Dokument-ID Dokumenttyp Verfasser/Autoren Herausgeber Haupttitel Abstract Auflage Verlagsort Verlag Erscheinungsjahr Seitenzahl Schriftenreihe Titel Schriftenreihe Bandzahl ISBN Quelle der Hochschulschrift Konferenzname Quelle:Titel Quelle:Jahrgang Quelle:Heftnummer Quelle:Erste Seite Quelle:Letzte Seite URN DOI Abteilungen OPUS4-1525 Dissertation Peters, Katrin Mechanismus der Polymerase-Inkorporation in foamyvirale Partikel In allen Retroviren, mit Ausnahme der Foamyviren (FV), wird das Pol-Protein als Gag-Pol-Fusionsprotein exprimiert. Dieser Mechanismus sichert die Inkorporation von Pol in das virale Partikel. FV unterscheiden sich in vielen Merkmalen von den Orthoretroviren, unter anderem wird das Pol-Protein von einer eigenen gespleißten mRNA translatiert. Diese von Gag unabhängige Expression führt zu der Frage nach dem Mechanismus der Pol-Inkorporation in foamyvirale Partikel. Unter Nutzung eines transienten FV-Vektor Transfektionssystems, das auf der Kotransfektion von vier separaten Expressionseinheiten zur Produktion von Gag, Pol, Env und einer Vektor-RNA beruht, konnte gezeigt werden, daß (prä)genomische RNA für die effiziente Partikelinkorporation von Pol notwendig ist. Protein-Protein-Interaktionen zwischen Pol und Gag sind deshalb nicht ausreichend für die Bildung vollständiger Viruspartikel. Im nächsten Schritt wurde untersucht, ob es möglich ist spezifische Sequenzen in der Virus-RNA zu identifizieren, die für die Inkorporation des Pol-Proteins essentiell sind. Empririsch wurden bereits zwei cis-aktive Sequenzen (CAS) identifiziert, die, zusammen mit den long terminal repeats (LTR) und benachbarten Sequenzen für die reverse Transkription und Integration, ausreichend für effizienten FV-Vektortransfer sind. Daher müssen RNA-Elemente, die für die Verpackung des Pol-Proteins nötig sind, in diesen beiden CAS liegen. Durch das Einführen von Deletionen und anschließender Analyse der Proteinzusammensetzung und des RNA-Gehaltes von Viruspartikeln, wurden die für die Pol-Inkorporation essentiellen RNA-Sequenzen identifiziert. In dieser Arbeit konnten zwei RNA-Sequenzelemente definiert werden, die für die Partikelinkorporation des Pol-Proteins notwendig sind, diese wurden PES (Pol encapsidation sequences) genannt. Keines der beiden Sequenzelemente hat einen signifikanten Einfluß auf die Verpackung der Vektor-RNA, wohingegen bereits die Deletion einer der PES zu einer signifikanten Reduktion der Pol-Verpackung führt. Eine PES, die möglicherweise nur 30 nt umfaßt, liegt unmittelbar 5' der PBS (Nukleotide 318-345, relativ zu PFV Transkriptionsstart) und die zweite PES mit einer wahrscheinlichen Länge von 370 nt liegt in der 3' Region des pol-Gens (Nukleotide 4980-5351). Diese Ergebnisse führen zu einem Model, in dem die (prä)genomische RNA von FV als eine Art Brückenmolekül zwischen Gag und Pol fungiert. Die RNA interagiert auf der einen Seite über die PES mit Pol und auf der anderen Seite mit Gag über die GRI-Box im carboxyterminalen Bereich des Proteins und vermittelt so die Inkorporation des Pol-Proteins in das Gag-Kapsid. Weiterhin wurden die Voraussetzungen auf Proteinebene für die Verpackung des Pol-Proteins untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, daß nur das Pol-Vorläuferprotein und weder die einzelne Reverse Transkriptase- noch die Integrase-Untereinheit in das foamyvirale Partikel verpackt wird. Die enzymatischen Aktivitäten der Protease, der Reversen Transkriptase oder der Integrase des Pol-Proteins sind für die Verpackung jedoch nicht essentiell. 2006 urn:nbn:de:bvb:20-opus-17690 Institut für Virologie und Immunbiologie OPUS4-462 Dissertation Picard-Maureau, Marcus Molekulare Analyse der Penetration von Foamyviren und Konstruktion und Charakterisierung von Adenovirus-Foamyvirus Hybridvektoren In dieser Arbeit wurde zum einen die Penetration von Foamyviren (FV) unter besonderer Berücksichtung des FV Hüllglykoproteins (Env) untersucht, zum anderen wurden Adenovirus-Foamyvirus (Ad-FV) Hybridvektoren zur Kombination der Vorteile beider Vektorsysteme konstruiert und analysiert. Das Ziel war die Herstellung von Ad-FV Vektoren mit hohen Titern, die stabil in das Genom des Wirts integrieren. Über die Penetration von FV ist bisher wenig bekannt. Umhüllte Viren können entweder durch direkte Fusion der viralen Hülle mit der Zellmembran oder durch rezep-torvermittelte Endocytose, oft mit einem pH-abhängigen Fusionsschritt der viralen Membran mit der Membran intrazellulärer Kompartimente, in Zielzellen gelangen. In dieser Studie wurde die Abhängigkeit der FV Env vermittelten Infektion verschie-dener FV Spezies von lysosomotropen Agenzien mit MuLV oder Prototyp FV (PFV) Pseudotypen analysiert. Ähnlich wie bei Vesikuläres Stomatitis Virus Glykoprotein (VSV-G) Pseudotypen wurde die FV Env vermittelte Infektion von fast allen Agen-zien, die den endosomalen pH anheben, inhibiert. Allerdings hatte Chloroquin keine inhibitorische Wirkung auf die FV Env vermittelte Infektion im Gegensatz zu der VSV-G katalysierten, was auf einen unter-schiedlichen Penetrationsmechanismus schließen lässt. Eine Analyse der pH-Abhängigkeit der FV Env Fusionsaktivität in einem Zell-Fusionsassay zeigte eine Induktion der Fusionsaktivität mit einer maximalen Stärke bei pH 5,5. Nur bei PFV Env wurde eine basale Fusionsaktivität bei neutralem pH detektiert. Die relativ schnelle Induktion der Fusionsaktivität in saurem Milieu weist auf eine Konformationsänderung des Hüllglykoproteins zur Transformation in einen fusionsaktiven Status hin. Aufgrund dieser Daten kann man von einem endocytotischen, pH-abhängigen Penetrationsmechanismus von FV ausgehen. Zur Kombination der Vorteile von Adenoviren und FV wurde ein Ad-FV Hybridvektorsystem konstruiert um eine effizientes Werkzeug zum stabilen Gentransfer zu schaffen. Das System besteht aus adenoviralen Hochkapazitäts- (HC-Ad) Vektoren auf Adenovirus 5 Basis, die eine selbst-inaktivierende PFV Vektor Kassette unter Kontrolle eines humanen Cytomegalovirus- (hCMV) Promotors oder des reversen Tet Transaktivator Systems (Tet) enthalten. In alle Vektoren ist eine Verstärktes Grün Fluoreszierendes Protein (EGFP) Expressionskassette als Markergen integriert. Es wurden sowohl FV Vektoren, die nach der Primärinfektion über einen intrazellulären Transduktionsmechanismus stabil integrieren, als auch solche, die über einen Se-kundärzyklus mit Hilfe extrazellulärer Partikel stabil transduzieren können, hergestellt. Die Ad-FV Vektoren konnten mit zu herkömmlichen HC-Ad Vektoren vergleich-baren Titern bis zu 1010 iU/ml produziert werden. In Ad-FV infizierten Zellen war die erwartete FV Proteinexpression und ihre Induzierbarkeit bei Ad-FVTet Vektoren nachweisbar. Mit diesen Vektorsystemen infizierte Zellen zeigten eine signifikant höhere persistierende Transgenexpression im Vergleich zu mit HC-Ad oder Kontroll- Ad-FV Vektoren ohne ein funktionales FV pol ORF infizierten Zellen. Eine Southern Blot Analyse von Ad-FVTet infizierten Einzelzellklonen mit persistierender EGFP Expression belegte eine stabile Integration der FV Vektor Kassette. In dieser Arbeit konnten Ad-FV Vektoren mit hohem Titer hergestellt werden, die eine, auch im Vergleich mit bisher publizierten Ad-Retrovirus Systemen, stark erhöhte Effizienz des persistenten Transgentransfers durch stabile Integration zeigten. 2003 urn:nbn:de:bvb:20-opus-5445 Institut für Virologie und Immunbiologie OPUS4-272 Dissertation Schenk, Thomas Genetische und funktionale Vereinfachung eines komplexen Retrovirus am Beispiel des Primaten Foamy Virus Typ 1 (PFV-1) Foamyviren (Spumaviridae) werden neuerdings von den übrigen Retroviren (Orthoretroviridae) abgegrenzt. Durch verschiedene Besonderheiten in ihrem Replikationszyklus, wie der Möglichkeit zur intrazellulären Retrotransposition oder der reversen Transkription spät im Vermehrungszyklus, nehmen sie eine funktionale Sonderstellung zwischen Retro-, Hepadnaviren und Retrotransposons ein. Aufgrund des Aufbaus ihres Genoms, das neben dem minimalen Gensatz der einfachen Retroviren Gag, Pro, Pol und Env noch zwei weitere akzessorische Leserahmen aufweist, werden sie zu den komplexen Retroviren gerechnet. Einer dieser zusätzlichen Leserahmen kodiert für den transkriptionalen Transaktivator Tas, der für die Replikation essentiell ist. Ein infektiöser Klon einer genetisch vereinfachten Variante des Primaten Foamy Virus Typ 1 (PFV-1) wurde konstruiert, der den konstitutiv aktiven immediate early gene (IE) Promotor und Enhancer des Cytomegalievirus (CMV) im Kontext einer hybriden LTR trägt. Dieses Konstrukt, sowie ein weiteres mit funktionaler Deletion des Tas-Gens führten nach Transfektion in Zellkulturen zur Freisetzung genetisch vereinfachter, infektiöser Viren, deren Replikationskompetenz und genetische Stabilität nachgewiesen wurde. Die rekombinanten Viren zeigten dabei um etwa drei lg-Stufen erniedrigte Virustiter im zellfreien Kulturüberstand und eine reduzierte Replikationskinetik. Versuche zur Steigerung der erreichbaren Virustiter durch thermisches Aufbrechen der Zellen, Inkubation mit dem demethylierenden Agens 5-Azacytidin (AZC) und Induktion mit dem Transkriptions-Stimulator Natriumbutyrat wurden unternommen, resultierten aber nicht in einer Steigerung der Freisetzung infektiöser Partikel oder der viralen Genexpression. Die Promotor-Aktivität der hybriden LTR wurde in einem transienten Reportergenassay unter Verwendung des Luciferasegens quantifiziert und war mit der der tas-stimulierten foamyviralen LTR vergleichbar. Eine Mutation des DD35E-Motivs im aktiven Zentrum der Integrase zu DA35E führte zur Replikationsunfähigkeit der vereinfachten Viren. Obwohl der Promotor eines nicht integrierenden Virus in die hybride LTR eingeführt wurde, blieb die Integration ein obligates Ereignis für die Replikation der Viren. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass eine genetische Vereinfachung des PFV-1 und Replikation mit einem heterologen Promotor in einer hybriden LTR möglich ist. Damit ist eine Voraussetzung für die Konstruktion PFV-basierter Vektoren zur Gentherapie unter Verwendung gewebespezifischer Promotoren gegeben. 2001 urn:nbn:de:bvb:20-opus-3249 Institut für Virologie und Immunbiologie OPUS4-147 Dissertation Pietschmann, Thomas Molekularbiologische Untersuchungen zur Funktion des Hüllproteins des Humanen Foamyvirus Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass fremde virale Hüllproteine wie das Env Protein des murinen Leukämievirus (MLV) oder das Glykoprotein des Virus der vesiklären Stomatitis (VSV) nicht in der Lage sind, die Funktion des homologen HFV Hüllproteins in Bezug auf die Viruspartikelfreisetzung des Humanen Foamyvirus zu übernehmen. Offenbar werden für die HFV Viruspartikelmorphogenese und -freisetzung spezifische Interaktionen zwischen dem Kapsid und dem homologen Hüllprotein benötigt. Mutationsanalysen ergaben, dass die membranspannende Domäne des HFV Hüllproteins in diesem Zusammenhang spezifische Aufgaben erfüllt, die nicht durch heterologe Formen der Membranverankerung übernommen werden können. Die Analyse der Fusionsaktivität verschiedener Hüllproteinmutanten zeigte, dass die zytoplasmatische Domäne des Proteins nicht essentiell für die Fusionsaktivität benötigt wird. Umfangreichere Deletionen, die auch Teile der langen membranspannenden Domäne des Proteins einschlossen, führten dagegen zum Verlust der Fusionseigenschaften des Hüllproteins. Innerhalb der membranspannenden Domäne des HFV Hüllproteins befindet sich ein konserviertes Lysin-Prolin Motiv, dessen Mutation sich auf den zellulären Transport und auf die Fusionsaktivität des Proteins auswirkte. Es zeichnet sich ab, dass die lange membranspannende Domäne des HFV Hüllproteins nicht nur als Membranverankerung dient, sondern zusätzlich für verschiedene Funktionen des Hüllproteins von Bedeutung ist. 2000 urn:nbn:de:bvb:20-opus-1879 Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften