@phdthesis{Roman2006, author = {Roman, Adriana}, title = {Erh{\"o}hung des Genomschadens in der humanen Brustkrebszelllinie MCF-7 durch die Induktion vermehrter Zellproliferation}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23501}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Die karzinogene Aktivit{\"a}t von {\"O}stradiol wurde bereits in mehreren Studien nachgewiesen und scheint das Ergebnis einer Kombination von hormonellen und genotoxischen Mechanismen zu sein. In der vorliegenden Arbeit konnte ein weiterer Mechanismus der Induktion chromosomaler Sch{\"a}den durch {\"O}stradiol festgestellt werden. Es kam in der {\"o}strogenrezeptorpositiven Zelllinie MCF-7 zu einer konzentrationsabh{\"a}ngigen Steigerung der Zellproliferation und Mikrokernsteigerung, als Maß f{\"u}r die chromosomale Sch{\"a}digung. In der {\"o}strogenrezeptornegativen Zelllinie MDA-MB231 konnte weder einer Steigerung der Zellproliferation, noch eine vermehrte Mikrokerninduktion nachgewiesen werden. Die Vermutung ist, dass die Zellen, durch den Proliferationsdruck den Zellteilungszyklus schneller durchlaufen und infolgedessen vermehrt Fehler im Replikationsablauf entstehen k{\"o}nnen. Zudem k{\"o}nnen wichtige Reparaturmechanismen oder Zellzykluskontrollpunkte nicht mehr ad{\"a}quat agieren.}, language = {de} } @phdthesis{Brink2007, author = {Brink, Andreas}, title = {The biological significance of chemically-induced DNA adducts in relation to background DNA damage}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23850}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {No abstract available}, subject = {DNS-Sch{\"a}digung}, language = {en} } @phdthesis{Simon2006, author = {Simon, Karoline}, title = {Development and Evaluation of a Generic HPLC-Tandem MS Screening Method for the Detection of Potential Biomarkers for Reactive Intermediates}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21916}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Conjugation of reactive intermediates of drugs with proteins or DNA may result in toxic effects such as hepatotoxicity, agranulocytosis, allergies, tumors, etc. From 1975 to 1999, 2.9\% of drugs were withdrawn from the market due to such severe adverse drug reactions. Thus, formation of chemically reactive intermediates is a widely discussed problem in drug development processes. Early detection of potentially toxic compounds is required for drug discovery and drug development. Conjugation of such electrophilic compounds with glutathione (GSH) is one of the most important detoxifying reactions in vivo. Processing of these GSH-conjugates ultimately leads to the formation of renally cleared mercapturic acids, which may also be oxidized to sulfoxides. Thus, mercapturic acids may be generated and detected in vitro and non-invasively in vivo in urine to assess the reactivity of a compound in early stages of drug development processes. Therefore, the aim of this work was to develop and evaluate a HPLC-MS/MS screening method for simple and rapid detection and characterization of known and unknown mercapturic acids and application of the method to several different matrices. Based on the common constant neutral loss (CNL) of 129 Da of all mercapturic acids tested (in negative ion mode), a CNL survey scan was performed using a linear ion trap instrument and was combined with two enhanced product ion (EPI) scans with different collision energies to characterize the detected signals. The CNL resulted from the cleavage between the sulfur and the carbon atom in the N-acetyl-L-cysteine moiety. After optimization of the experimental parameters, the detection limits of the reference substances in rat urine ranged from 0.3 to 15.5 pmol on column (i.e. 20 ng/ml to 800 ng/ml). For in vitro evaluation of the method, the model compounds acetaminophen, diclofenac, bifonazole, clozapine, troglitazone, carbamazepine, and bisphenol A were screened for formation of reactive intermediates and, hence, detection of the corresponding mercapturic acids. To determine possible species- and tissue-specific toxicities, the model compounds were incubated with stimulated neutrophils and with liver microsomes from rats and humans. Species-specific differences were observed in incubations of acetaminophen and diclofenac with rat and human hepatic microsomes. Tissue-specific differences in biotransformation of the model compounds in incubations with human neutrophils and human liver microsomes were observed for diclofenac, carbamazepine, clozapine, and bifonazole. The developed HPLC-MS/MS method was also evaluated in vivo by analysis of rat and human urine. Drug-related mercapturic acids were detected in urine of rats orally treated with acetaminophen (20 mg/kg and 640 mg/kg b.w.) or diclofenac (10 mg/kg and 20 mg/kg b.w.). Human urine samples were analyzed before and after oral administration of a clinically used dose of 500 mg and 50 mg of acetaminophen. Besides detection of the mercapturic acid of N-acetylbenzoquinoneimine (AAP-MA), a second mercapturic acid with m/z 327 occurred dose-dependently in rat and human urine samples after administration of acetaminophen. Further investigations on identification of this metabolite using authentic compounds and comparing their MS/MS mass spectra demonstrated oxidation of AAP-MA to stereoisomeric sulfoxides in vivo. For diclofenac, a novel mercapturic acid with m/z 441 was detected in rat urine samples that was identical to a metabolite obtained in incubations with human neutrophils before. The in vivo formation of this diclofenac metabolite is described here for the first time. In addition, three endogenously formed mercapturic acids were detected and identified. In conclusion, the results of the in vitro and in vivo evaluation demonstrate the advantages of the rapid and generic HPLC-MS/MS screening method for the detection of mercapturic acids, that can be obtained with a minimum of sample preparation and a high throughput in diverse matrices.}, subject = {Acetylcysteinderivate}, language = {en} } @phdthesis{Nickel2008, author = {Nickel, Florian}, title = {UCP2 und DIPP2alpha als differentiell exprimierte Kandidatengene in einem murinen Modell der Herzinsuffizienz}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-34502}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Die Herzinsuffizienz ist eine der f{\"u}hrenden Todesursachen weltweit. Eine auf die neurohumorale Aktivierung zugeschnittene Therapie mit ACE-Hemmern bzw. Angiotensin-Rezeptorantagonisten, Betablockern, Aldosteronantagonisten und Diuretika verbessert zwar die Symptomatik und Prognose. Letztere ist bei Diagnosestellung jedoch immer noch schlechter als die vieler maligner Erkrankungen einzusch{\"a}tzen. Ziel ist daher die Entwicklung von Medikamenten, die den Krankheitsverlauf des Syndroms Herzinsuffizienz aufhalten bzw. umkehren. Ein Ansatz ist dabei die Analyse sogenannter Kandidatengene, die im kranken Herzen differentiell exprimiert werden und potentiell medikament{\"o}s beeinflussbar sind. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei solcher Kandidatengene charakterisiert. M{\"a}use mit kardialer {\"U}berexpression b1-adrenerger Rezeptoren entwickeln eine Herzinsuffizienz mit kardialer Hypertrophie und Fibrose. In Gen Arrays mit 21000 Maus-ESTs zeigten sich unter anderem die Gene des Uncoupling Protein 2 (UCP2) und der Diphosphoinositol-Polyphosphat-Phosphohydrolase 2 alpha (DIPP2a) aktiviert. Diese Befunde wurden zun{\"a}chst mittels RNase Protection Assay und RT-PCR best{\"a}tigt. Auch andere murine Herzinsuffizienzmodelle wurden untersucht. So ließ sich ebenfalls im druckinduzierten Herzinsuffizienzmodell nach artifizieller Aortenstenose sowie im b2-AR {\"u}berexprimierenden Herzen eine erh{\"o}hte Konzentration von UCP2- und DIPP2a-mRNA messen. Um zu pr{\"u}fen, ob diese differentielle mRNA-Expression delet{\"a}re oder protektive Effekte vermittelt, wurden jeweils transgene Mauslinien mit herzspezifischer {\"U}berexpression von UCP2 und DIPP2a generiert. Die Linie UCP2-TG1 mit hoher {\"U}berexpression sowie ein Gr{\"u}nder-Tier der UCP2-transgenen M{\"a}use entwickelten eine Herzinsuffizienz mit vergr{\"o}ßertem Herzen, linksventrikul{\"a}rem Pumpversagen, interstitieller Fibrose und typischen Ver{\"a}nderungen der molekularen Marker ANF und SERCA. Zudem fanden sich dilatierte Vorh{\"o}fe sowie eine bradykarde Herzrhythmusst{\"o}rung. UCP2 ist ein Entkoppler der oxidativen Phosphorylierung im Mitochondrium. Im energieintensiven Stoffwechsel des Myokards k{\"o}nnte eine durch UCP2 reduzierte ATP-Synthese zu den genannten Ver{\"a}nderungen f{\"u}hren. F{\"u}r UCP2 wurden auch protektive Eigenschaften durch das Abfangen freier Radikale beschrieben. Die Linie UCP2-TG3 mit niedrigerem {\"U}berexpressionsniveau und ohne kardialen Ph{\"a}notyp wurde deshalb einem Aortic banding unterzogen, wo sich in der {\"U}berlebenskurve kein protektiver oder delet{\"a}rer Effekt einer moderat vermehrten Entkopplung im Vergleich zum Wildtyp zeigte. In drei unabh{\"a}ngigen Linien transgener M{\"a}use mit herzspezifischer {\"U}berexpression von DIPP2a ließ sich morphometrisch eine kardiale Hypertrophie nachweisen. Die Linie DIPP2a-TG9 mit dem h{\"o}chsten {\"U}berexpressionsniveau zeigte zudem eine kardiale Fibrose sowie unter Dobutamin eine verminderte kardiale Kontraktilit{\"a}tsreserve im Vergleich zum Wildtypen. DIPP-Proteine hydrolysieren Inositolphosphate und Nukleosiddiphosphate und greifen so in zentrale Stoffwechselvorg{\"a}nge ein, die im einzelnen noch nicht gekl{\"a}rt sind. Es konnte hier im Mausmodell gezeigt werden, dass UCP2 und DIPP2a zwei f{\"u}r die Entwicklung einer Herzinsuffizienz relevante Zielproteine darstellen. Geplant ist die weitere Aufkl{\"a}rung der beteiligten Mechanismen, um diese letztlich auch therapeutisch beeinflussen zu k{\"o}nnen.}, subject = {UCP2-Protein}, language = {de} } @phdthesis{Wagner2008, author = {Wagner, Silvia}, title = {Identifizierung von Biomarkern mittels LC-MS-basiertem Metabonomics - Merkapturs{\"a}uren als Indikatoren f{\"u}r die Bildung toxischer Intermediate}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35760}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Metabonomics bildet das Ende der Omics-Kaskade und stellt eine top-down-Strategie zur Erfassung und Interpretation des Metaboloms, d. h. der Gesamtheit aller niedermolekularen Metaboliten in einem intakten Organismus, dar. Ziel der Technik ist es, mittels geeigneter ungerichteter Screeningverfahren in nicht-invasiv zu gewinnenden biologischen Proben wie Urin oder Blut charakteristische Metabolitenprofile zu bestimmen. Im Kontext des Metabonomics wurde in Anlehnung an den Geno- bzw. Ph{\"a}notyp hierf{\"u}r der Begriff „Metabotyp" gepr{\"a}gt. Durch biostatistische Methoden, die auf Mustererkennung (pattern recognition) basieren, k{\"o}nnen Signaturen gegen{\"u}bergestellt und auf diesem Weg gruppenspezifische Metaboliten, d. h. Biomarker bzw. Metabolitenmuster, extrahiert werden. Metabonomics kann folglich als Fusion klassischer bioanalytischer und biostatistischer Verfahren aufgefasst werden. Seit der Einf{\"u}hrung im Jahr 1999 hat sich das Konzept des Metabonomics in mehrere Richtungen weiterentwickelt. So gab es Bestrebungen, die Technik, die urspr{\"u}nglich zur Pr{\"a}diktion von toxischen Effekten bei der Arzneistoffentwicklung etabliert wurde, auf Fragestellungen zu {\"u}bertragen, die den Menschen im Mittelpunkt haben. Neben pr{\"a}klinischen Anwendungen verfolgt man mit Metabonomics zunehmend das Ziel, einer personalisierten Medizin und Ern{\"a}hrung einen Schritt n{\"a}her zu kommen. Da sich die urspr{\"u}nglich eingesetzte NMR-Technik als zu unempfindlich und die resultierenden Metabolitenprofile als zu anf{\"a}llig gegen{\"u}ber biologischen und analytischen Einflussgr{\"o}ßen (Confoundern) erwiesen haben, wurde parallel auf sensitivere Verfahren wie die Massenspektrometrie gesetzt. Insbesondere die Kopplung mit der Hochdruckfl{\"u}ssigchromatographie erwies sich hierbei f{\"u}r das Metabolitenscreening als geeignet. Schnell wurde allerdings klar, dass aus den klassischen full scan/TOF-Methoden Datens{\"a}tze resultierten, die h{\"a}ufig zu komplex waren, um mit nachgeschalteten chemometrischen Verfahren die „Spreu vom Weizen trennen" zu k{\"o}nnen. Da sich Metabolitendatenbanken bisher noch im Aufbau befinden, ist die Identifizierung der Marker mit zus{\"a}tzlichen Schwierigkeiten verbunden und bedarf aufw{\"a}ndiger analytischer Verfahren. Eine Strategie stellt daher die Beschr{\"a}nkung auf ein Metabolitensubset dar. Indem man sich auf Metabolitenklassen fokussiert, die einen Bezug zum untersuchten Mechanismus haben, k{\"o}nnen die Erfolgsaussichten bei der Identifizierung charakteristischer Biomarker deutlich erh{\"o}ht werden. Aufgrund zahlreicher exogener und endogener Faktoren (Arzneistoffe, Industriechemikalien, Nahrungsbestandteile, Tabakrauchbestandteile, Produkte der Lipidperoxidation etc.) ist der menschliche Organismus stets einer Vielzahl an elektrophilen Verbindungen ausgesetzt. Oxidative Sch{\"a}digungen an Strukturen wie der DNA, Proteinen und Lipiden werden mit einer Reihe von Krankheitsbildern in Zusammenhang gebracht, darunter Parkinson, Alzheimer, Krebs und Volkskrankheiten wie Arteriosklerose, Allergien und koronare Herzerkrankungen. Mit dem Glutathionsystem verf{\"u}gt der K{\"o}rper {\"u}ber einen wirksamen Detoxifizierungsmechanismus. Das Tripeptid Glutathion reagiert als Nukleophil mit den exogen oder endogen gebildeten elektrophilen Intermediaten. Endprodukte sind Merkapturs{\"a}uren (N-Acetyl-L-Cystein-Addukte) bzw. deren Sulfoxide, die in erster Linie mit dem Urin ausgeschieden werden. Folglich besteht zwischen diesen Merkapturs{\"a}urederivaten und der elektrophilen Belastung eines Organismus ein direkter Zusammenhang. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der Arbeit, einen nicht-invasiven Metabonomicsansatz zur Anwendung am Menschen zu entwickeln. Durch die Fokussierung des Metabolitenscreenings auf die Effekt-, Dosis- und Suszeptibilit{\"a}tsmarkerklasse der Merkapturs{\"a}uren sollten hierbei die Erfolgsaussichten im Hinblick auf die Identifizierung potentieller Biomarker f{\"u}r diverse toxikologische sowie medizinische Endpunkte erh{\"o}ht werden.}, subject = {Metabolom}, language = {de} } @phdthesis{Treutlein2009, author = {Treutlein, Anna-Teresa}, title = {Genomprotektive Wirkung der Vitamine Fols{\"a}ure und Vitamin B12 in Dialysepatienten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-36028}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Bei Dialysepatienten sind vermehrte Genomsch{\"a}den bekannt, sie unterliegen auch einer erh{\"o}hten Karzinominzidenz. Erh{\"o}hte Genomsch{\"a}den k{\"o}nnen in vivo durch die Substitution von Fols{\"a}ure reduziert werden, unter Gabe von Vitamin B12 sinkt die Empfindlichkeit gegen{\"u}ber genotoxischen Agentien. 27 Dialysepatienten nahmen an dieser Studie teil. Die 9 Patienten der Substitutions-gruppe Fols{\"a}ure erhielten dreimal w{\"o}chentlich 15 mg Fols{\"a}ure intraven{\"o}s, den 10 Patienten der Substitutionsgruppe Fols{\"a}ure + Vitamin B12 wurde zus{\"a}tzlich einmal w{\"o}chentlich 1000 µg Vitamin B12 intraven{\"o}s verabreicht. 8 Dialysepatienten und 7 nicht dialysepflichtige Probanden dienten als Kontrolle. Zu drei Zeitpunkten vor und drei Zeitpunkten nach Substitutionsbeginn wurden die Mikrokernfrequenzen in peripheren, doppelkernigen Lymphozyten bestimmt. Mikro-kerne dienen als Marker f{\"u}r Genomsch{\"a}den, die Methode ist gut erprobt und es ist ein Zusammenhang zwischen erh{\"o}hten Mikrokernfrequenzen und einer prospektiv erh{\"o}hten Karzinominzidenz beschrieben. Weiterhin wurden die Homocystein-Plasmaspiegel vor und nach Substitutionsbeginn gemessen. Homocystein z{\"a}hlt zu den Ur{\"a}mietoxinen, in vitro steigt bei erh{\"o}hten Homocysteinwerten dosisabh{\"a}ngig der Genomschaden in Form von Mikrokernen an. Vor Substitutionsbeginn wiesen die Dialysepatienten um ein mehrfaches gegen{\"u}ber den Referenzwerten erh{\"o}hte Mikrokernfrequenzen auf, wobei die Mikrokernfrequenzen der Frauen deutlich {\"u}ber denen der M{\"a}nner lagen. Mit zunehmender Dialysedauer kam es zu einer Reduktion der Mikrokernfrequenz, wobei diese immer noch gegen{\"u}ber den Referenzwerten erh{\"o}ht blieb. Unter Gabe von Fols{\"a}ure + Vitamin B12 kam es zu einem signifikant st{\"a}rkeren R{\"u}ckgang der Mikrokernfrequenz als unter alleiniger Fols{\"a}uregabe. Dieser R{\"u}ckgang unter Vitaminsubstitution nahm mit zunehmendem Dialysealter zun{\"a}chst zu, bei einer Dialysedauer von l{\"a}nger als 10 Jahren nahm er wieder ab. Die Homocysteinspiegel waren vor Substitutionsbeginn deutlich erh{\"o}ht. Unter kombinierter Gabe von Fols{\"a}ure und Vitamin B12 kam es zu einer signifikanten Reduktion der Homocysteinwerte, so dass diese sogar unterhalb der im Normbereich liegenden Homocysteinwerte der nicht dialysepflichtigen Kontrollgruppe lagen. Ob die in der Studie vielversprechende kombinierte Substitution von Fols{\"a}ure und Vitamin B12 tats{\"a}chlich das Krebsrisiko von Dialysepatienten beeinflussen kann, wird nur durch prospektive Langzeitstudien zu kl{\"a}ren sein. Ebenfalls werden weitere Studien n{\"o}tig sein, um die optimale Dosis, welche m{\"o}glicherweise in Abh{\"a}ngigkeit von Alter, Geschlecht, Dialysedauer und Grunderkrankung variieren kann, zu ermitteln. Weitere Vorteile einer therapeutischen Gabe von Fols{\"a}ure und Vitamin B12 liegen sicherlich einerseits in den vergleichsweise geringen Kosten und andererseits in der guten Vertr{\"a}glichkeit, welche f{\"u}r die Compliance der Patienten von großer Bedeutung ist.}, subject = {Fols{\"a}ure}, language = {de} } @phdthesis{Bermel2006, author = {Bermel, Christina Maria}, title = {Regulation von G-beta-gamma-Untereinheiten durch Phosducin-{\"a}hnliche Proteine (PhLP)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19981}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Phosducin-like protein (PhLP) geh{\"o}rt zur Phosducinfamilie der G-Protein-betagamma-Regulatoren und kommt in zwei Spleißvarianten vor. Die lange Isoform PhLPlong und die kurze Isoform PhLPshort unterscheiden sich allein durch das Vorhandensein des 81 Aminos{\"a}uren langen N-Terminus von PhLPlong. In Versuchen mit gereinigten Proteinen erwies sich PhLPlong als der st{\"a}rkere Gbetagamma-Inhibitor, w{\"a}hrend die Bedeutung von PhLPshort nicht bekannt war. In dieser Arbeit wird gezeigt, daß in transfizierten HEK 293-Zellen PhLPshort die Gbetagamma-vermittelte Signalbildung 20mal st{\"a}rker hemmt als PhLPlong. Da der zus{\"a}tzliche N-Terminus von PhLPlong mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen f{\"u}r die konstitutiv aktive Caseinkinase 2 besitzt, wurde angenommen, daß die lange Spleißvariante in Zellen einer solchen Regulation unterliegt, was sich auf seine Funktion als Gbetagamma-Inhibitor auswirkt. Durch schrittweise Trunkierungen bzw. Serin-/Threonin-Alaninmutationen wurden die potentiellen Phosphorylierungsstellen entfernt, was zur Verbesserung der Gbetagamma-Hemmf{\"a}higkeit f{\"u}hrte. Der N-terminale Aminos{\"a}urenabschnitt Ser-18/Thr-19/Ser-20 wurde dabei als die verantwortliche Stelle identifiziert. In unserer Arbeitsgruppe wurde gezeigt, daß PhLPlong in HEK 293-Zellen im Gegensatz zu PhLPshort einer konstitutiven Phosphorylierung unterliegt und durch die Caseinkinase2 katalysiert wird. In dieser Arbeit werden die Phosphorylierung von PhLPlong durch die Caseinkinase2 anhand von rekombinanten Proteinen sowie ihre Kinetik dargestellt. Das Vorhandensein von mRNA der Caseinkinase2 in HEK 293-Zellen zeigt, daß sie in der Zelle exprimiert und somit aktiv ist, was ihre physiologische Bedeutung herausstellt. Eine direkte Gbetagamma-Bindung konnte durch Immunpr{\"a}zipitation nur f{\"u}r PhLPlong nachgewiesen werden, weswegen f{\"u}r PhLPshort ein alternativer Mechanismus der Gbetagamma-Hemmung angenommen wurde, was in folgenden Arbeiten n{\"a}her untersucht wurde.}, language = {de} } @phdthesis{Behr2006, author = {Behr, Bj{\"o}rn}, title = {Neue Mutanten des humanen beta1-adrenergen Rezeptors zeigen f{\"u}r die Rezeptoraktivierung relevante Aminos{\"a}uren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19074}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Eine durch Aktivierung eines G-Protein gekoppelten Rezeptors induzierte Konfirmations{\"a}nderung resultiert in einer Signaltransduktion durch das G-Protein zu einem Effektorenzym wie der Adenylylcyclase. In dieser Arbeit konnten Aminos{\"a}uren in dem zur G-Protein gekoppelten Rezeptorfamilie zugeh{\"o}rigen beta1-adrenergen Rezeptor identifiziert werden, welche f{\"u}r dessen Aktivierung von Bedeutung sind. Der Analyse von beta1-adrenergen Rezeptormutanten lag die Erkenntnis zu Grunde, dass therapeutisch genutzte Liganden wie Terbutalin, oder das experimentell eingesetzte Broxaterol Agonisten am beta2- und beta3-adrenergen Rezeptor, jedoch Antagonisten am beta1-adrenergen Rezeptor sind. Dieses Verhalten wurde zum Anlass genommen spezifische Aminos{\"a}uren zu identifizieren, welche eine bedeutende Funktion in der Aktivierung von beta -Rezeptorsubtypen haben k{\"o}nnten. Nach einem Aminos{\"a}urevergleich innerhalb der Familie der beta-adrenergen Rezeptoren konnten Aminos{\"a}urepositionen identifiziert werden, die identisch im beta2- bzw. beta3-Rezeptor sind und sich von denen des beta1- Rezeptors unterscheiden und damit das Aktivierungsprofil von Broxaterol und Terbutalin widerspiegeln. Mit zielgerichteten Punktmutationen wurden nun insbesondere im Bereich der Transmembranregionen solche Aminos{\"a}uren im beta1-adrenergen Rezeptor durch die entsprechende des beta2- (beta3-) Rezeptors ersetzt. Obwohl keine der getesteten Mutanten Unterschiede im pharmakologischen Bindungsprofil zeigten, konnten vier Mutanten gefunden werden, welche partiell oder vollst{\"a}ndig durch Broxaterol oder Terbutalin aktiviert wurden. Die beiden Mutanten I185L sowie D212N konnten mit Broxaterol und Terbutalin aktiviert werden, zwei Liganden, die Antagonisten am beta1- Wildtyprezeptor sind. Außerdem konnten zwei weitere Mutanten, V120L und K253R, durch Terbutalin aktiviert werden. Betrachtet man die Struktur von Terbutalin, so ist dieser Ligand den endogenen Katecholaminen {\"a}hnlicher als Broxaterol. Ein Rezeptormodell zeigt, dass die vier relevanten Aminos{\"a}uren außerhalb der Ligandenbindungsregion liegen und somit eine direkte Interaktion mit dem Liganden unwahrscheinlich erscheint. Diese These wird durch das im Vergleich zum Wildtyp nicht ver{\"a}nderte Bindungsprofil der beta1-Rezeptormutanten unterst{\"u}tzt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Aminos{\"a}uren V120, I185, D212 und K253 in der ligandeninduzierten Konfirmations{\"a}nderung des beta1-Rezeptors von Bedeutung sind.}, language = {de} } @phdthesis{Klenk2006, author = {Klenk, Johann Christoph}, title = {Posttranslationale Modifikation von Phosducin durch den small ubiquitin-related modifier "SUMO"}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19140}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Die Rezeptor vermittelte Aktivierung heterotrimerer G-Proteine ist einer der bedeutendsten Signaltransduktionsmechanismen in vielen Organismen. Die Vielzahl unterschiedlicher Rezeptoren und Agonisten macht eine effektive Kontrolle des einzelnen Signals unumg{\"a}nglich. Das zytosolische Protein Phosducin bindet beta-gamma-Untereinheiten aktivierter G-Proteine und hemmt damit sowohl Gbeta-gamma-vermittelte Effekte als auch Galpha-vermittelte Effekte. In der vorliegenden Arbeit wurde neben der bekannten 33 kDa Form von Phosducin eine weitere 47 kDa große Form in der Retina und im Herz identifiziert. Hierbei handelte es sich um Phosducin, welches mit dem small ubiquitin-related modifier, SUMO, modifiziert war. Weiterhin wurde sowohl in vitro als auch in zellul{\"a}ren Sytemen gezeigt, dass Phosducin mit einem Molek{\"u}l SUMO an Lysin 33 modifiziert wird. Durch punktgerichtete Mutation dieser Modifikationsstelle wurde eine SUMOylierungs-defiziente Phosducin-Mutante generiert. Diese Mutante unterliegt einem gesteigerten Turnover im Vergleich zu Wildtyp-Phosducin, welcher auf die verst{\"a}rke Ubiquitinierung und dem damit verbundenen proteasomalen Abbau der Mutante zur{\"u}ckzuf{\"u}hren war. Dies demonstriert, dass SUMOylierung von Phosducin protektive Wirkung auf dieses Protein hat. Dar{\"u}berhinaus behindert die SUMOylierung von Phosducin dessen Bindung an Gbeta-gamma-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine. Diese Beobachtungen erlauben den Schluss, dass SUMOylierung neben der Phosphorylierung ein neuer und wichtiger Mechanismus ist, {\"u}ber den die Verf{\"u}gbarkeit von Phosducin als G-Protein-Regulator kontrolliert wird.}, language = {de} } @phdthesis{Winkler2007, author = {Winkler, Michaela}, title = {Einfluss einer fortgesetzten Benfotiamintherapie auf die Konzentration zirkulierender Advanced Glycation Endproducts, proinflammatorischer Zytokine und DNA-L{\"a}sionen bei H{\"a}modialysepatienten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27563}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Der Einsatz der Vitamin B 1 Vorstufe Benfotiamin hat sich im Tiermodell durch Verhinderung oder gar Aufhebung typischer diabetischer Folgesch{\"a}den wie Ne- phropathie, Retinopathie und Neuropathie ausgezeichnet. Diese Wirkung wird unter anderem der Aktivit{\"a}tssteigerung des Enzyms Transketolase zugeschrie- ben, welches auch bei Dialysepatienten ohne diabetische Grunderkrankung sup- primiert ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Auswirkungen einer ora- len Benfotiaminsubstitution auf den Stoffwechsel von Langzeith{\"a}modialysepati- enten zu untersuchen. Die 15 rekrutierten Patienten mit und ohne Diabetes mel- litus erhielten {\"u}ber einen Zeitraum von 2 Monaten eine Dosis von 300 mg/d Benfotiamin, die in den folgenden 2 Monaten bis maximal 450 mg/d gesteigert wurde. Um einen Eindruck {\"u}ber den Verlauf der Entz{\"u}ndungssituation und des oxidativen Stresses zu gewinnen, wurden im Patientenvollblut AGEs und pro- inflammatorische Zytokine gemessen. Außerdem wurden peripheren Lympho- zyten mit Hilfe des alkaline Comet-Assay und des Mikrokerntestes auf DNA- Sch{\"a}digungen analysiert. In beiden Patientengruppen l{\"a}sst die Senkung der Mi- krokernraten den Schluss zu, dass Benfotiamin DNA-Sch{\"a}den und somit eventu- ell das Krebsrisiko reduziert. Dieses vielversprechende Ergebnis korreliert jedoch nicht mit dem Resultat des Comet-Assay. Da hier der relative DNA-Schaden ten- dentiell ansteigt, sollte es Ziel weiterer Studien sein, diesen Sachverhalt an ei- nem gr{\"o}ßeren Patientenkollektiv mit Kontrollgruppen zu {\"u}berpr{\"u}fen. Eventuell ist letzteres Testsystem wegen seiner hohen Sensitivit{\"a}t in diesem Fall nicht op- timal geeignet. Außerdem sollte gezielt auf die beobachtete schnellere und st{\"a}r- kere Mikrokernsenkung der diabetischen Patienten eingegangen werden, da die- se in der vorliegenden Studie zahlenm{\"a}ßig unterrepr{\"a}sentiert waren. Positiv zu bewerten ist der leichte CRP-Abfall sowie der Anstieg des Gesamtproteins und Albumin im Serum, was auf eine Reduktion der Mikroinflammation und oder eine verbesserte Ern{\"a}hrungssituation hinweist. Andererseits spricht der Anstieg des Neopterin- und Interleukin 6-Spiegels gegen die Ver{\"a}nderung des Inflamma- tionsstatus. Entgegen der Erwartung ließ sich in dieser Studie keine Reduktion der zirkulierenden AGEs und AOPPs im Serum erzielen. Um eine Reduktion des oxidativen Stresses besser beurteilen zu k{\"o}nnen, sollten in Folgestudien direkte und leicht ver{\"a}nderliche Marker wie der Glutathionspiegel verwendet werden. Zusammenfassend reduzierte Benfotiamin bei H{\"a}modialysepatienten mit und ohne Diabetes mellitus DNA-Sch{\"a}den in peripheren Lymphozyten bei unver- {\"a}nderter Inflammationssituation und steigerte die Plasmaproteinkonzentration. Dies wurde eventuell durch Reduktion von oxidativem Stress und oder Beein- flussung seiner Ursachen wie Reduktion von Ur{\"a}mietoxinen erreicht.Weitere kli- nische Studien sind notwendig, um dieses vielversprechende Medikament in der t{\"a}glichen Praxis einsetzen zu k{\"o}nnen. Besonders vorteilhaft ist seine gute Vertr{\"a}g- lichkeit auch in hoher Dosierung. Dar{\"u}ber hinaus soll das Pr{\"a}parat auch neuro- patische Schmerzen reduzieren, die sich bei Dialysepatienten h{\"a}ufig manifestie- ren, und wirkt somit multikausal.}, subject = {Benfotiamin}, language = {de} } @phdthesis{Kellert2008, author = {Kellert, Marco}, title = {Untersuchungen zum Metabolismus von Furan in Ratte und Maus, sowie zur Reaktivit{\"a}t und Gentoxizit{\"a}t von cis-2-Buten-1,4-dial in vitro und in Zellkultur}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28716}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Furan wird in einer Vielzahl von Speisen durch Hitzebehandlung gebildet und ist kanzerogen in der Leber von Ratte und Maus. Durch die hohe Fl{\"u}chtigkeit von Furan ist eine Expositionsabsch{\"a}tzung auf Basis der Kontamination von Lebensmitteln nur bedingt m{\"o}glich. Ein alternativer Ansatz dazu ist die Identifizierung von Furanmetaboliten als Expositions­biomarker. Nach der Aufnahme wird Furan zun{\"a}chst zum Dialdehyd cis-2-Buten-1,4-dial oxidiert. cis-2-Buten-1,4-dial besitzt mehrere elektrophile Strukturelemente, welche eine Reaktion mit Protein und DNS wahrscheinlich machen und damit zur bekannten Toxizit{\"a}t von Furan beitragen k{\"o}nnen. Es stellt sich in diesem Zusammenhang die Frage, ob eine Reaktion mit Protein die Reaktion mit der DNS verhindern kann und somit keine direkt gentoxischen Effekte auftreten. F{\"u}r ein kanzerogenes Agens ohne direkte gentoxische Wirkung kann eine Schwellendosis unterhalb derer kein DNS-Schaden auftritt diskutiert werden. F{\"u}r eine fundierte Risikobewertung bez{\"u}glich der Aufnahme von Furan {\"u}ber die Nahrung ist dies unabdingbar. In der vorliegenden Arbeit wurde nach der oralen Gabe von Furan im Urin von Fischer 344 Ratten nach Metaboliten gesucht. Eine Kontrollgruppe erhielt nur die Tr{\"a}gersubstanz {\"O}l. Das vor und nach Exposition {\"u}ber jeweils zwei 24 Stunden Perioden gesammelte Urin wurde mittels einer Tandemmassenspektrometrie-Methode analysiert. Die Methode bestand aus einem Full-Scan und einer dar{\"u}ber gesteuerten Aufzeichnung eines Fragmentionenspektrums. Die Full-Scan-Daten wurden mit Hilfe der Hauptkomponentenanalyse untersucht. In der ersten Sammelperiode nach der Behandlung konnten durch die erste Hauptkomponente die behandelten von den unbehandelten Tieren getrennt werden. Aus den f{\"u}r die Trennung relevanten Verbindungen konnten f{\"u}nf Biomarker strukturell aufgekl{\"a}rt werden. In einer weiteren Tierstudie an Ratten und M{\"a}usen wurde die Kinetik und die Dosis-Wirkungs-Beziehung der identifizierten Biomarker untersucht. Die gezielte LC-MS/MS-Analyse der Urine auf die identifizierten Biomarker hin zeigte, dass in der Ratte alle und in der Maus alle bis auf einen dosisabh{\"a}ngig anstiegen. Die Kinetik der Ausscheidung lieferte wertvolle Hinweise auf die Entstehung der Biomarker. Die Ausscheidung der Biomarker mit Lysinstruktur erfolgte {\"u}ber mehr als 72 Stunden. Dies war ein Hinweis auf eine Freisetzung aus Protein. Die Ausscheidung der restlichen Verbindungen erfolgte ausschließlich in den ersten 24 Stunden. Die in der Literatur vorhandenen Daten zur Gentoxizit{\"a}t von Furan und cis-Buten-1,4-dial sind unschl{\"u}ssig und unvollst{\"a}ndig. In der vorliegenden Arbeit wurde cis-2-Buten-1,4-dial im Ames Stamm TA104 und in L5178Y Mauslymphomzellen auf Mutagenit{\"a}t und Gentoxizit{\"a}t untersucht. Durch starke Zytotoxizit{\"a}t war der Konzentrationsbereich auf 4.5 µmol/Platte limitiert. Innerhalb dieses Bereich konnte mit der Vorinkubationsvariante des Ames-Tests keine Mutagenit{\"a}t beobachtet werden. Die L5178Y Mauslymphomzellen wurden mit Standardprotokollen f{\"u}r den Mikrokern-Test, Kometen-Test und den Thymidinkinase-Test untersucht. Der Konzentrationsbereich von cis-2-Buten-1,4-dial erstreckte sich bis 100 µM, konnte aber auf Grund der starken Zytotoxizit{\"a}t nur bis 25 µM ausgewertet werden. Dennoch konnte bereits in diesem Bereich ein 1.7- bzw. 2.2-facher Anstieg im Kometen- bzw. Thymidinkinase-Test beobachtet werden. Verglichen mit der Positivkontrolle Methylmethansulfonat hatte cis-2-Buten-1,4-dial bei einer deutlich h{\"o}heren Zytotoxizit{\"a}t eine {\"a}hnliche Potenz bez{\"u}glich der Mutagenit{\"a}t und Gentoxizit{\"a}t. Um das DNS-vernetzende Potential von cis-2-Buten-1,4-dial zu bestimmen wurde eine Variante des Kometen-Tests verwendet. Es wurde dabei untersucht, ob die Vorbehandlung von Zellen mit cis-2-Buten-1,4-dial die durch \&\#947;-Strahlung induzierbaren Kometen reduzieren kann. W{\"a}hrend die Positivkontrolle Glutaraldehyd die Kometen tats{\"a}chlich verringerte, blieb dieser Effekt bei cis-2-Buten-1,4-dial aus. Im Gegenteil, bei einer Konzentration von \&\#8805;100 mM konnte durch die Zunahme von Zellen mit beginnender Apoptose ein Anstieg der Kometen beobachtet werden. Obwohl cis-2-Buten-1,4-dial sehr deutliche gentoxische und mutagene Effekte zeigte, beschr{\"a}nkte die hohe Zytotoxizit{\"a}t den auswertbaren Bereich. M{\"o}glicherweise kann diese Problematik einen Teil der unschl{\"u}ssigen Ergebnisse erkl{\"a}ren, sicher ist jedoch, dass f{\"u}r die Untersuchung der Mechanismen der Toxizit{\"a}t und Kanzerogenit{\"a}t ein Beitrag von nicht gentoxischen Effekten diskutiert werden muss.}, subject = {Metabolismus}, language = {de} } @phdthesis{Triebel2008, author = {Triebel, Sven}, title = {Induktion einer dilatativen Kardiomyopathie am Modell der Lewis-Ratte durch Antik{\"o}rper gegen die zweite extrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne des humanen Beta1-adrenergen Rezeptors}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29580}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Vor etwas mehr als 20 Jahren wurden erstmals an das Myokard bindende beta1-Rezeptorantik{\"o}rper im Zusammenhang mit der Chagas-Krankheit beschrieben. Die Arbeiten der beiden folgenden Jahrzehnte konnten zeigen, dass solche beta1-Rezeptorantik{\"o}rper mit einer Pr{\"a}valenz von ca. 30 bis 95\% (in Abh{\"a}ngigkeit vom verwendeten Nachweisverfahren) v.a. auch bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie (DCM) nachgewiesen werden k{\"o}nnen. Insbesondere Antik{\"o}rper gegen die zweite extrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne des beta1-adrenergen Rezeptors (beta1-ECII) scheinen dabei in der Lage zu sein, den Rezeptor funktionell zu beeinflussen und zu aktivieren. Beta1-ECII wurde in der Folge als potentes Autoantigen mit T- und B-Zell-Epitopen identifiziert. Erste klinische Untersuchungen an Patienten mit DCM haben gezeigt, dass das Vorhandensein zirkulierender b1-ECII-Antik{\"o}rper mit einer schlechteren linksventrikul{\"a}ren Funktion, dem Auftreten ventrikul{\"a}rer Arrhythmien sowie mit einer erh{\"o}hten kardiovaskul{\"a}ren Mortalit{\"a}t verbunden ist. Der Verdacht, dass beta1-Antik{\"o}rper bei der DCM nicht nur ein Epiph{\"a}nomen, sondern bei einem Teil der betroffenen Patienten auch m{\"o}gliche Krankheitsursache darstellen k{\"o}nnten, verst{\"a}rkten dann in j{\"u}ngster Zeit die Bestrebungen, ein Tiermodell f{\"u}r die Antik{\"o}rper-induzierte Genese einer Kardio-myopathie zu generieren. So fanden 1997 Matsui et al. im Kaninchenmodell nach Immunisierung mit einem beta1-ECII-homologen Peptid {\"u}ber 12 Monate eine biventrikul{\"a}re Dilatation und kompensatorische Hochregulation der beta-Adrenozeptoren im Myokard. Im Gegensatz dazu fanden Iwata et al. wenige Jahre sp{\"a}ter im gleichen Tiermodell nach 6-monatiger Immunisierung eine linksventrikul{\"a}re Hypertrophie bei beta1-ECII-Antik{\"o}rper-positiven Tieren und eine Downregulation der beta-Rezeptoren. Diese Diskrepanzen ließen das Kaninchenmodell daher als fraglich geeignet erscheinen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Arbeit wurde die Lewis-Ratte zur Generierung eines Kardiomyopathiemodells gew{\"a}hlt, da die beta1-ECII-Sequenz bei Ratte und Mensch 100\% homolog ist. Zur Immunisierung verwendeten wir ein Fusionsprotein aus GST und der humanen beta1-ECII-Sequenz. Der Schwerpunkt des Vorhabens lag auf der Charakterisierung der durch die Immunisierung induzierten morphologischen und funktionellen Ver{\"a}nderungen am Herzen der Versuchstiere. Echokardiographisch konnte bei immunisierten Tieren bereits nach 9 Monaten eine linksventrikul{\"a}re Erweiterung nachgewiesen werden, die sich nach 12 bzw. 15 Immunisierungsmonaten durch das Auftreten einer progredienten linksventrikul{\"a}ren Dysfunktion (Echokardiographie/Herzkatheteruntersuchung) auch funktionell manifestierte. Makroskopisch-morphometrisch ließ sich an Paraffinschnitten eine Erweiterung des linken Ventrikels bei relativer Abnahme der Wanddicke nachweisen und best{\"a}tigte somit histologisch die echokardiographischen Messungen. Die mikroskopische Analyse zeigte eine relative Vergr{\"o}ßerung der Kardiomyozytenkerne ohne signifikante Zellhypertrophie. Durch Radioligandenbindungsversuche konnte zudem in beta1-ECII-immunisierten Tieren eine Downregulation der kardialen beta1-Rezeptoren nachgewiesen werden. Durch die Immunisierung mit beta1-ECII-Antigen konnte der Ph{\"a}notyp einer DCM somit erstmals in der Ratte induziert werden. Dieser Ph{\"a}notyp ist vermutlich {\"u}berwiegend auf die agonist-{\"a}hnliche funktionelle Aktivit{\"a}t der durch spezifische Immunisierung induzierten beta1-Rezeptorantik{\"o}rper zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Das vorgestellte Tiermodell erf{\"u}llt dabei einerseits die immunologischen Kriterien des 1. Koch'schen Postulats f{\"u}r den „indirekten" Nachweis einer Kardiomyopathieinduktion durch Antik{\"o}rper, die gegen die zweite extrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne des b1-adrenergen Rezeptors gerichtet sind. Andererseits lieferte es im Anschluss auch die direkte Evidenz f{\"u}r eine kausale Rolle solcher Antik{\"o}rper bei der Induktion einer Autoimmunkardiomyopathie durch den Transfer induzierter Antik{\"o}rper auf genetisch identische, herzgesunde Ratten (Nachahmen von Rezeptor-Autoantik{\"o}rpern). Zuk{\"u}nftig k{\"o}nnte dieses Tiermodell auch dazu dienen, weitere immunologische Faktoren, die an der Entwicklung einer Autoimmunkardiomyopathie durch beta1-Rezeptor-antik{\"o}rper beteiligt sind, zu untersuchen. Ferner k{\"o}nnen mit diesem Modell neue therapeutische Ans{\"a}tze f{\"u}r die Behandlung der Rezeptorantik{\"o}rper-positiven Kardiomyopathie entwickelt werden, mit dem Ziel einer sp{\"a}teren Anwendung im Tiermodell erprobter Strategien auch bei Antik{\"o}rper-positiven Patienten.}, subject = {Beta-1-Rezeptor}, language = {de} } @phdthesis{Schmid2008, author = {Schmid, Ursula}, title = {Protection against oxidative DNA damage by antioxidants, hormone-receptor blockers and HMG-CoA-reductase inhibitors}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28379}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {In the course of this study, several endogenous compounds and model substances were used to mimic the conditions in patients suffering from hypertension. As endogenous compounds, angiotensin II and aldosterone were chosen. As model substances, 4-nitroquinoline-1-oxide (NQO), hydrogen peroxide and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) were selected. Benfotiamine as well as \&\#945;-tocopherol proved in the course of the experiments to be able to prevent angiotensin II-induced formation of oxidative DNA strand breaks and micronuclei. This could be due to a prior inhibition of the release of reactive oxygen species and is in contrast to results which were achieved using thiamine. Furthermore, experiments in which cells were pre-incubated with benfotiamine followed by incubation with NQO showed that benfotiamine was not able to prevent the induction of oxidative stress. The hypothesis that benfotiamine has, like \&\#945;-tocopherol, direct antioxidative capacity was fortified by measurements in cell free systems. In brief, a new working mechanism for benfotiamine in addition to the ones already known could be provided. In the second part of the study, angiotensin II was shown to be dose-dependently genotoxic. This effect is mediated via the angiotensin II type 1 receptor (AT1R) which. Further experiments were extended from in vitro settings to the isolated perfused kidney. Here it could be shown that angiotensin II caused vasoconstriction and DNA strand breaks. Co-perfusion of kidneys with angiotensin II and candesartan prevented vasoconstriction and formation of strand breaks. DNA strand break formation due to mechanical stress or hypoxia could be ruled out after additional experiments with the thromboxane mimetic U 46619. Detailed investigation of the DNA damage in vitro revealed that angiotensin II induces single strand breaks, double strand breaks and 8-hydroxydeoxyguanosine (8-oxodG)-adducts as well as abasic sites. Investigations of the effects of aldosterone-treatment in kidney cells showed an increase of oxidative stress, DNA strand breaks and micronuclei which could be prevented by the steroidal mineralocorticoid receptor antagonist eplerenone. Additional experiments with the non-steroidal mineralocorticoid receptor antagonist (S)-BR-4628 revealed that this substance was also able to prevent oxidative stress and genomic damage and proved to be more potent than eplerenone. In vivo, hyperaldosteronism was imitated in rats by aid of the deoxycorticosteroneacetate (DOCA) salt model. After this treatment, levels of DNA strand breaks and chromosomal aberrations in the kidney could be observed. Furthermore, an increase in the release of ROS could be measured. Treatment of these animals with spironolactone , BR-4628 and enalaprile revealed that all antagonists were effective BR-4628 was the most potent drug. Finally, rosuvastatin was investigated. In HL-60 cells phorbol 12-myristate 13-acetate caused oxidative stress. Rosuvastatin was able to prevent the release of ROS and subsequent oxidative DNA damage when co-incubated with PMA. Furthermore, not only an inhibition of PMA-induced oxidative stress but also inhibition of the unspecific release of ROS induced by hydrogen peroxide was observable. Addition of farnesyl pyrophosphate (FPP), geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), and mevalonate, intermediates of the cholesterol pathway, caused only a marginal increase of oxidative stress in cells treated simultaneously with PMA and rosuvastatin, thus indicating the effect of rosuvastatin to be HMG-CoA-reductase-independent. Investigation of the gene expression of subunits of NAD(P)H oxidase revealed a down-regulation of p67phox following rosuvastatin-treatment. Furthermore, it could be shown that rosuvastatin treatment alone or in combination with PMA increased total glutathione levels probably due to an induction of the gene expression and enzyme activity of \&\#947;-glutamylcysteine synthetase (\&\#947;-GCS).}, subject = {Oxidativer Stress}, language = {en} } @phdthesis{Tiedge2008, author = {Tiedge, Oliver}, title = {Kombinationswirkungen nicht linearer Dosis-Wirkungsbeziehungen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28522}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Um realistische Risikoabsch{\"a}tzungen von karzinogenen und genotoxischen Expositionen besser bewerten zu k{\"o}nnen, bedarf es Untersuchungen von Kombinationen welche sich von der Einzellstoffbetrachtung losl{\"o}st. Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit bestand darin, herauszufinden, ob die Gentoxizit{\"a}t einer Kombination in ihrer St{\"a}rke vom erwarteten Effekt der normalen Additivit{\"a}t abweicht, wenn die Kurven der Dosis - Wirkungsbeziehung der Einzelkomponenten nicht lineare Verl{\"a}ufe zeigen. Dabei muss zwischen Dosisaddition und Wirkaddition der Kombinationen unterschieden werden, das heißt ob die Einzelkomponenten einen untereinander {\"a}hnlichen oder unabh{\"a}ngigen Wirkmechanismus verfolgen. F{\"u}r nicht lineare Dosis - Wirkungsbeziehungen differieren also die Kurvenverl{\"a}ufe zwischen Dosisaddition und Wirkaddition und bilden einen m{\"o}glichen Bereich der Additivit{\"a}t zwischen ihnen (auch: „H{\"u}lle der Additivit{\"a}t"). Nur Reaktionen welche außerhalb dieses Bereiches ablaufen, d{\"u}rfen als synergistische oder antagonistische Effekte bezeichnet werden. Diese {\"U}berlegungen wurden {\"u}berpr{\"u}ft mit der Analysierung von Mikrokernen, induziert in L5178Y Maus - Lymphom - Zellen durch die methylierenden Substanzen Methylmethansulfonat (MMS) und Methyl-Nitroso-Urea (MNU), sowie dem Topoisomerase II Inhibitor Genistein (GEN). Alle drei Chemikalien erzeugen reproduzierbare sublineare Dosis - Wirkungsbeziehungen. F{\"u}r die Analyse der Kombinationseffekte wurden diese Substanzen in drei bin{\"a}ren Mixturen miteinander gemischt. F{\"u}r MMS + MNU war der Effekt vereinbar mit Dosisaddition und lag signifikant h{\"o}her als der vorkalkulierte Effekt der Netto - Wirkung. F{\"u}r MMS + GEN lag der gemessene Effekt {\"u}ber der Wirkaddition, jedoch unter der Dosisaddition. F{\"u}r MNU + GEN lag der gemessene Effekt unterhalb der Wirkaddition und deutete damit auf einen echten Antagonismus hin. In Unkenntnis des sublinearen Dosis - Wirkungsverhaltens der Einzelsubstanzen w{\"a}re ein synergistischer Effekt von MMS mit beiden Substanzen MNU und GEN f{\"a}lschlicherweise vorausgesagt worden. Der beobachtete Unterschied zwischen MMS und MNU und deren jeweiligen Kombination mit GEN w{\"a}re mit einer stark vereinfachten Interpretation der DNA - Methylierung nicht vorausgesagt worden. Ursachen k{\"o}nnten eine doch zu unterschiedliche Form der DNA - Methylierung und / oder epigentische Faktoren sein. Zusammenfassend kann man sagen, dass Kenntnisse der Nichtlinearit{\"a}t von Dosis - Wirkungskurven der einzelnen Substanzen ausschlaggebend f{\"u}r die Analyse von Synergismus oder Antagonismus in deren Kombinationen ist. Weiterhin ist ein Vorwissen {\"u}ber tiefere mechanistische Vorg{\"a}nge hilfreich f{\"u}r eine Vorhersage von {\"a}hnlichen oder unabh{\"a}ngigen Wirkprozessen.}, subject = {Kleinkern}, language = {de} } @phdthesis{Jonas2008, author = {Jonas, Ren{\´e}}, title = {Arsen-induzierte Zyto- und Gentoxizit{\"a}t sowie deren Modulation}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28772}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Arsen ist daf{\"u}r bekannt, dass es mutagen und kanzerogen wirkt und ein gentoxisches Potential besitzt. Die Mechanismen, durch die diese Effekte ausge{\"u}bt werden, sind noch nicht vollst{\"a}ndig aufgekl{\"a}rt. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass Parameter, die mit der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), z.B. Superoxiddismutaseaktivit{\"a}t und H{\"a}moxygenase-Genexpression, und Ver{\"a}nderungen des epigenetischen Musters der DNA, z.B. Depletion von S-Adenosylmethionin, in Zusammenhang stehen, durch Arsen beeinflusst werden. In dieser Studie wurde versucht, das gentoxische Potential von Arsen mit Hilfe des Comet Assay, eines Standard-Gentoxizit{\"a}tstests, zu charakterisieren sowie zu pr{\"u}fen, ob dieser Test eine geeignete Messmethode f{\"u}r die gentoxische Wirkung von Arsen darstellt. Dies wurde unter Heranziehung verschiedener additiver Messgr{\"o}ßen wie der Vitalit{\"a}t und der Proliferation sowie der parallelen Quantifizierung der Mitose-, C-Mitose-, Mikrokern- und Apoptosefrequenzen der verwendeten murinen L5178Y-Zellen durchgef{\"u}hrt. Des Weiteren wurde der den Arsen-bedingten DNA-Sch{\"a}den zugrundeliegende Mechanismus genauer beleuchtet. Unter Zuhilfenahme verschiedener Modulatoren wurden durch Arsen induzierter oxidativer Stress und durch Arsen induzierte Ver{\"a}nderung der epigenetischen DNA-Struktur untersucht. Ferner wurde gepr{\"u}ft, inwieweit die Inhibition von oxidativem Stress und Hypomethylierung der DNA zur Verringerung von potenziellen Folgen wie der Entstehung unnat{\"u}rlicher Mitosemorphologien und chromosomaler Aberrationen beitragen k{\"o}nnen, die wiederum eventuell in der Entstehung von Karzinomen resultieren k{\"o}nnen. F{\"u}r die Modulation der Freisetzung von ROS wurden als prooxidative Substanz 4-Nitrochinolin-1-Oxid und als Antioxidantien Benfotiamin (Vitamin-B1-Prodrug), N-Acetylcystein (NAC) und \&\#945;-Tocopherol (Vitamin E) ausgew{\"a}hlt. Das Methylierungs¬muster der DNA sollte durch das hypomethylierende Agens 5-Azacytidin und durch die potenziell hypermethylierenden Verbindungen S-Adenosylmethionin (SAM) und Folat beeinflusst werden. Die Untersuchungen bez{\"u}glich des gentoxischen Potentials von Arsen und die Eignung des Comet Assay f{\"u}r dessen Quantifizierung ergaben, dass unter Miteinbeziehung der erw{\"a}hnten additiven Parameter und der Quantifizierung nach Behandlung mit unterschiedlichen Arsen-Konzentrationen nach unterschiedlich langen Behandlungszeiten die im Comet Assay erzielten Werte als korrekt und zuverl{\"a}ssig angesehen werden k{\"o}nnen. Des Weiteren zeigten die Untersuchungen der Freisetzung von ROS und der Ver{\"a}nderung des DNA-Methylierungsmusters mit Hilfe von Modulatoren, dass beide Mechanismen an den Arsen-induzierten Effekten beteiligt sind. Nicht nur konnte mit Hilfe der Modulatoren jeweils die Inhibition der Freisetzung von ROS und der DNA-Hypomethylierung erreicht werden, es konnte zudem gezeigt werden, dass die Substanzen auch die Reduktion der erh{\"o}hten Anzahl unnat{\"u}rlicher Mitosemorphologien und chromosomaler Aberrationen bewirkten. Dieser Zusammenhang konnte in dieser Studie zum ersten Mal aufgezeigt werden und k{\"o}nnte im Hinblick auf die potenzielle Erniedrigung der Krebsinzidenzen durch Supplementierung der Bev{\"o}lkerung in Gebieten mit Arsen-belastetem Trinkwasser mit den genannten Modulatoren von Bedeutung sein.}, subject = {Oxidativer Stress}, language = {de} } @phdthesis{Engelhardt2001, author = {Engelhardt, Stefan}, title = {Transgene Mausmodelle zur Charakterisierung der Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1181950}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren mit Hilfe einer Kombination aus transgenen Mausmodellen und physiologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Durch gezielte {\"U}berexpression des humanen beta1-adrenergen Rezeptors im Herzen transgener M{\"a}use konnte gezeigt werden, daß die chronische Aktivierung dieses Rezeptors eine trophische Wirkung auf die Herzmuskelzellen hat. {\"U}ber einen Zeitraum von mehreren Monaten f{\"u}hrte dies zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz. In der menschlichen Herzinsuffizienz kommt es zu einem {\"a}hnlichen Ph{\"a}nomen: Durch deutlich erh{\"o}hte Freisetzung von endogenen Katecholaminen kommt es zu einer chronischen Dauerstimulation kardialer beta1-adrenerger Rezeptoren. Daß diese sch{\"a}dlich ist belegen das hier beschriebene Mausmodell und zudem einige neuere klinische Studien, die zeigen daß eine pharmakologische Blockade beta-adrenerger Rezeptoren zu einer Verminderung der Herzinsuffizienzmortalit{\"a}t f{\"u}hrt. Dieses Mausmodell erlaubte es erstmals den beta1-adrenergen Rezeptor hinsichtlich seiner spontanen Rezeptoraktivit{\"a}t in einem physiologischen Modell zu untersuchen. Dabei zeigte sich, daß der humane beta1-adrenerge Rezeptor spontane Aktivit{\"a}t aufweist, jedoch in einem deutlich geringeren Ausmaß als der beta2-adrenerge Rezeptor. Dies k{\"o}nnte klinisch relevant sein, da klinisch verwendete beta-Rezeptor-Antagonisten die spontane Aktivit{\"a}t des beta1-adrenergen Rezeptors in unserem Modell unterschiedlich stark unterdr{\"u}ckten. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem untersucht, ob sich die beiden kardial exprimierten Beta-Rezeptor-Subtypen Beta1 und Beta2 hinsichtlich ihrer Signaltransduktion unterscheiden. Ausgehend von dem Befund, daß die chronische Aktivierung der beiden Subtypen in transgenen Mausmodellen zu deutlich unterschiedlichen Ph{\"a}notypen f{\"u}hrt, wurden verschiedene intrazellul{\"a}re Signalwege auf ihre Aktivierung hin {\"u}berpr{\"u}ft. Abweichend von publizierten, in vitro nach kurzzeitiger Rezeptorstimulation erhobenen Daten zeigte sich, daß die chronische Aktivierung der Rezeptorsubtypen zu einer unterschiedlichen Aktivierung der kardialen MAP-kinasen (ERK) f{\"u}hrt. Die beta1-spezifische Aktivierung dieser Kinasen k{\"o}nnte die beobachtete unterschiedliche Hypertrophieentwicklung in diesen beiden Mausmodellen erkl{\"a}ren. Einen weiteren Schwerpunkt bei der Aufkl{\"a}rung des Mechanismus beta-adrenerg induzierter Hypertrophie bildete die Untersuchung der zellul{\"a}ren Calcium-hom{\"o}ostase. Als fr{\"u}heste funktionelle Ver{\"a}nderung in der Entwicklung einer beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie und -insuffizienz trat dabei eine St{\"o}rung des intrazellul{\"a}ren Calciumtransienten auf. Als m{\"o}glicher Mechanismus f{\"u}r die St{\"o}rung des Calciumhaushalts konnte eine zeitgleich auftretende ver{\"a}nderte Expression des Calcium-regulierenden Proteins Junctin beschrieben werden. Einen neuen therapeutischen Ansatz f{\"u}r die Therapie der Herzinsuffizienz k{\"o}nnten schließlich vielleicht die Untersuchungen zum kardialen Na/H-austauscher ergeben: Es konnte erstmals gezeigt werden, daß der kardiale Na/H-Austauscher maßgeblich an der beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie- und Fibrose-entstehung beteiligt ist und daß die pharmakologische Inhibition dieses Proteins sowohl Hypertrophie als auch die Fibrose wirksam unterdr{\"u}cken kann.}, subject = {Beta-Rezeptor}, language = {de} } @phdthesis{Brede2001, author = {Brede, Marc}, title = {Kardiovaskul{\"a}re Ph{\"a}notypisierung von Angiotensin II AT2-Rezeptor- und adrenergen Rezeptor-"Knockout"-M{\"a}usen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1179726}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Die Deletion des AT2-Rezeptors (AT2-KO) f{\"u}hrt zu erh{\"o}hter Blutdruckempfindlichkeit und vaskul{\"a}rer Hypertrophie durch Aktivit{\"a}tszunahhme der P70S6-Kinase. Die Vasodilatation von Blutgef{\"a}ßen wird maßgeblich durch beta1-adrenerge Rezeptoren vermittelt. Die Deletion von alpha2-adrenergen Rezeptoren (alpha2-KO) f{\"u}hrt zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz nach Aortenstenose. Der Mortalit{\"a}tanstieg ist mit erh{\"o}hten Plasmanoradrenalin-Spiegeln (a2A-KO), bzw. Plasmaadrenalin-Spiegeln (a2C-KO) assoziiert.}, language = {de} } @phdthesis{Melichar2002, author = {Melichar, Volker O.}, title = {Einfluß der Atherosklerose auf den NO:cGMP Signalweg am Modell des cholesteringef{\"u}tterten Kaninchen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3833}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Atherosklerose ist Volkskrankheit und Todesursache Nummer Eins in den sogenannten entwickelten L{\"a}ndern. Ursachen f{\"u}r die meisten Folgeerkrankungen sind Minderperfusion und Gef{\"a}ßverschluß, verursacht durch Ablagerungen und Verdickung der Gef{\"a}ßwand und durch einen pathologisch erh{\"o}hten Gef{\"a}ßtonus. Mehrere zellul{\"a}re Signalwege, die im Gesunden eine Vasodilatation hervorrufen k{\"o}nnen, sind in atherosklerotischen Gef{\"a}ßen gest{\"o}rt, so auch der NO:cGMP-Signalweg. Der Einfluß der Atherosklerose auf den NO-abh{\"a}ngigen Teil des Signalwegs, also NO-Produktion und -Abbau, sowie Diffusion von NO zu den glatten Muskelzellen, ist seit l{\"a}ngerem bekannt. In dieser Studie zeigen wir, daß im fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung auch der NO-unabh{\"a}ngige Teil des Signalwegs in erheblichen Maße gest{\"o}rt ist. Die Expression und Aktivit{\"a}t der Enzyme l{\"o}sliche Guanylatzyklase (sGC) und cGMP-abh{\"a}ngige Proteinkinase-I ist vor allem in der neugebildeten Neointima reduziert. P-VASP, ein Indikator der Aktivit{\"a}t des gesamten NO:cGMP-Signalwegs, ist in eindrucksvoller Weise reduziert. Die Enzyme des NO-unabh{\"a}ngigen Teils des NO:cGMP-Signalwegs werden in zunehmenden Maße pharmakologisch beeinflußbar. Die Ergebnisse dieser Studie stellen somit eine wichtige Grundlage f{\"u}r neue Therapieans{\"a}tze der Atherosklerose dar.}, language = {de} } @phdthesis{Bossle2002, author = {Bossle, Franz}, title = {Zur Pharmakologie von meta-Iodbenzylguanidin}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3717}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Obwohl radioaktiv markiertes meta-Iodbenzylguanidin (MIBG) h{\"a}ufig in der Diagnose und bei der Behandlung von Neuroblastomen in der Klink Verwendung findet, ist bis heute sehr wenig {\"u}ber seine Pharmakologie bekannt. In der Literatur finden sich {\"o}fters Andeutungen, die aber nicht belegt wurden. So fehlten Untersuchungen {\"u}ber indirekt-sympathomimetische Wirkungen von MIBG. Vor diesem Hintergrund untersuchten wir am isoliert perfundierten Kaninchenherzen die Wirkung von MIBG im Vergleich zum Prototyp eines indirekten Sympathomimetikums (Tyramin). Dabei zeigte sich, daß MIBG zwar etwas potenter aber nicht so effektiv wie Tyramin war. Dies zeigte sich sowohl beim Paramter Herzfrequenz als auch beim Parameter Noradrenalin-Freisetzung. Im Gegensatz dazu zeigte sich im Zeitverlauf, daß die Wirkung von MIBG wesentlich l{\"a}nger anhielt als die von Tyramin. Der Unterschied zwischen MIBG und Tyramin bez{\"u}glich der Effektivit{\"a}t als indirekte Sympathomimetika konnte mit unterschiedlichen Wirkst{\"a}rken beider Substanzen als Hemmstoff des vesikul{\"a}ren Monoamin-Transporters erkl{\"a}rt werden. Tyramin und MIBG wurden in Versuchen mit Neuroblastomzellen mit gleicher Geschwindigkeit durch Uptake1 aufgenommen, Tyramin war aber ein wesentlich potenterer Hemmstoff des vesikul{\"a}ren Monoamin-Transporters als MIBG. Da aber MIBG im Gegensatz zu Tyramin kein Substrat der neuronalen Monoaminoxidase ist, hielt seine Wirkung auch deutlich l{\"a}nger an als die von Tyramin. Die indirekt sympathomimetische Wirkung von MIBG wurde anschließend auch in-vivo untersucht. Dort zeigte sich auch, daß MIBG trotz im Vergleich zu klinischen Anwendungen hoher Dosen wesentlich schw{\"a}cher indirekt-sympathomimetisch wirkt als Tyramin. In diesen Versuchen wurde auch beobachtet, daß die indirekt-sympathomimetische Wirkung auf die Herzfrequenz durch eine Gegenregulation des Nervensystems (n{\"a}mlich den Barorezeptor-Reflex) maskiert wurde. Obwohl MIBG in der Literatur von Anfang an als adrenerger Neuronenblocker bezeichnet wurde, fand sich in der Literatur kein direkter Beweis f{\"u}r diese Behauptung. Mit Hilfe eines in-vitro Modells konnte in der vorliegenden Arbeit der Beweis erbracht werden, daß MIBG ein adrenerger Neuronenblocker ist. Dazu benutzten wir als Parameter die durch elektrische Stimulation induzierte Freisetzung von Noradrenalin im spontan schlagenden, perfundierten Kaninchenherzen. Die stimulationsbedingte Abgabe von Noradrenalin ins Perfusat wurde durch MIBG zeit- und konzentrationsabh{\"a}ngig blockiert. Da viele adrenerge Neuronenblocker das Enzym Monoaminoxidase (MAO) hemmen, wurde in-vitro untersucht, ob MIBG die beiden Iso-Enzyme MAO-A und MAO-B hemmt. Es konnte gezeigt werden, daß MIBG die MAO kompetitiv hemmt und zwar bevorzugt die Isoform MAO-A. Diese MAO-Hemmung wurde auch in-vivo in den Versuchen mit narkotisierten Kaninchen beobachtet. MIBG verminderte n{\"a}mlich dosisabh{\"a}ngig die Konzentration des desaminierten Noradrenalin-Metaboliten DOPEG im Blutplasma der Tiere. Die Beobachtung, daß f{\"u}r die Hemmung der MAO-A im perfundierten Herzen eine IC50 von 17 nM, im Gewebehomogenat von Herzen dagegen eine IC50 von 18 µM gefunden wurde, spricht daf{\"u}r, daß MIBG als Substrat von Uptake1 im Axoplasma der sympathischen Neurone des Herzens um den Faktor 1000 angereichert wird. Somit konnten in der vorliegenden Arbeit einige offene Fragen zur Pharmakologie von MIBG im Bereich des sympathomimetischen Nervensystems beantwortet werden, die auch f{\"u}r den klinischen Einsatz von MIBG wichtig sein k{\"o}nnten.}, subject = {MIBG}, language = {de} } @phdthesis{Nerlich2004, author = {Nerlich, Kai}, title = {Untersuchung des genetischen Schadens in peripheren Lymphozyten von Dialysepatienten mittels Mikrokerntest und Comet-Assay}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9726}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Die vorliegende Arbeit besch{\"a}ftigt sich im Gegensatz zu bisherigen Studien ({\"u}berwiegend im Rahmen von Querschnittsstudien) v.a. prospektiv mit der Untersuchung der Auswirkung verschiedener Faktoren (1. Pr{\"a}dialysephase, 2. Wechsel von der H{\"a}modialyse zu HDF-Behandlung, 3. Einfluß einer Angiotensin IIAntagonistentherapie sowie (durch einmalige Erhebung) „Langzeit"-HDF-Behandlung)auf den relativen genetischen Schaden, ermittelt durch den Comet-Assay und den Mikrokern-Test in peripheren Lymphozyten bei Dialysepatienten bzw. Pr{\"a}dialysepatienten.}, language = {de} } @phdthesis{Gregor2003, author = {Gregor, Caroline}, title = {Genomische Instabilit{\"a}t bei der humanen Ovarialtumorzellinie BG-1 durch hormonelle Proliferationsstimulierung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-8072}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Ergebnisse vieler epidemiologischer Studien {\"u}ber die Risikoabsch{\"a}tzungen von Tumoren hormonabh{\"a}ngiger Gewebe legen einen deutlichen Zusammenhang zwischen den Hormonen und dem Auftreten dieser Tumoren nahe. Dabei wird der zellproliferationssteigernde Effekt der Hormone im Rahmen des Mehrstufenkonzeptes der Kanzerogenese meist als Promotionsfaktor beschrieben. In der vorliegenden Arbeit soll gezeigt werden, dass die hormonelle Induktion einer erh{\"o}hten Zellteilungsrate auch prim{\"a}r zu einer genetischen Instabilit{\"a}t beitr{\"a}gt, mit dem Ziel einen weiteren Mechanismus in der Pathogenese hormonabh{\"a}ngiger Tumoren aufzukl{\"a}ren. Die {\"o}strogenrezeptorpositive Ovarialtumorzellinie BG-1 und die rezeptornegativen UCI-107 Zellen wurden mit 17-ß {\"O}stradiol behandelt und anschließend mit Hilfe des Mikrokerntests auf chromosomale Sch{\"a}den untersucht. Die Bestimmung der Mikrokernrate bei den {\"o}strogensensitiven BG-1 Zellen zeigte, dass mit steigender Proliferationsinduktion auch die Mikrokernfrequenz konzentrationsabh{\"a}ngig erh{\"o}ht war. Bei der Behandlung der BG-1 Zellen mit 17-ß {\"O}stradiol in Kombination mit dem spezifischen {\"O}strogenrezeptorantagonisten 4- Hydroxytamoxifen wurde die {\"o}stradiolinduzierte rezeptorabh{\"a}ngige Proliferationsstimulation durch Hydroxytamoxifen gehemmt. Parallel dazu sank auch die Mikrokernrate. Bei vergleichbaren Versuchen mit der {\"o}strogeninsensitiven UCI-107 Zellinie, bei der keine Effekte auf die Proliferation bei Behandlung der Zellen mit 17-ß {\"O}stradiol alleine sowie in Kombination mit 4- Hydroxytamoxifen detektiert werden konnte, wurde auch keine Mikrokerninduktion beobachtet. Eine erh{\"o}hte Mikrokernfrequenz konnte wiederum ausschließlich in den {\"o}stradiolstimulierten BG-1 Zellen festgestellt werden, als durch den Einsatz des Zytokineseinhibitors Cytochalasin B die Auswertung der Mikrokerne auf jene Zellen normiert wurde, die genau eine Zellteilung durchgef{\"u}hrt hatten. Die Ergebnisse machten deutlich, dass die {\"o}stradiolstimulierten Zellen auf Grund der beschleunigten Proliferation eine „andere Art von Zellteilung" durchf{\"u}hren. In einem weiteren Abschnitt der Arbeit wurde der Einfluss der {\"O}stradiolstimulierung auf den Zellzyklus untersucht. Mittels eines FACScans konnten die prozentualen Zellzyklusphasenanteile (G1/ G0-, S- und G2/ M- Phase) der BG-1 Zellen zu verschiedenen Zeiten des Wachstums bestimmt werden. Zum Beispiel war der Anteil an Zellen der {\"o}stradiolstimulierten Zellpopulation in der G2/ M Phase durchgehend um 6-8 \% geringer gegen{\"u}ber dem Anteil an Zellen, die mit L{\"o}sungsmittel behandelt wurden. M{\"o}glicherweise ist dies ein Erkl{\"a}rungsansatz f{\"u}r das vermehrte Auftreten von Mikrokernen bei {\"O}stradiolstimulierung, da bekannt ist, dass es in der G2/ M-Phase einen wichtigen Kontrollpunkt innerhalb des Zellzyklus zur Detektion und Reparatur chromosomaler Sch{\"a}den gibt. Bei Berechnung der Zellzyklusphasenzeiten ergab sich ebenso in der G2/M Phase eine deutlich verk{\"u}rzte Verweildauer der {\"o}stradiol-behandelten BG-1 Zellen. Zusammengefaßt leitet sich die Hypothese ab: „Die Zellen werden auf Grund der hormonellen Proliferationsstimulierung durch den Zellzyklus „gejagt", demzufolge werden wichtige „Checkpoints" im Zellzyklus {\"u}berlaufen, wodurch eine genetische Instabilit{\"a}t entstehen.kann".}, language = {de} } @phdthesis{Philipp2002, author = {Philipp, Melanie}, title = {Die Rolle von alpha2-adrenergen Rezeptoren w{\"a}hrend der Embryonalentwicklung der Maus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5186}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Alpha2-Rezeptoren, die weiter in alpha2A, alpha2B und alpha2C unterteilt werden, geh{\"o}ren zur Gruppe der adrenergen Rezeptoren innerhalb der Klasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Sie sind maßgeblich an der Regulation vieler physiologischer Prozesse beteiligt. Vieles, was heute {\"u}ber alpha2-Rezeptoren bekannt ist, wurde mithilfe von alpha2-defizienten M{\"a}usen, sogenannten „Knock-Out"-M{\"a}usen (KO) herausgefunden, von denen bislang drei Einzel-KOs und der Doppel-KO der Subtypen A und C existieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden durch Kreuzung der vorhandenen KO-Linien Mauslinien generiert, die defizient f{\"u}r alpha2A und alpha2B, f{\"u}r alpha2B und alpha2C oder alle drei alpha2-Rezeptoren sind. W{\"a}hrend alpha2AB-KO-M{\"a}use ungef{\"a}hr entsprechend der Mendelschen Verteilung geboren wurden, zeigte sich, dass alpha2BC-KO-M{\"a}use teilweise und alpha2ABC-KO-M{\"a}use sogar komplett embryonal letal waren. Die morphologischen Unter-suchungen legten den Zeitpunkt der embryonalen Letalit{\"a}t der alpha2ABC-KO-M{\"a}use auf den Tag E10,5 der Embryonalentwicklung fest und konnten zeigen, dass diese Letalit{\"a}t in einem Vaskularisierungsdefekt innerhalb der extraembryonalen Organe Plazenta und Dottersack begr{\"u}ndet lag. Diese Organe stellen die Versorgung des Embryos mit N{\"a}hrstoffen und Sauerstoff sicher und sorgen somit f{\"u}r dessen Entwicklung. Durch RT-PCR-Experimente konnte die mRNS f{\"u}r alle drei alpha2-Rezeptorsubtypen an Tag E10,5 sowohl im Embryo als auch in Plazenta und Dottersack nachgewiesen werden. Autoradiographische Experimente und Radioligandenbindungsstudien an Plazenten machten deutlich, dass der Großteil an alpha2-Rezeptoren im embryonalen Teil der Plazenta exprimiert wird, n{\"a}mlich in den Riesenzellen und in der sich daran anschließenden Spongiotrophoblastschicht, und dass hierbei alpha2-Rezeptoren vom B-Subtyp vorherrschen. In den genannten Zellen konnte mittels Immunhistochemie eine alpha2-Rezeptor-vermittelte Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1/2 gezeigt werden, die auch in kultivierten WT-Dotters{\"a}cken beobachtet werden konnte. Unter basalen Bedingungen zeigte sich, dass die ERK1/2-Phosphorylierung in Gewebe von alpha2ABC-KO-Embryonen drastisch vermindert war, w{\"a}hrend andere Signalwege, die von alpha2-Rezeptoren angestoßen werden k{\"o}nnen, nicht beeintr{\"a}chtigt waren. Versuche in einem Zellkulturmodell und mit kultivierten WT-Dotters{\"a}cken ergaben eine physiologisch relevante Wechselwirkung zwischen dem alpha2B-Rezeptor und dem PDGFbeta-Rezeptor, einer Rezeptortyrosinkinase, als deren Mechanismus sich in Co-Kultur-Experimenten mit alpha2B-Rezeptor-transfizierten Zellen und alpha2ABC-defizienten Dotters{\"a}cken die Transaktivierung von Rezeptortyrosinkinasen herausstellte. In dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass a2-Rezeptoren bei der Maus {\"u}ber eine Transaktivierung von ERK1/2 die Vaskularisierung der Plazenta und des Dottersacks bedingen und damit eine normale Embryonalentwicklung sicherstellen.}, subject = {Maus}, language = {de} } @phdthesis{Rauchschwalbe2002, author = {Rauchschwalbe, Sonja}, title = {Korrelation des Polymorphismus der Uridindiphosphat-Glukuronyltransferase Isoform 1A1 mit der Glukuronidierung von Bilirubin und Paracetamol und der klinischen Diagnose des Gilbert Syndroms}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-4644}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {In einer Population von 304 M{\"a}nnern und Frauen konnte die Frequenz der TA-Duplikation im Promotor der Uridin-Diphosphat-Glukuronyltransferase Isoform 1A1 bestimmt werden. Sie betr{\"a}gt 0,39 in der Gruppe der M{\"a}nner und 0,30 in der Gruppe der Frauen, in der Gesamtgruppe kommt das Allel mit einer relativen H{\"a}ufigkeit von 0,35 vor. Es wurde gezeigt, daß die H{\"o}he der Bilirubinspiegel und die Diagnose "Gilbert Syndrom" nach definierten klinisch-chemischen Kriterien gut mit dem Genotyp korreliert. Dabei lagen die mittleren Bilirubinwerte der Frauen deutlich unter denen der M{\"a}nner. Die Festlegung neuer Referenzbereiche f{\"u}r Bilirubin von <18µmol/l f{\"u}r M{\"a}nner und <15µmol/l f{\"u}r Frauen wurde daraus abgeleitet. Ein Unterschied in der Glukuronidierungskapazit{\"a}t von Paracetamol zwischen Probanden mit homozygot wildtypischer, homozygot mutierter und heterozygoter Allelkombination konnte nicht nachgewiesen werden. Deshalb scheint die UGT1A1 nicht das f{\"u}r Para-cet-amol verantwortliche Isoenzym zu sein. Die Bestimmung des Genotyps des UGT1A1 Promotors kann zur Vorhersage zuk{\"u}nf-tiger oder Erkl{\"a}rung vorliegender erh{\"o}hter Bilirubinspiegel herangezogen werden. Dies kann in der Klinik zur routinem{\"a}ßigen Diagnostik des Gilbert Syndroms eingesetzt werden. F{\"u}r die klinische Forschung bietet die Genotypisierung der UGT1A1 eine M{\"o}glichkeit, zwischen dem genetischen Polymorphismus oder einer Reaktion auf die Pr{\"u}fmedikation als m{\"o}glichen Ursachen eine Erh{\"o}hung der Bilirubinwerte eines Probanden zu unterscheiden. Zur Ph{\"a}no-typisierung dieses Stoffwechselweges ist Paracetamol nicht geeignet. Personen mit Gilbert Syndrom unterliegen bei der Einnahme von Paracetamol vermutlich keinem erh{\"o}hten Risiko toxischer Nebenwirkungen.}, language = {de} } @phdthesis{Brede2002, author = {Brede, Anja}, title = {{\"U}ber die Beteiligung EGF-Rezeptor-vermittelter Signaltransduktionswege an den tumorpromovierenden Effekten von 2-Acetylaminofluoren, 2-Nitrosofluoren und Phenobarbital in HepG2-Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-4024}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {In dieser Arbeit wurden die tumorpromovierenden Effekte von 2-Acetylaminofluoren (2-AAF), 2-Nitrosofluoren (2-NOF) und Phenobarbital (PB) auf die Expression des EGF-Rezeptors (EGF-R), der Proteinkinase C (PKC), der Protoonkogene c-FOS und c-JUN in HepG2 Zellen bestimmt. Nur PB hemmte die Expression des EGF-R, wohingegen die PKC, c-FOS und c-JUN nicht beeinflusst wurden. 2-AAF, 2-NOF und PB wirkten konzentrationsabh{\"a}ngig zytotoxisch und antiproliferativ auf HepG2-Zellen. Die PKC scheint an diesem Effekt beteiligt zu sein. Die Bindungsaktivit{\"a}t der Transkriptionsfaktoren AP1 und NFkappa B wurde durch 2-NOF und Phenobarbital erh{\"o}ht, wohingegen der Effekt von 2-AAF nicht endeutig zu kl{\"a}ren war.}, language = {de} } @phdthesis{Wueck2002, author = {W{\"u}ck, Daniela Maria}, title = {Kombination von Paclitaxel und Bestrahlung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3356}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Paclitaxel wird als antineoplastisches Agenz haupts{\"a}chlich gegen Ovarial- und Brusttumore eingesetzt. Seine Wirkung beruht auf einer St{\"o}rung der mikrotubul{\"a}ren Dynamik und Struktur des Zytoskeletts, die einen Arrest der Zelle in der G2- und Mitosephase des Zellzykluses bewirkt. Da Zellen, die in der G2/M-Phase des Zellzykluses arretiert sind, eine erh{\"o}hte Empfindlichkeit gegen{\"u}ber ionisierender Strahlung aufweisen, k{\"o}nnte Paclitaxel als Strahlensensibilisierer in einer Kombinationstherapie mit Bestrahlung Vorteile in der Tumortherapie haben. In dieser Arbeit wurden daher die gentoxischer Effekte einer Einzelbehandlung und einer Kombinationsbehandlung von Paclitaxel und Strahlung untersucht. Da eine Tumortherapie stark von der Art des Tumors abh{\"a}ngt, wurden verschiedene Tumorzellinien untersucht. Als gentoxischen Endpunkt wurde die Induktion von Mikrokernen in vitro gew{\"a}hlt. Der in vitro Mikrokerntest ist ein valider und empfindlicher Test, der sensitiv gegen{\"u}ber Spindelgiften wie Paclitaxel und chromosomenbrechende Agentien, wie ionisiernder Strahlung ist. In der Maus Lymphom Zellinie L5178Y, den Lungenfibroblasten V79, den humanen Cervixkarzinomzellen HeLa und in den humanen Brustkrebszellen MCF-7 konnte keine Radiosensibilisierung durch Paclitaxel detektiert werden. Die Anzahl der induzierten Mikrokerne lag immer im Bereich der theoretischen Addition der Einzelbehandlung mit Paclitaxel und Bestrahlung. In der humanen Lungenkarzinomzellinie A549, die als f{\"u}nfte Zellreihe untersucht wurde, konnte f{\"u}r eine Kombination von 2,5 nM Paclitaxel und 2 Gy Bestrahlung ein synergistischer Effekt gefunden werden (30 \%ige Erh{\"o}hung der Mikrokernrate bei Kombinationsbehandlung verglichen mit der Summe der Einzelbehandlungen). Dieser Effekt konnte in Wiederholungsexperimenten, in denen h{\"o}here Dosen an Paclitaxel verwendet wurden jedoch nicht reproduziert werden. Insgesamt konnten damit die Ergebnisse des in vitro Mikrokerntestes in f{\"u}nf verschiedenen Zellinien keine eindeutige Radiosensibilisierung von Paclitaxel zeigen. In Folgestudien sollten daher verschiedene Konzentrationen und Behandlunsdauern von Paclitaxel sowie andere Endpunkte untersucht werden, um eine abschließende Beurteilung, ob Paclitaxel als zelltypabh{\"a}ngiger Radiosensibilisierer fungieren k{\"o}nnte, zu erlauben.}, language = {de} } @phdthesis{Rother2001, author = {Rother, Tobias}, title = {Die Plasmamembran-Kalzium-ATPase im Myokard}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-916}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Die Plasmamembran Kalzium-ATPase (PMCA) ist ein in den meisten eukaryontischen Zellen exprimiertes Enzym. Sie katalysiert den Transport von Kalziumionen aus der Zelle und besitzt gegen{\"u}ber Kalzium eine hohe Affinit{\"a}t jedoch geringe Transportkapazit{\"a}t. Trotz der guten biochemischen Charakterisierung der Pumpe ist ihre Funktion in Zellen wie Kardiomyozyten, die zus{\"a}tzlich {\"u}ber andere Kalzium-Transportsysteme wie den Natrium/Kalzium-Austauscher verf{\"u}gen, weiterhin unklar. Erste Ergebnisse aus dem eigenen Labor an PMCA-{\"u}berexprimierenden L6-Myoblasten zeigten einen Einfluss des Enzyms auf deren Wachstum und Differenzierung. Um diese Erkenntnisse auf den Herzmuskel zu {\"u}bertragen war im Vorfeld ein transgenes Rattenmodel generiert worden, welches die hPMCA4CI unter einem myokardspezifischen Promotor {\"u}berexprimierte. Dieses Modell stand f{\"u}r die vorliegende Arbeit zur weiteren Charakterisierung zur Verf{\"u}gung. Untersucht wurde zun{\"a}chst das Wachstumsverhalten von Prim{\"a}rkulturen neonataler Kardiomyozyten unter Stimulation mit fetalem K{\"a}lberserum, Noradrenalin und dem Platelet Derived Growth Factor BB, jeweils im Vergleich zwischen transgenen und Wildtyp-Kardiomyozyten. Dabei zeigte sich ein beschleunigtes Wachstum der PMCA-{\"u}berexprimierenden Zellen. In einem zweiten Ansatz wurden Untersuchungen angestellt, um die subzellul{\"a}re Lokalisation der PMCA innerhalb der Herzmuskelzelle aufzudecken. Dabei wurden im Speziellen die Caveolae als Ort der m{\"o}glichen Lokalisation untersucht, kleine, ca. 50-100 nm große Einst{\"u}lpungen der Plasmamembran, mit charakteristischer Lipid- und Proteinzusammensetzung, darunter auch viele Rezeptoren und Signaltransduktionsmolek{\"u}le. Insgesamt konnte mit den Methoden der Detergenzextraktion, Doppelimmunfluoreszenz, Pr{\"a}paration Caveolae-reicher Membranen und Immunpr{\"a}zipitation gezeigt werden, dass die PMCA zu einem großen Teil in Caveolae lokalisiert ist. Zus{\"a}tzlich konnte in der Immunpr{\"a}zipitation eine Interaktion der PMCA mit dem Caveolae-assoziierten Zytoskelettprotein Dystrophin dargestellt werden. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die PMCA {\"u}ber eine Steuerung der lokalen Kalziumkonzentration im Bereich der Caveolae modulierend in wachstumsregulierende Signaltransduktionswege von Kardiomyozyten eingreifen kann.}, language = {de} } @phdthesis{Boullay2002, author = {Boullay, Felix}, title = {Quantifizierung von DNA-Sch{\"a}den peripherer Lymphozyten bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-6722}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Schon vor mehr als zwei Jahrzehnten wurde eine erh{\"o}hte Tumorentstehungsrate bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung unter Dialysebehandlung festgestellt. Eine der wahrscheinlichsten Erkl{\"a}rungen f{\"u}r dieses Ph{\"a}nomen ist die klinische Manifestation eines Immundefektes innerhalb dieses Patientenkollektives. Lymphozyten von Patienten mit chronischen Nierenerkrankungen ohne Dialyse und Dialysepatienten mit einer Behandlungsdauer von mehr als 120 Monaten verf{\"u}gen nachweislich {\"u}ber eine reduzierte DNA-Reparaturf{\"a}higkeit. Zus{\"a}tzlich weisen sie eine erh{\"o}hte Rate von Mikrokernen auf, was f{\"u}r verst{\"a}rkte gentoxische Einfl{\"u}sse im Patientenblut spricht. In dieser Arbeit wurde mittels Comet Assay, einem sensiblen Testverfahren zur Quantifizierung von DNA-Sch{\"a}den auf Einzellzellniveau, aus verschiedenen Gruppen von chronisch Nierenkranken die Zellkern-DNA von peripheren Lymphozyten auf Sch{\"a}den untersucht. Neben Patienten mit leicht bis stark erh{\"o}hten Kreatininspiegeln wurden auch Kollektive mit H{\"a}modialyse und H{\"a}modiafiltrationsbehandlung auf DNA-Sch{\"a}den untersucht und miteinander verglichen. In den Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass in der Gruppe der chronisch Nierenkranken ohne Dialysebehandlung offensichtlich ein Zusammenhang zwischen H{\"o}he des Kreatininspiegels und einer durch den Comet Assay feststellbaren DNA-Sch{\"a}digung besteht: im Kollektiv der H{\"a}modialysepatienten ist mit der Dauer der Behandlung ein Anstieg des Schadens zu verzeichnen. Bei Patienten mit H{\"a}modiafiltrationsbehandlung hingegen war kein Anstieg der DNA-Sch{\"a}den mit der L{\"a}nge der Behandlung feststellbar. Bei gleicher Behandlungsdauer bestehen zwischen H{\"a}modialyse- und H{\"a}modiafiltrationsgruppe nur unwesentliche Schadensdifferenzen. Dies war nicht vorhersehbar, da besonders Patienten mit st{\"a}rkeren gesundheitlichen Einschr{\"a}nkungen in den Vorzug der H{\"a}modiafiltration gelangen. Insgesamt zeigten jedoch alle untersuchten Gruppen einen signifikanten Anstieg der DNA-Sch{\"a}digung gegen{\"u}ber den Kontrollen. Da der Comet Assay derzeit noch mit methodischen und patientenbedingten Ergebniss-Schwankungen behaftet ist, muss jede Interpretation mit Zur{\"u}ckhaltung erfolgen. Insbesondere muss anhand eines Zusammenhanges hinsichtlich Gentoxizit{\"a}t und vorliegender Erkrankung untersucht und kritisch hinterfragt werden, ob ein fr{\"u}herer Beginn der Dialyse-Behandlung f{\"u}r den Patienten von Vorteil sein k{\"o}nnte. Inwieweit eine Umstellung von H{\"a}modialyse auf H{\"a}modiafiltration die Sch{\"a}den der lymphozyt{\"a}ren Zellkern DNA und somit eventuell auch die Tumorentstehungsraten beeinflusst, ist durch weitere Forschungen auf diesem Gebiet zu kl{\"a}ren.}, language = {de} } @phdthesis{Vietinghoff2003, author = {Vietinghoff, Sibylle von}, title = {Das Ecdysonsystem zur induzierbaren Genexpression in Herzen von transgenen M{\"a}usen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7101}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Zusammenfassung Systeme zur induzierbaren Transgenexpression sind wichtige Werkzeuge, um die Funktion einzelner Gene in vitro und in vivo zu untersuchen. Sie bestehen aus drei Grundkomponenten, einem zu regulierenden Zielgen, einem "Schalter" und einem Liganden, der diesen Schalter bedient. In dieser Arbeit wurden Untersuchungen am Ecdysonsystem durchgef{\"u}hrt, das als Schalter den Insektensteroidhormonrezeptor f{\"u}r das Verpuppungshormon Ecdyson verwendet. Zun{\"a}chst wurde ein neuer Rezeptor mit der Ligandenbindedom{\"a}ne des Ecdysonrezeptors (EcR) des Seidenspinners Bombyx mori konstruiert, dessen Eigenschaften in der Zellkultur mit einem DrosophilaEcR-Konstrukt, das f{\"u}r mammalische Expression optimiert ist, verglichen wurden. Mit dem BombyxEcR konnte die Transgenexpression durch den nichtsteroidalen Liganden Tebufenozid gesteuert werden, was beim DrosophilaEcR nicht m{\"o}glich war. Damit ist man in diesem Expressionssystem nicht wie beim DrosophilaEcR auf teure steroidale Liganden wie Ponasteron angewiesen. Außerdem mußte beim BombyxEcR der Heterodimerisierungspartner RXR nicht kotransfiziert werden. In Bezug auf erreichbaren Induktionsfaktor und Kinetik der Genexpression zeigten sich f{\"u}r die beiden Systeme vergleichbare Ergebnisse. Weiterhin wurden durch Pronukleusinjektion transgene M{\"a}use erzeugt, die den BombyxEcR unter einem herzspezifischen Promotor (aMHC) exprimieren. Als Zielgen wurde die b2a-Untereinheit des L-Typ-Calciumkanals eingebracht, die mit dem neuen Schaltsystem herzspezifisch gesteuert werden sollte. Die Bioverf{\"u}gbarkeit des Agonisten Tebufenozid nach intraperitonealer Injektion wurde in einem in-vitro Assay in HEK293-Zellen {\"u}berpr{\"u}ft. Es ergaben sich hinreichende Wirkstoffspiegel im Serum der M{\"a}use, um das Reportergen zu induzieren. Auch wenn bei der transgenen Maus nach der Induktion mit Tebufenozid kein immunologischer Nachweis erh{\"o}hter Expression der b2a-Untereinheit gelang,konnte doch in Herzkatheteruntersuchungen eine ver{\"a}nderte Herzfunktion nachgewiesen werden. Bei transgenen M{\"a}usen f{\"u}hrte die intraperitoneale Applikation von Tebufenozid f{\"u}r bis zu sieben Tage zu einem signifikanten Anstieg des systolischen Blutdrucks und der maximalen linksventrikul{\"a}ren Kontraktionsgeschwindigkeit, der bei nicht-transgenen Kontrolltieren nicht beobachtet wurde. Diese Befunde deuten erstmals in vivo darauf hin, daß die b2a-Untereinheit des L-Typ-Calciumkanals am Herzen eine positiv inotrope Wirkung vermitteln kann. Systeme zur induzierbaren Genexpression m{\"u}ssen weiterentwickelt werden, um die Ideale der pr{\"a}zisen Steuerung ohne Nebenwirkungen sowohl f{\"u}r die Grundlagenforschung als auch f{\"u}r eine in weiterer Zukunft liegende Verwendung in der Gentherapie zu erreichen.}, language = {de} } @phdthesis{Hoffmann2010, author = {Hoffmann, Dana}, title = {Neue Biomarker zum Nachweis von Nierentoxizit{\"a}t}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48562}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Der Prozess von der Entdeckung und Entwicklung eines potentiellen Arzneistoffs bis zu dessen Zulassung ist extrem kosten\&\#8208; und zeitintensiv und eine Vielzahl dieser Stoffe kann aufgrund toxischer Nebenwirkungen in pr{\"a}klinischen Studien nicht weiterentwickelt werden. Dabei ist die Niere eines der Hauptziele von Xenobiotika\&\#8208;induzierter Organtoxizit{\"a}t, jedoch ist eine fr{\"u}he Detektion von Nierensch{\"a}den schwierig. Den derzeitig verwendeten klinischen Parameter, wie Blutharnstoff (BUN) und Serumkreatinin fehlt es an Sensitivit{\"a}t und Spezifit{\"a}t, da sie Fremdstoff\&\#8208;induzierte Toxizit{\"a}t meist erst aufzeigen, wenn schon ein erheblicher Teil der Nierenfunktion beeintr{\"a}chtigt ist. Daher ist es notwendig, empfindlichere und zuverl{\"a}ssigere Biomarker zu identifizieren und zu validieren, welche kleinste Nierensch{\"a}digungen fr{\"u}her als traditionelle Parameter erkennen. In den letzten Jahren wurden in der Literatur aber auch von verschiedenen Projekten eine Reihe neuer gen\&\#8208;basierender und Urinbiomarker (Kim\&\#8208;1, Clusterin, Lipocalin\&\#8208;2, Timp\&\#8208;1) identifiziert. Ziel dieser Dissertation war es die Aussagekraft dieser Marker im Vergleich zu traditionellen Endpunkten, einschließlich klinische Chemie und Histopathologie an Gewebe\&\#8208;, Urin\&\#8208; und Serumproben von m{\"a}nnlichen Ratten, welche mit Modellsubstanzen f{\"u}r Nephrotoxizit{\"a}t (Aristolochias{\"a}ure und Gentamicin) oder nephrotoxischen Arzneistoffkandidaten (PredTox Projekt) behandelt wurden, mittels qRT\&\#8208;PCR, Immunhistochemie und ELISA zu untersuchen. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Effekte auf Ebene der Gen\&\#8208; und Proteinexpression generell sehr gut mit den histopathologischen Ver{\"a}nderungen korrelieren. Sie konnten meist fr{\"u}her oder in niedrigeren Dosierungen als die traditionellen Nierenmarker BUN und Serumkreatinin detektiert werden. Eine erh{\"o}hte Expression und Exkretion von Kim\&\#8208;1 zeigte sich in allen Studien als eine der fr{\"u}hesten Antworten auf Sch{\"a}digung der proximalen Tubuli und stellt somit den empfindlichsten Biomarker dar. Die erh{\"o}hte Ausscheidung von Clusterin konnte teilweise vor einer ver{\"a}nderten Gen\&\#8208; und Proteinexpression im Gewebe detektiert werden und unterst{\"u}tzen die Verwendung von Clusterin als nicht\&\#8208;invasiven Biomarker. Obwohl eine gesteigerte Exkretion von Lipocalin\&\#8208;2 sehr fr{\"u}h nach Sch{\"a}digung des proximalen Tubulus detektiert werden konnte, ist diese nicht spezifisch f{\"u}r einen Nierenschaden. Dennoch k{\"o}nnte die vermehrte Expression/Ausscheidung von Lipocalin\&\#8208;2 als fr{\"u}he Antwort auf eine Entz{\"u}ndung oder einen Gewebeschaden eine sinnvolle Erg{\"a}nzung der routinem{\"a}ßigen Testung auf Toxizit{\"a}t darstellen. Ebenfalls konnte ein dosis\&\#8208; und zeitabh{\"a}ngiger Konzentrationsanstieg von einem Großteil der potentiellen Biomarker des „WideScreen™ Rat Kidney Toxicity Panels 1 and 2" im Urin beobachtet werden. Da jedoch die potentiellen Biomarker unterschiedliche Empfindlichkeiten besitzen und unter Umst{\"a}nden auch vom Mechanismus der Toxizit{\"a}t von Verbindungen abh{\"a}ngen, erscheint eine Kombination von verschiedenen Biomarkern zur fr{\"u}hzeitigen Erkennung von proximalen Nierensch{\"a}den sowie zur Verlaufskontrolle von Nierenerkrankungen sinnvoll. Durch die einfache Probenahme und leichte Bestimmung ist die Messung der neuen potentiellen Nierenbiomarker im Urin neben der Bestimmung der traditionellen Parameter der klinischen Chemie sowie der Histopathologie sinnvoll f{\"u}r die Identifizierung von Nierensch{\"a}digungen in pr{\"a}klinischen Studien.}, subject = {Biomarker}, language = {de} } @phdthesis{Sumski2014, author = {Sumski, Anna Magdalena}, title = {Adenosinrezeptoren auf Zervix-, Uterus- und Mammakarzinomzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-99332}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Adenosinrezeptoren werden auf nahezu allen K{\"o}rperzellen exprimiert und {\"u}bernehmen dort vielf{\"a}ltige und wichtige Funktionen. Auch auf diversen Tumorzelllinien konnten bereits Adenosinrezeptoren nachgewiesen und - je nach Subtyp - mit Pro- oder Anti-tumor-Effekten in Zusammenhang gebracht werden. In dieser Arbeit wurden Geb{\"a}rmutterhalskrebszellen sowie endometriale und triple-negative Brustkrebszellen auf Expression und m{\"o}gliche Funktionen von Adenosinrezep-toren untersucht. Da spezifische Antik{\"o}rper bis heute nicht verf{\"u}gbar sind, wurde ein pharmakologischer Ansatz mit subtypspezifischen Agonisten und Antagonisten gew{\"a}hlt. In Radioliganden-Bindungsassays, konnte nachgewiesen werden, dass sich auf der Zer-vixkarzinom-Zelllinie SiHa und der Brustkrebs-Zelllinie HCC1806 Adenosinrezeptoren des Subtyps A1 befinden. Die endometrialen Krebszelllinien Ishikawa und HEC-1-A exprimieren Rezeptoren vom Subtyp A1 und A2A. A3-Adenosinrezeptoren wurden auf keiner der untersuchten Zelllinien gefunden. Der Nachweis von A2B-Rezeptoren kann mit dem Radioliganden-Bindungsassay nicht erbracht werden, da bislang kein Radioligand bekannt ist, der eine ausreichende Affini-t{\"a}t besitzt, um diesen Subtyp zweifelsfrei nachweisen zu k{\"o}nnen. Obwohl die Mehrheit der untersuchten Zelllinien Adenosinrezeptoren exprimiert, konnte ein signifikanter Effekt auf die Adenylatcyclase bei Stimulation der auf den Zellen vorhandenen Adenosinrezeptoren nur bei den HEC-1-A-Zellen festgestellt werden. Auch auf funktionelle A2B-Rezeptoren fand sich im Adenylatcyclaseassy kein Hinweis. Im durchgef{\"u}hrten Kristallviolettassay zeigte sich ein proapoptotischer Effekt auf Ishi-kawa- und HEC-1-A-Zellen bei hohen Adenosin-Konzentrationen (100 µM). Die im BrdU-Assay gemessene Proliferationsrate hingegen {\"a}nderte sich nach Vorbehandlung mit Adenosin nicht. Das metabolisch stabilere NECA (in Kombination mit ADA) hatte im Kristallviolettassay einen st{\"a}rkeren Einfluss auf die Apoptoserate der jeweiligen Zelllinie als Adenosin und auch im BrdU-Assay sank die Menge an inkorporiertem BrdU. Ein Synergismus zwischen Stimulation von Adenosinrezeptoren und diversen Todesliganden bzw. Chemotherapeutika konnte nicht nachgewiesen werden. Freies extrazellul{\"a}res Adenosin kann auch aus dem Abbau von ATP generiert werden, wenn Zellen die Ektonukleotidasen CD39 und CD73 exprimieren. Aufgrund der im-munsuppressiven Wirkung von Adenosin k{\"o}nnen diese Enzyme T-Zell- und NK-Zellantworten im Mikromilieu von Tumoren hemmen. Die durchflusszytometrische Analyse von HEC-1-A- und Ishikawa-Zellen zeigte zwar, dass die Expression von CD39 und CD73 nach Stimulation der Adenosinrezeptoren unver{\"a}ndert blieb. Die Ex-pression von Enzymen, l{\"a}sst aber vermuten, dass die Zellen in vivo von Adenosin profi-tieren k{\"o}nnten. Angesichts der in vitro Daten, die allenfalls einen wachstumshemmen-den Effekt von Adenosin zeigten, k{\"o}nnte die vorrangige Wirkung von Adenosin im Tumormikromilieu tats{\"a}chlich auf der Inhibition von Immunantworten beruhen. M{\"o}g-licherweise w{\"u}rden die Rezeptoren dann in erster Linie als Sensoren dienen. Weitere Forschungsarbeit wird helfen, die Rolle der Adenosinrezeptoren im Tumorge-schehen vollst{\"a}ndig zu verstehen und m{\"o}glicherweise f{\"u}r die Krebstherapie nutzbar zu machen.}, subject = {Adenosinrezeptor}, language = {de} } @phdthesis{Fazeli2010, author = {Fazeli, Gholamreza}, title = {Signaling in the induction of genomic damage by endogenous compounds}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55634}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Reactive oxygen species (ROS) are continuously generated in cells and are involved in physiological processes including signal transduction but also their damaging effects on biological molecules have been well described. A number of reports in the literature implicate excessive oxidative stress and/or inadequate antioxidant defense in the pathogenesis of cancer, atherosclerosis, chronic and age related disorders. Several studies have indicated that activation of the renin-angiotensin-aldosterone-system can lead to the formation of ROS. Epidemiological studies have revealed higher renal cell cancer incidences and also higher cancer mortalities in hypertensive individuals. Recently, our group has shown that perfusion of the isolated mouse kidney with Ang II or treatment of several cell lines with Ang II leads to formation of DNA damage and oxidative base modifications. Here, we tried to scrutinize the pathway involved in genotoxicity of Ang II. We confirmed the genotoxicity of Ang II in two kidney cell lines of human origin. Ang II treatment led to the production of superoxide anions which we could hinder when we used the membrane permeable superoxide dismutase (SOD) mimetic TEMPOL. One of the enzymes which is activated in the cells after Ang II treatment and is able to produce ROS is NADPH oxidase. We demonstrated the activation of NADPH oxidase in response to Ang II by upregulation of its p47 subunit using RT-PCR. Also, pPhosphorylation of p47 subunit of NADPH oxidase after Ang II treatment was enhanced. Using two inhibitors we showed that NADPH oxidase inhibition completely prevents DNA damage by Ang II treatment. To differentiate between Nox2 and Nox4 isoforms of NADPH oxidase subunits in the genotoxicity of Ang II, we performed siRNA inhibition and found a role only for Nox4, while Nox2 was not involved. Next, we investigated PKC as a potential activator of NADPH oxidase. We showed that PKC becomes phosphorylated after Ang II treatment and also that inhibition of PKC hinders Ang II from damaging the cells. Our results from using several inhibitors of different parts of the pathway revealed that PKC activation in this pathway is dependent on the action of PLC on membrane phospholipids and production of IP3. IP3 binds to its receptor at endoplasmic reticulum (ER), opening a channel which allows calcium efflux into the cytoplasm. In this manner, both ER calcium stores and extracellular calcium cooperate so that Ang II can exert its genotoxic effect. PLC is activated by AT1R stimulation. We could also show that the genotoxicity of Ang II is mediated via AT1R signaling using the AT1R antagonist candesartan. In conclusion, here we have shown that Ang II is able to damage genomic damage in cell lines of kidney origin. The observed damage is associated with production of ROS. A decrease in Ang II-induced DNA damage was observed after inhibition of G-proteins, PLC, PKC and NADPH oxidase and interfering with intra- as well as extracellular calcium signaling. This leads to the following preliminary model of signaling in Ang II-induced DNA damage: binding of Ang II to the AT1 receptor activates PLC via stimulation of G-proteins, resulting in the activation of PKC in a calcium dependent manner which in turn, activates NADPH oxidase. NADPH oxidase with involvement of its Nox4 subunit then produces reactive oxygen species which cause DNA damage. Dopamine content and metabolism in the peripheral lymphocytes of PD patients are influenced by L-Dopa administration. The PD patients receiving a high dose of L-Dopa show a significantly higher content of dopamine in their lymphocytes compared to PD patients who received a low dose of L-Dopa or the healthy control. Central to many of the processes involved in oxidative stress and oxidative damage in PD are the actions of monoamine oxidase (MAO), the enzyme which is responsible for the enzymatic oxidation of dopamine which leadsing to production of H2O2 as a by-product. We investigated whether dopamine oxidation can cause genotoxicity in lymphocytes of PD patents who were under high dose L-Dopa therapy and afterward questioned the occurrence of DNA damage after dopamine treatment in vitro and tried to reveal the mechanism by which dopamine exerts its genotoxic effect. The frequency of micronuclei in peripheral blood lymphocytes of the PD patients was not elevated compared to healthy age-matched individuals, although the formation of micronuclei revealed a positive correlation with the daily dose of L-Dopa administration in patients who received L-Dopa therapy together with dopamine receptor agonists. In vitro, we describe an induction of genomic damage detected as micronucleus formation by low micromolar concentrations in cell lines with of different tissue origins. The genotoxic effect of dopamine was reduced by addition of the antioxidants TEMPOL and dimethylthiourea which proved the involvement of ROS production in dopamine-induced DNA damage. To determine whether oxidation of dopamine by MAO is relevant in its genotoxicity, we inhibited MAO with two inhibitors, trans-2-phenylcyclopropylamine hydrochloride (PCPA) and Ro 16-6491 which both reduced the formation of micronuclei in PC-12 cells. We also studied the role of the dopamine transporter (DAT) and dopamine type 2 receptor (D2R) signaling in the genotoxicity of dopamine. Inhibitors of the DAT, GBR-12909 and nomifensine, hindered dopamine-induced genotoxicity. These results were confirmed by treatment of MDCK and MDCK-DAT cells, the latter containing the human DAT gene, with dopamine. Only MDCK-DAT cells showed elevated chromosomal damage and dopamine uptake. Although stimulation of D2R with quinpirole in the absence of dopamine did not induce genotoxicity in PC-12 cells, interference with D2R signaling using D2R antagonist and inhibition of G-proteins, phosphoinositide 3 kinase and extracellular signal-regulated kinases reduced dopamine-induced genotoxicity and affected the ability of DAT to take up dopamine. Furthermore, the D2R antagonist sulpiride inhibited the dopamine-induced migration of DAT from cytosol to cell membrane. Overall, the neurotransmitter dopamine causes DNA damage and oxidative stress in vitro. There are also indications that high dose L-Dopa therapy might lead to oxidative stress. Dopamine exerts its genotoxicity in vitro upon transport into the cells and oxidization oxidation by MAO. Transport of dopamine by DAT has the central role in this process. D2R signaling is involved in the genotoxicity of dopamine by affecting activation and cell surface expression of DAT and hence modulating dopamine uptake. We provided evidences for receptor-mediated genotoxicity of two compounds with different mechanism of actions. The involvement of these receptors in many human complications urges more investigations to reveal whether abnormalities in the endogenous compounds-mediated signaling can play a role in the initiation of new conditions like carcinogenesis.}, subject = {Angiotensin II}, language = {en} } @article{MarinovichLutz1985, author = {Marinovich, M. and Lutz, Werner K.}, title = {Covalent binding of aflatoxin B\(_1\) to liver DNA in rats pretreated with ethanol}, series = {Experientia}, volume = {41}, journal = {Experientia}, number = {10}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55237}, pages = {1338 -- 1340}, year = {1985}, abstract = {Male Fischer F-344 rats were given ethanol in the drinking water and/or by single oral administration. Following this, the animals received p.o. 100 ng/kg of the hepatocarcinogen eHJaflatoxin BI (AFBI)' 24 h later, the level of DNA-bound AFBI was determined in the liver and was found not to be affected by any type of ethanol pretreatment. A cocarcinogenic effect of ethanol in the liver is therefore unlikely to be due to an effect on the metabolic activation and inactivation processes governing the formation of DNA-binding AFBI metabolites.}, subject = {Toxikologie}, language = {en} } @phdthesis{Vidal2013, author = {Vidal, Marie}, title = {b-adrenergic receptors and Erk1/2-mediated cardiac hypertrophy}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-83671}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Chronische Aktivierung von b-Adrenorezeptoren (b-ARs) durch Katecholamine ist ein Stimulus f{\"u}r kardiale Hypertrophie und Herzinsuffizienz. Ebenso f{\"u}hrt die Expression von b1-ARs oder Gas-Proteinen in genetisch modifizierten M{\"a}usen zu Hypertrophie und Herzinsuffizienz. Allerdings f{\"u}hrt die direkte Aktivierung dem Gas nachgeschalteten Komponenten des b-adrenergen Signalwegs wie z.B. die Aktivierung der Adenylylcyclase (AC) oder der Proteinkinase A (PKA) nicht im signifikanten Ausmaß zur Herzhypertrophie. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zus{\"a}tzlich zu dem klassischen Signalweg, auch weitere durch Gas-Proteine aktivierte Komponenten in die b-adrenerg vermittelte Hypertrophieentwicklung involviert sind. Interessanterweise wurde vor kurzem ein hypertropher Signalweg beschrieben, der eine direkte Involvierung von Gbg-Untereinheiten bei der Induktion von Herzhypertrophie durch die extrazellul{\"a}r-regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) zeigt: Nach Aktivierung Gaq-gekoppelter Rezeptoren binden Gbg-Untereinheiten an die aktivierte Raf/Mek/Erk Kaskade. Die Bindung der freigesetzten Gbg-Untereinheiten an Erk1/2 f{\"u}hrt zu einer Autophosphorylierung von Erk1/2 an Threonin 188 (bzw. Thr208 in Erk1; im folgenden ErkThr188-Phosphorylierung genannt), welche f{\"u}r die Vermittlung kardialer Hypertrophie verantwortlich ist. In dieser Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass auch die Aktivierung von b-ARs in M{\"a}usen sowie von isolierten Kardiomyozyten zur Induktion von ErkThr188-Phosphorylierung f{\"u}hrt. Dar{\"u}berhinaus f{\"u}hrte die {\"U}berexpression von Erk2 Mutanten (Erk2T188S und Erk2T188A), die nicht an Threonin 188 phosphoryliert werden k{\"o}nnen, zu einer deutlich reduzierten Hypertrophieantwort von Kardiomyozyten auf Isoproterenol. Auch die kardiale Expression der Erk2T188S Mutante im M{\"a}usen verminderte die Hypertrophieantwort auf eine 2-w{\"o}chige Isoproterenol-Behandlung deutlich: Die linksventrikul{\"a}re Wanddicke, aber auch interstitielle Fibrose und Herzinsuffizienzmarker wie z.B. BNP waren signifikant reduziert. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass tats{\"a}chlich ein Zusammenspiel von Ga und Gbg-vermittelten Signalen zur Induktion von ErkThr188-Phosphorylierung und damit zur Induktion von b-adrenerg vermittelter Hypertrophie notwendig ist. W{\"a}hrend die Hemmung von Gbg-Signalen mit dem C-Terminus der GRK2 oder die Hemmung von Adenylylzyklase eine ErkThr188-Phosphorylierung und eine Hypertrophieantwort nach Isoprenalingabe effektiv reduzierten, f{\"u}hrt die alleinige Aktivierung von Adenylylzyklase nicht zu einer Hypertrophieantwort. Diese Ergebnisse k{\"o}nnten bei der Entwicklung neuer m{\"o}glicher therapeutischen Strategien zur Therapie b-adrenerg induzierter Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz helfen.}, subject = {Adrenerger Rezeptor}, language = {en} } @article{JesaitisKlotz1993, author = {Jesaitis, A. J. and Klotz, Karl-Norbert}, title = {Cytoskeletal regulation of chemotactic receptors: Molecular complexation of N-formyl peptide receptors with G proteins and actin}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-79673}, year = {1993}, abstract = {Signal transduction via receptors for N-formylmethionyl peptide chemoattractants (FPR) on human neutrophils is a highly regulated process. It involves direct interaction of receptors with heterotrimeric G-proteins and may be under thc control of cytoskeletal clemcnts. Evidencc exists suggesting that thc cytoskeleton and/or the membrane ske1eton determines the distribution of FPR in the plane of the plasma membrane, thus controlling FPR accessibility to different protcins in functionally distinct membrane domains. In desensitized cells, FPR are restricted to domains which are depleted of G proteins but enriched in cytoskeletal proteins such as actin and fodrin. Thus, the G protein signal transduction partners of FPR become inacccssible to the agonist-occupied receptor, preventing cell activation. We are investigating the molecular basis for the interaction of FPR with the membrane skeleton, and our results suggest that FPR, and possibly other receptors, may directly bind to cytoskeletal proteins such as actin.}, subject = {Immunologie}, language = {en} } @article{Lutz1990, author = {Lutz, Werner K.}, title = {Dosis-Wirkungs-Beziehungen in der chemischen Kanzerogenese}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-80046}, year = {1990}, abstract = {Ich habe versucht darzulegen, daß mechanistische {\"U}berlegungen zur Extrapolation der Dosis-WirkungsBeziehung herangezogen werden k{\"o}nnen. Ein nichtlinearer Verlauf ist nicht nur bei den epigenetischen Kanzerogenen wahrscheinlich, sondern auch bei den DNA-bindenden. Echte Schwellen sind aber nur in solchen F{\"a}llen zu erwarten, wo kein endogenes Korrelat besteht. Immerhin k{\"o}nnen auch steile Nichtlinearit{\"a}ten zu einer drastischen Risikoreduktion f{\"u}hren, so daß die Anstrengungen dahin gehen sollten, die Steigung und den Bereich des {\"u}berproportionalen Abfalls experimentell zu zeigen. In einer heterogenen Population kann die 0 0- sis-Wirkungs-Kurve zus{\"a}tzliche "Wellen" bekommen und wird dadurch grunds{\"a}tzlich flacher. Im Extremfall ergibt sich eine lineare Dosis-Wirkungs-Beziehung unabh{\"a}ngig vom Wirkmechanismus des Kanzerogens. Diese Proportionalit{\"a}t zwischen tiefster Dosis und Effekt wird bei genotoxischen Kanzerogenen aus mechanistischen Gr{\"u}nden schon f{\"u}r eine homogene Population postuliert, doch kann dies in einer heterogenen Population auch bei epigenetischen Kanzerogenen in Frage kommen.}, subject = {Toxikologie}, language = {de} } @inproceedings{SagelsdorffLutz1987, author = {Sagelsdorff, P. and Lutz, Werner K.}, title = {Sensitivity of DNA and nucleotides to oxidation by permanganate and hydrogen peroxide}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-80062}, year = {1987}, abstract = {no abstract available}, subject = {Toxikologie}, language = {en} } @inproceedings{Lutz1987, author = {Lutz, Werner K.}, title = {Quantitative evaluation of DNA-binding data in vivo for low-dose extrapolations}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-80079}, year = {1987}, abstract = {no abstract available}, subject = {Toxikologie}, language = {en} } @inproceedings{Lutz1984, author = {Lutz, Werner K.}, title = {Structural characteristics of compounds that can be activated to chemically reactive metabolites: use for a prediction of a carcinogenic potential}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-80105}, year = {1984}, abstract = {Many mutagens and carcinogens act via covalent interaction of metabolic intermediates with DNA in the target cell. This report groups those structural elements which are often found to form the basis for a metabolism to such chemically reactive metabolites. ~mpounds which are chemically reactive per se and which do not require metabolic activation form group 1. Group 2 compri~es of olefins and aromatic hydrocarbons where the oxidation via an epoxide can be responsible for the generation of reactive species. Aromatic amines, hydrazines, and nitrosamirres form group 3 requiring an oxidation of a nitrogen atom or of a carbon atom in alpha position to a nitrosated amine. Group 4 compounds are halogenated hydrocarbons which can either give rise to radicals or can form an ·olefin (group 2) upon dehydrohalogenation. Group 5 compounds depend upon some preceding enzymatic activity either not available in the target cell or acting on positions in the molecule which are not directly involved in the subsequent formation of electrophilic atoms. Examples for each group are taken from the "List of Chemieals and Irrdustrial Processes Associated with Cancer in Humans" as compiled by the International Agency for the Research on Cancer, and it is shown that 91\% of the organic carcinogens would have been detected on the basis of structural elements characteristic for group 1-5. As opposed to this very high sensitivity, the specificity ( the true negative fraction) of using this approach as a short-term test for carcinogenicity is shown to be bad because detoxification pathways have so far not been taken into account. These competing processes are so complex, however, that either only very extensive knowledge about pharmacokinetics, stability, and reactivity will be required or that in vivo systems have to be used to predict, on a quantitative basis, the darnage expected on the DNA. DNA-binding experiments in vivo are presented with benzene and toluene to demonstrate one possible way for an experimental assessment and it is shown that the detoxification reaction at the methyl group available only in toluene gives rise to a reduction by at least a factor of forty for the binding to rat liver DNA. This quantitative approach available with DNA-binding tests in vivo, also allows evaluation as to whether reactive metabolites and their DNA binding are always the most important single activities contributing to the overall carcinogenicity of a chemical. With the example of the livertumor inducing hexachlorocyclohexane isomers it is shown that situations will be found where reactive metabolites are formed and DNA binding in vivo is measurable but where this activity cannot be the decisive mode of carcinogenic action. It is concluded that the lack of structural elements known to become potentially reactive does not guarantee the lack of a carcinogenic potential.}, subject = {Toxikologie}, language = {en} } @phdthesis{EmamiNemini2012, author = {Emami-Nemini, Alexander Darius}, title = {Differential parathyroid hormone receptor signaling directed by adaptor proteins}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72369}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {The superfamily of G protein-coupled receptors (GPCR) regulates numerous physiological and pathophysiological processes. Hence GPCRs are of significant interest for pharmacological therapy. Embedded into cytoplasmic membranes, GPCRs represent the core of large signaling complexes, which are critical for transduction of exogenous stimuli towards activation of downstream signaling pathways. As a member of the GPCR family B, the parathyroid hormone receptor (PTHR) activates adenylyl cyclases, phospholipases C β as well as mitogen-activated protein kinase-dependent signaling pathways, thereby mediating endocrine and paracrine effects of parathyroid hormone (PTH) and parathyroid hormone-related peptide (PTHrP), respectively. This regulates, calcium homeostasis, bone metabolism and bone development. Paradoxically, PTH is able to induce both catabolic and anabolic bone metabolism. The anabolic effect of PTH is successfully applied in the therapy of severe osteoporosis. Domination of anabolic or catabolic bone-metabolism is entailed by temporal and cell-type specific determinants. The molecular bases are presumably differential arrangements of adaptor proteins within large signaling complexes that may lead to differential activation of signaling pathways, thereby regulating physiological effects. The molecular mechanisms are largely unclear; thus, there is significant interest in revealing a better understanding of PTHR-related adaptor proteins. To identify novel adaptor proteins which direct PTHR signaling pathways, a proteomic screening approach was developed. In this screening, vav2, a guanine-nucleotide exchange factor (GEF) for small GTPases which regulates cytoskeleton reorganization, was found to interact with intracellular domains of PTHR. Evidence is provided that vav2 impairs PTH-mediated phospholipase C β (PLCβ) signaling pathways by competitive interactions with G protein αq subunits. Vice versa, PTH was shown to regulate phosphorylation and subsequent GEF activity of vav2. These findings may thus shed new light on the molecular mechanisms underlying the effects of PTH on bone metabolism by PLC-signaling, cell migration and cytoskeleton organization. In addition to the understanding of intracellular molecular signaling processes, screening for ligands is a fundamental and demanding prerequisite for modern drug development. To this end, ligand binding assays represent a fundamental technique. As a substitution for expensive and potentially harmful radioligand binding, fluorescence-based ligand-binding assays for PTHR were developed in this work. Based on time-resolved fluorescence, several assay variants were established to facilitate drug development for the PTHR.}, subject = {G-Protein gekoppelte Rezeptoren}, language = {en} } @article{CaviezelAeschbachLutzetal.1984, author = {Caviezel, M. and Aeschbach, A. P. and Lutz, Werner K. and Schlatter, C.}, title = {Reduction of covalent binding of aflatoxin B1 to rabbit liver DNA after immunization against this carcinogen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-80116}, year = {1984}, abstract = {The covalent binding of [3H]aflatoxin B1 (AF) to liver DNA was determined, 6 h after oral administration to male rabbits. A Covalent Binding Index, CBI (flmol AF/mol DNA-P)/(mmol AF/kg b. w.) = 8,500 was found. Pretreatment of rabbits with AF coupled to bovine serum albumin in Freund's adjuvant led to the production of AF-directed antibodies. Administration of [3H]AF to such immunized rabbits resulted in a CJH of only 2,500, i.e., the iiDJ{.lUnization provided a protection by a factor of more than 3. Although this is encouraging evidence for the potential of active immunization against genotoxic carcinogens, a nurober of pointswill have to be clarified, such as the time course for the DNA binding and the question of a possible shift to other target cells.}, subject = {Krebs}, language = {en} } @article{LutzSchlatter1979, author = {Lutz, Werner K. and Schlatter, C.}, title = {In vivo covalent binding of chemicals to DNA as a short-term test for carcinogenicity}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-80127}, year = {1979}, abstract = {The determination of a covalent binding of radioactive chemieals to DNA in intact mammalian organisms is proposedas a short-term test for carcinogenicity. The effectiveness of covalent binding to rat liver DNA correlates well with the hepatocarcinogenicity known from long-term bioassays. The binding indices range over more than five orders of rriagnitude between the strongest hepatocarcinogen aflatoxin B 1 and the limit of detection of a binding with 100 f-LCi 14C-labelled chemical. The order of magnitude of binding is therefore a surprisingly good quantitative measure for carcinogenicity. The pattern of DNA binding sites is important especially for small alkylating agents where the determination of total binding might indicate a higher carcinogenic potency than is actually observed.}, subject = {DNA}, language = {de} } @phdthesis{Mueller2014, author = {M{\"u}ller, Markus}, title = {Effekte kardioprotektiver Zyklopeptide auf Funktion und Morphometrie des Herzens im Rattenmodell der dilatativen Immunkardiomyopathie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-101935}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Kardiomyopathien sind Erkrankungen des Herzmuskels, die mit einer kardialen Funktionsst{\"o}rung einhergehen. Formen, die ohne erkennbare Ursache zu einer progredienten Dilatation und Reduktion der Kontraktilit{\"a}t des linken Ventrikels f{\"u}hren, werden als idiopathische dilatative Kardiomyopathie (DCM) bezeichnet. Sie ist der Hauptgrund f{\"u}r schwere Herzinsuffizienz und die damit assoziierten Einschr{\"a}nkungen der Lebensqualit{\"a}t bei jungen Erwachsenen. Neben der beeintr{\"a}chtigten kardialen Funktion weisen diese Patienten oftmals auch Ver{\"a}nderungen im Bereich der humoralen und zellul{\"a}ren Immunit{\"a}t auf. Ein Teil der Patienten entwickelt Autoantik{\"o}rper, die sich gegen den kardialen β1-adrenergen Rezeptor richten und ihn {\"a}hnlich wie der nat{\"u}rliche Ligand Adrenalin aktivieren. Hieraus resultiert eine chronische {\"U}berstimulation des Rezeptors, die {\"u}ber eine initiale Hypertrophie dann zu einer eingeschr{\"a}nkten Pumpfunktion f{\"u}hrt. Nachdem sich die Therapie der Antik{\"o}rper-vermittelten Immunkardiomyopathie bisher auf die Behandlung der Herzinsuffizienz und die Kontrolle der Herz-insuffizienzsymptome beschr{\"a}nkt, k{\"o}nnten β1-ECII-homologe Peptide als Antik{\"o}rper-F{\"a}nger bei Antik{\"o}rper-positiven Patienten nun einen kausalen Therapieansatz darstellen. In diesem Zusammenhang wurden ein aus 25 Aminos{\"a}uren bestehendes zyklisches Peptid, eine aus 18 Aminos{\"a}uren bestehende Zyklopeptid-Mutante und ihre jeweiligen linearen {\"A}quivalente im Rattenmodell auf Antik{\"o}rper-neutralisierende Effekte und potentielle therapeutische Wirksamkeit getestet. Das Rattenmodell ist hierf{\"u}r besonders geeignet, da die Aminos{\"a}uresequenz der funktionell wichtigen zweiten extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne des β1-adrenergen Rezeptors (β1-ECII) bei Mensch und Ratte absolut identisch ist. Auf immunologischer Ebene konnte der Titer der krankheitsinduzierenden β1-ECII-Antik{\"o}rper bereits nach der ersten Applikation zyklischer Peptide relevant gesenkt werden und nahm im weiteren Verlauf der Behandlung kontinuierlich ab. Nach Zyklopeptidgabe kam es am Herzen zu einer Reduktion des linksventrikul{\"a}ren Durchmessers und zu einer fast vollst{\"a}ndigen Normalisierung der anatomischen Proportionen. Auf die Morphologie der Myozyten selbst und auch den Kollagengehalt des Gewebes hatte die Zyklopeptidtherapie keinen wesentlichen Einfluss. Die funktionellen Eigenschaften des Herzens ließen sich durch die Neutralisation stimulatorischer β1-ECII-Antik{\"o}rper mittels intraven{\"o}ser Zyklopeptidapplikation deutlich verbessern: Die Verk{\"u}rzungsfraktion des linken Ventrikels und der Herzindex als Parameter f{\"u}r die kardiale Leistungsf{\"a}higkeit konnten durch die Behandlung wieder weitgehend normalisiert werden. Diese im Tiermodell erzielten Ergebnisse lassen einen therapeutischen Effekt der Zyklopeptide vermuten. Der Ansatz einer spezifisch gegen Antik{\"o}rper gerichteten Therapie zur Behandlung von Patienten mit β1-Antik{\"o}rper-positiver Herzinsuffizienz erscheint daher vielversprechend.}, subject = {Dilatative Kardiomyopathie}, language = {de} } @article{KannenHintzscheZanetteetal.2012, author = {Kannen, Vinicius and Hintzsche, Henning and Zanette, Dalila L. and Silva Jr., Wilson A. and Garcia, Sergio B. and Waaga-Gasser, Anna Maria and Stopper, Helga}, title = {Antiproliferative Effects of Fluoxetine on Colon Cancer Cells and in a Colonic Carcinogen Mouse Model}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-75879}, year = {2012}, abstract = {The antidepressant fluoxetine has been under discussion because of its potential influence on cancer risk. It was found to inhibit the development of carcinogen-induced preneoplastic lesions in colon tissue, but the mechanisms of action are not well understood. Therefore, we investigated anti-proliferative effects, and used HT29 colon tumor cells in vitro, as well as C57BL/6 mice exposed to intra-rectal treatment with the carcinogen N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) as models. Fluoxetine increased the percentage of HT29 cells in the G0/G1 phase of cell-cycle, and the expression of p27 protein. This was not related to an induction of apoptosis, reactive oxygen species or DNA damage. In vivo, fluoxetine reduced the development of MNNG-induced dysplasia and vascularization-related dysplasia in colon tissue, which was analyzed by histopathological techniques. An anti-proliferative potential of fluoxetine was observed in epithelial and stromal areas. It was accompanied by a reduction of VEGF expression and of the number of cells with angiogenic potential, such as CD133, CD34, and CD31-positive cell clusters. Taken together, our findings suggest that fluoxetine treatment targets steps of early colon carcinogenesis. This confirms its protective potential, explaining at least partially the lower colon cancer risk under antidepressant therapy.}, subject = {Medizin}, language = {en} } @phdthesis{Schmidt2013, author = {Schmidt, Tobias}, title = {Biotransformation of trans-1-chloro-3,3,3-trifluoropropene and 2,3,3,3-tetrafluoropropene}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-78579}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {The novel refrigerant 2,3,3,3-tetrafluoropropene (HFO-1234yf) as well as the novel foam blowing and precision cleaning agent trans-1-chloro-3,3,3-trifluoropropene (trans-HCFO-1233zd) are both chlorofluorocarbon replacements with low GWPs and a short atmospheric life time. Whereas the hydrofluoroolefin HFO-1234yf has no negative effect on stratospheric ozone due to the lack of chlorine in its structure, the hydrochlorofluoroolefine trans-HCFO-1233zd exhibits a very low potential for ozone depletion (ODP). This is approximately 100 times lower than the ozone depletion potential of precursor compounds such as 1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane (CFC-113). Principle aims of this thesis were to investigate the unknown metabolism of the new solvent trans-HCFO-1233zd and to further investigate a possible biotransformation based toxicity of HFO-1234yf observed in rabbits. Therefore study specimens of different in vitro and in vivo studies with trans-HCFO-1233zd and HFO-1234yf were analyzed for metabolites using 19FNMR spectroscopy, LC-MS/MS spectrometry and GC/MS spectrometry. Metabolites were identified by comparison with purchased or synthesized standard substances. Excretion kinetics of the predominant metabolites were determined by LC-MS/MS quantification,inorganic fluoride was determined by potentiometry. Moreover cytochrome P-450 2E1 and 3A4 liver enzyme activities were measured in a multi-exposure study with HFO-1234yf. ...}, subject = {Propenderivate}, language = {en} } @phdthesis{Saxena2011, author = {Saxena, Ambrish}, title = {Role of the novel protein tyrosine phosphatase AUM for cell adhesion}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65503}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Cell adhesion and migration are essential for development and homeostasis. Adhesion to the extracellular matrix occurs at specialized plasma membrane domains where transmembrane adhesion receptors, signaling proteins such as kinases and phosphatases, and a large number of adaptor proteins interact with the cytoskeleton in a tightly regulated and synchronized fashion. Whereas altered cell adhesion and migration are known to be important in cardiovascular disease and malignant tumors, the target proteins and molecular interactions that regulate these complex processes still remain incompletely understood. Whereas numerous kinases are known to regulate cell adhesion dynamics, information about the involved protein phosphatases is still very limited. A newly emerging phosphatase family contains the unconventional active site sequence DXDX(T/V) and belongs to the haloacid dehalogenase (HAD) superfamily of hydrolases. Our laboratory has recently discovered AUM, a novel phosphatase that belongs to this poorly characterized enzyme family. Initial findings pointed toward a potential involvement of AUM in the regulation of cell adhesion to the extracellular matrix. The objective of the present study was to study the potential role of AUM in cell adhesion. We could show that cells stably depleted of AUM are characterized by accelerated adhesion on immobilized fibronectin. To confirm these findings, we used an siRNA-based approach for the acute depletion of AUM and observed a similar phenomenon. Rescue experiments were performed with stably AUM-depleted cells to ensure that the above mentioned effects are indeed AUM specific. We observed that the re-addition of AUM normalizes cellular adhesion kinetics on fibronectin. These results clearly show that AUM exerts important functions in cell-matrix adhesion. To investigate the molecular basis of these effects, we have characterized integrin expression patterns using flow cytometry. Interestingly, fibronectin-stimulated AUM-depleted cells are characterized by an increase in the cell surface expression of conformationally active 1-integrins. Consistent with the important role of 1-integrins in the regulation of RhoA activity, we also observed a specific increase in RhoA-GTP, but not Rac1-GTP-levels during cell adhesion to fibronectin. Consistent with these findings and with the important role of RhoA for focal adhesion maturation, AUM depleted cells showed more elongated and more centripetally oriented focal adhesions as compared to control cells when spread on fibronectin. Taken together, this study has revealed an important role of AUM for cell-matrix adhesion. Our findings strongly suggest that AUM functions as a negative regulator of 1-integrins and RhoA-dependent cytoskeletal dynamics during cell adhesion.}, subject = {Proteintyrosinphosphatase}, language = {en} } @phdthesis{Schlippverh:Woelfel2011, author = {Schlipp [verh.: W{\"o}lfel], Angela}, title = {Characterization of anti-beta1-adrenoceptor antibodies with F{\"o}rster resonance energy transfer microscopy}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67162}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Dilated cardiomyopathy (DCM) represents an important subgroup of patients suffering from heart failure. The disease is supposed to be associated with autoimmune mechanisms in about one third of the cases. In the latter patients functionally active conformational autoantibodies directed against the second extracellular loop of the β1-adrenergic receptor (AR, β1ECII-aabs) have been detected. Such antibodies chronically stimulate the β1-AR thereby inducing the adrenergic signaling cascade in cardiomyocytes, which, in the long run, contributes to heart failure progression. We analyzed the production of cAMP after aab-mediated β1-AR activation in vitro using a fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay. This assay is based on HEK293 cells stably expressing human β1-AR as well as the cAMP-sensor Epac1-camps. The assay showed a concentration-dependent increase in intracellular cAMP upon stimulation with the full agonist (-) isoproterenol. This response was comparable to results obtained in isolated adult murine cardiomyocytes and was partially blockable by a selective β1-AR antagonist. In the same assay poly- and monoclonal anti-β1ECII-abs (induced in different animals) could activate the adrenergic signaling cascade, whereas isotypic control abs had no effect on intracellular cAMP levels. Using the same method, we were able to detect functionally activating aabs in the serum of heart failure patients with ischemic and hypertensive heart disease as well as patients with DCM, but not in sera of healthy control subjects. In patients with DCM we observed an inverse correlation between the stimulatory potential of anti-β1-aabs and left ventricular pump function. To adopt this assay for the detection of functionally activating anti-β1ECII-aabs in clinical routine we attempted to establish an automated large-scale approach. Neither flow cytometry nor FRET detection with a fluorescence plate reader provided an acceptable signal-to-noise ratio. It was possible to detect (-) isoproterenol in a concentration-dependent manner using two different FRET multiwell microscopes. However, due to focus problems large-scale detection of activating anti-β1ECII-abs could not be implemented. Neutralization of anti-β1-aabs with the corresponding epitope-mimicking peptides is a possible therapeutic approach to treat aab-associated autoimmune DCM. Using our FRET assay we could demonstrate a reduction in the stimulatory potential of anti-β1ECII-abs after in vitro incubation with β1ECII-mimicking peptides. Cyclic (and to a lesser extent linear) peptides in 40-fold molar excess acted as efficient ab-scavengers in vitro. Intravenously injected cyclic peptides in a rat model of DCM also neutralized functionally active anti-β1ECII-abs efficiently in vivo. For a detailed analysis of the receptor-epitope targeted by anti-β1ECII-abs we used sequentially alanine-mutated β1ECII-mimicking cyclic peptides. Our data revealed that the disulfide bridge between the cysteine residues C209 and C215 of the human β1-AR appears essential for the formation of the ab-epitope. Substitution of further amino acids relevant for ab-binding in the cyclic scavenger peptide by alanine reduced its affinity to the ab and the receptor-activating potential was blocked less efficiently. In contrast, the non-mutant cyclic peptide almost completely blocked ab-induced receptor activation. Using this ala-scan approach we were able to identify a "NDPK"-epitope as essential for ab binding to the β1ECII. In summary, neutralization of conformational activating anti-β1ECII-(a)abs by cyclic peptides is a plausible therapeutic concept in heart failure that should be further exploited based on the here presented data.}, subject = {Adrenerger Rezeptor}, language = {en} } @article{GonzalezCaleroCuberoKlotz1991, author = {Gonzalez-Calero, G. and Cubero, A. and Klotz, Karl-Norbert}, title = {Characterization and photoaffinity labeling of A1 adenosine receptors in coated visicles form bovine brain}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-86004}, year = {1991}, abstract = {The antagonist (3 II ) DPCPX exhi bitcd a Kd of 0. 4 nM at coalcd vcsicles from bovine brain. Agonist compelition for ( 3 11) DPCPX bind in~ revcaled two affini ty slales for gonists. The pholoaffinity probe I25 I -AHPIA specifically labelled a band with a molecular weight of 35 Kd.}, subject = {Pharmakologie}, language = {en} } @phdthesis{Eman2013, author = {Eman, Maher Othman Sholkamy}, title = {In Vitro and In Vivo Analysis of Insulin-Induced Oxidative Stress and DNA Damage}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-69274}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Hyperinsulinemia, a condition with excessively high insulin blood levels, is related to an increased cancer incidence. Diabetes mellitus, metabolic syndrome, obesity and polycystic ovarian syndrome are the most common of several diseases accompanied by hyperinsulinemia. Since an elevated cancer risk especially for colon and kidney cancers, was reported for those patients, we investigated for the first time the induction of genomic damage by insulin mainly in HT29 (human colon cells), LLC-PK1 (pig kidney cells), HK2 (human kidney cells) and peripheral lymphocytes, and to confirm the genotoxicity of insulin in other cells from different tissues. To ascertain that the insulin effects were not only limited to permanent cell lines, rat primary colon, kidney, liver and fatty tissue cells were also studied. To connect the study and the findings to in vivo conditions, two in vivo models for hyperinsulinemia were used; Zucker diabetic fatty rats in a lean and diabetic state infused with different insulin concentrations and peripheral lymphocytes from type 2 diabetes mellitus patients. First, the human colon adenocarcinoma cells (HT29) showed significant elevation of DNA damage using comet assay and micronucleus frequency analysis upon treatment with 5 nM insulin in standard protocols. Extension of the treatment to 6 days lowered the concentration needed to reach significance to 0.5-1 nM. Insulin enhanced the cellular ROS production as examined by the oxidation of the dyes 2´,7´-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA) and dihydroethidium (DHE). The FPG modified comet assay and the reduction of damage by the radical scavenger tempol connected the insulin-mediatedDNA damage to ROS production. To investigate the sources of ROS upon insulin stimulation, apocynin and VAS2870 as NADPH oxidase inhibitors and rotenone as mitochondrial inhibitor were applied in combination with insulin and all of them led to a reduction of the genomic damage. Investigation of the signaling pathway started by evaluation of the binding of insulin to its receptor and to the IGF-1 receptor. The results showed the involvement of both receptors in the signaling mechanism. Following the activation of both receptors, PI3K activation occurs leading to phosphorylation of AKT which in turn activates two pathways for ROS production, the first related to mitochondria and the second through activation of Rac1 , resulting in the activation of Nox1. Both pathways could be activated through AKT or through the mitochondrial ROS which in turn could activates Nox1. Studying another human colon cancer cell line, Caco-2 and rat primary colon cells in vitro confirmed the effect of insulin on cellular chromatin. We conclude that pathophysiological levels of insulin can cause DNA damage in colon cells, which may contribute to the induction or progression of colon cancer. Second, in kidney cells, insulin at a concentration of 5 nM caused a significant increase in DNA damage in vitro. This was associated with the formation of reactive oxygen species (ROS). In the presence of antioxidants, blockers of the insulin and IGF-1 receptors, and a phosphatidylinositol 3-kinases (PI3K) inhibitor, the insulin mediated DNA damage was reduced. Phosphorylation of AKT was increased and p53 accumulated. Inhibition of the mitochondrial and NADPH oxidase related ROS production reduced the insulin mediated damage. In primary rat cells insulin also induced genomic damage. HK2 cells were used to investigate the mechanistic pathway in the kidney The signaling is identical to the one in the colon cells untill the activation of the mitochondrial ROS production, because after the activation of PI3K activation of Nox4 occurs at the same time across talk between mitochondria and Nox4 activation has been suggested and might play a role in the observed effects. In the in vivo model, kidneys from healthy, lean ZDF rats, which were infused with insulin to yield normal or high blood insulin levels, while keeping blood glucose levels constant, the amounts of ROS and p53 were elevated in the high insulin group compared to the control level group. ROS and p53 were also elevated in diabetic obese ZDF rats. The treatment of the diabetic rats with metformin reduced the DNA oxidation measured as 8-oxodG as well as the ROS production in that group. HL60 the human premyelocytic cells and cultured lymphocytes as models for the hemopoietic system cells showed a significant induction for DNA damage upon treatment with insulin. The diabetic patients also exhibited an increase in the micronucleus formation over the healthy individuals. In the present study, we showed for the first time that insulin induced oxidative stress resulting in genomic damage in different tissues, and that the source of the produced ROS differs between the tissues. If the same mechanisms are active in patients, hyperinsulinemia might cause genomic damage through the induction of ROS contributing to the increased cancer risk, against which the use of antioxidants as well as mitochondrial and NADPH oxidase inhibitors might exert protective effects with cancer preventive potential under certain conditions. Normal healthy human plasma insulin concentrations are in the order of 0.04 nM after overnight fasting and increase to less than about 0.2 nM after a meal. Pathophysiological levels can reach 1 nM and can stay above 0.2 nM for the majority of the daytime yielding condictions close to the insulin concentrations determined in the present study. Whether the observed effects also occur in vivo and whether they actually initiate or promote tumor formation remains to be determined. However, if proof of that can be obtained, our experiments with inhibitors indicate chances for pharmacological intervention applying antioxidants or enzyme inhibitors. It will not be the aim to reduce ROS in any case or as much as possible because ROS have now been recognized as important signaling molecules and participatants in immune defense, but a reduction to physiological levels instead of pathophysiological levels in the context of a disease associated with ROS overproduction might be beneficial.}, subject = {Insulin}, language = {en} } @article{StopperKirchnerSchiffmannetal.1994, author = {Stopper, Helga and Kirchner, S. and Schiffmann, D. and Poot, M.}, title = {Cell cycle disturbance in relation to micronucleus formation induced by the carcinogenic estrogen diethylstilbestrol}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-82250}, year = {1994}, abstract = {In addition to its tumor-promoting activity in honnone-receptive tissue, the carcinogenic estrogen diethylstilbestrol (DES) has been found to induce cell transformation, aneuploidy and micronucleus formation in mammalian cells. The majority of these micronuclei contained whole chromosomes and were fonned during mitosis. Here a possible relationship between a disturbance in cell cycle progression and micronucleus fonnation is investigated by exposing Syrian hamster embryo (SHE) cells to DES. Continuous bromodeoxyuridine labeling followed by bivariate Hoechst 33258/ethidium bromide flow cytometry was employed for analysis of cell cycle transit and related to the time course of micronucleus formation. Treatment of SHE cells with DES resulted in delayed and impaired cell activation (exit from the GO/G 1 phase), impaired S-phase transit and, mainly, G2-phase traverse. Cells forming micronuclei, on the other hand, were predominantly in G2 phase during DES treatment. These results suggest that impairment of Sand G2 transit may involve a process ultimately leading to micronucleus formation.}, subject = {Toxikologie}, language = {en} } @article{StopperZimmermannWecker1985, author = {Stopper, Helga and Zimmermann, U. and Wecker, E.}, title = {High yields of DNA-transfer into mouse L-cells by electropermeabilization}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-82408}, year = {1985}, abstract = {no abstracts available}, subject = {Toxikologie}, language = {en} }