Dokument-ID Dokumenttyp Verfasser/Autoren Herausgeber Haupttitel Abstract Auflage Verlagsort Verlag Erscheinungsjahr Seitenzahl Schriftenreihe Titel Schriftenreihe Bandzahl ISBN Quelle der Hochschulschrift Konferenzname Quelle:Titel Quelle:Jahrgang Quelle:Heftnummer Quelle:Erste Seite Quelle:Letzte Seite URN DOI Abteilungen OPUS4-154 Dissertation Sauer, Christina Charakterisierung intrazellulärer, bakterieller Endosymbionten im Mitteldarm von Ameisen der Gattung Camponotus In der vorliegenden Dissertation wurden verschiedene Themenbereiche bearbeitet, die zur Charakterisierung der intrazellulären, bakteriellen Endosymbionten im Mitteldarm von Ameisen der Gattung Camponotus beitrugen. Es wurden phylogenetische Untersuchungen mit Hilfe der 16S rDNA-Sequenzen der Symbionten und der Sequenzen der Cytochrom-Oxidase-Untereinheit I (COI-Sequenzen) ihrer Wirte durchgeführt, die zur näheren Klärung der Fragen zu Übertragungsweg und Stellung der Camponotus-Endosymbionten verhalfen. Untersuchungen an dreizehn verschiedenen Camponotus-Arten brachten folgende Ergebnisse. Die intrazellulären Bakterien der Ameisen gehören zur g-Subklasse der Proteobakterien. Innerhalb des 16S-Stammbaumes der Symbionten kann man drei Untergruppen unterscheiden, in denen die einzelnen Arten enger miteinander verwandt sind. Bei den nächstverwandten Bakteriennachbarn der Camponotus-Endosymbionten handelt es sich um die ebenfalls symbiontisch lebenden Bakterien der Gattungen Wigglesworthia und Buchnera. Die Ameisen-Symbionten besitzen in ihren rrs-Genen intervenierende DNA-Sequenzen (IVS), die stabile Sekundärstrukturen ausbilden können. Ihre 16S-Gene sind nicht strangaufwärts von den 23S-Genen lokalisiert. Durch diese genetische Besonderheit ähneln die Camponotus-Symbionten den Buchnera-Symbionten, deren rRNA-Gene auf zwei Transkriptionseinheiten verteilt sind. Innerhalb des Stammbaumes der untersuchten Wirtsameisen existieren ebenfalls drei Untergruppen, deren einzelne Arten enger miteinander verwandt sind. Die direkte Gegenüberstellung des Symbionten-Stammbaumes mit dem der Ameisen zeigt ein weitgehend gleiches Verzweigungsmuster. Beide Dendrogramme zeigen signifikante Übereinstimmungen bezüglich ihrer taxonomischen Beziehungen und legen eine kongruente Entwicklung von Symbionten und Wirten, die nur durch einen vertikalen Übertragungsweg erzeugt werden kann, nahe. Einzige Ausnahme bildete hierbei der C. castaneus-Symbiont, bei dem ein horizontaler Transfer von Symbionten nicht gänzlich ausgeschlossen werden kann. Die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführten phylogenetischen Untersuchungen ermöglichten die Benennung einer neuen Symbiontengattung innerhalb der gamma-Subgruppe der Proteobakterien: "Candidatus Blochmannia spp." Histologische Studien der Endosymbiose mit Hilfe von licht- und elektronenmikroskopischen Methoden sollten Fragen zur Symbiontenlokalisation innerhalb adulter Individuen beantworten und die Ergebnisse zum Übertragungsweg der intrazellulären Bakterien festigen. Die Endosymbionten sind in den Mitteldarmepithelien von Arbeiterinnen, Königinnen und Männchen in Myzetozytenzellen lokalisiert, die in das Mitteldarmepithel interkalieren. Diese spezialisierten Zellen besitzen kaum Vesikel und tragen keinen Mikrovillisaum. In den Oozyten der Ovarien von Königinnen und Arbeiterinnen wurden ebenfalls große Symbiontenmengen gefunden. Die Spermatheka der Königinnen und die Geschlechtsorgane der Männchen waren symbiontenfrei. Die Abwesenheit von Symbionten innerhalb dieser beiden Organe zeigt, dass eine Bakterieninfektion der weiblichen Tiere nicht durch die Männchen stattfindet, sondern wie schon in den phylogenetischen Untersuchungen postuliert, ein rein maternaler Übertragungsweg der Symbionten vorliegt. Die Detektion der Bakterien in Eiern und Larven der Ameisen mittels In situ-Hybridisierungen trugen zur Aufklärung des Weges der Endosymbionten während der Embryogenese bei. Während sich im abgelegten Ei ein Ring aus Symbionten bildete, kam es in den Larvenstadien 1 bis 3 zur Auswanderung der Bakterien in Meso- bzw. Ektoderm. Im größten untersuchten Larvenstadium 4, das kurz vor der Verpuppung stand, konnten die Symbionten ausschließlich in den Myzetozyten des Mitteldarmes detektiert werden. Die Behandlung der Ameisen mit Antibiotika ermöglichte es, symbiontenfreie Ameisen zu erzeugen, die über einen längeren Zeitraum weiterlebten, ohne ihre Symbionten zu regenerieren. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es erstmals, die intrazellulären Bakterien intakt aus dem sie umgebenden Mitteldarmgewebe zu isolieren. Somit konnten gereinigte Symbionten für Kultivierungs- und Infektionsversuche verwendet werden. Diese Versuche die mit Hilfe von Bakteriennährmedien und Insektenzelllinien durchgeführt wurden, zeigten jedoch sehr deutlich, dass es nicht möglich ist, die Camponotus-Symbionten außerhalb ihrer Wirte zu kultivieren. 2000 urn:nbn:de:bvb:20-opus-1940 Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften OPUS4-2989 Dissertation Stoll, Sascha Funktionelle Analyse von Blochmannia floridanus, dem primären Endosymbionten der Rossameise Camponotus floridanus Ameisen der Gattung Camponotus beherbergen bakterielle Symbionten der Gattung Blochmannia in spezialisierten Zellen des Mitteldarms (Blochmann, 1882; Buchner, 1965; Sauer, 2000; Schröder et al., 1996). Die Genomsequenzierung dieser Symbionten zeigte, dass Blochmannia, ähnlich den Symbionten von Blattläusen, hauptsächlich Gene der Aminosäurebiosynthese beibehalten hat (Degnan et al., 2005; Gil et al., 2003). Die Relevanz dieser nahrungsaufwertenden Funktion konnte experimentell bestätigt werden (Feldhaar et al., 2007). Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der dynamischen Interaktion der beiden Partner während des komplexen Lebenszyklus des holometabolen Wirtes. Frühere Studien deuteten darauf hin, dass die Symbiose vor allem während der Larven- und Puppenphasen von Bedeutung sein könnte (Feldhaar et al., 2007; Wolschin et al., 2004; Zientz et al., 2006). Mit fluoreszenter in situ Hybridisierung (FISH) und konfokaler Laserscanning Mikroskopie konnte in der vorliegenden Arbeit die Lokalisierung von B. floridanus während der wichtigsten Entwicklungsstadien aufgeklärt werden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Symbionten schon im ersten Larvenstadium in spezialisierten Zellen um den Darm angeordnet sind, aber in späteren Stadien nicht, wie bisher angenommen, auf diese Bakteriozyten beschränkt sind, sondern bis zum Schlupf der jungen Arbeiterinnen massiv andere Darmzellen infizieren. Übereinstimmend mit Bestimmungen der Zellzahl in den verschiedenen Wirtsstadien ist die Anzahl der Symbionten gegen Ende der Metamorphose am höchsten. Die Symbiose degeneriert in sehr alten Arbeiterinnen, gut gefüllte Bakteriozyten werden jedoch noch monatelang beibehalten. Mit Macroarray- und qRT- PCR- basierten Transkriptomanalysen wurde die Expression der bakteriellen Gene in charakteristischen Entwicklungsstadien des Wirtes untersucht. Allgemein zeigen vor allem Gene für molekulare Chaperons und bestimmte bakterielle Grundfunktionen eine hohe Expression. Aber auch viele Gene, die möglicherweise wichtige Funktionen in der Symbiose besitzen, wie die Biosynthese essentieller Aminosäuren und das Recycling von Stickstoffverbindungen, zeigen ein hohes absolutes Transkriptlevel. Zudem besteht eine positive Korrelation zwischen dem Expressionsniveau und dem GC- Gehalt der Gene, die in dem höheren Selektionsdruck und damit einer geringeren Mutationsrate der essentiellen Gene begründet liegt (Schaber et al., 2005). Durch Proteinanalysen konnte bestätigt werden, dass die Faktoren mit der höchsten absoluten Transkription die dominanten Proteine der Symbionten darstellen. In den unterschiedlichen Entwicklungsstadien zeigen viele Gene eine deutliche Dynamik, deren Ausmaß aber, verglichen mit freilebenden Bakterien, gering ist. Aus den Expressionsprofilen aufeinanderfolgender Gene lassen sich mögliche Transkriptionseinheiten ableiten, die teilweise auch experimentell bestätigt wurden. Oftmals zeigen auch Gene, die nicht in Transkriptionseinheiten angeordnet sind, aber verwandten Stoffwechselwegen angehören, ähnliche Muster. Dies deutet auf das Vorhandensein grundlegender Genregulations-mechanismen hin, obwohl im Genom von B. floridanus nur noch sehr wenige Transkriptionsfaktoren codiert sind (Gil et al., 2003). Auf übergeordneter Ebene zeigt sich, dass bei Symbionten aus späten Puppenstadien viele symbioserelevante Gene im Vergleich zu Genen des Grundmetabolismus eine erhöhte Expression zeigen. Dies betrifft besonders die Biosynthese aromatischer und verzweigter Aminosäuren, die in diesen Stadien vom Wirt in hoher Menge benötigt werden, während die internen Reserven gleichzeitig zur Neige gehen. Dies äußert sich auch im deutlichen Abfallen der Speicherproteinmenge des Wirts gegen Ende der Puppenphase. Die festgestellte Veränderung der Symbiontenzahl übertrifft das geringe Ausmaß der Genregulation um ein Vielfaches. Die Bakterien liegen in jedem Stadium polyploid mit bis zu 100 Genomkopien vor, dieser Polyploidiegrad bleibt jedoch während der gesamten Wirtsentwicklung weitestgehend konstant. Somit scheint die Kontrolle des Wirts über die bakterielle Vermehrung der entscheidende Faktor dieser Symbiose zu sein. Die verbleibenden regulatorischen Fähigkeiten der Bakterien stellen möglicherweise eine Feinjustierung von optimierten Produktionseinheiten dar, deren Anzahl nach den Bedürfnissen des Wirtes verändert wird. Insgesamt konnten in der vorliegenden Arbeit neue Einblicke in das komplexe Zusammenleben von Blochmannia und Camponotus gewonnen werden, die zu einem besseren Verständnis der biologischen Funktion und der grundlegenden Mechanismen dieser Symbiose führen. Eine der wichtigsten Fragestellungen nach dem Sinn einer nahrungsaufwertenden Symbiose für einen Nahrungsgeneralisten konnte mit starken Hinweisen auf eine stadienabhängige Relevanz der Symbiose beantwortet werden, die den enormen evolutionären Erfolg dieser Ameisengattung erklären könnte.  2009 urn:nbn:de:bvb:20-opus-37238 Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften OPUS4-6935 Dissertation Ratzka, Carolin Immune responses of the ant Camponotus floridanus towards pathogens and its obligate mutualistic endosymbiont Blochmannia floridanus Ants of the species Camponotus floridanus live in huge colonies composed of genetically identical or closely related animals, which should predispose them to an increased vulnerability towards infection by pathogens (Cremer et al. 2007). Therefore the question is how ants (or social insects in general) can nevertheless efficiently combat infections. In order to investigate the immune response of the ant C. floridanus, the present study initially focused on the identification of possible immune factors, encoded by the ant´s genome. By using the method "suppression subtractive hybridization" as well as by Illumnia sequencing technology, several immune-related genes could be identified. Among these were genes encoding proteins involved in pathogen recognition, signal transduction, antimicrobial activity, or general stress response. In accordance with the ant´s genome sequence (Bonasio et al. 2010), only three antimicrobial peptide (AMP) genes could be identified in C. floridanus. The gene and cDNA sequences of these AMPs were established and their expression was shown to be induced by microbial challenge. Two different defensin genes (type 1 and 2) were characterized. A detailed characterization of the mRNA and gene sequence of the other AMP, a hymenoptaecin, revealed a special repeat structure. The C. floridanus hymenoptaecin has a signal and a pro-sequence followed by a hymenoptaecin-like domain and six directly repeated hymenoptaecin domains (HDs). Since each HD is flanked by two known processing sites, proteolytic processing of the precursor protein may generate several mature AMPs. Bioinformatical analyses revealed the presence of hymenoptaecin genes with similar multipeptide precursor structure in genomes of other ant species suggesting an evolutionary conserved important role of this gene in ant immunity. C. floridanus ants harbor the obligate intracellular bacterium, Blochmannia floridanus, in specialized cells (so-called bacteriocytes), which are intercalated between midgut cells as well as in ovaries of females (Blochmann 1882; Sauer et al. 2002; Schröder et al. 1996). Ant hosts face the problem that on the one hand they have to maintain the beneficial symbiotic bacteria and on the other hand they need to raise an immune response against harmful pathogenic bacteria during an infection. It was investigated, if endosymbionts are actually detected by the host immune system. Injection of B. floridanus induced an immune response of its host C. floridanus, which was comparable to the one towards pathogens. This means that, despite the evolutionary established cooperation of the endosymbionts and their hosts, these bacteria are still recognized as „non-self" by the host immune system. This finding led to the question, if the ant immune system might be involved in regulation of the endosymbiont number in the midgut tissue in order to avoid their uncontrolled replication. During the holometabolous life cycle of the ant hosts the distribution of bacteriocytes and of Blochmannia endosymbionts is remarkably dynamic and peaks in late pupal stages, in which the entire midgut is transformed into a symbiotic organ (Stoll et al. 2010). It was hypothesized that hosts could regulate the number of endosymbionts present in their tissues via the innate immune system. A quantitative gene expression analysis of assumed symbiosis-relevant candidate genes revealed distinct expression patterns of some genes according to developmental stage and tissue. Moreover, the immune gene expression in response to bacterial challenge was investigated in the pupal stage. By an artificial immune-challenge of pupae it was confirmed that in fact the immune response of the endosymbiont-bearing midgut tissue differs from that of other body parts. The data support a key role for amidase peptidoglycan recognition proteins (PGRPs), especially PGRP-LB, in endosymbiont tolerance and suggest an involvement of the lysosomal system in control of Blochmannia endosymbionts. In sum, this thesis provides a first description of the immune response of the ant C. floridanus. A comprehensive set of immune-relevant genes was determined. Especially, the identification and molecular characterization of the hymenoptaecin gene delivered new insights into the immune competence of ants in general. Moreover, first indications could be gathered for the involvement of the immune system in controlling the endosymbiont B. floridanus. 2012 urn:nbn:de:bvb:20-opus-69350 Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften