in low scores. The high scores from the application of the QWoE methodology to the toxicological data for DnHP represent clear evidence for adverse effects and justify a classification of DnHP as category 1B for both development and fertility. The conclusions on classification based on the QWoE are well supported using a narrative assessment of consistency and biological plausibility.}, language = {en} } @article{ArimanyNardiMinuesaPastorAngladaetal.2016, author = {Arimany-Nardi, Cristina and Minuesa, Gerard and Pastor-Anglada, Mar{\c{c}}al and Keller, Thorsten and Erkizia, Itziar and Koepsell, Hermann and Martinez-Picado, Javier}, title = {Role of Human Organic Cation Transporter 1 (hOCT1) Polymorphisms in Lamivudine (3TC) Uptake and Drug-Drug Interactions}, series = {Frontiers in Pharmacology}, volume = {7}, journal = {Frontiers in Pharmacology}, number = {175}, doi = {10.3389/fphar.2016.00175}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-165236}, year = {2016}, abstract = {Lamivudine (3TC), a drug used in the treatment of HIV infection, needs to cross the plasma membrane to exert its therapeutic action. Human Organic cation transporter 1 (hOCT1), encoded by the SLC22A1 gene, is the transporter responsible for its uptake into target cells. As SLC22A1 is a highly polymorphic gene, the aim of this study was to determine how SNPs in the OCT1-encoding gene affected 3TC internalization and its interaction with other co-administered drugs. HEK293 cells stably transfected with either the wild type form or the polymorphic variants of hOCT1 were used to perform kinetic and drug-drug interaction studies. Protein co-immunoprecipitation was used to assess the impact of selected polymorphic cysteines on the oligomerization of the transporter. Results showed that 3TC transport efficiency was reduced in all polymorphic variants tested (R61C, C88R, S189L, M420del, and G465R). This was not caused by lack of oligomerization in case of variants located at the transporter extracellular loop (R61C and C88R). Drug-drug interaction measurements showed that co-administered drugs [abacavir (ABC), zidovudine (AZT), emtricitabine (FTC), tenofovir diproxil fumarate (TDF), efavirenz (EFV) and raltegravir (RAL)], differently inhibited 3TC uptake depending upon the polymorphic variant analyzed. These data highlight the need for accurate analysis of drug transporter polymorphic variants of clinical relevance, because polymorphisms can impact on substrate (3TC) translocation but even more importantly they can differentially affect drug-drug interactions at the transporter level.}, language = {en} } @article{ProppingLorenzMicheletal.2016, author = {Propping, Stefan and Lorenz, Kristina and Michel, Martin C. and Wirth, Manfred P. and Ravens, Ursula}, title = {beta-Adrenoceptor-mediated Relaxation of Urinary Bladder Muscle in beta 2-Adrenoceptor Knockout Mice}, series = {Frontiers in Pharmacology}, volume = {7}, journal = {Frontiers in Pharmacology}, number = {118}, doi = {10.3389/fphar.2016.00118}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-165245}, year = {2016}, abstract = {Background and Objective: In order to characterize the β-adrenoceptor (AR) subtypes involved in agonist-stimulated relaxation of murine urinary bladder we studied the effects of (-)-isoprenaline and CL 316,243 on tonic contraction and spontaneous contractions in detrusor strips of wild-type (WT) and β2-AR knockout (β2-AR KO) mice. Materials and Methods: Urinary bladders were isolated from male WT and β2-AR KO mice. β-AR subtype expression was determined with quantitative real-time PCR. Intact muscle strips pre-contracted with KCl (40 mM) were exposed to cumulatively increasing concentrations of (-)-isoprenaline or β3-AR agonist CL 316,243 in the presence and absence of the subtype-selective β-AR blockers CGP 20712A (β1-ARs), ICI 118,551 (β2-ARs), and L748,337 (β3-ARs). Results: Quantitative real-time PCR confirmed lack of β2-AR expression in bladder tissue from β2-AR KO mice. In isolated detrusor strips, pre-contraction with KCl increased basal tone and enhanced spontaneous activity significantly more in β2-AR KO than in WT. (-)-Isoprenaline relaxed tonic tension and attenuated spontaneous activity with similar potency, but the concentrations required were two orders of magnitude higher in β2-AR KO than WT. The concentration-response curves (CRCs) for relaxation were not affected by CGP 20712A (300 nM), but were shifted to the right by ICI 118,551 (50 nM) and L748,337 (10 μM). The -logEC50 values for (-)-isoprenaline in WT and β2-AR KO tissue were 7.98 and 6.00, respectively, suggesting a large receptor reserve of β2-AR. (-)-CL 316,243 relaxed detrusor and attenuated spontaneous contractions from WT and β2-AR KO mice with a potency corresponding to the drug's affinity for β3-AR. L743,337 shifted the CRCs to the right. Conclusion: Our findings in β2-AR KO mice suggest that there is a large receptor reserve for β2-AR in WT mice so that this β-AR subtype will mediate relaxation of tone and attenuation of spontaneous activity under physiological conditions. Nevertheless, upon removal of this reserve, β3-AR can also mediate murine detrusor relaxation.}, language = {en} } @article{BankogluTschoppSchmittetal.2016, author = {Bankoglu, Ezgi Eyluel and Tschopp, Oliver and Schmitt, Johannes and Burkard, Philipp and Jahn, Daniel and Geier, Andreas and Stopper, Helga}, title = {Role of PTEN in Oxidative Stress and DNA Damage in the Liver of Whole-Body Pten Haplodeficient Mice}, series = {PLoS One}, volume = {11}, journal = {PLoS One}, number = {11}, doi = {10.1371/journal.pone.0166956}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-146970}, pages = {e0166956}, year = {2016}, abstract = {Type 2 diabetes (T2DM) and obesity are frequently associated with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and with an elevated cancer incidence. The molecular mechanisms of carcinogenesis in this context are only partially understood. High blood insulin levels are typical in early T2DM and excessive insulin can cause elevated reactive oxygen species (ROS) production and genomic instability. ROS are important for various cellular functions in signaling and host defense. However, elevated ROS formation is thought to be involved in cancer induction. In the molecular events from insulin receptor binding to genomic damage, some signaling steps have been identified, pointing at the PI3K/AKT pathway. For further elucidation Phosphatase and Tensin homolog (Pten), a tumour suppressor phosphatase that plays a role in insulin signaling by negative regulation of PI3K/AKT and its downstream targets, was investigated here. Dihydroethidium (DHE) staining was used to detect ROS formation in immortalized human hepatocytes. Comet assay and micronucleus test were performed to investigate genomic damage in vitro. In liver samples, DHE staining and western blot detection of HSP70 and HO-1 were performed to evaluate oxidative stress response. DNA double strand breaks (DSBs) were detected by immunohistostaining. Inhibition of PTEN with the pharmacologic inhibitor VO-OHpic resulted in increased ROS production and genomic damage in a liver cell line. Knockdown of Pten in a mouse model yielded increased oxidative stress levels, detected by ROS levels and expression of the two stress-proteins HSP70 and HO-1 and elevated genomic damage in the liver, which was significant in mice fed with a high fat diet. We conclude that PTEN is involved in oxidative stress and genomic damage induction in vitro and that this may also explain the in vivo observations. This further supports the hypothesis that the PI3K/AKT pathway is responsible for damaging effects of high levels of insulin.}, language = {en} }