30331
2023
eng
doctoralthesis
1
2023-02-23
--
2023-02-23
Improving the quality analysis of monographed drugs - dapsone, baclofen, acarbose and other selected APIs
Verbesserung der Qualitätsanalyse von monographierten Arzneistoffen - Dapson, Baclofen, Acarbose und andere ausgewählte Wirkstoffe
All presented studies aimed on the improvement of the quality analysis of already monographed drugs. Thereby different LC methods were applied and coupled to i.e., the UV/VIS detector, the CAD or a hyphenation of these detectors, respectively. The choice of the chromatographic system including the detector was largely dependent on the physicochemical properties of the respective analytes.
With the risk-assessment report on the API cetirizine we presented an exemplary tool, that can help to minimize the risk of the occurrence of unexpected impurities. An in- deep analysis of each step within synthesis pathway by means of reaction matrices of all compounds was performed. It is essential to understand the complete impurity profile of all reactants, solvents, and catalysts and to include them in the matrix. Finally, the API of this synthesis was checked if all impurities are identified by this tool. Of note, a shortcoming of such a targeted approach is that impurities can still occur, but they are not captured. This disadvantage can be partially compensated by non-targeted approaches if they are performed in parallel with the other studies that represent most of the impurities. However, this work also shows that even in a supposedly simple synthesis, potentially hundreds of by-products can be formed. For each of them, it must be decided individually whether their formation is probable or how their quantity can be minimized in order to obtain APIs, that are as pure as possible.
In the dapsone project it was aimed to replace the existing old Ph. Eur. TLC method with a modern RP-HPLC method. This was successful and since Ph. Eur. 10.6, the method developed in this work, became a valid monograph. Within the revision process of the monograph, the individual limits for impurities were tightened. However, this new method needs HPLC instrumentation, suitable to perform gradients. As this is not always available in all control laboratories, we also developed an alternative, more simple method using two different isocratic runs for the impurity analysis. The obtained batch results of both, the new pharmacopoeial method and the more simple one, were in a comparable order of magnitude. Furthermore, within the method development stage of the Ph. Eur. method, we could identify one unknown impurity of the impurity reference by high-resolution MS/MS analysis.
Also, in the baclofen project it was aimed to replace the existing Ph. Eur. method with the introduction of an additional impurity to be quantified. A corresponding method was developed and validated. However, due to the harmonization process of the pharmacopoeias, it is currently not used. In addition, we tried to find further, non- 116
SUMMARY
chromophoric impurities by means of the CAD. However, except for one counterion of an impurity, no further impurities were found. Also, the aforementioned new impurity could not be detected above the reporting threshold in the batches analyzed. As the only individually specified impurity A is also present at a low level, it can be concluded that the examined batches of baclofen are very pure.
The use of universal detectors, such as the CAD can be particularly interesting for compounds with no chromophore or those with only a weak chromophore. Therefore, we decided to take a closer look at the impurity profile of acarbose. Currently, acarbose and its impurities are being studied by low wavelength UV detection at 210 nm. Therefore, the question arose whether there are no other impurities in the API that do not show absorption at this wavelength. CAD, which offers consistent detection properties for all non-volatile compounds, is ideally suited for this purpose. However, it was not so easy to use the CAD together with the UV detector, for example, as a hyphenated detection technique, because the Ph. Eur. method uses phosphate buffers. However, this is non-volatile and therefore inappropriate for the CAD. Therefore, an attempt was made to replace the buffer with a volatile one. However, since this did not lead to satisfactory results and rather the self-degradation process of the stationary phase used could be observed by means of the CAD, it was decided to switch to alternative stationary phases. A column screening also revealed further difficulties with acarbose and its impurities: they show an epimerization reaction at the end of the sugar chain. However, since one wanted to have uniform peaks in the corresponding chromatograms, one had to accelerate this reaction significantly to obtain only one peak for each component. This was best achieved by using two stationary phases: PGC and Amide-HILIC. Impurity-profiling methods could be developed on each of the two phases. In addition, as expected, new impurities could be detected, albeit at a low level. Two of them could even be identified by spiking experiments as the sugar fragments maltose and maltotriose.
Taken together, it can be concluded, that this work has contributed significantly to the improvement of the quality analysis of monographed drugs. In addition to the presented general tool for the identification of potential impurities, one of the methods developed, had already been implemented to the Ph. Eur. In an effort to improve the CAD's universal detection capabilities, additional methods have also been developed. Further, new improved methods for the impurity profiling are ready to use.
Alle vorgestellten Arbeiten zielten auf die Verbesserung der Qualitätsanalyse von im Europäischen Arzneibuch monographierten Wirkstoffen ab. Dabei wurden verschiedene flüssig-chromatographische Methoden angewandt und z.B. mit dem UV/VIS-Detektor, dem CAD oder einer Kombination dieser Detektoren gekoppelt. Die Wahl des chromatographischen Systems einschließlich des Detektors war weitgehend von den physikochemischen Eigenschaften der jeweiligen Analyten abhängig.
Mit dem Bericht zur Risikoanalyse des Wirkstoffs Cetirizin haben wir ein beispielhaftes Instrument vorgestellt, das helfen kann, das Risiko des Auftretens unerwarteter Verunreinigungen zu minimieren. Es wurde eine eingehende Analyse der einzelnen Syntheseschritte anhand der Reaktionsmatrizen aller Verbindungen durchgeführt. Dabei ist wichtig, das vollständige Verunreinigungsprofil aller Reaktanten, Lösungsmittel und Katalysatoren zu verstehen und in die Matrix mit aufzunehmen. Schließlich wurde produzierte Arzneistoff-Chargen überprüft, ob alle Verunreinigungen mit diesem Werkzeug identifiziert werden konnten. Es soll aber nicht unerwähnt bleiben, dass ein Nachteil eines solch gezielten Ansatzes darin besteht, dass Verunreinigungen im Wirkstoff dennoch vorkommen können, sie aber nicht durch das Tool erfasst werden. Dieser Nachteil kann z.B. durch nicht-zielgerichtete Ansätze kompensiert werden, wenn sie parallel zu den anderen Untersuchungen durchgeführt werden, die bereits den Großteil der Verunreinigungen abbilden können. Diese Arbeit zeigt aber auch, dass selbst bei einer vermeintlich einfachen Synthese potenziell Hunderte von Nebenprodukten gebildet werden können. Für jedes von ihnen muss individuell entschieden werden, ob ihre Bildung wahrscheinlich ist und wie ihre Menge im Endprodukt minimiert werden kann, um möglichst reine Wirkstoffe zu erhalten.
Im Dapsonprojekt wurde versucht, die bestehende dünnschichtchromatographische Ph.Eur.-Methode durch eine moderne HPLC-Methode zu ersetzen. Dies war erfolgreich und seit Ph. Eur. 10.6 wurde die in dieser Arbeit entwickelte Methode zu einer gültigen Monographie. Im Rahmen der Überarbeitung der Monographie sind auch die einzelnen Grenzwerte für Verunreinigungen verschärft worden. Die neue Methode erfordert jedoch ein HPLC-Gerät, mit dem man eine Gradientenelution durchführen kann. Da dies aber nicht immer in allen Kontrolllabors verfügbar ist, haben wir ein alternatives, einfacheres Prozedere entwickelt, bei dem zwei verschiedene isokratische Methoden für die Verunreinigungsanalyse verwendet werden. Die Batch- Ergebnisse der neuen und der einfacheren Methode lagen dabei in einer 118
ZUSAMMENFASSUNG
vergleichbaren Größenordnung wie die Ph. Eur.-Methode. Darüber hinaus konnten wir eine unbekannte Verunreinigung der Verunreinigungsreferenz durch hochauflösende Massenspektrometrie identifizieren.
Im Rahmen des Baclofen-Projekts sollte die bestehende Ph. Eur.-Methode ersetzt werden und die Monographie durch eine zusätzlich zu quantifizierende Verunreinigung ergänzt werden. Eine entsprechende Methode wurde entwickelt und validiert. Aufgrund des Harmonisierungsprozesses der Pharmakopöen wird sie jedoch derzeit nicht verwendet. Darüber hinaus haben wir versucht, mit Hilfe des CAD weitere, nicht- chromophore Verunreinigungen zu finden. Bis auf ein Gegenion einer Verunreinigung wurden jedoch keine weiteren Verunreinigungen gefunden. Auch die oben erwähnte neue Verunreinigung konnte in den untersuchten Chargen nicht oberhalb des Berichtsgrenzwert nachgewiesen werden. Da auch die sonst einzig individuell zu spezifizierende Verunreinigung A nur in geringem Maße vorhanden ist, kann der Schluss gezogen werden, dass die untersuchten Baclofen-Chargen sehr rein sind. Der Einsatz von universellen Detektoren wie dem CAD kann besonders für Verbindungen ohne Chromophor oder solche mit nur schwachem Chromophor interessant sein. Daher wurde das Verunreinigungsprofil von Acarbose genauer untersucht. Derzeit werden Acarbose und ihre Verunreinigungen mit Hilfe der UV- Detektion bei 210 nm untersucht. Daher stellte sich die Frage, ob es nicht noch anderen Verunreinigungen im Wirkstoff gibt, die keine Absorption bei dieser Wellenlänge zeigen. Die Detektion mittels CAD, der für alle nichtflüchtigen Verbindungen gleichbleibende Werte liefert, ist für diesen Zweck gut geeignet. Allerdings war es nicht so einfach, den CAD zusammen mit dem UV-Detektor z. B. als gekoppeltes Detektionsverfahren zu verwenden, da die Ph.Eur.-Methode Phosphatpuffer verwendet. Dieser ist jedoch nicht flüchtig und daher für CAD ungeeignet. Es wurde daher versucht, den Puffer durch einen flüchtigen Puffer zu ersetzen. Da dies jedoch nicht zu befriedigenden Ergebnissen führte und vielmehr die Selbstzersetzung der verwendeten stationären Phase mit Hilfe der CAD beobachtet werden konnte, wurde auf alternative stationäre Phasen ausgewichen. Eine Auswahl von verschiedenen Säulen zeigte zudem weitere analytische Schwierigkeiten mit Acarbose und ihren Verunreinigungen: Sie zeigen die Epimerisierungsreaktion am Ende der Zuckeralkohole. Da man für jede Komponente einen Peak in den entsprechenden Chromatogrammen haben wollte, wurde die beschriebene Reaktion durch Temperaturerhöhung beschleunigt. Dies wurde am besten durch die
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ZUSAMMENFASSUNG
Verwendung mit folgenden stationären Phasen erreicht: PGC und Amid-HILIC. Auf jeder der beiden Phasen konnten Methoden zur Erfassung der Verunreinigungsprofile entwickelt werden. Darüber hinaus konnten erwartungsgemäß neue Verunreinigungen nachgewiesen werden, wenn auch auf niedrigem Niveau. Zwei von ihnen konnten durch „Spiking“-Experimente als die Zuckerfragmente Maltose und Maltotriose identifiziert werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit einen wesentlichen Beitrag zur Verbesserung der Qualitätsanalyse von monographierten Arzneimitteln geleistet hat. Zusätzlich zu dem vorgestellten allgemeinen Werkzeug zur Identifizierung potenzieller Verunreinigungen wurde eine der entwickelten Methoden bereits in die Ph. Eur. aufgenommen. In dem Versuch, die universellen Detektionsmöglichkeiten des CAD zu verbessern, wurden auch ergänzende Methoden entwickelt. Außerdem sind neue verbesserte Methoden für die Analyse von Verunreinigungsprofilen einsatzbereit.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-303318
10.25972/OPUS-30331
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X 130352
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Adrian Dieter Leistner
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Instrumentelle Analytik
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HPLC
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Chemische Reinheit
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uncontrolled
Charged Aerosol Detection
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uncontrolled
Impurity Profiling
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uncontrolled
Pharmaceutical Analysis
Analytische Chemie
open_access
Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/30331/Dissertation_Leistner_Adrian-quality_analysis.pdf
24346
2021
eng
doctoralthesis
1
2021-08-19
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2021-08-19
Development of analytical methods for the quality assessment of mineral oil based excipients and mechanochemically stressed active pharmaceutical ingredients
Entwicklung analytischer Methoden für die Qualitätsbeurteilung mineralölbasierter Hilfsstoffe und mechanochemisch gestresster Arzneistoffe
For the quality assurance of substances for pharmaceutical use, a variety of analytical techniques are available to address specific analytical problems. In this field of application, liquid chromatography (LC) stands out as the gold standard in the pharmaceutical industry. Various detectors can be employed, which are e.g. based on UV/Vis spectroscopy for the examination of molecules with a chromophore, or mass spectrometry (MS) for structural elucidation of analytes. For the separation of enantiomers, the use of capillary electrophoresis (CE) may be more favorable due to the high separation efficiency and easy-to-use and comparatively inexpensive chiral selectors, in contrast to chiral columns for LC, which are usually very expensive and limited to a restricted number of analytes. For structure elucidation in impurity profiling, one- and multidimensional 1H NMR spectroscopy is a valuable tool as long as the analyte molecule has got nuclei that can be detected, which applies for the magnitude of organic pharmaceutical substances.
For the evaluation of the amount of mineral oil aromatic hydrocarbons (MOAH) in various paraffin samples from different suppliers, a straightforward method based on 1H NMR spectroscopy was elaborated. The MOAH/MOSH ratio was used to indicate the amount of MOAH of paraffins and to evaluate the extent of refining. In addition, a representative paraffin sample was measured without sample solvent at high temperatures (about 340 K) to avoid the interfering residual solvent signals in the spectral regions of interest. The results of both methods were in good accordance.
Moreover, the 1H NMR results were complemented with the UV measurements from the purity testing of paraffins according to the DAB 8. Correlations of the NMR and UV spectroscopic data indicated a linear relationship of both methods for the determination of MOAH in paraffins.
Finally, the 1H NMR data was evaluated by principal component analysis (PCA) to explore differences within the paraffin samples and the spectral regions in the 1H NMR spectrum which are responsible for the formation of groups. It could be found that most variation is due to the MOSH of the paraffins. The PCA model was capable of differentiating between soft, liquid and solid paraffins on the one hand and between natural and synthetic liquid paraffins on the other hand.
The impurity profiling of L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium (A2PMg) was performed by means of one- and two-dimensional NMR spectroscopy. Several ethylated impurities could be detected, which were likely to be formed during synthesis of A2PMg. The structures of two of the ethylated impurities were identified as ascorbic acid 2-phosphate ethyl ester and ethanol, (residual solvent from synthesis). NMR spectroscopic studies of the fractions obtained from preparative HPLC of A2PMg revealed two additional impurities, which were identified as phosphorylated derivatives of ascorbic acid, ascorbic acid 3,5-phosphate and ascorbic acid 5-phosphate.
Solid state mechanochemistry as an alternative approach for stress testing was applied on the drug substances S-Ibuprofen (Ibu) and Clopidogrel (CLP) using a ball mill, in order to study their degradation profile:
First, the isomerization of S-Ibu was investigated, which was stressed in the solid state applying several milling frequencies and durations under basic, acidic and neutral conditions. For the separation of Ibu enantiomers, a chiral CE method was developed and validated according to ICH Q2(R1). It was found that S-Ibu is overall very stable to isomerization; it shows minor conversion into the R-enantiomer under basic environment applying long milling times and high frequencies.
Last, the degradation profile of clopidogrel hydrogen sulfate (CLP) was investigated, which was stressed in the solid state under various oxidative conditions. An already existing HPLC-UV method was adjusted to sufficiently separate the degradation products, which were characterized by means of UV and MS/(MS) detection. Most of the degradation products identified were already reported to result from conventional CLP stress tests. The degradation profile of CLP was mainly influenced by the material of the milling jar and the type of catalyst used.
Für die Qualitätssicherung von Arznei- und Hilfsstoffen steht eine Vielzahl von analytischen Techniken für spezifische analytische Fragestellungen zur Verfügung. In der pharmazeutischen Industrie hat sich dabei die Flüssigkeitschromatographie als Goldstandard etabliert. Es können verschiedene Detektoren eingesetzt werden, die z. B. auf UV/Vis-Spektroskopie zur Untersuchung von Molekülen mit einem Chromophor oder auf Massenspektrometrie zur Strukturaufklärung von Analyten basieren. Für die Trennung von Enantiomeren kann die Verwendung von Kapillarelektrophorese aufgrund der hohen Trenneffizienz und der einfach zu handhabenden und vergleichsweise preiswerten chiralen Selektoren gegenüber chiralen Säulen in der Flüssigchromatographie bevorzugt sein, die in der Regel sehr teuer und auf eine begrenzte Anzahl von Analyten beschränkt sind. Für die Strukturaufklärung im Rahmen der Erstellung von Verunreinigungsprofilen ist die ein- und mehrdimensionale 1H-NMR-Spektroskopie eine sehr wertvolle Methode, solange das Analytmolekül Kerne besitzt, die der NMR-Spektroskopie zugänglich sind, was für den Großteil der organischen Arznei- und Hilfsstoffe zutrifft.
Um die Menge an „mineral oil aromatic hydrocarbons (MOAH)“ in verschiedenen Paraffinproben von unterschiedlichen Herstellern zu bestimmen, wurde eine einfache 1H-NMR-Spektroskopie-Methode erarbeitet. Das Verhältnis von MOAH zu „mineral oil saturated hydrocarbons (MOSH)“ wurde dazu verwendet, um die Menge der MOAH in Paraffinen zu bestimmen und ihren Raffinationsgrad zu beurteilen. Zusätzlich wurde eine repräsentative Paraffinprobe ohne Probenlösungsmittel bei hohen Temperaturen (ca. 340 K) vermessen, um die interferierenden Restlösemittel Signale in den relevanten Spektralbereichen zu vermeiden. Die Ergebnisse beider Methoden stimmten gut überein.
Weiterhin wurden die 1H-NMR-Ergebnisse durch die UV-Messungen aus der Reinheitsprüfung von Paraffinen gemäß DAB 8 ergänzt. Korrelationen der NMR- und UV-spektroskopischen Daten wiesen auf eine lineare Beziehung beider Methoden für die Bestimmung der MOAH in Paraffinen hin.
Schließlich wurden die 1H-NMR-spektroskopischen Daten mittels Hauptkomponentenanalyse ausgewertet, um Unterschiede innerhalb der Paraffinproben und die für die Gruppenbildung verantwortlichen Spektralbereiche im 1H-NMR-Spektrum zu ermitteln. Es konnte festgestellt werden, dass der Hauptanteil der Varianz auf die MOSH zurückzuführen ist. Das PCA-Modell war dazu in der Lage, zwischen weichen, flüssigen und festen Paraffinen einerseits und zwischen natürlichen und synthetischen flüssigen Paraffinen andererseits zu unterscheiden.
Das Verunreinigungsprofil von L-Ascorbinsäure-2-phosphat-Magnesium (A2PMg) wurde mittels ein- und zweidimensionaler NMR-Spektroskopie untersucht. Es konnten mehrere ethylierte Verunreinigungen nachgewiesen werden, die vermutlich während des Syntheseprozesses von A2PMg gebildet wurden. Die Strukturen von zwei der ethylierten Verunreinigungen wurden als Ascorbinsäure-2-phosphat ethylester und Ethanol (Restlösungsmittel aus der Synthese) identifiziert. NMR spektroskopische Untersuchungen der aus der präparativen HPLC von A2PMg erhaltenen Fraktionen ergab zwei weitere Verunreinigungen, die als phosphorylierte Derivate von Ascorbinsäure, Ascorbinsäure-3,5-phosphat und Ascorbinsäure-5-phosphat, identifiziert wurden.
Die Festkörper-Mechanochemie als alternativer Ansatz für Stresstests wurde auf die Arzneistoffe S-Ibuprofen und Clopidogrel unter Einsatz einer Kugelmühle angewandt, um deren Abbauprofil zu analysieren:
Zunächst wurde die Isomerisierung von S-Ibuprofen (Ibu) untersucht, das im festen Zustand unter Anwendung verschiedener Mahlfrequenzen und -dauern unter basischen, sauren und neutralen Bedingungen gestresst wurde. Für die Trennung der Ibu-Enantiomere wurde eine chirale Kapillarelektrophorese-Methode entwickelt und gemäß ICH Q2(R1) Leitlinie validiert. Es wurde festgestellt, dass S-Ibu insgesamt sehr stabil gegenüber Isomerisierung ist, jedoch unter basischen Bedingungen und hohen Mahldauern und -frequenzen eine geringe Umwandlung in das R-Enantiomer zeigt.
Zuletzt wurde das Abbauprofil von Clopidogrelhydrogensulfat (CLP) untersucht, das im festen Zustand unter oxidativen Bedingungen gestresst wurde. Eine bereits bestehende HPLC-UV Methode wurde optimiert, um die Abbauprodukte ausreichend zu trennen und anschließend mittels UV- und MS/(MS)-Detektion zu charakterisieren. Die meisten der identifizierten Abbauprodukte waren bereits aus konventionellen CLP-Stresstests bekannt. Das Abbauprofil von CLP wurde hauptsächlich durch das Material der Kugelmühle und den Typ des verwendeten Katalysators beeinflusst.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-243465
10.25972/OPUS-24346
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X 129490
Deutsches Urheberrecht
Jonas Urlaub
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HPLC
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Kapillarelektrophorese
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NMR-Spektroskopie
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Paraffin
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Verunreinigung
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uncontrolled
NMR spectroscopy
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uncontrolled
capillary electrophoresis
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uncontrolled
liquid chromatography
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uncontrolled
paraffins
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uncontrolled
mechanochemical degradation
eng
uncontrolled
impurities
Chemie und zugeordnete Wissenschaften
open_access
Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/24346/Urlaub_Jonas_Quality_assessment.pdf
24319
2021
eng
doctoralthesis
1
2021-08-14
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2021-08-12
Charged Aerosol Detector Performance Evaluation and Development of Optimization Strategies for the Analysis of Amino Acids
Leistungsbeurteilung des Charged Aerosol Detektors und Entwicklung von Optimierungsstrategien für die Analyse von Aminosäuren
The charged aerosol detector (CAD) is an aerosol-based detector employed in liquid chromatography which has become established in the field of pharmaceutical analysis due to its outstanding performance characteristics, e.g. the almost uniform response for nonvolatile analytes. Owing to its principle of detection, the response of the CAD depends on the volatility of a compound and is inherently nonlinear. However, the newly implemented instrumental settings evaporation temperature and power function value (PFV) are valuable tools to overcome some of these drawbacks and can even enhance the detector’s capabilities when adjusted properly.
This thesis aimed to evaluate the impact of the new instrumental settings on the CAD performance. Additionally, the influence of modern separation techniques for small polar compounds on the CAD was assessed and the applicability of hyphenated UV-CAD techniques explored. The optimization strategies derived from the evaluation procedures and the conjunction of the instrumental and chromatographic techniques investigated were utilized for the challenging impurity profiling of amino acids and amino acid-like drugs.
The results of the method validation procedures confirmed the broad applicability of the CAD in the pharmaceutical analysis of nonvolatile compounds, supported by satisfactory sensitivity and reproducibility for meeting the regulatory requirements with respect to the ICH guidelines Q2(R1) and Q3A(R2). The limits of applicability include the analysis of semivolatile compounds, and the method transfer between current and legacy CAD models. Further advances in the definition and standardization of allowed ranges for the instrumental settings and the establishment of general optimization procedures in the method development could lead to a more widespread use of the detection technique in compendial methods.
Der “charged aerosol detectorˮ (CAD) ist ein aerosol-basierter Detektor in der Flüssigchromatographie, der sich im Bereich der pharmazeutischen Analytik etabliert hat, da er über herausragende Leistungsmerkmale verfügt, wie das annährend einheitliche Signal für nichtflüchtige Analyte. Aufgrund des Detektionsprinzips ist das Signal des Detektors abhängig von der Flüchtigkeit einer Verbindung und zudem nichtlinear. Die neu eingeführten Geräteparameter Verdampfungstemperatur und „power function value” (PFV) stellen hierbei wertvolle Werkzeuge dar, um einige der mit dem Detektionsprinzip verbundenen Nachteile auszugleichen und können darüber hinaus die Detektionsmöglichkeiten erweitern, sofern sie auf geeignete Weise eingestellt wurden.
Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die Auswirkungen der neuen Geräteparameter auf die Leistungsfähigkeit des Detektors zu untersuchen. Zusätzlich wurde der Einfluss moderner Trenntechniken auf den CAD beurteilt und die Anwendbarkeit gekoppelter UV-CAD Techniken erforscht. Die sich aus den Evaluierungsprozeduren ergebenden Optimierungsstrategien und die Verknüpfung der untersuchten instrumentellen und chromatographischen Techniken wurden anschließend verwendet, um Methoden für die herausfordernde Verunreinigungsanalyse von Aminosäuren und Arzneistoffen mit Aminosäurestruktur zu entwickeln.
Die Ergebnisse der Validierungsverfahren bestätigten die weitgehende Anwendbarkeit des CAD in der pharmazeutischen Analyse nichtflüchtiger Verbindungen, unterstützt durch zufriedenstellende Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit, wodurch die Vorgaben der ICH-Leitfäden Q2(R1) und Q3A(R2) erfüllt werden konnten. Einschränkungen der Anwendbarkeit bestehen in der Analyse halbflüchtiger Verbindungen, sowie im Methodentransfer zwischen gegenwärtigen und alten CAD-Modellen. Weitere Fortschritte in der Definition und Standardisierung erlaubter Bereiche für die Einstellung der Geräteparameter und die Etablierung allgemeiner Optimierungsverfahren in der Methodenentwicklung könnten zu einer umfassenderen Nutzung der Detektionstechnik für Arzneibuchmethoden führen.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-243197
10.25972/OPUS-24319
Universität Belgrad, Serbien
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X 129466
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Ruben Pawellek
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Instrumentelle Analytik
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swd
HPLC
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Chemische Reinheit
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Chromatographischer Detektor
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uncontrolled
Pharmaceutical Analysis
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uncontrolled
Charged Aerosol Detection
eng
uncontrolled
Impurity Profiling
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uncontrolled
Amino Acids
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Aminosäuren
Analytische Chemie
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Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/24319/Pawellek_Ruben_Dissertation.pdf
20211
2020
eng
doctoralthesis
1
2020-03-21
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2020-04-03
Liquid chromatographic analysis of weakly- and non-chromophore compounds focusing on Charged Aerosol Detection
Flüssigchromatographische Analyse von schwach- und nicht-chromophoren Substanzen mit Schwerpunkt auf Charged Aerosol Detektion
Liquid chromatography has become the gold standard for modern quality control and purity analytics since its establishment in the 1930s. However, some analytical questions remain very challenging even today. Several molecules and impurities do not possess a suitable chromophore for the application of UV detection or cannot be retained well on regular RP columns. Possible solutions are found in derivatization procedures, but they are time consuming and can be prone to errors. In order to detect non chromophore molecules underivatized, the concept of aerosol based universal detection was established with the introduction of the evaporative light scattering detector (ELSD) in the 1970s and the charged aerosol detector (CAD) followed in 2002. These two challenging fields – polar and non chromophore molecules – are tackled in this thesis.
An overview of applications of the CAD in the literature and a comparison to its aerosol based competitors and MS is presented, emphasizing on its high sensitivity and robustness. Parameters and techniques to overcome the drawbacks of CAD, such as the use of gradient compensation or adjusted evaporation temperatures are discussed. A consideration of aspects and drawbacks of data transformation such as the integrated power function value (PFV) in the GMP environment is performed.
A method for the fatty acid analysis in polysorbate 80 that was developed on HPLC CAD was transferred to UHPLC CAD. Time and eluent savings of over 75% and 40%, respectively, as well as ways to determine the optimal CAD parameters resulted from this investigation. The evaporation temperature was determined as the most crucial setting, which has to be adjusted with care. Optimal signal to noise ratios are found at a compromise between maintaining analyte signal and reducing background noise. The incorporation of semi volatile short chain fatty acids enabled the observation of differences based on volatility of the analyte. E.g. for semi volatiles, an improved linearity by means of adjusting the PFV is achieved at values below 1.0 instead of at elevated PFVs.
Using sugars and sugar related antibiotics, a proof-of-concept was given that artificial neural networks can describe correlations between the structure and physicochemical properties of molecules and their response in CAD. Quantitative structure property relationships obtained by design of experiment approaches were able to predict the response of unseen substances and yielded insights on the response generation of the detector, which heavily relies on the formed surface area of the dried particle. Further work can substantiate upon these findings, eventually building a library of diverse eluent compositions, analytes and settings.
In order to cope with a chromatographically challenging substances, the application of ion pairing reversed phase chromatography coupled to low wavelength UV detection has been shown as a possible approach for the amino acid L asparagine. A method capable of compendial purity analysis in one single HPLC approach, thus making the utilization of the semi quantitative TLC-ninhydrin analysis obsolete, resulted from this. One cyclic dipeptide impurity (diketoasparagine) that was formerly not assessed, could be identified in several batches and added to the monograph of the Ph.Eur.
Studying ibandronate sodium with CAD and ELSD, it was found that randomly occurring spike peaks represent a major flaw of the ELSD when high sample load is present. The research with this non chromophore bisphosphonate drug furthermore shed light on possible drawbacks of mixed mode chromatography methods and ways to overcome these issues. Due to strong adsorption of the analyte onto the column, over ten injections of the highly concentrated test solution were found to be necessary to ensure reproducible peak areas. Preconditioning steps should thus be evaluated for mixed mode approaches during method development and validation.
Last, using a ternary mixed mode stationary phase coupled to CAD, a method for the impurity profiling of pamidronate disodium, also applicable to the assessment of phosphate and phosphite in four other bisphosphonate drugs, has been developed. This represents a major advantage over the Ph.Eur. impurity profiling of pamidronate, which requires two different methods, one of which is only a semi quantitative TLC approach.
Flüssigchromatographische Untersuchungen sind seit deren Einführung in den 1930er Jahren zum Goldstandard für die moderne Qualitätskontrolle und Reinheitsanalytik geworden. Allerdings sind auch noch heutzutage einige Fragestellungen sehr herausfordernd. Viele Moleküle und Verunreinigungen besitzen keinen geeigneten Chromophor, das die Anwendung klassischer UV Detektion ermöglicht, oder erfahren auf gewöhnlichen Umkehrphasen keine ausreichende Retention. Lösungsansätze in Form von Derivatisierungsverfahren sind zeitaufwändig und fehleranfällig. Um underivatisierte Moleküle ohne geeignetes Chromophor zu analysieren, wurde das Prinzip der auf Aerosolen basierenden universellen Detektion mit dem „Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)“ in den 1970er Jahren entwickelt und 2002 folgte der „Charged Aerosol Detector (CAD)“. Diese zwei Felder - polare und nicht chromophore Analyte - werden in der vorliegenden Dissertation bearbeitet.
Eine Literaturübersicht und analyse von Applikationen des CAD, sowie ein Vergleich zu seinen auf Aerosoltechnik basierenden Konkurrenten und der Massenspektroskopie wird dargestellt; besonders die hohe Sensitivität und Robustheit werden ersichtlich. Geräteeinstellungen und Techniken, mit denen sich Nachteile des CAD ausgleichen lassen, werden erläutert und diskutiert. Hierbei werden beispielsweise die Gradientenkompensation oder die Veränderung der Verdampfungstemperatur diskutiert. Ein Überblick über Möglichkeiten und Nachteile der Datentransformation des CAD Signals mittels des eingebauten „Power Function Values (PFV)“ im GMP Umfeld wird gegeben.
Ein Methodentransfer der Analytik von Fettsäuren in Polysorbat 80 von HPLC CAD zu UHPLC CAD wurde durchgeführt. Chemikalien und Zeitersparnisse jenseits von 40 bzw. 75%, sowie Herangehensweisen für die Optimierung der CAD Einstellungen resultierten hieraus. Die Verdampfungstemperatur ist der wichtigste Parameter des Detektors und sollte stets feinjustiert werden. Die höchste Sensitivität findet sich für einen Kompromiss aus verringertem Rauschen und auch erhaltenem Analytsignal. Durch die Analyse von semi flüchtigen Fettsäuren konnten Unterschiede, die auf der Flüchtigkeit von Substanzen basieren, erarbeitet werden. Für semi flüchtige Stoffe ist die Linearisierung mittels PFV bespielsweise bei Werten unter 1.0 erfolgreich, wohingegen für nicht flüchtige Analyte Werte jenseits von 1.0 optimal sind.
Für Zucker und zuckerverwandte Antibiotika konnte ein konzeptioneller Beweis erbracht werden, dass künstliche neuronale Netzwerke Korrelationen zwischen den physikochemischen Eigenschaften der Moleküle und deren Signal im CAD herstellen können. Ein solches Netzwerk wurde mittels Methoden des experimentellen Designs erstellt. Die CAD Detektorantwort, die stark von der Oberfläche der Partikel abhängt, konnte auf diese Weise für Substanzen innerhalb des Experimentalraumes vorhergesagt werden. Hierauf aufbauend kann eine Bibliothek aus Analyten, Fließmitteln und Detektorparametern erarbeitet werden, um weiteres Detailwissen über den CAD zu erhalten.
Die Aminosäure L Asparagin stellt eine chromatographische Herausforderung dar. Es wurde eine Ionenpaar Umkehrphasen Methode mit UV Detektion bei 210 nm als erfolgreicher Ansatz gezeigt. Die arzneibuchkonforme Bestimmung des Verunreinigungsprofils ist mit dieser Methode in einem Lauf möglich, wodurch die Nutzung der halbquantitativen Dünnschichtchromatographie obsolet wird. Weiterhin konnte ein cyclisches Dipeptid (Diketoasparagin), welches zuvor nicht im Verunreinigungsprofil gelistet war, in einigen Batches gefunden und so der Monographie des Ph.Eur. hinzugefügt werden.
Bei der Untersuchung von Natrium-Ibandronat mit dem CAD und dem ELSD konnte gezeigt werden, dass zufällig auftretende „spike peaks“ bei hohen Probenkonzentrationen ein enormes analytisches Problem des ELSD darstellen. Weiterhin wurde mit der Analyse der nicht chromophoren Bisphosphonaten ein Problem von „mixed mode“ Chromatographie aufgedeckt. Durch die starke Adsorption des Analyten auf der Säule waren über zehn Injektionen der konzentrierten Testlösung notwendig, um reproduzierbare Peakflächen zu erhalten. Derartige Sättigungs- und Vorkonditionierungsprozesse sollten für „mixed mode“ Chromatographie während der Entwicklung und Validierung untersucht werden.
Zuletzt wurde eine ternäre „mixed mode“ stationäre Phase gekoppelt mit CAD verwendet, um das Verunreinigungsprofil von Pamidronat Dinatrium zu analysieren. Diese entwickelte Methode konnte auch für die Bestimmung von Phosphat und Phosphit in vier anderen Bisphosphonaten genutzt werden. Erneut ergibt sich ein Vorteil gegenüber der Arzneibuchmethode für Pamidronat, welche zwei verschiedene Methoden - eine davon nur eine halbquantitative Dünnschichtchromatographie - nutzt.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-202114
10.25972/OPUS-20211
Universität Belgrad, Serbien
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Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Klaus Jussi Schilling
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HPLC
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Flüssigkeitschromatographie
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Instrumentelle Analytik
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Chemische Reinheit
eng
uncontrolled
Charged Aerosol Detection
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uncontrolled
mixed-mode chromatography
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uncontrolled
ion-pair chromatography
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uncontrolled
non-chromophore analytes
Analytische Chemie
open_access
Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie
Universität Würzburg
Universität Würzburg
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19982
2020
eng
doctoralthesis
1
2020-02-19
--
2020-02-14
Stability of Tryptophan in Parenteral Amino Acid Solutions: Identification of Degradation Products and Development of HPLC Analysis Methods
Stabilität von Tryptophan in parenteralen Aminosäure-Lösungen: Identifizierung von Abbauprodukten und Entwicklung von analytischen HPLC Methoden
The stability of Trp in pure solutions and in parenteral AA formulations was evaluated with regard to typically used manufacturing processes, storage conditions and primary packaging. Therefore, thorough stability studies on Trp solutions were conducted beforehand. The applied stressing method, i.e. steam sterilization by autoclave, are chemically seen relatively mild but showed to be efficient to induce Trp degradation in the presence of oxygen. Subsequent identification, separation and characterization were challenging due to similar substance properties, numerous stereoisomers and pairs of diastereomers found amongst them. However, the identified o-aminoacetophenone compounds, Kyn and NFK, are associated with photo reactivity and have photo-oxidizing properties. Thus, best possible protection from UV-light, together with strict oxygen expulsion, are the most important criteria to impede Trp degradation after autoclaving.
The identification of Trp degradation products was assisted by the compilation of a substance library, which included manifold reported and chemically plausible Trp degradation substances. The substances were classified for priority and their early or late-stage occurrence. The large number of possible substances and stereoisomers was narrowed down with the information retrieved from LC-UV/MS experiments. However, final identification was achieved by the synthesis of proposed substances as references. The following eight substances were characterized as Trp degradation substances: Kyn, NFK and three pairs of diastereomers R,R/R,S DiOia, R,R/R,S Oia and cis/trans PIC. Fig. 33 shows the proposed degradation pathway and demonstrates the close chemical relationship, which may be an explanation for the conversion of some substances into each other during the storage period. The proposed pathway brings together the results of different Trp stability and stressing studies, respectively [89, 94, 97, 98, 103, 133]. To our knowledge, the simultaneous formation of the identified degradation substances has not been reported before and especially not under the stressing conditions applied.
The application of a traditional RP-HPLC method was compared to two developed IP-HPLC methods and a RP-HPLC methods using a modified perfluorinated column. Orthogonal analyses methods and especially the combination of UV and MS detection are necessary in order to indicate potentially undetected degradation substances. Main evaluation criteria were the separation performance, analyses time, reproducibility and feasibility. The best results upon assessment of all Trp degradation products, in both; pure Trp solutions and pharmaceutical formulations, were obtained by a traditional RP-HPLC. The optimized method was validated according to ICH guidelines Q2(R1) and meets the criteria of a stability-indicating HPLC-UV method. The validated method has a sufficient separation performance with an adequate selectivity indicating the Trp degradation substances next to each other and next to other AAs in finished pharmaceutical formulations.
The detailed knowledge of Trp degradation and the method presented may be transferred practically to the pharmaceutical industry processing Trp-containing products. In general, the findings might contribute to the quality management of such pharmaceutical products during
manufacturing and storage. Additionally, the study results provide basic information for the establishment of an impurity consideration following the ICH guidelines Q3B (R2) (impurities in new drug products) for products containing Trp. However, further development of the method applying more sophisticated detectors or more potent HPLC techniques like e.g. UHPLC and the implication of more sensitive (MS) detectors like ToF-MS would be advantageous with regard to economic and practical aspects.
Diese Arbeit dient der Stabilitätsbeurteilung von Tryptophan (Trp) in parenteralen Aminosäurelösungen, insbesondere im Hinblick auf Einflussfaktoren wie der Herstellungsprozess, z.B. der Sterilisationsvorgang, Lagerungsbedingungen, sowie die Art der verwendeten Primärverpackung. Zunächst wurde die Stabilität von reinen Trp-Lösungen untersucht, die mehreren aufeinanderfolgenden Sterilisationszyklen im Autoklav ausgesetzt wurden. Generell stellt der Autoklavierprozess eine Vergleichsweise milde und kontrollierte Art der Hitzebelastung dar. Dabei wurde zwischen Lösungen unterschieden, die Sauerstoff enthielten und Lösungen, in denen der gelöste Sauerstoff mittels Stickstoffgas ausgetrieben wurde und die anschließend luftdicht verschlossen wurden. Es konnte festgestellt werden, dass der Autoklavierprozess, in Anwesenheit von Sauerstoff, zu einem Abbau von Trp führt, welcher sich außerdem auch durch eine Gelbfärbung der Lösungen zeigt. Die Identifizierung und Charakterisierung der Abbauprodukte erwies sich als schwierig aufgrund von sehr ähnlichen Substanzen, die eine Trennung mittels HPLC und die UV-Detektion alleine erschwerten. Die Massenspektroskopie zeigte erst, dass einige Abbauprodukte zeitgleich eluieren und einige isomere Formen vorliegen. Mithilfe von preparativer HPLC und Fragmentierung in der Ionenfalle konnten drei Diastereomeren-Paare gefunden werden, R,R/R,S Oia und DiOia, cis/trans PIC und zwei weitere Substanzen, Kyn und NFK. Die beiden letztgenannten Stoffe haben eine Sonderstellung, denn sie besitzen jeweils ein o-Aminoacetophenon-Grundgerüst anstelle des Indols, und absorbieren dadurch zusätzlich bei Wellenlängen von > 320 nm, und wirken photosensibilisierend, wodurch die Stabilität von Trp (unter Lichteinstrahlung) zusätzlich nachteilig beeinflusst wird. Daraus lässt sich ableiten, dass der Abbau von Trp in Lösungen maßgeblich durch strengen Sauerstoff- und Lichtausschluss verhindert werden kann. Die Abbildung Fig. 33 zeigt schematisch, wie die einzelnen Abbauprodukte möglicherweise entstehen und zusammenhängen könnten. Die Aufstellung der chemischen Zusammenhänge beruht auf den Ergebnissen verschiedener Trp-Stabilitätsstudien und bringt diese auf einen Nenner [89, 94, 97, 98, 103, 133]. Soweit durch die Literaturrecherche bekannt, wurde das zeitgleiche Auftreten aller hier identifizierten Abbauprodukte bislang noch nicht dokumentiert. Insbesondere wurden keine Studien über Stabilitätsprobleme, bedingt durch die Wasserdampf- Sterilisation gefunden. Des Weiteren zeigten die quantitativen Untersuchungen von Lösungen, die eine Woche, ein und drei Jahre (nach einmaligem Autoklavieren) eingelagert wurden, dass die Abbauprodukte nicht linear entstehen und zunehmen, sondern, dass sich deren prozentuale Anteile dynamisch verändern (Kapitel 3.2.).
Für die Identifizierung der Abbauprodukte von Trp war die Zusammenstellung einer Substanz- Bibliothek äußerst hilfreich. Sie beinhaltet chemisch plausible Trp-Abbauprodukte, sowie aus
der Literatur bekannte Abbauprodukte, die durch verschiedenste Stressmethoden hervorgerufen werden. Diese Substanzen wurden nach Plausibilität und Priorität kategorisiert, um ein gezieltes Screening in gestressten (autoklavierten) Trp-Lösungen durchzuführen. Zusammen mit den Ergebnissen der LC-UV/MS Analyse konnte die Auswahl auf einige wenige Abbauprodukte begrenzt werden. Da es sich dabei um Isomere handelte, gelang die Identifizierung letztendlich erst durch die Synthese der in Frage kommenden Stoffe.
Mithilfe der Synthese der Referenzsubstanzen konnte eine HPLC-UV Methode entwickelt, optimiert und nach den ICH Q2(R1) Richtlinien validiert werden, die eine Quantifizierung der Substanzen in reinen Trp-, und in handelsüblichen parenteralen Aminosäurelösungen ermöglicht. Für die validierte Methode wurde als stationäre Phase eine herkömmliche C18- Säule verwendet. Zu Vergleichszwecken wurde eine Methode auf einer Pentafluorophenyl (PFP)-Säule entwickelt und optimiert (Method D 1 und D 2), sowie zwei RP-Methoden mit zwei analogen Ionen-Paar-Reagenzien (Method B und C). Verglichen und beurteilt wurden dabei die Trennleistungen, Analysendauer, Reproduzierbarkeit und die praktische Anwendbarkeit der jeweiligen Methoden. Die besten Ergebnisse wurden aber mittels der traditionellen RP-HPLC erreicht.
Die Ergebnisse könnten für die Herstellung, Lagerung und Beurteilung von Trp-haltigen Lösungen durchaus relevant sein. Eine strenge Kontrolle der Sauerstoffwerte sowie ein kontinuierlicher Lichtschutz während und nach der Verarbeitung sind unverzichtbar. Die Ergebnisse erlauben außerdem ein gezieltes Screening nach Abbauprodukten, bzw. „Markern“. Die Erstellung von Beurteilungen, wie es z.B in den ICH Q3B(R2) Richtlinien gefordert ist, wird erleichtert, da die Identität bestimmt wurde und eine validierte Quantifizierungsmethode entwickelt wurde. Die Methode könnte für industrielle Zwecke noch weiter optimiert werden, indem z.B. eine UHPLC entwickelt wird oder sensiblere Detektoren, wie z.B. ein ToF- Massendetektor, verwendet werden. Letztendlich sollte allerdings von der Arzneibuchmethode abgegrenzt werden, die Verunreinigungen aus dem Trp-Herstellungsprozess erfasst (1,1´ Ethyliden(bis)Trp). Die hier entwickelte Methode erfasst die Abbauprodukte von Trp in reinen Trp und in Trp-haltigen Aminosäurelösungen, die typischerweise durch Fehler bei der Herstellung oder den Autoklavierprozess hervorgerufen werden können.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-199825
10.25972/OPUS-19982
X 128617
CC BY-SA: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Weitergabe unter gleichen Bedingungen 4.0 International
Nina Unger
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Stabilität
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uncontrolled
Stability
mul
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Parenteral
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uncontrolled
Amino acids
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Aminosäuren
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Tryptophan
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HPLC
Chemie und zugeordnete Wissenschaften
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Universität Würzburg
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17927
2019
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doctoralthesis
1
2019-04-14
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2019-04-12
Qualitative Charakterisierung polydisperser Macrogole sowie strukturell verwandter Hilfsstoffe mittels HPLC-CAD
Qualitative characterization of polydisperse macrogols and related excipients with HPLC-CAD
The class of macrogols and macrogol-based excipients, i.e. macrogol fatty alcohol ethers, macrogol fatty acid esters, and polysorbates, plays an important role in modern galenic formulations. Formerly used as simple emulsifiers, they are nowadays utilized in fields such as targeted drug release to increase bioavailability, and as solubilizers for complex systems. For these multifaceted applications, and regarding the polydisperse structures of the macrogols, a reproducible and significant analytical procedure is required.
For the characterization of excipients, the European Pharmacopoeia (Ph. Eur.) provides some compendial protocols which are able to describe the number of functional groups present in the substance. Some examples of these bulk parameters are the hydroxyl value, the iodine value, the peroxide value, or the acid value. Thus, these bulk parameters allow an overview of the average molar weight or possible degradation processes (e.g. autoxidation), but they provide no further information about the polymeric distribution which can heavily depend on the manufacturing process. Furthermore, bulk parameter investigations are very time-consuming and prone to errors due to their stringent reaction processes and numerous reaction steps.
Since several years, the HPLC has been the gold standard of pharmaceutical analytics particularly due to the fact of automation. Coupled to UV detection, it offers the opportunity for a quick, easy, and robust analysis for many drugs. In the field of excipients, the development progress of HPLC-analysis is much slower due to the fact that most excipients lack a UV-chromophore. The application of the highly sensitive mass spectrometry would be eligible for detection but is rather complex and expensive. However, the development of the aerosol-based detectors such as the ELSD (evaporative light scattering detection), the CAD (charged aerosol detection), and the NQADTM (nano quantity aerosol detection) enables the application of HPLC for analyzing non-chromophoric substances.
This work aimed to develop a generic HPLC-CAD method to analyze a wide range of macrogols and macrogol-based excipients. The separation was performed on a C18-column. A gradient method was developed based upon several linear gradient steps in order to be able to separate the different chain lengths. The mobile phases were water and acetonitrile, respectively, to which 0.1% formic acid was added.
Macrogols in the average size range of PEG 300 to PEG 3000 were separated with acceptable resolution. The separation results were verified by mass spectrometry for PEG 300 - 1500. Five saturated and two non-saturated fatty acids, as well as two fatty alcohols of different chain lengths were successfully separated. 13 macrogol-based excipients were analyzed with the developed method and separated successfully. The macrogol fatty alcohol ethers, macrogol stearates, and polysorbates were separated to sufficient extent to analyze the polymeric distribution.
The free PEGs in the excipients were separated and identified. Based on these free PEGs, different manufactural processes could be determined. Depending on the average chain lengths of the processed PEGs, the free fatty acids or alcohols could be identified and separated from the esters or ethers, respectively. For the smaller average chain lengths, the free fatty acids and alcohols coeluted with the esters and ethers.
Macrogol glycerol hydroxy stearate (Cremophor® RH40) was separated into its components except for the linear monoesters which partially coeluted with the free PEGs, and the glycerol triesters which showed effects of size exclusion.
The developed method was also used for stability tests of the non-saturated fatty acids, i.e. oleic and linoleic acid. Here, the fatty acid solutions were chemically (hydrogen peroxide) and thermally (60 °C) stressed and analyzed after different time spans. A time and temperature dependent degradation was observed. An assignment of some degradation products was performed by determining the m/z values with mass spectrometry. The method proved to be capable of separating the degradation products of the main substance and allows to estimate the dimension of degradational processes and partly identify the structures of the degradational products.
In general, the provided method offers a good basis for analyzing and characterizing a wide field of substance classes. It provides an extension of bulk parameters (e.g. hydroxyl value) with a reduction of analytical effort. It offers a good starting point for more specific observations such as long-term stability or other related substance classes.
Der Gruppe der Macrogole sowie den darauf basierenden Abkömmlingen, den Macrogolfettalkoholethern, Macrogolfettsäureestern und Polysorbaten, kommt in der modernen Galenik eine wichtige Rolle zu. Dienten sie vormals nur als gewöhnliche Emulgatoren, so finden sie heutzutage vor allem im Bereich der gezielten Wirkstofffreisetzung, der Erhöhung der Bioverfügbarkeit sowie als Löslichkeitsvermittler komplexer Systeme Anwendung. Diese vielschichtigen Anwendungsgebiete erfordern, auch aufgrund der polydispersen Strukturen der Macrogole, eine reproduzierbare und aussagekräftige Analytik.
Das Europäische Arzneibuch (Ph. Eur.) bietet zur Charakterisierung der Hilfsstoffe eine Handvoll Messgrößen, die sog. Fettkennzahlen, die eine Größenordnung vorhandener funktioneller Gruppen liefern. Zu diesen gehören Werte wie Hydroxylzahl, Iodzahl, Peroxidzahl oder Säurezahl. Diese bieten zwar einen Überblick über den Größenbereich der mittleren Kettenlängen oder einen möglichen Abbau der Strukturen, beispielsweise durch Autoxidation, jedoch geben sie keine Auskunft über die Polymerverteilung. Insbesondere diese kann jedoch, je nach Herstellungsweise, stark variieren. Außerdem ist die Methodik der Fettkennzahlenbestimmungen aufgrund der strikten Reaktionsabläufe und zahlreicher Reaktionsschritte einerseits sehr zeitaufwändig und andererseits anfällig für Fehler.
Die HPLC hat, insbesondere aufgrund der Automation, bereits seit Jahren den Status des Goldstandards in der pharmazeutischen Analytik inne. Gekoppelt mit der UV-Detektion bietet sie für zahlreiche Wirkstoffe die Möglichkeit zur schnellen, einfachen und robusten Analyse. Im Bereich der Hilfsstoffe verbreitet sich die HPLC-Analytik langsamer, da viele Hilfsstoffe keinen Chromophor aufweisen. Eine Anwendung der hochsensitiven Massenspektrometrie wäre zwar zur Detektion geeignet, würde sich für die Routineanwendung jedoch als zu komplex und kostenintensiv gestalten. Doch mit der Entwicklung der Aerosol-basierten Detektoren wie dem ELSD (evaporative light scattering detector), dem CAD (charged aerosol detector) und dem NQADTM (nano quantity aerosol detector) wurde auch für nicht-chromophore Substanzen ein Einsatz der HPLC möglich.
Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Entwicklung einer HPLC-CAD-Methode, die eine möglichst große Bandbreite der Macrogole und der darauf basierenden Hilfsstoffe erfassen kann. Die Trennung erfolgte an einer C18-Trennsäule. Es wurde eine Gradienten-Methode entwickelt, die aus mehreren linearen Gradientenstufen zusammengesetzt wurde, um verschiedene Kettenlängen der Polymere besser voneinander zu trennen. Als mobile Phasen dienten Wasser und Acetonitril, denen jeweils 0.1 % Ameisensäure zugesetzt wurden.
Es konnten Macrogole im Bereich PEG 300 bis PEG 3000 mit akzeptabler Auflösung aufgetrennt werden. Diese Ergebnisse wurden für PEG 300 – 1500 mittels Massenspektrometrie verifiziert. Es konnten fünf gesättigte und zwei ungesättigte Fettsäuren, sowie zwei Fettalkohole verschiedener Kettenlängen voneinander getrennt werden. Es wurden 13 Macrogol-basierte Hilfsstoffe mit der entwickelten Methode untersucht und erfolgreich getrennt. Die Macrogolfettalkoholether, -stearate und Polysorbate wurden insoweit aufgetrennt, dass die Polymerverteilung beobachtet werden konnte.
Freie PEGs in den Hilfsstoffen wurden getrennt und identifiziert. Anhand dieser konnten unterschiedliche Herstellungsweisen zugeordnet werden. Abhängig von der mittleren Kettenlänge der verarbeiteten PEGs konnten teilweise die freien Fettsäuren bzw. -alkohole von den Estern bzw. Ethern getrennt und identifiziert werden. Im Bereich der kürzeren mittleren Kettenlängen wurden die freien Fettsäuren und -alkohole von den Estern und Ethern überlagert.
Macrogolglycerolhydroxystearat (Cremophor® RH40) wurde in seine Komponenten aufgetrennt, mit Ausnahme der linearen Monoester, die mit den freien PEGs partiell koeluierten und die Glyceroltriester, die Größenausschlusseffekte zeigten.
Die Methode wurde für Stabilitätsuntersuchungen der ungesättigten Fettsäuren, Öl- und Linolsäure, eingesetzt. Hierzu wurden diese Säuren in Lösung chemisch (Wasserstoffperoxid) und thermisch (60 °C) gestresst und in bestimmten Zeitabständen analysiert. Es zeigte sich ein zeit- und temperaturabhängiger Abbau. Die teilweise Zuordnung der Abbauprodukte erfolgte durch Bestimmung des m/z mittels Massenspektrometrie. Die Methode war geeignet, um das Ausmaß eines oxidativen Abbaus von der Hauptsubstanz zu trennen und strukturell einzuordnen.
Generell bietet die Methode eine gute Basis, die eine Vielzahl an Substanzgruppen erfassen und charakterisieren kann. Sie bietet eine Ergänzung der Fettkennzahlen, die einen verringerten Arbeitsaufwand mit sich bringt. Für spezifischere Betrachtungen (Langzeitstabilität, verwandte Substanzgruppen) stellt sie einen guten Ausgangspunkt dar.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-179274
10.25972/OPUS-17927
X 128154
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Christiane Theiss
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HPLC
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Macrogol
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Pharmazeutischer Hilfsstoff
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uncontrolled
Charged Aerosol Detection
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uncontrolled
Excipients
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Pharmacy
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Chromatographie
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Macrogole
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uncontrolled
Hilfsstoffanalytik
Analytische Chemie
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Universität Würzburg
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17721
2019
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doctoralthesis
1
2019-02-25
--
2019-02-22
Development of simple and cost-effective High Performance Liquid Chromatography methods for quality control of essential beta-lactam antibiotics in low- and middle-income countries
Entwicklung einfacher und kosteneffektiver Hochleistungs-Flüssigchromatographie(HPLC)-Methoden für die Qualitätskontrolle für Betalaktam-Antibiotika in Entwicklungs- und Schwellenländern
Assay and impurity profiling of the pharmaceuticals are the key routine quality control methods employed worldwide for which High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is the most widely used technique. The ability to carry out these routine laboratory procedures in low- and middle- income countries (LMICs) need the methods to be based upon simple instruments manageable with moderate levels of personnel skill and costs involved.
Simple, convenient, and cost effective reverse phase HPLC methods were developed using phosphate buffer and methanol as mobile phase with C18 column as stationary phase for the impurity profiling and assay of beta lactam antibiotics. Isocratic elution and UV detection was employed in these methods. Impurity profiling method was developed for coamoxiclav tablets and ceftriaxone bulk drug. The method for ceftriaxone included a supplementary method to quantify one of its known impurity (Impurity D of ceftriaxone). This method involved use of acetonitrile where as the two main methods were achieved on the targeted method design, described above. With the exception of impurity A of ceftriaxone, the methods developed can successfully quantify impurities to the concentration as low as ≤0.05%, which is in accordance with the current guidelines for the impurity profiling of antibiotics issued by European Medicines Agency.
As ensuring cost reduction was one of the key objectives of carrying out the method development exercise, in situ methods for the preparation of impurities were also identified and some new methods were introduced. The stability of beta lactam antibiotics and the choice of solvent were given due attention during the process of method development revealing information on the presence of new impurities. Deacetyl cefotaxime and 2-mercaptobenzathiazole were identified in this process as new impurities of ceftriaxone currently not listed under known impurities by United States Pharmacopoeia and European Pharmacopoeia. However, deacetyl cefotaxime is a known impurity of cefotaxime whereas the latter molecule is a degradation product of one of the synthesis impurities of ceftriaxone. This substance is reported to be carcinogenic and is resolved using the supplementary method developed for ceftriaxone, hence making its detection and quantification possible. A known inactive impurity of ceftriaxone (Impurity A, E-isomer of ceftriaxone) was` also shown to be produced by exposure to day light, thus warranting the light protection of the ceftriaxone solution, an information that is of critical importance in the clinical settings.
A series of experimentation was carried out on the finished products of beta lactam antibiotics sampled from Pakistan and few other countries, to identify key quality issues in the samples. Though the limited sample size and convenient sampling did not provide results that could yield a decisive figure for the country status for prevalence of substandard and falsified medical products, but the experiments have clearly indicated that the problems in drug quality do exist and beta lactam antibiotics form a class of high-risk medicine with respect to surveillance for poor-quality medicines. Isolation of unknown impurities was also carried out along with the introduction of new and modified methods for preparation of impurities of beta-lactam antibiotics.
In addition, detailed literature survey was carried out for understanding the complex problem of the poor-quality medicine, impact of poor quality antimicrobials on health care system and the magnitude of the problem at the global level. The country status of Pakistan regarding quality of medicines was recorded based upon the available documentary evidence. The current technologies and strategic options available for low- and middle-income countries in aiding fight for combating poor quality medicines was also laid down to design recommendations for Pakistan. A comprehensive review of the information technology tools used for identification and control of substandard and falsified medicines was also conducted.
Für die Bestimmung der Reinheit und des Gehaltes von Arzneistoffen wird weltweit maßgeblich die Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) eingesetzt. Damit die entsprechenden Methoden auch in Entwicklungs- und Schwellenländern angewendet werden können, müssen sie zur Verwendung mit sehr einfachen Messgeräten geeignet sein und von auch weniger gut ausgebildetem Personal durchgeführt werden können. Zudem sollten die Kosten möglichst niedrig sein.
Für die Reinheitsanalytik sowie die Bestimmung des Gehaltes von Betalaktam-Antibiotika wurden einfache, praktische und kostengünstige chromatographische Methoden unter Verwendung von Umkehrphasen entwickelt, die als mobile Phase Gemische aus Phosphatpuffern und Methanol sowie als stationäre Phase C18-Säulen verwenden. Die Methoden sind isokratisch, die Detektion erfolgt mittels UV/Vis-Spektrometer. Für Coamoxiclav-Tabletten sowie den Arzneistoff Ceftiaxon wurden Methoden zur Reinheitsprüfung entwickelt. Für die Reinheitsprüfung von Ceftriaxon wurde eine zweite Methode benötigt, um eine der bekannten Verunreinigungen (Ceftriaxon-Verunreinigung D) zu quantifizieren. Hierbei musste Acetonitril als Bestandteil der mobilen Phase gewählt werden, wohingegen die beiden Hauptmethoden dem beschriebenen Methodendesign folgten. Außer im Falle der Ceftriaxon-Verunreinigung A können mit den Methoden Verunreinigungen bis zu einem Konzentrationslevel ≤ 0,05 % bestimmt werden, was den Vorgaben aktueller Richtlinien für die Reinheitsanalytik der Europäischen Arzneimittelbehörde entspricht.
Da es ein Kernziel während der Methodenentwicklung war, die Kosten für die Analytik möglichst gering zu halten, wurden in situ-Methoden für die Gewinnung von Verunreinigungen entwickelt und einige neue eingeführt. Während des Entwicklungsprozesses wurde besonders auf die Stabilität der Antibiotika und auf die Wahl des Lösungsmittels geachtet, wobei Erkenntnisse über die Anwesenheit neuer Verunreinigungen erlangt werden konnten. Desacetylcefotaxime und 2-Mercaptobenzathiazol wurden als neue Verwandte Substanzen von Ceftriaxon identifiziert und sind derzeit nicht als bekannte Verunreinigen in der United States Pharmacopoeia sowie dem Europäischen Arzneibuch aufgeführt. Desacetylcefotaxime ist eine bekannte Verunreinigung von Cefotaxime, wohingegen das zweite Molekül ein Abbauprodukt einer der Verunreinigungen ist, die während der Synthese von Ceftriaxon entstehen können. Es ist bekannt, dass diese Substanz karzinogen ist, und sie kann mit der erweiterten zweiten Methode für Ceftriaxon erfasst und quantifiziert werden. Unter Lichteinfluss bildete sich zudem eine weitere bekannte, inaktive Verunreinigung von Ceftriaxon (Verunreinigung A, E-Isomeres von Ceftriaxon), weshalb Ceftriaxon-haltige Lösungen vor Licht geschützt aufbewahrt werden sollten. Dieses Wissen ist besonders für den klinischen Bereich relevant.
An einer Reihe von Betalaktam-haltigen Fertigarzneimitteln aus Pakistan und einigen anderen Ländern wurden mehrere Qualitätsuntersuchungen angestellt. Obwohl der geringe Probenumfang und die Methoden der Probensammlung kein eindeutiges Bild darüber zeichnen konnte, ob in einem bestimmten Land Arzneimittelfälschungen besonders häufig auftreten, konnte durch die Versuche dennoch festgestellt werden, dass es Probleme bei der Arzneimittelqualität gibt und dass Betalaktam-Antibiotika eine Hochrisikogruppe darstellen, die besonders gut hinsichtlich des Vorkommens minderwertiger Arzneimittel untersucht werden muss. Zudem wurden unbekannte Verunreinigungen aus den Proben isoliert und neue sowie modifizierte Methoden entwickelt, um Verunreinigungen der untersuchten Substanzen zu gewinnen.
Zudem wurde eine ausführliche Literaturrecherche durchgeführt, um das komplexe Problem minderwertiger Arzneimittel, den Einfluss minderwertiger Antibiotika auf das Gesundheitssystem sowie das globale Ausmaß des Problems zu verstehen. Für Pakistan wurde der status quo der Arzneimittelqualität aufgrund vorhandener Dokumentation ermittelt. Außerdem wurde dargelegt, inwiefern die heutigen modernen Technologien und Strategien, die für Entwicklungs- und Schwellenländern zur Verfügung stehen, zur Bekämpfung von qualitativ minderwertigen Arzneimitteln in Pakistan beitragen können. Hierzu wurde eine Übersicht aktueller, moderner digitaler Techniken angefertigt, die für die Aufdeckung und Bekämpfung von minderwertigen und gefälschten Arzneimitteln verwendet werden können.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-177214
10.25972/OPUS-17721
X 128072
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Huma Rasheed
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uncontrolled
Quality ccontrol
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uncontrolled
antibiotics
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uncontrolled
HPLC
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uncontrolled
LMICS
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uncontrolled
simple
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HPLC
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Low-income Countries
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Qualitätskontrolle
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Antibiotikum
Chemie und zugeordnete Wissenschaften
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14582
2018
eng
doctoralthesis
1
2017-03-20
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2017-03-20
Assessment of Counterfeit and Substandard Antimalarial Medicines using High Performance Thin Layer Chromatography and High Performance Liquid Chromatography
Untersuchung der Qualität gefälschter Antimalaria-Medikamente mittels Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie und Hochleistungs-Flüssigchromatographie
Although the prevalence of substandard and counterfeit pharmaceutical products is a global problem, it is more critical in resource-constrained countries. The national medicines regulatory authorities (MNRA) in these countries have limited resources to cater for regular quality surveillance programmes aimed at ensuring that medicines in circulation are of acceptable quality. Among the reasons explained to hinder the implementation of these strategies is that compendial monographs are too complicated and require expensive infrastructures in terms of environment, equipment and consumables. In this study it was therefore aimed at developing simple, precise, and robust HPLC and HPTLC methods utilizing inexpensive, readily available chemicals (methanol and simple buffers) that can determine the APIs, other API than declared one, and which are capable of impurity profiling. As an outcome of this study, three isocratic and robust HPLC and two HPTLC methods for sulfadoxine, sulfalene, pyrimethamine, primaquine, artesunate, as well as amodiaquine have been developed and validated. All HPLC methods are operated using an isocratic elution mode which means they can be implemented even with a single pump HPLC system and standard C18 columns. The densitometric sulfadoxine/sulfalene and pyrimethamine method utilizes standard TLC plates as well as inexpensive, readily available and safe chemicals (toluene, methanol, and ethyl acetate), while that for artesunate and amodiaquine requires HPTLC plates as well as triethylamine and acetonitrile due to challenges associated with the analysis of amodiaquine and poorly the detectable artesunate. These HPTLC methods can be implemented as alternative to those requiring HPLC equipment e.g. in countries that already have acquired densitometer equipment. It is understood that HPTLC methods are less sensitive, precise and accurate when compared to HPLC methods, but this hindrance can easily be addressed by sending representative samples to third party quality control laboratories where the analytical results are verified using compendial HPLC methods on a regular basis.
It is therefore anticipated that the implementation of these methods will not only address the problem of limited resources required for medicines quality control but also increase the number of monitored targeted antimalarial products as well as the number of resource- constrained countries participating in quality monitoring campaigns. Moreover, the experiences and skills acquired within this work will be applied to other API groups, e. g. antibiotics, afterwards.
Trotz der weltweiten Verbreitung gefälschter Arzneimittel und solcher, die nicht die deklarierte Menge an Wirkstoff enthalten, sind vor allem Entwicklungs- und Schwellenländer von dieser Problematik betroffen. Die Arzneimittelüberwachungs- bzw. Zulassungsbehörden dieser Länder verfügen nur über eingeschränkte Möglichkeiten, die Arzneimittelqualität regelmäßig zu überwachen und somit sicherzustellen, dass die im Markt befindlichen Medikamente eine gute Qualität aufweisen. Einer der Gründe hierfür ist unter anderem, dass die in Arzneibüchern beschriebenen Methoden oftmals sehr komplex sind und eine umfassende Laborausstattung, spezielle Geräte oder teure Chemikalien benötigen. In dieser Arbeit wurden einfache, genaue und robuste flüssigchromatographische Methoden entwickelt, die lediglich günstige, überall verfügbare Chemikalien (z. B. Methanol oder einfache Puffersalze) benötigen und mit denen der Gehalt des deklarierten Arzneistoffes, Arzneistoffverwechslungen sowie das Verunreinigungsprofil bestimmt werden kann. Es konnten drei isokratische, robuste flüssigchromatographische sowie zwei dünnschichtchromatographische Methoden zur Bestimmung von Sulfadoxin, Sulfalen, Pyrimethamin, Primaquin, Artesunat sowie Amodiaquin entwickelt und validiert werden. Alle flüssigchromatographischen Methoden arbeiten isokratisch, folglich können sie auch mit sehr einfachen HPLC-Geräten mit beispielsweise nur einem Pumpenkopf genutzt werden. Zudem werden nur einfache, kommerziell erhältliche C18-Säulen benötigt. Die densitometrischen Methoden für Sulfadoxin/Sulfalen sowie Pyrimethamin benötigen standardisierte Dünnschichtchromatographie-Platten sowie günstige, überall verfügbare und wenig toxische Chemikalien wie beispielsweise Toluol, Methanol oder Ethylacetat. Für die Methode zur Bestimmung von Artesunat und Amodiaquin werden Hochleistungsdünnschichtchromatographie-Platten und Triethylamin sowie Acetonitril benötigt. Dieser Umstand ist der Tatsache geschuldet, dass Amodiaquin und Artesunat sich anderweitig nur ungenügend trennen ließen. Die dünnschichtchromatographischen Protokolle können als Alternative zur HPLC eingesetzt werden, beispielsweise überall dort, wo bereits die entsprechenden Gerätschaften vorhanden sind. Natürlich weisen dünnschichtchromatographische Methoden im Vergleich zur Flüssigchromatographie eine geringere Sensitivität, Präzision und Richtigkeit auf, dies kann jedoch dadurch umgangen werden, die entsprechenden Methoden nur zum Screening zu verwenden und die zu analysierenden Proben anderweitig, z. B. in externen Laboratorien, detailliert zu untersuchen. Dort können beispielsweise Methoden aus gängigen Arzneibüchern verwendet werden. Durch die Implementierung der neu entwickelten Methoden kann zum einen das Problem schlecht verfügbarer Chemikalien umgangen werden und gleichzeitig die Anzahl an untersuchten Arzneimitteln erhöht werden. Dies ist ein wichtiger Beitrag zur Qualitätskontrolle in Ländern mit eingeschränkten Infrastrukturen.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-145821
Tanzania Food and Drugs Authority
Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte
X 127526
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Yonah Hebron Mwalwisi
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Instrumentelle Analytik
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Arzneimittel
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Fälschung
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Malaria
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HPLC
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Counterfeit Medicines
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HPLC
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Pharmaceutical Analysis
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Impurity Profiling
Analytische Chemie
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Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/14582/Hebron_Yonah_Impurity_Profiling.pdf
14571
2016
eng
doctoralthesis
1
2017-03-14
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2017-03-14
Development and Validation of Methods for Impurity Profiling of Amino Acids
Entwicklung und Validierung von Methoden für die Reinheitsanalytik von Aminosäuren
The requirements for the impurity profiling of substances for pharmaceutical use have become greater over time. They can be accomplished by the use of modern instrumental analysis techniques, which have been evolved in the last decades. New types of columns with HILIC, mixed-mode and chiral stationary phases are suitable for the separation of all kinds of substances mixtures, that were previously hardly possible with the use of common reversed phase columns. Modern, almost universal detectors like CAD, ELSD and CNLSD can be applied for a sensitive detection of substances without a chromophore. However, in addition to some small individual disadvantages to these methods, the costs are high and applications are still kind of rare. Thus, the introduction of these devices at a broader level has not yet taken place. While this presumably will change over time, there is a need for methods that enable the impurity profiling of challenging substances with widespread analytics devices.
Methionine is a substance with hydrophobic and hydrophilic impurities. With the help of a mixed-mode stationary phase, which is a combination of a reversed phase and a strong cationic exchanger, the separation of all putative impurities was found possible with good sensitivity and selectivity. The method requires apart from the column only standard isocratic HPLC equipment and was successfully validated.
The evaluation of the enantiomeric purity of amino acids is challenging. Two approaches were made. The first method utilizes CE by means of in-capillary derivation with OPA and the subsequent separation with a cyclodextrin. With the use of OPA/NAC and γ-cyclodextrin, a simple and cost-effective method for the indirect enantioseparation of 16 amino acids was developed. With the second approach, racemic amino acids can be analyzed with HPLC and in-needle derivatization. For this, different columns and chiral thiols were evaluated and the chromatographic parameters were optimized. A method with OPA/NIBLC, a pentafluorophenyl column made the enantioseparation of 17 amino acids feasible. A LOQ of the minor enantiomer down to 0.04 % can be achieved with UV spectrophotometric detection. A similar method was developed for impurity profiling of L-amino acids. This can be used alternatively for the amino acid analysis performed by the European Pharmacopoeia.
A simple, robust, precise and accurate method for the evaluation of impurities in glyceryl trinitrate solution was developed and validated. The four impurities of glyceryl trinitrate are separated by means of an acetonitrile-water gradient and the assay for this substance is also possible.
Die Anforderungen an die Reinheitsanalytik von Substanzen für pharmazeutische Zwecke sind mit der Zeit größer geworden. Diese können durch die Verwendung von modernen instrumentellen Analysetechniken, die sich in den letzten Jahrzehnten entwickelt haben, erfüllt werden. Neue Arten von Säulen mit HILIC, mixed-mode und chiralen Phasen sind geeignet für die Trennung von allen möglichen Substanzgemischen, die vorher mit der Verwendung von gewöhnlichen Umkehrphasensäulen kaum möglich waren. Moderne, fast universelle Detektoren wie CAD, ELSD und CNLSD können für eine sensitive Detektion von Substanzen ohne Chromophor verwendet werden. Allerdings, neben ein paar individuellen Nachteilen von diesen Methoden, sind die Kosten sehr hoch und die Anwendungen noch eher selten. Daher haben sich diese Geräte noch nicht auf breiter Ebene durchgesetzt. Auch wenn sich das mit der Zeit ändern wird, gibt es die Notwendigkeit für Analysemethoden mit denen die Reinheitsanalytik von herausfordernden Substanzen auf verbreiteten analytischen Geräten ermöglicht wird.
Methionin ist eine Substanz mit hydrophilen und hydrophoben Verunreinigungen. Mit der Hilfe einer „mixed-mode“-Phase, welche eine Kombination aus Umkehrphase und starker Kationenaustauscher ist, wurde die Trennung von allen mutmaßlichen Verunreinigungen mit guter Sensitivität und Selektivität ermöglicht. Die Methode benötigt abgesehen von der Säule nur eine normale isokratische HPLC und wurde erfolgreich validiert.
Die Untersuchung der chiralen Reinheit von Aminosäuren ist anspruchsvoll. Zwei Ansätze wurden durchgeführt. Die erste Methode verwendet CE mittels In-Capillary- Derivatisierung durch OPA und der anschließenden Trennung mit Hilfe von einem Cyclodextrin. Durch den Gebrauch von OPA/NAC und γ-Cyclodextrin, wurde eine einfache und kosteneffektive Methode für die indirekte Enantioseparation von 16 Aminosäuren entwickelt. Mit dem zweiten Ansatz können Aminosäuren mittels HPLC und einer In-Needle- Derivatisierung analysiert werden. Dafür wurden verschiedene Säulen und chirale Thiole getestet und die chromatographischen Parameter optimiert. Eine Methode mit OPA/NIBLC, einer Pentafluorophenyl-Säule ermöglichte die Trennung on 17 Aminosäuren. Ein LOQ des kleinen Enantiomers von 0,04 % kann mit UV-spektroskopischer Detektion erreicht werden. Eine ähnliche Methode wurde für die Reinheitsanalytik von L-Aminosäuren entwickelt. Diese kann alternativ zur Aminosäurenanalyse im Europäischen Arzneibuch verwendet werden.
Zusammenfassung
163
Eine einfache, robuste, präzise und richtige Methode zur Untersuchung der Verunreinigungen in Glyceryltrinitratlösung wurde entwickelt und validiert. Die vier Verunreinigungen von Glyceryltrinitrat werden mit Hilfe eines Acetonitril-Wasser-Gradienten getrennt und die Gehaltsbestimmung dieser Substanz ist ebenfalls möglich.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-145718
X 126994
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Raphael Kühnreich
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Aminosäuren
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HPLC
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Enantiomere
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Trennung
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uncontrolled
amino acid
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uncontrolled
impurity profiling
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uncontrolled
chiral separation
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uncontrolled
Aminosäure
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Reinheitsanalytik
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uncontrolled
chirale Trennung
Analytische Chemie
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https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/14571/Kuehnreich_Raphael_DevelopmentValidationAminoAcids.pdf
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11319
2015
deu
doctoralthesis
1
2015-05-15
--
2015-05-13
Entwicklung vereinfachter flüssigchromatographischer
Untersuchungsmethoden zur Qualitätskontrolle essentieller Antimalaria-Medikamente in Entwicklungs- und
Schwellenländern
Im Rahmen dieser Arbeit wurden sehr einfache, flüssigchromatographische Methoden zur Qualitätsanalytik gebräuchlicher Antimalaria-Medikamente (Amodiaquin, Mefloquin, Proguanil sowie die Kombination Artemether/Lumefantrin) entwickelt, die nur wenige, günstig erhältliche Chemikalien (Phosphatpuffer, Methanol) sowie gewöhnliche, kommerzielle RP-18-Säulen benötigen. Sie sind insbesondere zur Anwendung in Laboratorien in Entwicklungsländern geeignet und erfordern keine komplexen HPLC-Instrumente wie beispielsweise Gradientenpumpen oder Säulenthermostate. Der Verzicht auf Ionenpaarreagenzien ermöglicht es, dass eine stationäre Phase für mehr als nur einen einzigen Einsatzzweck verwendet werden kann und dass langwierige Äquilibrier- bzw. Spülschritte nicht notwendig sind. Alle Methoden arbeiten im isokratischen Elutionsmodus und durch die Verwendung kurzer Säulen (125 mm) konnten die jeweiligen Analysenzeiten zusätzlich verringert werden. Hierdurch ist zudem eine Reduzierung des Fließmittelverbrauches möglich.
Während der Methodenentwicklung wurden charakteristische, aus dem Herstellungsweg des jeweiligen Arzneistoffes stammende potentielle Verunreinigungen berücksichtigt. Ihre Bestimmung erlaubt eine Aussage über die Herkunft eines Wirkstoffes bzw. eines Arzneimittels, da das Verunreinigungsmuster einer Substanz oftmals die Zuordnung zu einem bestimmten Herstellungs- bzw. Reinigungsprozess ermöglicht.
Alle Methoden wurden hinsichtlich der Linearität innerhalb des Arbeitsbereiches sowie der Wiederholpräzision charakterisiert. Es wurde eine gute Reproduzierbarkeit gefunden. Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen der untersuchten Verunreinigungen lagen bei einem Level von je 0.1 %. Durch gezielte Variation wurde der Einfluss wechselnder Trenntemperaturen sowie schwankender pH-Werte der jeweiligen mobilen Phase und die hieraus resultierenden Effekte untersucht. Hierbei zeigte sich, dass die Methoden sehr robust gegenüber diesen Einflussgrößen sind und somit für die Anwendung mit einfach ausgestatteten HPLC-Systemen sowie besonders für den Einsatz in tropische Gebieten mit wechselnden klimatischen Bedingungen gut geeignet sind.
Flüssigchromatographische Methoden spielen heute in der pharmazeutischen Analytik vor allem zur Bestimmung der Reinheit eines Arzneistoffes eine herausragende Rolle und sind in nahezu jeder Monographie der wichtigsten Arzneibücher (z. B. im Ph. Eur.) zu finden. Einfach durch-führbare Untersuchungsmethoden, wie beispielsweise die im GPHF-Minilab® angewandte Dünnschichtchromatographie, erfordern im Vergleich zur HPLC weniger komplexe und teure Instrumente und können selbst in entlegenen Gebieten ohne Laboratorium durchführt werden. Sie verfügen allerdings über eine nur sehr geringe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit, da sowohl die praktische Durchführung als auch die anschließende Auswertung rein manuell bzw. visuell erfolgt und somit in hohem Maße einer Beeinflussung durch den jeweiligen Analytiker unterworfen ist. Die entwickelten HPLC-Methoden wurden mit dünnschichtchromatographischen Verfahren verglichen, hierbei besonders unter dem Aspekt der visuellen und der instrumentellen Auswertung der Chromatogramme zur Bestimmung des Gehaltes einer unbekannten Probe. Hierbei konnte aufgezeigt werden, dass die Dünnschichtchromatographie der Flüssigchromatographie eindeutig unterlegen ist, insbesondere wenn die Auswertung nicht mittels eines entsprechenden Scanners sondern rein visuell erfolgt: Nur in den wenigsten Fällen ist es möglich, eine annähernd präzise Aussage über den Gehalt zu treffen und zudem ist die Bestimmung der Verwandten Substanzen nur sehr bedingt möglich. Durch den Einsatz von Auftragegeräten bzw. Plattenscannern kann die Genauigkeit zwar signifikant erhöht werden, allerdings sind solche Instrumente im Verhältnis wesentlich teurer als einfache, modulare HPLC-Systeme und zählen heute in den wenigsten Laboratorien zum Standardinventar.
Vereinfachte chromatographische Methoden können ein wichtiges Hilfsmittel für Kontrolllaboratorien in Entwicklungsländern sein, wenn komplexe, etablierte Protokolle nur eingeschränkt angewendet werden können. Durch die Kombination aus dünnschichtchromatographischer Basisanalytik und einer flächendeckenden Untersuchung mittels HPLC lässt sich die Arzneimittelqualität sehr gut überprüfen, die regulatorischen Organe eines Landes entsprechend zu entlasten und die Versorgung der Bevölkerung mit qualitativ einwandfreien Medikamenten zu gewährleisten.
Ein weiterer Teil der Arbeit befasst sich mit der Stabilitätsanalytik individuell hergestellter, Noradrenalin-haltiger Injektionslösungen. Solche Rezepturen werden oftmals in Krankenhausapotheken im Rahmen der Defektur auf Vorrat durch Verdünnen der entsprechenden kommerzieller Fertigarzneimittel mit isotonischer Kochsalzlösung zubereitet, um z. B. für Notfallsituationen am Wochenende die Rezepturen vorrätig zu haben. Durch die Untersuchungen wurde geprüft, inwieweit der übliche Verdünnungsgrad von 0.1 % einen Einfluss auf die Stabilität des Noradrenalins hat und welche Lagerungsbedingungen für die Zubereitungen empfohlen werden können. Nach der Lagerung unter verschiedenen Bedingungen (gekühlt, bei Raumtemperatur sowie jeweils mit bzw. ohne Lichtschutz) konnte gezeigt werden, dass die Gehalte an Noradrenalin bei keiner der untersuchten Lagerungsbedingungen unter einen Wert von 99.0 % fielen. Individuell hergestellte Noradrenalin-Injektionslösungen können somit bis zu sieben Tage im Voraus hergestellt und für die Anwendung am Patienten bereit gehalten werden. Die Lösungen sollten dennoch gekühlt und unter Lichtschutz aufbewahrt werden, um den Abbau des Arzneistoffes und eine mikrobielle Kontamination zu minimieren.
This work focuses on the development of simple, liquid chromatographic methods for the quality analysis of common antimalarial medicines, i.e. amodiaquine, mefloquine, proguanil and the fix-dose combination of artemether and lumefantrine. They require a minimum of readily available, cheap chemicals (e.g. phosphate buffers or methanol) and commercially available RP-18 columns. They were designed for use in quality control laboratories in resource-restraint environments, e.g. in laboratories in the developing world, and do not require complex HPLC instrumentation which are either not available or affordable, e.g. with expensive gradient pumps or column ovens. Ion-pairing reagents were strictly avoided during method development which is a great advantage for routine application: long equilibration and flushing procedures are not necessary and a column can be used for more than one single method. An isocratic elution mode was applied and using short analytical columns (125 mm) allows reducing the analysis time and eluent consumption, respectively, to a minimum.
During method development impurities being characteristic for the respective synthesis pathway(s) of the active substances were considered. Thus, determining the quality of a com-pound with regard to its content and purity is possible and distinct manufacturers or sources can be identified.
Linearity and repeatability were assessed and a good reproducibility was found. Limits of detection and quantitation, respectively, were measured and the respective impurities can be determined to a level of 0.1 %. By varying the separation temperature and the pH-value of the respective mobile phases method ruggedness was investigated. A high grade of robustness towards these parameters could be confirmed, indicating that the methods are suitable for being used in tropical environments.
Liquid chromatographic methods play an important role in pharmaceutical analysis today and they are widely applied for determining the purity of a compound. Respective protocols have been added to almost every monograph of the most important pharmacopoeias, e.g. the European Pharmacopoeia. Of note, those protocols may not be applied in every laboratory without limitations. Although very simple methods of analysis, e.g. thin-layer chromatography which is described in the manuals of the GPHF-Minilab®, require less expensive instruments and may even be applied in resource-restraint environments, they exhibit a poor accuracy and reproducibility. Preparing and evaluating the plates manually may strongly bias the results, and in addition this highly depends from the respective analyst who performs the tests. The comparison of thin-layer chromatographic assays applying a manual and an instrumental evaluation to results obtained from liquid chromatographic tests clearly exhibited the disadvantages particularly for determining the quality of a compound. It is almost impossible to exactly determine the content of a sample, and a comprehensive test for related substances cannot be carried out. Using application devices and plate readers may increase the accuracy, however such instruments are a lot more expensive than simple, modular HPLC systems and normally do not belong to the standard inventory of a quality control laboratory.
Simplified HPLC methods may serve as helpful instruments for the regulatory infrastructure of developing countries. Combining them with basic thin-layer chromatographic tests and applying them comprehensively may enable the respective quality control laboratories to ensure the nationwide supply with immaculate medicines.
In the second part of this work the stability of individually prepared dilutions of commercially available norepinephrine injectable solutions was investigated and recommendations for storage conditions were derived. In hospital pharmacies it is a common practice to prepare such solutions from proprietary products by diluting them with isotonic sodium chloride solution or other suitable buffer solutions, respectively, to a concentration of 0.01 mg/ml (1:100). This is important particularly in case of emergencies, e.g. on the weekend or during holidays, because the respective medication can be held in stock even when the pharmacy is closed.
Within the framework of the experiments the influence on the stability of norepinephrine after diluting the respective proprietary product with sodium chloride solution was investigated. The samples were stored with and without refrigeration, and unprotected and protected from sunlight. The results showed that under none of the investigated storing conditions the content of norepineprhine decreased significantly. The lowest content which was found was 99.0 %. Thus, individual norepinephrine injectable solutions can be prepared in advance and storing them is possible for at least seven days. Although a degradation of the active ingredient or a diffusion in the primary packaging material (e.g. a syringe made from polyethylene) could not be observed, it is recommended to store the preparations in the refrigerator and protected from light. A microbial contamination may also be avoided like this.
Development of simplified HPLC-methods for the detection of counterfeit antimalarials in developing countries
urn:nbn:de:bvb:20-opus-113194
X 126058
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Ludwig Höllein
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HPLC
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Qualitätskontrolle
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Chromatographie
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Malaria
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uncontrolled
HPLC-Methodenentwicklung
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Reinheitsanalytik
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uncontrolled
HPLC method development
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uncontrolled
Determination of compound purity
Analytische Chemie
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Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie
Universität Würzburg
Universität Würzburg
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