20435
2020
deu
doctoralthesis
1
2020-05-17
--
2020-05-08
Dosis-Wirkungsbeziehungen von Gefitinib in einem humanen Lungentumormodell
Characterization of dose and impact relations of Gefitinib in a human lung cancer model
Als die häufigste tödliche Tumorerkrankung weltweit ist das Lungenkarzinom mit einer sehr schlechten Prognose verbunden. Eine Behandlungsoption für Lungenadenokarzinome, die eine aktivierende EGFR-Mutation aufweisen, ist der orale EGFR-TKI Gefitinib (Iressa®, ZD1839). Die Resistenzentwicklung von Tumoren gegen diese Therapie stellt ein großes klinisches Problem dar.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die Dosis-Wirkungs-Beziehung von Gefitinib, sowie die Entwicklung von Resistenzen in einem etablierten humanen 3D Lungentumormodell zu untersuchen und dieses Testsystem für eben diese Fragestellungen zu validieren.
Vorliegende Arbeit bestätigt, dass pharmakologische Untersuchungen in Zellkulturen häufig zu einer Überschätzung des Behandlungserfolges führen. Das verwendete Modell entspricht mehr den in vivo Bedingungen. In dieser Arbeit wurden zwei ATP-Zellvitalitätsassays für die statischen 3D Lungentumormodelle etabliert und erfolgreich angewendet. Dabei zeigte sich eine konzentrationsabhängige Wirkung von Gefitinib auf das Wachstum, die Proliferation, die Apoptose, die Markerexpression sowie die Signalwegsaktivierungen. Im statischen 3D Lungentumormodell lag der IC50-Wert zwischen 0,05-0,1 µM Gefitinib welches den Werten aus klinischen Beobachtungen entspricht. Auch der in der Klinik bereits nach wenigen Stunden eintretende zeitliche Effekt von Gefitinib konnte in unserem Modell bestätigt werden. Eine dynamische Kultivierung der Lungentumorzellen, mit von Scherkräften verursachtem schnellerem Zellwachstum, führte zu einer weiteren Annährung an die klinischen Gegebenheiten. Das Netzwerk der Gefitinib-Wirkung auf die EGFR-Signalkaskade wurde in unserem Modell charakterisiert.
Die Betrachtung einer resistenten Zell-Subpopulation zeigte einen Resistenzmechanismus über eine Epitheliale-Mesenchymale-Transition. Zusätzlich wurde versucht, eine neue medikamenten-resistente Zell-Subpopulation zu generieren.
Das beschriebene 3D Lungentumormodell ermöglicht richtungsweisende Untersuchungen zu Dosis-Wirkungs-Beziehung von Gefitinib. Ansätze für eine weitere Optimierung des Modells wurden herausgearbeitet.
Lung cancer is the deadliest proliferative disease worldwide and associated with a poor prognosis. One option for treatment of adenocarcinomas of the lung with an activating epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation is the oral EGFR-tyrosine kinase inhibitor (TKI) Gefitinib (Iressa®, ZD1839). The development of resistances against EGFR-TKIs is a predominant clinical threat.
The aim of this dissertation was to further explore the relations of dose and impact of Gefitinib and the development of resistances in an established three dimensional (3D) human lung cancer model. The models accuracy was analysed.
This study confirmed that pharmacological testing in cell cultures often leads to an overestimation of the treatment while our model represents in vivo conditions in a more accurate way. Initially two ATP-cell viability assays were established and successfully used in the static 3D lung cancer model. Gefitinib had a concentration-dependent impact on cell growth, proliferation, apoptosis, the expression of markers and the activation of signalling pathways. In the static 3D lung cancer model the half maximal inhibitory concentration was reached between 0.05 µM and 0.1 µM Gefitinib. The effect of Gefitinib was apparent after several hours. These findings confirmed clinical observations. To mimic the clinical setting further the lung cancer cells were cultivated under dynamic conditions which lead to shear forces and a resulting rise in cell growth. In our model we characterized the network of the EGFR signalling pathways.
Exploration of a resistant subpopulation of adenocarcinoma cells revealed an epithelial-mesenchymal transition of the cells. The generation of another resistant subpopulation was attempted.
The described 3D lung cancer model can be used for an indicatory analysis of Gefitinib and its properties. Options for further improvement were explored.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-204359
10.25972/OPUS-20435
X 128689
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Elena Johanna Dorothée Weigl
deu
swd
Lungentumor
deu
swd
Dosis-Wirkungs-Beziehung
deu
swd
Adenocarcinom
deu
swd
Tissue Engineering
deu
swd
Protein-Tyrosin-Kinasen
deu
uncontrolled
Gefitinib
deu
uncontrolled
Tumormodell
deu
uncontrolled
Resistenzentwicklung
Pharmakologie, Therapeutik
open_access
Klinik und Poliklinik für Thorax-, Herz- u. Thorakale Gefäßchirurgie
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/20435/Weigl_Elena_Dissertation.pdf
18551
2019
deu
doctoralthesis
1
2019-08-04
--
2019-07-11
Entwicklung und Charakterisierung eines humanen oralen Plattenepithelkarzinomäquivalentes
Development and characterisation of a human oral squamous cell carcinoma equivalent
Trotz hochmoderner Technologien und ausgefeilter therapeutischer und rekonstruktiver chirurgischer Heilungsmethoden beträgt die 5-Jahres Überlebensrate bei der Diagnose PECA der Mundhöhle im Durchschnitt auch im Jahre 2017 nur 55 % und die Heilungsmethoden haben sich in den letzten drei Jahrzehnten kaum verbessert. Umso wichtiger ist es deshalb, die Forschung voranzutreiben und ein aussagekräftiges Tumormodell zu etablieren, das bei der Entwicklung neuer Therapieansätze schnell und sicher gute Ergebnisse liefert.
In dieser Studie soll mit Hilfe des Tissue Engineering (TE) ein in gesunder Mundschleimhaut (MSH) integriertes 3D-Tumormodell generiert werden, welches bestmöglich die Analyse pathologischer Mechanismen im Tumorzentrum, sowie im Randbereich von gesundem und erkranktem Gewebe, und auch die Analyse der Auswirkungen neuartiger Chemotherapeutika auf gesunde und maligne Zellen in direkter Nachbarschaft ermöglicht – ohne Tierversuche. In der Konsequenz könnte ein erheblicher Fortschritt mit höheren Erfolgsaussichten der Therapieansätze erzielt werden.
Es wird ein Tumormodell generiert, in dem auf Basis eines gesunden MSH-Modells Tumorzellen eingebracht werden, um - genauso, wie die Tumorentstehung in vivo von statten gehen würde – Tumorentstehung und Tumorwachstum in der Umgebung von gesunder MSH analysieren zu können. Das Modell basiert dabei auf einer Matrix aus dezellularisierter, porciner, small-intestinal-submucosa (SIS/MUC), die mit primären Fibroblasten, primären Keratinozyten und Tumorzellen der Tumorzelllinie FaDu besiedelt wird. Eine Besonderheit der FaDu-Zellen ist die vorangegangene Transduktion mit dem Lentivirus RFP – um die eingewanderten Zellen von gesunden Zellen unterscheiden zu können. Der Vorgang der Transduktion war gelungen und es konnte eine Fluoreszenz der noch in Zellkulturschalen kultivierten Zellen erzielt werden. Allerdings waren die fluoreszierenden Zellen in den fixierten Schnitten nicht mehr nachweisbar.
Zur Generierung eines Tumormodelles wurden auf Basis eines OMÄ drei unterschiedliche Applikationsformen zur Integration von Tumorzellen getestet. Die Integration von Tumorzellen fand in Form von Spots, Sphäroiden oder Tumorzellgemischen (prim. Keratinozyten/FaDu-Zellen) in zuvor kultivierte gesunde OMÄ statt. Dabei sollte das Applizieren von Spots oder Sphäroiden das Tumorzellwachstum auch in der Umgebung von gesundem Gewebe initiieren. Dies würde die Möglichkeit schaffen, auch in vitro, gesundes neben pathologischem Gewebe und den Übergang dazu genau analysieren zu können.
Es sollen sowohl die optimale Konzentration der Tumorzellen, welche für die Entstehung von Tumoren nötig ist, als auch die geeignetste Applikationsmethode eruiert werden, um optimale Tumormodelle zuverlässig reproduzierbar ansetzen zu können. Die Modelle wurden histologisch und immunhistochemisch analysiert und die Ergebnisse mit ermittelten TEER-Werte in Korrelation gesetzt.
In dieser Arbeit konnte mit der Applikation von Spots oder Sphäroiden kein suffizientes Tumorwachstum in Umgebung von gesunder MSH erzielt werden. Die Zellen lagen ohne Reaktion des angrenzenden Stratum corneums auf der zu stark ausgeprägten Hornschicht der OMÄ auf und es war keine Einwanderung in das darunterliegende Gewebe möglich.
Allerdings ist es gelungen, durch Applikation eines Zellgemisches variierender Mischungsverhältnisse von primären Keratinozyten und Tumorzellen der Zelllinie FaDu ein 3D-Tumorwachstum unterschiedlicher Malignitätsstufen zu initiieren. Je kleiner das Mischungsverhältnis und je höher in der Konsequenz die Anzahl der FaDu-Tumorzellen, desto ausgeprägter waren die morphologischen Anzeichen einer Tumorbildung. Abhängig vom Mischungsverhältnis war dabei die Ausprägung des Tumors. Auch wenn dadurch keine Kombination von gesundem und pathologischem Gewebe in einem Modell mehr imitiert werden konnte, so konnten zumindest nach histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen eindeutige pathologische, maligne Tumormodelle generiert werden. Die Tumormodelle zeigten durchgehend Zell- und Kernpleomorphismen, atypische und vermehrte suprabasale Mitosen, eine Störung der normalen Gewebearchitektur, die Ausbildung von Interzellularbrücken, Einzelzelldyskeratosen und Verhornungsknospen, sowie Stellen der Durchbrechung der Basalmembran und Invasion von Tumorzellen in die darunterliegende Lamina propria. All das sind eindeutige Kennzeichen malignen Wachstums
Auch die Ergebnisse der TEER-Wert Messung stimmten mit den morphologischen Entwicklungen der Modelle überein. So stiegen die TEER-Werte der Kontrollmodelle konsequent an, was für eine deutliche Entwicklung von kontinuierlichem Gewebe spricht und im Gegensatz dazu fielen die TEER-Werte im zeitlichen Verlauf der Tumormodelle, bei denen die Basalmembran und somit die Kontinuität des Gewebes durchbrochen wurde rapide ab, bzw. lagen im konstant niedrigen Bereich.
Der Erfolg der Etablierung dieses zuverlässig rekonstruierbaren 3D, in vitro generierten Tumormodells, das der in vivo Situation eines Plattenepithelkarzinoms sehr nahekommt, bietet der Wissenschaft eine sehr gute Möglichkeit, weitere Studien zum Tumorwachstum durchzuführen. Außerdem kann die Weiterentwicklung und Verbesserung vielversprechender, neuartiger chemotherapeutischer und radiologischer Therapieverfahren erheblich voran¬getrieben und dadurch die Heilungschancen mit geringeren Nebenwirkungen für den Patienten verbessert und eine erhöhte Lebensqualität erzielt werden.
Despite state-of-the-art technologies and sophisticated therapeutic and reconstructive surgical methods, the average 5-year survival rate of patients diagnosed with oral squamous cell carcinoma (OSCC) is still only 55% in 2017. Healing methods have barely improved over the last three decades. Therefore, it is important to establish a meaningful tumour model that delivers fast and reliable results in the development of new therapeutic approaches.
In this study, Tissue Engineering is used to generate a three-dimensional tumour model integrated into healthy oral mucosa. This enables an ideal analysis of pathological mechanisms in the tumour center, as well as in the margins of healthy and diseased tissue. It also allows the analysis of the effects of novel chemotherapeutic agents on healthy and malignant cells in proximity - without animal testing. Consequently, a considerable progress could be achieved with a higher chance of success of therapeutic approaches. A tumour model, based on a healthy oral mucosa equivalent (OME), is generated in which tumour cells are integrated in order to be able to analyse tumourigenesis and tumour growth in the environment of healthy oral mucosa just as the tumour development would take place in vivo. For this primary fibroblasts, primary keratinocytes and tumour cells were cultured on a matrix of decellularized, porcine, small intestinal submucosa (SIS/MUC). For this FaDu cells were transduced with the lentivirus RFP to be able to distinguish the immigrated cells from healthy cells. The transduction was successful. It was possible to achieve a fluorescence of the cells still cultivated in cell culture dishes. However, the fluorescent cells could no longer be detected in the fixed tissue sections. For the tumour model three different forms of application of the tumour cells on the OMEs have been tested. The application of cell-spots, spheroids or cell mixtures of primary keratinocytes and FaDu tumour cells in previously cultivated OME. The application of spots or spheroids should initiate tumour cell growth even in the environment of healthy tissue. This would enable the in vitro analysation of the area of healthy and pathological tissue in one model. Therefore, the optimal concentration of tumour cells, which is necessary for the tumour development, and the most suitable application method are to be determined to be able to apply a suitable reproducible tumour model. The models were analysed histologically and immunohistochemically, and the results were correlated with determined TEER values.
In this work, the application of spots or spheroids did not achieve tumour growth in the environment of healthy oral mucosa. The cells were not responsive to the adjacent stratum corneum on the highly pronounced horn layer of the OME and no migration into the underlying tissue was possible. However, by applying a cell mixture of varying mixing ratios of primary keratinocytes and tumour cells of the FaDu cell line, it has been possible to initiate 3D tumour growth of different malignant stages. The smaller the mixing ratio and the higher the number of FaDu tumour cells, the more pronounced have been the morphological signs of tumour formation. Even if it was no longer possible to mimic a combination of healthy and pathological tissue in a model, clear pathological, malignant tumour models could be generated at least after histological and immunohistochemical investigations. The tumour models consistently showed cellular- and nuclearpleomorphisms, atypical and increased suprabasal mitoses, disruption of normal tissue architecture, the formation of intercellular bridges, single cell dyskeratosis and cornification buds, as well as sites of disruption of the basement membrane and invasion of tumour cells into the underlying lamina propria. All these are clear signs of malignant growth.
The results of the TEER value measurement were also consistent with the morphological developments of the models. Thus, the TEER values of the control models rose consistently, which indicates a significant development of continuous tissue. In contrast, the TEER values over the course of time of the tumour models, in which the basal membrane and thus the continuity of the tissue was broken, fell rapidly or were in a constantly low range.
The success of the establishment of this reliably reconstructable 3D, in vitro generated tumour model, which is very close to the in vivo situation of a squamous cell carcinoma, offers the science a very good opportunity to carry out further studies on tumour growth.
In addition, the further development and improvement of promising, novel chemotherapeutic and radiological therapy methods can be considerably advanced, thereby improving the chances of recovery with fewer side effects for the patient and achieving an increased quality of life.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-185512
10.25972/OPUS-18551
X 128346
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Anna Teresa Mineif
deu
swd
orales Plattenepithelkarzinomäquivalent
deu
swd
Tissue Engineering
deu
swd
SIS/MUC
deu
swd
TEER-Wert
deu
swd
Tumormodell
deu
uncontrolled
Mundschleimhautäquivalent
Krankheiten
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/18551/Mineif_Anna_Dissertation.pdf
15561
2017
eng
doctoralthesis
1
2017-12-06
--
2017-12-05
Development of an osteochondral cartilage defect model
Entwicklung eines osteochondralen Knorpeldefektmodells
The limited intrinsic self-healing capability of articular cartilage requires treatment of
cartilage defects. Material assisted and cell based therapies are in clinical practice but
tend to result in formation of mechanical inferior fibro-cartilage in long term follow up. If
a lesion has not been properly restored degenerative diseases are diagnosed as late sequela
causing pain and loss in morbidity. Complex three dimensional tissue models mimicking
physiological situation allow investigation of cartilage metabolism and mechanisms involved
in repair. A standardized and reproducible model cultured under controllable conditions
ex vivo to maintain tissue properties is of relevance for comparable studies.
Topic of this thesis was the establishment of an cartilage defect model that allows for
testing novel biomaterials and investigate the effect of defined defect depths on formation
of repair tissue.
In part I an ex vivo osteochondral defect model was established based on isolation of
porcine osteochondral explants (OCE) from medial condyles, 8 mm in diameter and 5 mm
in height. Full thickness cartilage defects with 1 mm to 4 mm in diameter were created
to define ex vivo cartilage critical size after 28 days culture with custom developed static
culture device. In part II of this thesis hydrogel materials, namely collagen I isolated from
rat tail, commercially available fibrin glue, matrix-metalloproteinase clevable poly(ethylene
glycol) polymerized with heparin (starPEGh), methacrylated poly(N-(2-hydroxypropyl)
methacrylamide mono-dilactate-poly(ethylene glycol) triblock copolymer/methacrylated
hyaluronic acid (MP/HA), thiol functionalized HA/allyl functionalized poly(glycidol)
(P(AGE/G)-HA-SH), were tested cell free and chondrocyte loaded (20 mio/ml) as implant
in 4 mm cartilage defects to investigate cartilage regeneration. Reproducible chondral
defects, 8 mm in diameter and 1 mm in height, were generated with an artificial tissue
cutter (ARTcut®) to investigate effect of defect depth on defect regeneration in part III.
In all approaches OCE were analyzed by Safranin-O staining to visualize proteoglycans
in cartilage and/or hydrogels. Immuno-histological and -fluorescent stainings (aggrecan,
collagen II, VI and X, proCollagen I, SOX9, RUNX2), gene expression analysis (aggrecan,
collagen II and X, SOX9, RUNX2) of chondrocyte loaded hydrogels (part II) and proteoglycan
and DNA content (Part I & II) were performed for detailed analysis of cartilage
regeneration.
Part I: The development of custom made static culture device, consisting of inserts in which OCE is fixed and deep well plate, allowed tissue specific media supply without
supplementation of TGF � . Critical size diameter was defined to be 4 mm.
Part II: Biomaterials revealed differences in cartilage regeneration. Collagen I and fibrin
glue showed presence of cells migrated from OCE into cell free hydrogels with indication
of fibrous tissue formation by presence of proCollagen I. In chondrocyte loaded study
cartilage matrix proteins aggrecan, collagen II and VI and transcription factor SOX9 were
detected after ex vivo culture throughout the two natural hydrogels collagen I and fibrin
glue whereas markers were localized in pericellular matrix in starPEGh. Weak stainings resulted
for MP/HA and P(AGE/G)-HA-SH in some cell clusters. Gene expression data and
proteoglycan quantification supported histological findings with tendency of hypertrophy
indicated by upregulation of collagen X and RunX2 in MP/HA and P(AGE/G)-HA-SH.
Part III: In life-dead stainings recruitment of cells from OCE into empty or cell free
collagen I treated chondral defects was seen.
Separated and tissue specific media supply is critical to maintain ECM composition in
cartilage. Presence of OCE stimulates cartilage matrix synthesis in chondrocyte loaded
collagen I hydrogel and reduces hypertrophy compared to free swelling conditions and
pellet cultures. Differences in cartilage repair tissue formation resulted in preference of
natural derived polymers compared to synthetic based materials. The ex vivo cartilage
defect model represents a platform for testing novel hydrogels as cartilage materials, but
also to investigate the effect of cell seeding densities, cell gradients, cell co-cultures on
defect regeneration dependent on defect depth. The separated media compartments allow
for systematic analysis of pharmaceutics, media components or inflammatory cytokines on
bone and cartilage metabolism and matrix stability.
Aufgrund der geringen Selbsheilungsfähigkeit von artikulären Knorpel erfordern Knorpeldefekte
eine orthopädische Behandlung. Bislang konnte mit material- oder zellbasierenden
Behandlungsstrategien keine funktionelle Regeneration von Knorpeldefekten erreicht werden.
In Langzeitstudien zeigt sich vermehrt die Bildung von mechanisch instabilem fibrosen
Knorpel. Als Spätfolge nicht vollständig verheilter Knorpeldefekte wird die degenerative
Erkrankung Osteoarthrose diagnostiziert. 3-dimensionale Gewebemodelle, die die
physiologischen Gegebenheiten nachahmen erlauben einen Einblick in die Mechanismen
während der Defektheilung. Dem subchondralen Knochen kommt eine kritische Rolle in der
Regeneration nach Mikrofrakturierung zu, weshalb ein Knorpelmodell auf osteochondralen
Gewebe basieren sollte.
Thema der Arbeit war es ein standardisiertes Knorpeldefektmodell zu etablieren, das die
Testung neuer Hydrogelformulierungen sowohl zellfrei als auch zellbeladen hinsichtlich
deren Regenerationspotential ermöglicht und den Einfluss der Knorpeldefekttiefe auf die
Regeneration zu analysieren.
Teil I der Arbeit umfasste die Etablierung des ex vivo osteochondralen Defektmodells,
basierend auf der Isolation von porcinen osteochondralen Explantaten (OCE) mit eine
Durchmesser von 8 mm und einer Höhe von 5 mm aus der medialen Kondyle. Full
thickness Knorpeldefekte mit einem Durchmesser zwischen 1 mm und 4 mm wurden
induziert, um den kritischen Defektdurchmesser nach 28 Tagen Kultur in einer neuartigen
statischen Kulturplatte zu definieren. In Teil II stand die Testung von Hydrogelen aus
Kollagen I isoliert aus Rattenschwänzen, kommerziell erhältlicher Firbrinkleber, Matrix-
Metalloproteinase clevable poly(Ethylen Glycol) polymerisiert mit Heparin (starPEGh),
methacrylates poly(N-(2-hydroxypropyl) methacrylamid mono-dilactate-poly(Ethylene Glycol)
triblock copolymer/methacrylated Hyaluronsäure (MP/HA), thiol functionalisiertes
HA/allyl functionalisiertes poly(Glycidol) (P(AGE/G)-HA-SH) als zellfreies oder mit
20 Mio/ml Chondrozyten beladenes Implantat im Knorpeldefekt mit einem Durchmesser
von 4 mm im Fokus. Ein automatisiertes Verfahren zur Wundsetzung (ARTcut®) erlaubte
in Teil III der Thesis das Kreieren von reproduzierbaren chondralen Defekten mit 4 mm
Durchmesser und 1 mm Tiefe in das OCE Modell , um den Einfluss der Defekttiefe auf
die Knorpelregeneration zu analysieren.
Das Knorpelgewebe des OCE und/oder Hydrogele wurde in allen Experimenten mittels
Safranin-O auf Proteoglykangehalt untersucht. Immunhistologische und -fluoreszenzfärbung knorpelspezifischer Marker, Genexpressionsanalysen der Chondrozyten beladenen Hydrogele
(Teil II) und Quantifizierung der Proteoglykane und des DNA Gehalts (Teil I & II)
folgten nach ex vivo Kultur.
Teil I: Die neu entwickelten statischen Kulturkammern setzen sich aus Inserts, in denen das
OCE fixiert ist, und einer 6 Well–Platte zusammen. Dadurch wird eine Gewebespezifische
Medienversorung mit Knorpelmedium ohne TGF � in den Inserts und Knochenmedium
in der Vertiefung der Wellplatte ermöglicht. Die kritische Defektgröße im ex vivo Modell
wurde mit 4 mm festgesetzt. Teil II: Biomaterialien als Implantate im Knorpeldefekt
zeigten ein materialabhängiges Regenerationspotential. Die Einwanderung von Zellen aus
dem OCE in zellfreie Hydrogele resultierte in der Lebend-Tot Färbung bei Kollagen I
und Fibrinkleber mit der Tendenz der Synthese von fibrösem Knorpel. Die Chondorzyten
beladenen Hydrogele aus Kollagen I und Fibrinkleber zeigten eine homogene Positivfärbung
für die hyalinen Proteine Aggrekan, Collagen II und X und des Knorpeltranskriptionsfaktors
SOX9, wohingegen die Färbung bei starPEGh lokal in der perizellulären Region
lokalisiert war. Die weiteren Materialien MP/HA und P(AGE/G)-HA-SH wiesen eine
schwache Positivfärbung an einzelnen Zellclustern auf. Die Genexpressionsanalyse und
die Quantifizeirung der Proteoglykane bestätigten die histologischen Ergebnisse mit der
Tendenz der Hypertrophie, belegt durch Hochregulierung von Kollagen X und RunX2, bei
Chondrozyten eingebettet in MP/HA und P(AGE/G)-HA-SH. Teil III: In der Lebend-Tot
Färbung konnte die Einwanderung von Zellen aus dem Knorpel des OCE in den Leerdefekt
und zellfreies Kollagen I Hydrogel nachgewisen werden.
Separierte und Gewebe spezifische Medienversorgung erwieß sich als kritischer Faktor
zur Aufrechterhaltung der Knorpel ECM. Die Anwesenheit des OCE stimuliert Knorpelmatrixsynthese,
die für das in vitro kultivierte Chondrozyten beladene Kollagen I
nachweislich geringer vorhanden war. Außerdem war die Produktion des hypertrophen
Markers Kollagen X im Implantat im OCE weniger stark ausgeprägt als in der in vitro Kultur.
Die Unterschiede der Knorpelregeneration deutet auf die Bevorzugung von natürlichen
Polymeren gegenüber den synthetisch basierten Hydrogelen hin. Das ex vivo Knorpeldefektmodell
stellt eine Platform zur Testung neuer Hydrogelmaterialien als Knorpelimplantate
dar. Weiterhin kann das Modell zur Analyse von Zellbesiedelungsstrategien als auch
für Zell-Ko-Kulturen im Hinblick auf die Defektregeneration herangezogen werden. Die
getrennten Medienreservoire ermöglichen weiterhin die systematische Analyse von Medienkomponenten
oder entzündlichen Zytokinen auf die Vitalität und Stabilität von Knochen
und Knorpelgewebe.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-155617
X 127500
Deutsches Urheberrecht
Andrea Schwab
deu
swd
Hyaliner Knorpel
eng
uncontrolled
hyaline cartilage
eng
uncontrolled
Test system
eng
uncontrolled
cartilage regeneration
Biowissenschaften; Biologie
Medizin und Gesundheit
open_access
Graduate School of Life Sciences
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/15561/Schwab_Andrea_cartilage.pdf
15718
2018
deu
doctoralthesis
1
2018-01-31
--
2018-01-31
Entwicklungsaspekte eines Medizinproduktes zur Prävention und Überwachung von Hydrierungszuständen
Development aspects of a microwave based hydration monitoring system
Der demografische Wandel und das Populationswachstum stellen eine globale Herausforderung für die Gesundheitssysteme dar. Eine vielversprechende Lösungsstrategie liegt in der digitalen Überwachung, Prävention und Therapie akuter und chronischer Erkrankungen durch die Nutzung von innovativen Technologien aus dem Bereich der personalisierten Medizin.
Die Digitalisierung in der Überwachung von Vitalparametern mittels Sensorik besitzt großes Potential für die längere Gesunderhaltung der Patienten und somit die Entlastung der Gesundheitssyteme im Ganzen.
Da Wassermangel für eine Vielfalt von Krankheiten einen Katalysator darstellt, ist die Hydratation ein wichtiger aber bislang nur invasiv zugänglicher Vitalparameter. Zur Etablierung nicht invasiver Messungen des Wasserhaushaltes am Menschen wurde im Rahmen dieser Arbeit die Eignung der Mikrowellentechnologie untersucht.
Dehydratation resultiert in der Veränderung des Osmolythaushaltes und beeinflusst biochemische Prozesse, was zur Entstehung von Morbidität führen kann. Im Rahmen der Arbeit werden Teilbereiche der Entwicklung eines Medizinproduktes abgebildet. Zu diesem Zweck wird die Machbarkeit der mikrowellenbasierten Analyse des Wasserhaushaltes in einer technischen Machbarkeitsstudie untersucht, um im zweiten Prozessschritt einen technischen Demonstrator in vitro und in vivo am Probanden erproben zu können. Hochfrequente elektromagnetische Wellen interagieren mit Molekülen, speziell Wasser. Enthält eine Probe freie Wassermoleküle, kann dies im reflektierten Signal detektiert werden. Zur Überprüfung des Sensorsystems in vitro dienen humane 3D-Vollhautmodelle mit spezifischer Hydratation und Gewebedichte der Matrixkomponenten als standardisiertes Modell zur Untersuchung definierter Exsikkoseszenarien und des Einflusses verschiedener Modellkomplexitäten. Die Eignungsüberprüfung des Systems mit einem technischen Demonstrator des künftigen Medizinproduktes belegt die Anwendbarkeit des Messsystems zur Erfassung des relativen Wassergehaltes. Die Technologie zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität bei der Destinktion von Proben mittels Frequenz- und Signalreflektionsdifferenzen aus. Neben den In-vitro-Testungen wird das entwickelte Sensorsystem aus regulatorischer Sicht zur klinischen Leistungsüberprüfung vorbereitet und im Rahmen eines bewilligten Ethikvotums in vivo erprobt. Die Ergebnisse belegen die Machbarkeit der nichtinvasiven Erfassung des Wasserhaushaltes durch mikrowellenbasierte Messungen. Die Technologie birgt das Potential, in ein körpernahes Sensorsystem integriert zu werden, welches als Medizinprodukt zur persönlichen Gesundheitsüberwachung zugelassen werden kann.
The demographic change and the growth of mankind are challenging worldwide, especially for healthcare systems. One possible solution to keep humans healthier at all ages coeval fighting disease-related consequences is given by modern technologies for personalized disease treat-ment and digital health monitoring.
The digitalization of the health care through new technological advance in personalized disease treatment and health monitoring using sensor-based technologies helps people to recover from illness or stay healthy, to monitor the health state of patients in need and to assist caregivers during their daily routine. This thesis aims to analyze microwave measurements as a technology to monitor the hydration status as a particularly important vital parameter, which can be catalyst for diverse secondary disorders.
Wireless body area networks (WBANs) are used for individually tailored therapy of disease and preventive monitoring of health parameters. There are some already existing technologies but there is not yet a way to monitor non-invasively the entire health state and especially hydration as a particularly critical vital parameter. WBANs may help to pave the way for personalized med-icine, improve acute and preventive healthcare and support individual physical fitness.
Tissue dehydration results in impaired biochemical processes, and can finally cause severe mor-bidity. The aim of this study was to demonstrate the feasibility of microwave measurements for the non-invasive analysis of the hydration status in vitro and in vivo and to develop a prototype of a medical device for this measurment. Moreover, accompanying regulatory aspects are con-sidered as a basis for an approval of the sensor technology as medical device. Electromagnetic waves at high frequencies interact with molecules, especially water. Thus, free water molecules can be detected via the reflected microwave signal. To develop the sensor system, human three-dimensional skin equivalents were instituted as a standardized test platform mimicking repro-ducible exsiccosis scenarios. Therefore, skin equivalents with a specific hydration and density of matrix components were generated and microwave measurements were performed. Hydration-specific spectra allowed deriving the hydration state of the skin models. A further advantage of the skin equivalents was the characterization of the impact of distinct skin components on the measured signals to investigate mechanisms of signal generation. Together with these in vitro results, the technology is investigated in vivo within initial testing scenarios on test subjects. The results demonstrate the feasibility of non-invasive microwave-based hydration measurements and thus the technologies potential to be integrated in a wearable medical device for personal digital health monitoring.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-157181
X 127674
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Rico Brendtke
deu
swd
Medizinprodukt
deu
swd
Hautmodell
deu
swd
Mikrowellen
Biowissenschaften; Biologie
open_access
Fakultät für Biologie
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/15718/Brendtke_Rico_Hydrierungszustaende.pdf
15250
2017
deu
doctoralthesis
1
2017-08-06
--
2017-07-14
Etablierung eines 3D in vitro Blutgefäß-/Gewebemodells zur Testung spezifischer Therapeutika zur Leukämiebehandlung
Establishment of a 3D in vitro blood vessel /tissue model to test specific therapeutic agents to treat leukemia
In Deutschland erkranken jährlich etwa 500.000 Menschen an Krebs, wovon circa
12.000 die Diagnose „Leukämie“ gestellt bekommen [1]. Unter den Leukämien weist
die akute myeloische Leukämie (AML) die ungünstigste Prognose auf, sodass hier
erheblicher Forschungsbedarf besteht. Zusätzlich schnitten viele potentielle Therapeutika,
die sich in bisherigen präklinischen Testsystemen als vielversprechend erwiesen
haben, in klinischen Studien schlecht ab [8]. Ziel dieser Arbeit war daher die
Etablierung eines 3D in vitro Blutgefäß-/Gewebemodells als verbessertes präklinisches
System zur Testung von Therapeutika, die zur erfolgreichen Behandlung von
Leukämien beitragen sollen.
Das 3D Blutgefäßmodell bestand aus humanen primären Endothelzellen, welche
als Monolayer auf der Serosaseite einer dezellularisierten, porzinen, intestinalen Kollagenmatrix
(SIS-Ser) wuchsen. Nach 14-tägiger Zellkultur wurden dem Versuchsansatz
entsprechend nichtadhärente THP-1 Zellen (AML-M5-Zelllinie) und Tipifarnib
oder entsprechende Kontrolllösungen beziehungsweise bimolekulare Antikörperkonstrukte
mit PBMCs als Effektorzellen hinzupipettiert. Nach 5-tägiger Inkubation
mit Tipifarnib beziehungsweise 24-stündiger Behandlung mit Antikörperkonstrukten
wurde der therapiebedingte Anstieg der Apoptoserate in den malignen THP-1 Zellen
mittels durchflusszytometrischer Analyse der Modellüberstände ermittelt. Zum
Ausschluss verbliebener und durchflusszytometrisch zu analysierender Zellen wurde,
stellvertretend für alle Suspensionszellen, eine Anti-CD13/DAB-Färbung durchgeführt,
welche negativ ausfiel. Mögliche Kollateralschäden am Endothel wurden
mittels histologischen Färbemethoden an Gewebeparaffinschnitten untersucht.
In der Durchflusszytometrie zeigte Tipifarnib sowohl im 2D als auch im 3D Modell
äquivalente, dosisabhängige und antileukämische Auswirkungen auf die THP-1 Zellen.
Bei Applikation der Antikörperkonstrukte ließ lediglich die Kombination beider Hemibodies signifikante Effekte auf die THP-1 Zellen erkennen. Dabei zeigten sich
bei konstanten Konzentrationen der Antikörperkonstrukte im 3D Modell deutlich
höhere Apoptoseraten (58%) als im 2D Modell (38%). Stellt man Vergleiche von
Tipifarnib mit den T-Zell-rekrutierenden Antikörperkonstrukten an, so ließen sich
im 2D Modell ähnliche Apoptoseraten in den THP-1 Zellen erzielen (jeweils 38% bei
Anwendung von 500 nM Tipifarnib). In den 3D Modellen erzielten jedoch die niedriger
konzentrierten Antikörperkonstrukte bei kürzerer Inkubationsdauer eine noch
höhere spezifische Apoptoserate in den THP-1 Zellen (im Mittel 58%) als 500 nM
Tipifarnib (mittlere Apoptoserate 40%). Bezüglich der Nebenwirkungen ließ sich
im 3D Modell nach Applikation von Antikörperkonstrukten kein wesentlicher Einfluss
auf das Endothel erkennen, während Tipifarnib/DMSO als auch die mit DMSO
versetzten Kontrolllösungen zu einer dosisabhänigen Destruktion des ursprünglichen
Endothelzellmonolayers führten. Damit stellt die hier beschriebene, hoch spezifische,
Hemibody-vermittelte Immuntherapie einen vielversprechenden Ansatz für zukünftige
onkologische Therapien dar.
Mithilfe des etablierten humanen 3D in vitro Modells konnte im Vergleich zur
konventionellen Zellkultur eine natürlichere Mikroumgebung für Zellen geschaffen
und die Auswirkungen der Testsubstanzen sowohl auf maligne Zellen, als auch auf
die Gefäßstrukturen untersucht werden.
In Germany every year about 500,000 people contract cancer whereof about 12,000 have leukemia [1]. Among all types of leukemia, acute myeloid leukemia (AML) has the worst prognosis so that there is an increased need for research. In addition many potential therapeutic agents, which had been very promising in previous preclinical tests, subsequently performed poorly in clinical studies [8]. The aim of this work was to establish a 3D in vitro blood vessel /tissue model as an enhanced preclinical test system for therapeutic agents, which could contribute to successful treatment of leukemia.
The 3D blood vessel model consists of human primary endothelial cells growing as a monolayer on the serosa site of a decellularized porcine intestinal collagen matrix (called SIS-Ser). After 14 days in cell culture non-adherent THP-1 cells (AML-M5) and Tipifarnib or control solution, or other bimolecular antibody constructs and PBMC as effector cells were added to the experimental setting. After 5 days treatment with Tipifarnib or 24 hours with antibody constructs the therapy related effects on THP-1 cells were observed by flow cytometric analysis of the model remants. For exclusion of adherent suspension cells on the matrix an anti CD-13/DAB labeling was carried out, which was negative. Damaging effects on endothelial cells were assessed by histological staining of paraffin sections.
In 2D as well as in 3D tipifarnib showed equivalent dose-dependent antileukemic effects on THP-1 by flow cytometry. After application of antibody constructs only the combination of both hemibodies showed significant effects on THP-1. While having constant concentrations in 2D and 3D the antibody constructs resulted in higher apoptotic rate in 3D (58%) than in 2D (38%).
In comparison to tipifarnib, the t-cell recruting antibody constructs resulted in a similar apoptotic rate in THP-1 in 2D (38% when using 500 nM tipifarnib) whereas they had higher specific effects on THP-1 in 3D by a shorter incubation period and lower concentrations (58% versus 40% after incubation with 500 nM tipifarnib).
Concerning side effects, the hemibodies had no significant influence on the endothelial monolayer
whereas tipifarnib/DMSO and DMSO alone led to damage in a dose-dependent manner.
So highly specific hemibody- mediated immunotherapy shows a promising approach for future cancer treatment.
With this human 3D in vitro model a more natural mico-environment was created for the cells in comparison to conventional cell cultures and it is was possible to investigate the anti-leukemic effects of therapeutic drugs as well as their impact on the endothelial monolayer.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-152506
X 127316
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Heidi Bersi
deu
swd
Tissue Engineering
deu
swd
Gewebekultur
deu
swd
Akute myeloische Leukämie
deu
swd
Antikörper
deu
swd
Immuntherapie
deu
uncontrolled
3D in vitro Modell
deu
uncontrolled
Akute myeloische Leukämie
deu
uncontrolled
Tipifarnib
deu
uncontrolled
T-Zell-rekrutierende Antikörperkonstrukte
eng
uncontrolled
3D in vitro model
eng
uncontrolled
acute myeloid leukemia
eng
uncontrolled
t-cell recruting antibody constructs
Pharmakologie, Therapeutik
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/15250/Bersi_Heidi_Etablierung_eines_3D_in_vitro_Blutgefaessmodells.pdf
14237
2016
deu
doctoralthesis
1
2016-12-22
--
2016-12-20
Biomechanische und zellbiologische Untersuchung zu augmentierten Biomaterial-basierten Kreuzbandkonstrukten
Mechanical and cell-biological properties of crosslinked kollagen scaffolds for acl reconstruction
Aktueller Goldstandard bei der Rekonstruktion des ACL des Menschen sind au-tologe Transplantate. Diese sind allerdings je nach Entnahmeort mit einer mehr oder weniger hohen Entnahmemorbidität und dem Risiko für Folgeerkrankungen verbunden. Um dies zu umgehen, wurde ein xenogenes Kollagenimplantat aus
Kollagen-I-Fasern von Ratten entwickelt und das native Konstrukt bereits in einer Vorläuferstudie getestet.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden diese Kreuzbandkonstrukte mit Hilfe diverser
Crosslinker modifiziert und hinsichtlich ihrer Biomechanik, Biokompatibilität und ihres in-vivo Verhaltens untersucht.
Bewusst wurde dabei auf die Zellbesiedlung dieser Konstrukte verzichtet, da un-ter Berücksichtigung wirtschaftlicher Gesichtspunkte eines späteren humanen
Einsatzes hierfür eine Arzneimittelzulassung notwendig gewesen wäre. Mit Hilfe der Crosslinker wurde versucht, die mechanische Stabilität sowie die Resistenz gegen kollagenabbauende Enzyme der Synovia zu erhöhen, um die Gefahr post-operativer Instabilitäten zu verringern. Dabei sollten Fragen bezüglich Immun-antwort, Biokompatibilität sowie Biodegradierbarkeit genau berücksichtigt wer-den. Als Crosslinker wurden für einen Vergleich in vitro neben 0,5 % Genipin auch 10 % HMDI sowie Glukose und EDC/NHS herangezogen.
Dabei zeigten die Genipin-gecrosslinkten Einzelfasern die größte Reißfestigkeits-zunahme, wohingegen auf Minikonstruktbasis 10 % HMDI zu den höchsten UTS-Werten führte. Ebenso ließen sich bezüglich der Biokompatibilutät in vitro bei den Crosslinkern 0,5 % Genipin und 10 % HMDI Vorteile gegenüber den beiden an-deren erkennen.
Schließlich erfolgte im Rahmen eines Tierversuchs an 16 Minipigs der Einbau von 0,5 % Genipin-gecrosslinkten Konstrukten als Kreuzbandersatz und an-schließend die biomechanische Testung sowie nach Paraffineinbettung auch eine durchlichtmikrokopische deskriptive Auswertung der Transplantate.
Während nach 6 Wochen eine deutliche Reißfestigkeitsabnahme zu verzeichnen war, erreichte diese nach 6 Monaten wieder fast 60 % ihrer ursprünglichen UTS.
Somit konnte ein Remodeling des eingesetzten Implantats angenommen wer-den. Dies bestätigte sich in der durchgeführten histologischen Untersuchung.
Hier war das Implantat deutlich vaskularisiert, von zahlreichen Fibroblasten durchsetzt und wies eine synoviale Deckschicht auf. Allerdings scheint vor allem wegen der Schwäche der Konstrukte nach 6 Wochen sowie den vermutlich auf-grund des Crosslinkers auftretenden Reaktionserscheinungen innerhalb des
Kniegelenks ein Einsatz im humanen Bereich zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch nicht ausgereift.
Dennoch lässt sich gerade anhand des stattfindenden Remodelings das große Potential kollagenbasierter Materialien für den Kreuzbandersatz erkennen. Eine weitere Optimierung des bestehenden Konstrukts sollte deshalb forciert werden.
We developed an ACL-scaffold consisting of crosslinked preformed rat collagen fibres. In this study we examined the influence of several crosslinking substances on the mechanical and cell-biological properties of this scaffold in vitro as well as in vivo as part of a minipig model. The results were promising thus more studies have to be made before an use for humans can be recommended.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-142379
X 127037
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Alexander Klug
deu
swd
Tissue Engineering
deu
swd
Kreuzband
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/14237/Klug_Alexander_Kreuzbandkonstrukte.pdf
14257
2016
eng
doctoralthesis
1
2017-01-09
--
2016-12-20
Development of advanced human intestinal in vitro models
Entwicklung von erweiterten humanen intestinalen in vitro Modellen
The main function of the small intestine is the absorption of essential nutrients, water and vitamins. Moreover, it constitutes a barrier protecting us from toxic xenobiotics and pathogens. For a better understanding of these processes, the development of intestinal in vitro models is of great interest to the study of pharmacological and pathological issues such as transport mechanisms and barrier function. Depending on the scientific questions, models of different complexity can be applied.
In vitro Transwell® systems based on a porous PET-membrane enable the standardized study of transport mechanisms across the intestinal barrier as well as the investigation of the influence of target substances on barrier integrity. However, this artificial setup reflects only limited aspects of the physiology of the native small intestine and can pose an additional physical barrier. Hence, the applications of this model for tissue engineering are limited.
Previously, tissue models based on a biological decellularized scaffold derived from porcine gut tissue were demonstrated to be a good alternative to the commonly used Transwell® system. This study showed that preserved biological extracellular matrix components like collagen and elastin provide a natural environment for the epithelial cells, promoting cell adhesion and growth. Intestinal epithelial cells such as Caco-2 cultured on such a scaffold showed a confluent, tight monolayer on the apical surface. Additionally, myofibroblasts were able to migrate into the scaffold supporting intestinal barrier formation.
In this thesis, dendritic cells were additionally introduced to this model mimicking an important component of the immune system. This co-culture model was then successfully proven to be suitable for the screening of particle formulations developed as delivery system for cancer antigens in peroral vaccination studies. In particular, nanoparticles based on PLGA, PEG-PAGE-PLGA, Mannose-PEG-PAGE-PLGA and Chitosan were tested. Uptake studies revealed only slight differences in the transcellular transport rate among the different particles. Dendritic cells were shown to phagocytose the particles after they have passed the intestinal barrier. The particles demonstrated to be an effective carrier system to transport peptides across the intestinal barrier and therefore present a useful tool for the development of novel drugs.
Furthermore, to mimic the complex structure and physiology of the gut including the presence of multiple different cell types, the Caco-2 cell line was replaced by primary intestinal cells to set up a de novo tissue model. To that end, intestinal crypts including undifferentiated stem cells and progenitor cells were isolated from human small intestinal tissue samples (jejunum) and expanded in vitro in organoid cultures. Cells were cultured on the decellularized porcine gut matrix in co-culture with intestinal myofibroblasts. These novel tissue models were maintained under either static or dynamic conditions.
Primary intestinal epithelial cells formed a confluent monolayer including the major differentiated cell types positive for mucin (goblet cells), villin (enterocytes), chromogranin A (enteroendocrine cells) and lysozyme (paneth cells). Electron microscopy images depicted essential functional units of an intact epithelium, such as microvilli and tight junctions. FITC-dextran permeability and TEER measurements were used to assess tightness of the cell layer. Models showed characteristic transport activity for several reference substances. Mechanical stimulation of the cells by a dynamic culture system had a great impact on barrier integrity and transporter activity resulting in a tighter barrier and a higher efflux transporter activity.
In Summary, the use of primary human intestinal cells combined with a biological decellularized scaffold offers a new and promising way to setup more physiological intestinal in vitro models. Maintenance of primary intestinal stem cells with their proliferation and differentiation potential together with adjusted culture protocols might help further improve the models. In particular, dynamic culture systems and co culture models proofed to be a first crucial steps towards a more physiological model. Such tissue models might be useful to improve the predictive power of in vitro models and in vitro in vivo correlation (IVIVC) studies. Moreover, these tissue models will be useful tools in preclinical studies to test pharmaceutical substances, probiotic active organisms, human pathogenic germs and could even be used to build up patient-specific tissue model for personalized medicine.
Die Hauptfunktion des Dünndarms besteht in der Aufnahme von lebenswichtigen Nährstoffen, Wasser und Vitaminen. Zudem stellt er eine Barriere dar, die uns vor toxischen Fremdstoffen und Pathogenen schützt. Um diese Prozesse besser zu verstehen, ist die Entwicklung neuer in vitro Modellen des Darms von großem Interesse um pharmakologische und pathologische Studien durchzuführen. Abhängig von der wissenschaftlichen Fragestellung können Modelle von unterschiedlicher Komplexität zur Anwendung kommen.
In vitro Transwell® Systeme basierend auf einer porösen PET-Membran ermöglichen die Untersuchung von Transportmechanismen über die intestinal Barriere und den Einfluss von Wirkstoffen auf deren Integrität. Dieser künstliche Aufbau ähnelt jedoch nur eingeschränkt der Physiologie des Dünndarms und kann eine zusätzliche physikalische Barriere darstellen. Die Anwendungsmöglichkeiten dieses Modells im Tissue Engineering sind daher begrenzt.
Gewebemodelle basierend auf einer dezellularisierten biologischen Matrix hergestellt aus Schweinedarmgewebe haben sich als gute Alternative zum herkömmlichen Transwell® System herausgestellt. Diese Studie zeigt, dass die erhaltenen Komponenten der biologischen Extrazellulärmatrix wie Kollagen und Elastin eine natürliche Umgebung für die Epithelzellen bieten und Zelladhäsion und Wachstum der Zellen fördern. Darmepithelzellen wie Caco-2 Zellen, welche auf einer solchen Matrix kultiviert wurden, bildeten einen konfluenten, dichten Monolayer auf der apikalen Oberfläche aus. Zusätzlich ermöglichte dieser Aufbau die Migration von Myofibroblasten in die Matrix, was die Bildung der intestinalen Barriere unterstützt.
In dieser Doktorarbeit wurden zusätzlich dendritische Zellen als wichtige Komponente des adaptiven Immunsystems in das Modell integriert. Dieses Ko-Kultur Modell erwies sich als geeignet um partikuläre Formulierungen zu testen, welche als Transportsysteme für Tumorantigene entwickelt wurden. Es wurden Partikel basierend auf PLGA, PEG-PAGE-PLGA, Mannose-PEG-PAGE-PLGA und Chitosan untersucht. Aufnahmestudien ergaben nur geringfügige Unterschiede in den Transportraten zwischen den verschiedenen Partikeln. Es konnte ausserdem gezeigt werden, dass dendritische Zellen die Partikel phagozytieren, nachdem sie die intestinale Barriere überwunden haben. Die Partikel erwiesen sich als effektives Transportsystem um Peptide über die intestinale Barriere zu schleusen und stellen daher ein nützliches Werkzeug für die Entwicklung neuartiger Medikamente dar.
Um die komplexe Struktur und Physiologie des Darms noch besser nachzustellen, wurde für den Aufbau des Modells die Caco-2 Zelllinie durch primäre Darmzellen ersetzt. Die Darmkrypten, welche undifferenzierte Stammzellen und Vorläuferzellen enthalten, wurden aus humanen Dünndarmgewebe, dem Jejunum, isoliert und in vitro expandiert. Die Zellen wurden zusammen mit Myofibroblasten auf der dezellularisierten Schweinedarmmatrix, unter statischen und dynamischen Bedingungen, kultiviert.
Die primären Darmepithelzellen bildeten einen konfluenten Monolayer, welcher alle differenzierten intestinalen Zelltypen aufwies, gezeigt durch Zellen positiv für Mucin (Becherzellen), Villin (Enterozyten), Chromogranin A (enteroendokrine Zellen) und Lysozym (Paneth-Zellen). Mit Hilfe von Elektronenmikroskopie ließen sich essentielle funktionelle Einheiten eines intakten Epithels darstellen, wie die Mikrovilli und Tight Junctions. Um die Dichtigkeit des Epithels zu überprüfen wurde mit FITC-Dextran die Permeabilität bestimmt und TEER-Messungen durchgeführt. Die Modelle zeigten einen charakteristischen Transport für mehrere Referenzsubstanzen. Mechanische Stimulation durch ein dynamisches Kultivierungssystem hatte einen starken Einfluss auf die Barriereintegrität und Transporteraktivität der Modelle, was sich in einer dichteren Barriere und erhöhten Efflux-Transporteraktivität widerspiegelte.
Alles in allem bietet die Verwendung primärer intestinaler Zellen in Kombination mit einer dezellularisierten biologischen Matrix eine neue, vielversprechende Möglichkeit physiologischere in vitro Modelle des Darms aufzubauen. Der Erhalt intestinaler Stammzellen mit ihrem Proliferations- und Differenzierungspotential zusammen mit angepassten Protokollen könnte dabei helfen die Modelle weiter zu verbessern. Insbesondere die dynamische Kultivierung und die Ko-Kultur-Modelle erwiesen sich als entscheidender Schritt auf dem Weg zu physiologischeren Modellen. Solche Gewebemodelle könnten sich als nützlich erweisen, wenn es darum geht die Vorhersagekraft der in vitro Modelle, sowie die in vitro-in vivo Korrelation zu verbessern. Solche Gewebemodelle können ein nützliches Werkzeuge in der präklinischen Forschung für die Testung von pharmazeutischen Wirkstoffen, probiotisch aktiven Organismen, sowie humaner pathogener Keime sein und sogar zum Aufbau personalisierter Modelle für die regenerative Medizin dienen.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-142571
X 126898
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Matthias Oliver Schweinlin
deu
swd
Tissue Engineering
deu
swd
in vitro
deu
swd
Dünndarm
eng
uncontrolled
intestinal in vitro model
eng
uncontrolled
intestine
Biowissenschaften; Biologie
open_access
Graduate School of Life Sciences
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/14257/Schweinlin_Matthias_in_vitro_models.pdf
14263
2016
deu
doctoralthesis
1
2017-01-11
--
2017-01-11
Entwicklung und Charakterisierung von Gelatine-basierten Hydrogelen und PLGA-basierten Janus-Partikeln
Development and characterization of gelatin-based hydrogels and PLGA-based Janus particles
Zusammenfassung
In der Regenerativen Medizin sind polymerbasierte Biomaterialien von großer Bedeutung für
die Entwicklung und Anwendung verbesserter bzw. neuer Therapien. Die Erforschung der
Oberflächeneigenschaften von Biomaterialien, welche als Implantate eingesetzt werden, ist
eine grundlegende Voraussetzung für deren erfolgreichen Einsatz. Die Protein-Oberflächen-
Interaktion geschieht initial, sobald ein Implantat mit Körperflüssigkeiten oder mit Gewebe
in Kontakt kommt, und trägt maßgeblich zur direkten Wechselwirkung von Implantat und
umgebenden Zellen bei. Dieser Prozess wird in der vorliegenden Arbeit an Gelatine untersucht.
Daher bestand ein Ziel darin, stabile, nanometerdünne Gelatineoberflächen herzustellen
und darauf die Adsorption von humanen Plasmaproteinen und bakteriellen Proteinen zu
analysieren.
Die Abscheidung der Gelatinefilme in variabler Schichtdicke auf zuvor mit PPX-Amin modifizierten
Oberflächen wurde unter Verwendung eines Rotationsbeschichters durchgeführt.
Um stabile Hydrogelfilme zu erhalten, wurden die Amingruppen der disaggregierten Gelatinefibrillen
untereinander und mit denen der Amin-Modifizierung durch ein biokompatibles
Diisocyanat quervernetzt. Dieser Prozess lieferte einen reproduzierbaren und chemisch stabilen
Gelatinefilm, welcher durch die substratunabhängige Amin-Modifizierung kovalent auf
unterschiedlichste Oberflächen aufgebracht werden konnte. Die durch den Herstellungsprozess
präzise eingestellte Schichtdicke (Nano- bzw. Mikrometermaßstab) wurde mittels Ellipsometrie
und Rasterkraftmikroskopie ermittelt. Die ebenso bestimmte Rauheit war unabhängig
von der Schichtdicke sehr gering. Gelatinefilme, die auf funktionalisierte und strukturierte
Proben aufgebracht wurden, konnten durch Elektronenmikroskopie dargestellt werden. Mit
Hilfe der Infrarot-Reflexions-Absorptions-Spektroskopie wurden die Gelatinefilme im Hinblick
auf ihre Stabilität chemisch charakterisiert. Zur Quantifizierung der Adsorption humaner
Plasmaproteine (Einzelproteinlösungen) und komplexer Proteingemische aus steril filtrierten
Kulturüberständen des humanpathogenen Bakteriums Pseudomonas aeruginosa wurde die
Quarzkristall-Mikrowaage mit Dissipationsüberwachung eingesetzt. Hiermit konnte nicht
nur die adsorbierte Menge an Proteinen auf dem Gelatinehydrogel bzw. Referenzoberflächen
(Gold, PPX-Amin, Titan), sondern auch die viskoelastischen Eigenschaften des adsorbierten
Proteinfilms bestimmt werden. Allgemein adsorbierte auf dem Gelatinehydrogel eine geringere
Proteinmasse im Vergleich zu den Referenzoberflächen. Circa ein Viertel der adsorbierten
Proteine migrierte in die Poren des gequollenen Gels und veränderte dessen viskoelastische
Eigenschaften. Durch anschließende MALDI-ToF/MS- und MS/MS-Analyse konnten die bakteriellen
Proteine auf den untersuchten Oberflächen identifiziert und untereinander verglichen
werden. Hierbei zeigten sich nur geringfügige Unterschiede in der Proteinzusammensetzung.
Zudem wurde eine Sekundärionenmassenspektrometrie mit Flugzeitanalyse an reinen Gelatinefilmen
und an mit humanen Plasmaproteinen beladenen Gelatinefilmen durchgeführt.
Durch eine anschließende multivariante Datenanalyse konnte zwischen den untersuchten
Proben eindeutig differenziert werden. Dieser Ansatz ermöglicht es, die Adsorption von
unterschiedlichen Proteinen auf proteinbasierten Oberflächen markierungsfrei zu untersuchen
und kann zur Aufklärung der in vivo-Situation beitragen. Darüber hinaus bietet dieser
Untersuchungsansatz neue Perspektiven für die Gestaltung und das schnelle und effiziente
Screening von unterschiedlichen Proteinzusammensetzungen.
Biomaterialien können jedoch nicht nur als Implantate oder Implantatbeschichtungen eingesetzt
werden. Im Bereich des drug delivery und der Depotarzneimittel sind biologisch
abbaubare Polymere, aufgrund ihrer variablen Eigenschaften, von großem Interesse. Die
Behandlung von bakteriellen und fungalen Pneumonien stellt insbesondere bei Menschen mit
Vorerkrankungen wie Cystische Fibrose oder primäre Ziliendyskinesie eine große Herausforderung
dar. Oral oder intravenös applizierte Wirkstoffe erreichen die Erreger aufgrund der
erhöhten Zähigkeit des Bronchialsekretes oft nicht in ausreichender Konzentration. Daher
besteht ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit darin, mittels electrohydrodynamic cojetting
mikrometergroße, inhalierbare, wirkstoffbeladene Partikel mit zwei Kompartimenten
(Janus-Partikel) herzustellen und deren Eignung für die therapeutische Anwendung bei
Lungeninfektionen zu untersuchen.
Durch das in dieser Arbeit entwickelte Lösungsmittelsystem können Janus-Partikel aus
biologisch abbaubaren Co-Polymeren der Polymilchsäure (Poly(lactid-co-glycolid), PLGA)
hergestellt und mit verschiedenen Wirkstoffen beladen werden. Darunter befinden sich ein
Antibiotikum (Aztreonam, AZT), ein Antimykotikum (Itraconazol, ICZ), ein Mukolytikum
(Acetylcystein, ACC) und ein Antiphlogistikum (Ibuprofen, IBU). Die Freisetzung der eingelagerten
Wirkstoffe, mit Ausnahme von ICZ, konnte unter physiologischen Bedingungen
mittels Dialyse und anschließender Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen werden.
Die Freisetzungsrate wird von der Kettenlänge des Polymers beeinflusst, wobei eine
kürzere Kettenlänge zu einer schnelleren Freisetzung führt. Das in die Partikel eingelagerte
Antimykotikum zeigte in vitro eine gute Wirksamkeit gegen Aspergillus nidulans. Durch das
Einlagern von ICZ in die Partikel ist es möglich diesen schlecht wasserlöslichen Wirkstoff in
eine für Patienten zugängliche und wirksame Applikationsform zu bringen. In Interaktion mit
P. aeruginosa erzielten die mit Antibiotikum beladenen Partikel in vitro bessere Ergebnisse
als der Wirkstoff in Lösung, was sich in einem in vivo-Infektionsmodell mit der Wachsmotte
Galleria mellonella bestätigte. AZT-beladene Partikel hatten gegenüber einer identischen
Wirkstoffmenge in Lösung eine 27,5% bessere Überlebensrate der Wachsmotten zur Folge.
Des Weiteren hatten die Partikel keinen messbaren negativen Einfluss auf die Wachsmotten.
Dreidimensionale Atemwegsschleimhautmodelle, hergestellt mit Methoden des Tissue Engineerings,
bildeten die Basis für Untersuchungen der Partikel in Interaktion mit humanen
Atemwegszellen. Die Untersuchung von Apoptose- und Entzündungsmarkern im Überstand
der 3D-Modelle zeigte diesbezüglich keinen negativen Einfluss der Partikel auf die humanen
Zellen. Diese gut charakterisierten und standardisierten in vitro-Testsysteme machen es
möglich, Medikamentenuntersuchungen an menschlichen Zellen durchzuführen. Hinsichtlich
der histologischen Architektur und funktionellen Eigenschaften der 3D-Modelle konnte eine
hohe in vitro-/in vivo-Korrelation zu menschlichem Gewebe festgestellt werden. Humane
Mucine auf den 3D-Modellen dienten zur Untersuchung der schleimlösenden Wirkung von
ACC-beladenen Partikeln. Standen diese in räumlichem Kontakt zu den Mucinen, wurde deren
Zähigkeit durch das freigesetzte ACC herabgesetzt, was qualitativ mittels histologischen
Methoden bestätigt werden konnte.
Die in dieser Arbeit entwickelten Herstellungsprotokolle dienen als Grundlage und können
für die Synthese ähnlicher Systeme, basierend auf anderen Polymeren und Wirkstoffen,
modifiziert werden. Gelatine und PLGA erwiesen sich als vielseitig einsetzbare Werkstoffe
und bieten eine breite Anwendungsvielfalt in der Regenerativen Medizin, was die erzielten
Resultate bekräftigen.
In the field of regenerative medicine, polymer-based biomaterials are of great importance for the
development and application of improved or new therapies. The research on the surface properties of
biomaterials, which are used as implants, is essential for their successful use. The
protein-surface interaction is the initial step and occurs when an implant comes into contact with
bodily fluids or tissues and significantly increases direct interaction of the implant and the
surrounding cells. This thesis investigates these processes on gelatin. Accordingly, one of the
project’s major goals was to produce stable nanometer-thin gelatin surfaces and analyze the
adsorption of human plasma and bacterial proteins.
The deposition of gelatin films and the assortment of layer thicknesses on PPX-amine modified
surfaces were carried out using a spin coater. To gain hydrogel films with reproducible
properties, the amine groups of the disaggregated gelatin fibrils were cross- linked with each
other and with those of the amine modification by a biocompatible diisocyanate. The result was a
reproducible and chemically stable gelatin film, which could be applied to a wide variety of
surfaces through the substrate-independent amine modification. The manufacturing process precisely
adjusted the layer thickness to the nano- or micrometer scale which could be determined applying
ellipsometry and atomic- force microscopy. The roughness was very low regardless of the layer
thickness. Gelatin films applied to the functionalized and patterned samples could be visualized by
electron microscopy. With the help of infrared reflection absorption spectroscopy, the gelatin
films were chemically characterized in terms of stability. The adsorption of human plasma proteins
(single protein solutions) as well as the complex protein mixtures of sterile filtered supernatants
belonging to Pseudomonas aeruginosa, a human pathogenic bacterium, were quantified by quartz
crystal microbalance with dissipation monitoring. Both the adsorbed amount of proteins on the
gelatin hydrogel or reference surfaces (gold, PPX-amine, titanium) and the viscoelastic properties
of the adsorbed protein film were determined. In general, there was less protein mass adsorbed on
the gelatin hydrogel compared to the reference surfaces. About a quarter of the adsorbed proteins
migrated into the pores of the swollen gel and changed its viscoelastic properties. Subsequent
MALDI-ToF/MS and MS/MS analysis were used to identify and compare the adsorbed bacterial proteins
on the investigated surfaces. Only slight differences were found in the adsorbed protein
composition. A secondary ion mass spectrometry with time-of-flight analysis was performed on pure
gelatin films and gelatin films loaded with human plasma proteins. By subsequent multivariate data
analysis, it was possible to clearly differentiate between the examined samples. Not only does this
approach enable us to screen the adsorption of different proteins on protein-based surfaces without
labeling, but it also contributes to the elucidation of the in vivo-situation. ach provides new
perspectives regarding the design and efficient
screening of different protein compositions. ...
urn:nbn:de:bvb:20-opus-142636
X 126899
Deutsches Urheberrecht
Sina Maria Siglinde Schönwälder
deu
uncontrolled
PLGA
deu
uncontrolled
Partikel
deu
swd
Gelatine
deu
swd
Polylactid-co-Glycolid
deu
swd
Hydrogel
deu
swd
Tissue Engineering
Biowissenschaften; Biologie
open_access
Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/14263/Schoenwaelder_Sina_Janus-Partikel.pdf
14018
2011
eng
53-62
08. Okt
17
article
1
2016-11-10
--
--
Gene expression profiling of connective tissue growth factor (CTGF) stimulated primary human tenon fibroblasts reveals an inflammatory and wound healing response in vitro
Purpose:
The biologic relevance of human connective tissue growth factor (hCTGF) for primary human tenon fibroblasts (HTFs) was investigated by RNA expression profiling using affymetrix (TM) oligonucleotide array technology to identify genes that are regulated by hCTGF.
Methods:
Recombinant hCTGF was expressed in HEK293T cells and purified by affinity and gel chromatography. Specificity and biologic activity of hCTGF was confirmed by biosensor interaction analysis and proliferation assays. For RNA expression profiling HTFs were stimulated with hCTGF for 48h and analyzed using affymetrix (TM) oligonucleotide array technology. Results were validated by real time RT-PCR.
Results:
hCTGF induces various groups of genes responsible for a wound healing and inflammatory response in HTFs. A new subset of CTGF inducible inflammatory genes was discovered (e.g., chemokine [C-X-C motif] ligand 1 [CXCL1], chemokine [C-X-C motif] ligand 6 [CXCL6], interleukin 6 [IL6], and interleukin 8 [IL8]). We also identified genes that can transmit the known biologic functions initiated by CTGF such as proliferation and extracellular matrix remodelling. Of special interest is a group of genes, e.g., osteoglycin (OGN) and osteomodulin (OMD), which are known to play a key role in osteoblast biology.
Conclusions:
This study specifies the important role of hCTGF for primary tenon fibroblast function. The RNA expression profile yields new insights into the relevance of hCTGF in influencing biologic processes like wound healing, inflammation, proliferation, and extracellular matrix remodelling in vitro via transcriptional regulation of specific genes. The results suggest that CTGF potentially acts as a modulating factor in inflammatory and wound healing response in fibroblasts of the human eye.
Molecular Vision
urn:nbn:de:bvb:20-opus-140189
Molecular Vision 2011; 17:53-62
IZKF (Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung), Universität Würzburg
false
true
Axel Seher
Joachim Nickel
Thomas D. Mueller
Susanne Kneitz
Susanne Gebhardt
Tobias Meyer ter Vehn
Guenther Schlunck
Walter Sebald
eng
uncontrolled
Bone morphogenetic protein-2
eng
uncontrolled
Smooth-muscle-cells
eng
uncontrolled
Myofibroblast differentiation
eng
uncontrolled
TGF-beta
eng
uncontrolled
CYR61
eng
uncontrolled
Proliferation
eng
uncontrolled
Mechanisms
eng
uncontrolled
Apoptosis
eng
uncontrolled
Receptor
eng
uncontrolled
Cancer
Medizin und Gesundheit
open_access
Augenklinik und Poliklinik
Abteilung für Molekulare Innere Medizin (in der Medizinischen Klinik und Poliklinik II)
Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften
Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/14018/060_Seher_Mol_Vis.pdf
20017
2021
deu
doctoralthesis
1
2020-02-26
--
2020-02-20
Tissue Engineering für seltene Erkrankungen mit Störungen des mukoziliären Transports
Tissue engineering for rare diseases with impaired mucociliary transport
Bei der zystischen Fibrose (CF) sowie der primären Ziliendyskinesie (PCD) handelt es sich um zwei seltene Erkrankungen, die unter anderem den mukoziliären Transport beeinträchtigen. CF gehört hierbei zu den am häufigsten vorkommenden angeborenen Stoffwechselerkrankungen, wobei Betroffene unter einem Defekt des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductor Regulator (CFTR)-Gens leiden, der durch die Produktion von hochviskosem Sekret in muzinproduzierenden Organen, wie dem gastrointestinalen Trakt und der Lunge, gekennzeichnet ist. Patienten, die an PCD leiden, weisen Defekte in, zum jetzigen Zeitpunkt, ca. 38 bekannten und PCD-assoziierten Genen auf, die in strukturellen Defekten des ziliären Apparats und somit in dysfunktionalen Kinozilien resultieren. Da aktuell weder für die CF noch für die PCD eine Heilung möglich ist, steht bei der Therapie vor allem die Linderung der Symptome im Fokus. Grundlegendes Ziel ist der langfristige Erhalt der Lungenfunktion sowie die Prävention bakterieller Infekte. Als bisherige Modellsysteme zur Erforschung möglicher Therapeutika gelten Tiermodelle, die den humanen Phänotyp aufgrund von Speziesdiversität nicht vollständig abbilden können. Als vielversprechende Testsysteme für die zystische Fibrose gelten humane intestinale Organoidkulturen. Nachdem allerdings vorwiegend respiratorische Symptome für die Mortalität der Patienten verantwortlich sind, stellen CF-Atemwegsmodelle bessere Testsysteme für zukünftige Therapeutika dar. Atmungsorganoidkulturen wurden verwendet, um die CFTR-Funktionalität zu untersuchen, repräsentieren aber nicht vollständig die in vivo Situation. Deshalb werden zur Entwicklung neuer Therapiestrategien patientenspezifische 3D in vitro Testsysteme der humanen Atemwege benötigt, die insbesondere im Hinblick auf personalisierte Medizin ihren Einsatz finden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine für den Lehrstuhl neue Methode zur Zellgewinnung aus nasalen Schleimhautabstrichen etabliert, die eine standardisierte Versorgung mit humanem Primärmaterial garantiert. Zur Generierung einer krankheitsspezifischen Zelllinie, wie beispielsweise einer PCD-Zelllinie mit Hilfe des CRISPR/Cas9-Systems, ist eine Atemwegszelllinie erforderlich, die die in vivo Situation vollständig repräsentiert. So wurden vier verschiedene respiratorische Epithelzelllinien (HBEC3-KT, Calu-3, VA10 und Cl-huAEC) auf ihren mukoziliären Phänotyp hin untersucht, wobei lediglich die Zelllinie HBEC3-KT in zilientragende Zellen differenzierte. Diese zeigten jedoch nur auf ca. 5 % der Modelloberfläche Kinozilien, wodurch die humane respiratorische Mukosa nicht komplett abgebildet werden konnte und die HBEC3-KT-Zelllinie keine geeignete Zelllinie zur Generierung einer PCD-Zelllinie darstellte. Mit Hilfe des Tissue Engineering war es möglich, 3D in vitro Testsysteme basierend auf zwei unterschiedlichen Matrices, der biologischen SIS (small intestinal submucosa) und der synthetischen Polyethylenterephthalat (PET)-Membran, aufzubauen. Es wurden 3D Atemwegstestsysteme mit humanen primären nasalen und tracheobronchialen Epithelzellen generiert. Ergänzend zu histologischen Untersuchungen und zur Charakterisierung spezifischer Marker des respiratorischen Systems mittels Immunfluoreszenz, wurde die Ultrastruktur der Modelle, mit speziellem Fokus auf ziliäre Strukturen, analysiert. Um Rückschlüsse auf die ziliäre Funktionalität ziehen zu können und somit eine hohe in vivo Korrelation zu bestätigen, wurde im Rahmen dieser Arbeit am Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin die Methode der Hochgeschwindigkeitsvideomikroskopie etabliert, welche die Analyse der Zilienschlagfrequenz sowie des mukoziliären Transports ermöglicht. Ebenfalls wurde der Einfluss von isotoner Kochsalzlösung und des � 2-adrenergen Agonisten Salbutamol, das vor allem als Bronchodilatator bei Asthmapatienten eingesetzt wird, auf die Zilienschlagfrequenz analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass beide Substanzen den Zilienschlag im Atemwegsmodell erhöhen. Zur Generierung der Testsysteme der beiden seltenen Erkrankungen CF und PCD wurden Epithelzellen der betroffenen Patienten zunächst mittels nicht-invasiver Raman-Spektroskopie auf einen potentiellen Biomarker untersucht, welcher Einsatz in der Diagnostik der beiden Krankheiten finden könnte. Es konnte jedoch weder für die CF noch für die PCD ein Biomarker aufgedeckt werden. Jedoch zeigten PCD-Zellen eine geringe Auftrennung gegenüber nicht-PCD Zellen. Anschließend wurden 3D-Atemwegstestsysteme basierend auf Patientenzellen aufgebaut. Der Phänotyp der CF-Modelle wurde mittels immunhistologischer Färbung und der Analyse des gestörten mukoziliären Transports verifiziert. Strukturelle ziliäre Defekte konnten durch die ultrastrukturelle Analyse von Zilienquerschnitten in drei donorspezifischen PCD-Modellen identifiziert werden. Darüber hinaus konnte die ziliäre Funktionalität mit Hilfe der Hochgeschwindigkeitsvideomikroskopie nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, eine neue Methode zur vollständigen Charakterisierung von 3D-Atemwegstestsystemen zu etablieren, die die Analyse der Zilienschlagfrequenz sowie des mukoziliären Transports ermöglicht. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass mit Hilfe des Tissue Engineering ein personalisiertes Krankheitsmodell für die PCD auf Segmenten eines dezellularisierten porzinen Jejunums generiert werden kann, das zukünftig ein Testsystem für potentielle Therapeutika darstellen kann.
Cystic fibrosis (CF) and primary ciliary dyskinesia (PCD) are two rare diseases which,among others, impair the mucociliary transport. CF is one of the most common in-herited metabolic diseases with patients suffering from a defect in theCystic FibrosisTransmembrane Conductor Regulator(CFTR) gene, which is characterized by the pro-duction of highly viscous secretions in mucin-producing organs such as the gastrointestinaltract and lungs. Patients suffering from PCD have defects in currently approximately 38known and PCD-associated genes resulting in structural defects of the ciliary appara-tus and thus in dysfunctional cilia. Since neither CF nor PCD have any chance of beingcured so far, the main focus is on alleviating the symptoms. The basic goal is the long-term preservation of lung function and the prevention of microbial infections. Previousmodel systems for exploring possible therapeutic options have been animal models thatcan never completely represent the human phenotype due to species diversity. Humanintestinal organoid cultures are considered as a promising test system for cystic fibro-sis. However, since respiratory symptoms are mainly responsible for patient mortality,CF respiratory models provide better test systems for future therapeutics. Respiratoryorganoid cultures have been used to study CFTR functionality, but do not completelyrepresent thein vivosituation. In order to develop new therapeutic strategies, patient-specific 3Din vitrotest systems for the human respiratory tract expressing functionalkinocilia are required, which can be used in particular with regard to personalized medi-cine.In the present thesis, a new method for obtaining cells from nasal mucosal brush biop-sies was established, that guarantees a standardised supply of human primary materi-al. In order to generate a disease-specific cell line, such as a PCD cell line, using theCRISPR/Cas9 system, a respiratory cell line that fully represents thein vivosituation isrequired. Hence, four different respiratory epithelial cell lines (HBEC3-KT, Calu-3, VA10and Cl-huAEC) were investigated with regard to their mucociliary phenotype, wherebyonly the cell line HBEC3-KT differentiated into ciliated cells. However, these showed ki-nocilia only on approx. 5 % of the model’s surface, thus the human respiratory mucosacould not be completely modelled and HBEC3-KT cell line is no suitable cell line for geneediting experiments.Tissue engineering made it possible to build 3Din vitrotest systems based on two differentmatrices, the biological SIS (small intestine submucosa) and synthetic PET (polyethyleneterephthalate) membranes. 3D airway test systems were generated using human primarynasal and tracheobronchial epithelial cells. In addition to histological investigations and the characterization of specific markers of the respiratory system by immunofluorescence,the ultrastructure of the models was analyzed with a special focus on ciliary structures.In order to gain insight into the ciliary functionality and thus to achieve a highin vivocorrelation, the method of high-speed video microscopy was established within the scopeof this work at the Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, which allowsthe analysis of ciliary beat frequency as well as mucociliary transport. The influence ofisotonic saline solution and salbutamol, aβ2-adrenergic agonist mainly used as broncho-dilator in asthma patients, on ciliary beat frequency was also analyzed. It could be shownthat both substances increased the ciliary beat of the primary respiratory mucosa models.In order to generate test systems for the two rare diseases CF and PCD, epithelial cellsof the affected patients were first examined by non-invasive Raman spectroscopy for apotential biomarker that could be used in diagnostic approaches. However, no biomarkerfor CF or PCD could be detected, with PCD cells showing a low separation to non-PCDcells. Subsequently, 3D test systems based on patient cells were developed. The phenotypeof the CF models was verified by immunohistological staining and analysis of impairedmucociliary transport. Ultrastructural ciliary defects could be identified by ultrastructuralanalysis of cilia cross sections in three donor-specific PCD models. Additionally, ciliaryfunctionality could not be detected using high speed video microscopy analysis.In summary, this work succeeded in establishing a new method for the complete characte-rization of 3D airway test systems, which allows the analysis of ciliary beating frequencyand mucociliary transport. It has been shown for the first time that tissue engineering canbe used to generate a personalized disease model for PCD using a decellularized poricinejejunum as a scaffold. Both, PCD and CF disease models could in future be regarded astest systems for potential therapeutics.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-200178
10.25972/OPUS-20017
X 129192
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Nina Theresa Lodes
deu
swd
In-vitro-Kultur
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swd
Tissue Engineering
deu
swd
Gewebekultur
deu
swd
Individualisierte Medizin
deu
uncontrolled
Respiratorisches System
deu
uncontrolled
Primäre Ziliendyskinesie
eng
uncontrolled
airways
eng
uncontrolled
primary ciliary dyskinesia
Biowissenschaften; Biologie
open_access
Graduate School of Life Sciences
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/20017/Lodes_Nina_TissueEngineering.pdf
19250
2019
deu
doctoralthesis
1
2019-12-06
--
2019-11-13
Biokompatibilitätsmessungen, Anwendung und histologische Untersuchung eines Kreuzbandtransplantats aus Kollagen-I basiertem Biomaterial am Tiermodell
Biocompatibility, application and histologic examination of a type I collagen based implant for reconstruction of the anterior cruciate ligament in an animal model
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Biokompatibilität von Kollagen I-basierten ACL-Konstrukten in-vitro und in-vivo zu überprüfen. Zudem erfolgte eine histologische Charakterisierung der Konstrukte nach sechswöchiger bzw. sechsmonatiger Versuchslaufzeit im Minipig-Tiermodell.
Das Kollagen I wurde durch eine neuartige Methode aus Rattenschwänzen isoliert und zu einem Implantat geknotet und gewickelt. Die Fasern wurden mittels Proliferationsmessung, Proteinbestimmung, Zellzählung und Zellmorphologie auf in-vitro-Biokompatibilität getestet. Hier zeigte sich eine gute Biokompatibilität sowohl für γ-sterilisierte Fasern als auch für nicht sterilisierte Fasern. In der Sterilitätsüberprüfung waren nach Anpassung des Sterilisationsverfahrens weder Bakterien- noch Pilzwachstum nachweisbar. Diese Ergebnisse sind vergleichbar mit vielfältigen Studien zur Biokompatibilität von Kollagen, in denen jeweils gute Zellviabilität und –proliferation im direkten oder indirekten Kontakt mit Kollagen gezeigt werden konnte.
Anschließend wurde das Konstrukt im Tierversuch direkt im Kniegelenk als vorderer Kreuzbandersatz implantiert. Nach Ablauf der Standzeit und Explantation der Kniegelenke wurden Paraffinschnittpräparate der Implantate sowie Paraffinschnittpräparate und Kunststoffschnittpräparate der ossa femora angefertigt und durchlichtmikroskopisch deskriptiv ausgewertet. Zusätzlich wurden die immunhistochemischen Färbungen Kollagen I des Schweins und der Ratte und Faktor VIII angefertigt, wobei in der Faktor VIII-Färbung zusätzlich eine quantitative Auswertung der Gefäßzahl vorgenommen wurde. Es wurde in der Kollagenfärbung ein Ersatz des Rattenkollagens durch das Schweinekollagen einhergehend mit einer hohen Zellzahl gezeigt. Eine synoviale Deckschicht und eine fortschreitende Vaskularisierung, sowie Form und Anordnung der Zellen zeigten Vorgänge des Remodeling. Innerhalb von 6 Monaten nahm die Vaskularisierung zu und neu gebildeter Geflechtknochen verengte die Bohrkanäle. Die Knochen-Implantat-Heilung war im Bohrkanal durch Sharpey´sche Fasern gekennzeichnet. Am Tunnelausgang fanden sich von sechs Wochen zu sechs Monaten Hinweise auf die fortschreitende Entwicklung einer direkten Bandinsertion.
Diese Ergebnisse entsprechen weitgehend den in der Literatur beschriebenen Remodelingvorgängen bei Studien zum Thema Kreuzbandersatz. Die beginnende direkte Bandinsertion spricht für eine gute Fixation und die Einheilung begünstigende Eigenschaften des Implantates. Dies ist ein geeigneter Ansatz für weitere Untersuchungen. Von Seiten der Biokompatibilität und der Integration des Gewebes ist das Implantat zum Kreuzbandersatz geeignet. Es bleibt abzuwarten, inwieweit die erforderlichen mechanischen Eigenschaften erreicht werden können.
The aim of the study was to examine the biocompatibility of type I collagen based ACL constructs in vitro and in vivo. In addition, the constructs were histologically characterized after a test period of six weeks or six months in the minipig animal model.
The type I collagen was isolated from rat tails by a novel method and knotted and wrapped into an implant. The fibers were tested for in vitro biocompatibility by proliferation measurement, protein determination, cell counting and cell morphology. This showed good biocompatibility for both γ-sterilized fibers and for non-sterilized fibers. After adjustment of the sterilization process, neither bacterial nor fungal growth was detectable in the sterility check. These results are comparable to various studies on the biocompatibility of collagen, in which good cell viability and proliferation could be shown in direct or indirect contact with collagen.
The construct was implanted directly in the knee joint as an anterior cruciate ligament replacement. After the explantation of the knee joints, paraffin-cut preparations of the implants as well as paraffin-cut preparations and plastic-cut preparations of the ossa femora were made and evaluated descriptively using light microscopy. In addition, the immunohistochemical stains type I collagen of the pig and the rat and factor VIII were prepared, with a quantitative evaluation of the number of vessels also being carried out in the factor VIII staining. In the collagen staining, a replacement of the rat collagen by the pig collagen was shown, along with a high cell number. A synovial cover layer and progressive vascularization, as well as the shape and arrangement of the cells showed processes of remodeling. Vascularization increased within 6 months and newly formed bone narrowed the drill channels. Bone implant healing was characterized by Sharpey fibers in the drill channel. At the tunnel exit, indications of the progressive development of a direct band insertion were found from six weeks to six months.
These results largely correspond to the remodeling processes described in the literature for studies on the subject of anterior cruciate ligament replacement. The beginning of direct band insertion suggests good fixation and healing properties of the implant. This is a suitable approach for further investigations. In terms of biocompatibility and the integration of the tissue, the implant is suitable for anterior cruciate ligament replacement. To reach the mechanical properties will be the key for clinical use.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-192501
10.25972/OPUS-19250
X 128530
Deutsches Urheberrecht
Franziska Stöckhert
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swd
Kollagen
deu
swd
Kreuzband
deu
swd
Biokompatibilität
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/19250/Stoeckhert_Franziska_Kollagen-I-basiertes_Kreuzbandtransplantat.pdf
18731
2016
eng
254-261
36
article
1
2019-09-13
--
--
Catch-up validation study of an in vitro skin irritation test method based on an open source reconstructed epidermis (phase II)
To replace the Draize skin irritation assay (OECD guideline 404) several test methods based on reconstructed human epidermis (RHE) have been developed and were adopted in the OECD test guideline 439. However, all validated test methods in the guideline are linked to RHE provided by only three companies. Thus,the availability of these test models is dependent on the commercial interest of the producer. To overcome this limitation and thus to increase the accessibility of in vitro skin irritation testing, an open source reconstructed epidermis (OS-REp) was introduced. To demonstrate the capacity of the OS-REp in regulatory risk assessment, a catch-up-validation study was performed. The participating laboratories used in-house generated OS-REp to assess the set of 20 reference substances according to the performance standards amending the OECD test guideline 439. Testing was performed under blinded conditions. The within-laboratory reproducibility of 87% and the inter-laboratory reproducibility of 85% prove a high reliability of irritancy testing using the OS-REp protocol. In addition, the prediction capacity was with an accuracy of 80% comparable to previous published RHE based test protocols. Taken together the results indicate that the OS-REp test method can be used as a standalone alternative skin irritation test replacing the OECD test guideline 404.
Toxicology in Vitro
10.1016/j.tiv.2016.07.008
urn:nbn:de:bvb:20-opus-187311
Toxicology in Vitro (2016) 36, 254-261. https://doi.org/10.1016/j.tiv.2016.07.008
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true
CC BY-NC-ND: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Nicht kommerziell, Keine Bearbeitungen 4.0 International
Florian Groeber
Lena Schober
Freia F. Schmid
Andrea Traube
Silvia Kolbus-Hernandez
Karolina Daton
Sebastian Hoffmann
Dirk Petersohn
Monika Schaefer-Korting
Heike Walles
Karsten R. Mewes
eng
uncontrolled
Model
eng
uncontrolled
Chemicals
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uncontrolled
Assay
eng
uncontrolled
Episkin
eng
uncontrolled
Vivo
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uncontrolled
RHE
eng
uncontrolled
In vitro skin irritation testing
eng
uncontrolled
Open source reconstructed epidermis
eng
uncontrolled
Validation
eng
uncontrolled
Alternative test methods
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/18731/Groeber_ToxicologyInVitro_2016.pdf
18976
2016
eng
730-742
6
5
article
1
2019-10-24
--
--
In vivo host response and degradation of copolymer scaffolds functionalized with nanodiamonds and bone morphogenetic protein 2
The aim is to evaluate the effect of modifying poly[(L-lactide)-co-(epsilon-caprolactone)] scaffolds (PLCL) with nanodiamonds (nDP) or with nDP+physisorbed BMP-2 (nDP+BMP-2) on in vivo host tissue response and degradation. The scaffolds are implanted subcutaneously in Balb/c mice and retrieved after 1, 8, and 27 weeks. Molecular weight analysis shows that modified scaffolds degrade faster than the unmodified. Gene analysis at week 1 shows highest expression of proinflammatory markers around nDP scaffolds; although the presence of inflammatory cells and foreign body giant cells is more prominent around the PLCL. Tissue regeneration markers are highly expressed in the nDP+BMP-2 scaffolds at week 8. A fibrous capsule is detectable by week 8, thinnest around nDP scaffolds and at week 27 thickest around PLCL scaffolds. mRNA levels of ALP, COL1 alpha 2, and ANGPT1 are signifi cantly upregulating in the nDP+BMP-2 scaffolds at week 1 with ectopic bone seen at week 8. Even when almost 90% of the scaffold is degraded at week 27, nDP are observable at implantation areas without adverse effects. In conclusion, modifying PLCL scaffolds with nDP does not aggravate the host response and physisorbed BMP-2 delivery attenuates infl ammation while lowering the dose of BMP-2 to a relatively safe and economical level.
Advanced Healthcare Materials
10.1002/adhm.201500723
urn:nbn:de:bvb:20-opus-189764
Advanced Healthcare Materials (2016) 5:6, S. 730-742. https://doi.org/10.1002/adhm.201500723
242175‐VascuBone
true
true
CC BY-NC-ND: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Nicht kommerziell, Keine Bearbeitungen 4.0 International
Salwa Suliman
Yang Sun
Torbjorn O. Pedersen
Ying Xue
Joachim Nickel
Thilo Waag
Anna Finne-Wistrand
Doris Steinmüller-Nethl
Anke Krueger
Daniela E. Costea
Kamal Mustafa
eng
uncontrolled
inflammatory response
eng
uncontrolled
biocompatibility
eng
uncontrolled
BMP-2 delivery
eng
uncontrolled
inflammation
eng
uncontrolled
tissue engineering
Biowissenschaften; Biologie
Medizin und Gesundheit
open_access
Institut für Organische Chemie
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
OpenAIRE
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/18976/Suliman_AdvancedHealthcareMaterials_2016.pdf
14799
2016
eng
8
1
8
article
1
2017-05-05
--
--
Non-Coding RNAs in Lung Cancer: Contribution of Bioinformatics Analysis to the Development of Non-Invasive Diagnostic Tools
Lung cancer is currently the leading cause of cancer related mortality due to late diagnosis and limited treatment intervention. Non-coding RNAs are not translated into proteins and have emerged as fundamental regulators of gene expression. Recent studies reported that microRNAs and long non-coding RNAs are involved in lung cancer development and progression. Moreover, they appear as new promising non-invasive biomarkers for early lung cancer diagnosis. Here, we highlight their potential as biomarker in lung cancer and present how bioinformatics can contribute to the development of non-invasive diagnostic tools. For this, we discuss several bioinformatics algorithms and software tools for a comprehensive understanding and functional characterization of microRNAs and long non-coding RNAs.
Genes
10.3390/genes8010008
urn:nbn:de:bvb:20-opus-147990
Genes 2017, 8(1), 8; doi:10.3390/genes8010008
Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology (IGB)
Meik Kunz
Beat Wolf
Harald Schulze
David Atlan
Thorsten Walles
Heike Walles
Thomas Dandekar
eng
uncontrolled
lung cancer
eng
uncontrolled
non-invasive biomarkers
eng
uncontrolled
miRNAs
eng
uncontrolled
lncRNAs
eng
uncontrolled
bioinformatics
eng
uncontrolled
early diagnosis
eng
uncontrolled
algorithm
Biowissenschaften; Biologie
open_access
Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Institut für Experimentelle Biomedizin
Förderzeitraum 2016
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/14799/Kunz_genes-08-00008.pdf
14654
2016
eng
e0151335
3
11
article
1
2017-03-31
--
--
Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo
Background
Enteric glial cells (EGCs) are the main constituent of the enteric nervous system and share similarities with astrocytes from the central nervous system including their reactivity to an inflammatory microenvironment. Previous studies on EGC pathophysiology have specifically focused on mucosal glia activation and its contribution to mucosal inflammatory processes observed in the gut of inflammatory bowel disease (IBD) patients. In contrast knowledge is scarce on intestinal inflammation not locally restricted to the mucosa but systemically affecting the intestine and its effect on the overall EGC network.
Methods and Results
In this study, we analyzed the biological effects of a systemic LPS-induced hyperinflammatory insult on overall EGCs in a rat model in vivo, mimicking the clinical situation of systemic inflammation response syndrome (SIRS). Tissues from small and large intestine were removed 4 hours after systemic LPS-injection and analyzed on transcript and protein level. Laser capture microdissection was performed to study plexus-specific gene expression alterations. Upon systemic LPS-injection in vivo we observed a rapid and dramatic activation of Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)-expressing glia on mRNA level, locally restricted to the myenteric plexus. To study the specific role of the GFAP subpopulation, we established flow cytometry-purified primary glial cell cultures from GFAP promotor-driven EGFP reporter mice. After LPS stimulation, we analyzed cytokine secretion and global gene expression profiles, which were finally implemented in a bioinformatic comparative transcriptome analysis. Enriched GFAP+ glial cells cultured as gliospheres secreted increased levels of prominent inflammatory cytokines upon LPS stimulation. Additionally, a shift in myenteric glial gene expression profile was induced that predominantly affected genes associated with immune response.
Conclusion and Significance
Our findings identify the myenteric GFAP-expressing glial subpopulation as particularly susceptible and responsive to acute systemic inflammation of the gut wall and complement knowledge on glial involvement in mucosal inflammation of the intestine.
PLoS One
10.1371/journal.pone.0151335
urn:nbn:de:bvb:20-opus-146544
PLoS ONE 11(3): e0151335. doi:10.1371/journal.pone.0151335
Corinna Rosenbaum
Martin Alexander Schick
Jakob Wollborn
Andreas Heider
Claus-Jürgen Scholz
Alexander Cecil
Beate Niesler
Johannes Hirrlinger
Heike Walles
Marco Metzger
eng
uncontrolled
gene expression
eng
uncontrolled
gastrointestinal tract
eng
uncontrolled
inflammatory bowel disease
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uncontrolled
central nervous system
eng
uncontrolled
systemic inflammatory response syndrome
eng
uncontrolled
inflammation
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uncontrolled
astrocytes
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uncontrolled
cytokines
Medizin und Gesundheit
open_access
Klinik und Poliklinik für Anästhesiologie (ab 2004)
Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Förderzeitraum 2016
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/14654/Rosenbaum_journal.pone.0151335.pdf
17865
2019
eng
doctoralthesis
1
2019-03-28
--
2019-03-27
Development and proof of concept of a biological vascularized cell‐based drug delivery system
Entwicklung und Proof of Concept eines biologischen, vaskularisierten, zellbasierten Drug‐Delivery‐Systems
A major therapeutic challenge is the increasing incidence of chronic disorders.
The persistent impairment or loss of tissue function requires constitutive on‐demand
drug availability optimally achieved by a drug delivery system ideally directly connected
to the blood circulation of the patient. However, despite the efforts and achievements in
cell‐based therapies and the generation of complex and customized cell‐specific
microenvironments, the generation of functional tissue is still unaccomplished.
This study demonstrates the capability to generate a vascularized platform technology to
potentially overcome the supply restraints for graft development and clinical application
with immediate anastomosis to the blood circulation.
The ability to decellularize segments of the rat intestine while preserving the ECM for
subsequent reendothelialization was proven. The reestablishment of a functional
arteriovenous perfusion circuit enabled the supply of co‐cultured cells capable to replace
the function of damaged tissue or to serve as a drug delivery system. During in vitro
studies, the applicability of the developed miniaturized biological vascularized scaffold
(mBioVaSc‐TERM®) was demonstrated. While indicating promising results in short term
in vivo studies, long term implantations revealed current limitations for the translation
into clinical application. The gained insights will impact further improvements of quality
and performance of this promising platform technology for future regenerative therapies.
Eine kontinuierlich steigende Inzidenz chronischer Krankheiten stellt eine immer größer
werdende therapeutische Herausforderung dar. Der anhaltende Funktionsverlust von
Geweben erfordert die bedarfsgerechte Verfügbarkeit von Wirkstoffen, deren
kontinuierliche Bereitstellung und Verteilung über die Blutzirkulation von
implantierbaren Pharmakotherapie‐Produkten gelöst werden kann. Trotz der
Fortschritte und Erfolge mit Zelltherapien sowie der Nachbildung der Zell‐eigenen
Nischen konnten bisher noch keine funktionellen Gewebe für die medizinische
Anwendbarkeit hergestellt werden.
Diese Studie zeigt die Möglichkeit zur Herstellung einer vaskularisierten Plattform‐
Technologie um die Beschränkung der Nährstoff‐Versorgung zu überwinden für die
Entwicklung von Transplantaten für die klinische Anwendung und deren sofortige
Anastomose an die Blutzirkulation.
Die Möglichkeit Rattendarmsegmente zu dezellularisieren, die Extrazellulärmatrix und
das interne Gefäßsystem dabei jedoch zu erhalten um diese Strukturen
wiederzubesiedeln wurde bewiesen. Das Wiederherstellen des funktionellen
arteriovenösen Perfusionskreislaufs ermöglichte die Versorgung von Ko‐kultivierten
Zellen um damit funktionalen Gewebeersatz bzw. ‐modelle aufzubauen oder als Medizin‐
Produkt Einsatz zu finden. In vitro‐Studien zeigten eindrucksvoll Reife und
Anwendbarkeit des hier entwickelten miniaturisierten, biologischen, vaskularisierten
Scaffold (mBioVaSc‐TERM®). Während in in vivo‐Studien zunächst vielversprechende
Ergebnisse erzielt wurden, zeigten Langzeit Implantationen die aktuellen Grenzen zur
Translation in die klinische Anwendung. Die gewonnenen Erkenntnisse werden dazu
dienen Qualität und Funktionalität dieser vielversprechenden Plattform‐Technologie zu
verbessern um zukünftige regenerative Therapien zu ermöglichen.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-178650
10.25972/OPUS-17865
X 128101
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Sebastian Kreß
deu
swd
Vaskularisation
deu
swd
Dezellularisierung
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swd
Tissue Engineering
deu
swd
Therapeutisches System
deu
swd
Implantat
eng
uncontrolled
Vascularized
eng
uncontrolled
drug delivery
Biowissenschaften; Biologie
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/17865/Kress_Sebastian_Dissertation.pdf
17886
2019
eng
doctoralthesis
1
2019-04-03
--
2019-03-27
Development of a prevascularized bone implant
Entwicklung eines prävaskularisierten Knochenimplantats
The skeletal system forms the mechanical structure of the body and consists of bone, which is hard connective tissue. The tasks the skeleton and bones take over are of mechanical, metabolic and synthetic nature. Lastly, bones enable the production of blood cells by housing the bone marrow. Bone has a scarless self-healing capacity to a certain degree. Injuries exceeding this capacity caused by trauma, surgical removal of infected or tumoral bone or as a result from treatment-related osteonecrosis, will not heal. Critical size bone defects that will not heal by themselves are still object of comprehensive clinical investigation. The conventional treatments often result in therapies including burdening methods as for example the harvesting of autologous bone material. The aim of this thesis was the creation of a prevascularized bone implant employing minimally invasive methods in order to minimize inconvenience for patients and surgical site morbidity. The basis for the implant was a decellularized, naturally derived vascular scaffold (BioVaSc-TERM®) providing functional vessel structures after reseeding with autologous endothelial cells. The bone compartment was built by the combination of the aforementioned scaffold with synthetic β-tricalcium phosphate. In vitro culture for tissue maturation was performed using bioreactor technology before the testing of the regenerative potential of the implant in large animal experiments in sheep. A tibia defect was treated without the anastomosis of the implant’s innate vasculature to the host’s circulatory system and in a second study, with anastomosis of the vessel system in a mandibular defect. While the non-anastomosed implant revealed a mostly osteoconductive effect, the implants that were anastomosed achieved formation of bony islands evenly distributed over the defect.
In order to prepare preconditions for a rapid approval of an implant making use of this vascularization strategy, the manufacturing of the BioVaSc-TERM® as vascularizing scaffold was adjusted to GMP requirements.
Das Skelett bildet die mechanische Struktur des Körpers und besteht aus Knochen, einem harten Bindegewebe. Knochen übernehmen mechanische, metabolische und synthetische Aufgaben. Schlussendlich ermöglichen Knochen die Synthese von Blutzellen durch die Beherbergung des Knochenmarks. Wird die Heilungskapazität von Knochen durch Trauma, operative Entfernung von infiziertem oder tumorösem Knochen oder als Ergebnis behandlungsbedingter Osteonekrose, überschritten, findet keine vollständige Heilung statt. Knochendefekte, die eine kritische Größe überschreiten, sind daher immer noch Gegenstand umfangreicher, klinischer Forschung. Bei herkömmlichen Behandlungsmethoden können Eingriffe notwendig werden, die den Patienten belasten, wie bei der Gewinnung von autologem Knochenmaterial. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Herstellung eines prävaskularisierten Implantats unter Verwendung minimalinvasiver Methoden, um die Belastung von Patienten und die Morbidität an der Entnahmestelle, zu verringern. Zur Herstellung eines vaskularisierten Implantats bildete ein dezellularisiertes Darmsegment (Jejunum) porcinen Ursprungs die Grundlage (BioVasc-TERM®). Diese Trägerstruktur stellte ein funktionales Blutgefäßsystem nach Wiederbesiedelung mit autologen Endothelzellen bereit. Der Knochenanteil des Implantats wurde durch die Kombination der genannten Trägerstruktur mit dem synthetischen Knochenersatzmaterial β-Tricalciumphosphat gebildet. In-vitro-Kultivierung in einem Bioreaktor führte zur Reifung des Implantats vor der Testung seines Potenzials zur Knochenregeneration in Großtierversuchen bei Schafen. Ein Tibiadefekt wurde behandelt ohne die Anastomose des implantateigenen Gefäßsystems an den Blutkreislauf und ein Mandibeldefekt wurde mit Gefäßanschluss behandelt. Das Implantat ohne Gefäßanschluss hatte einen osteokonduktiven Effekt, während das anastomosierte Implantat zur Bildung zahlreicher Knocheninseln, gleichmäßig über den Defekt verteilt, führte. Um eine zügige Zulassung eines Implantats, das diese Strategie zur Vaskularisierung von Knochen nutzt, zu ermöglichen, wurde die Herstellung der BioVaSc-TERM® an die Vorgaben der Guten Herstellungspraxis angepasst.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-178869
10.25972/OPUS-17886
Medizinische Universität Innsbruck
Queensland University of Technology
X 128155
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Christoph Rücker
deu
swd
Tissue Engineering
deu
swd
Knochenregeneration
deu
swd
Regenerative Medizin
deu
swd
Angiogenese
deu
swd
Implantat
eng
uncontrolled
bone
eng
uncontrolled
implant
deu
uncontrolled
Knochenimplantat
deu
uncontrolled
Vaskularisierung
Biowissenschaften; Biologie
open_access
Fakultät für Biologie
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/17886/Ruecker_Christoph_Dissertation.pdf
17993
2016
eng
4
11
article
1
2019-05-02
--
--
Feasibility Study on a Microwave-Based Sensor for Measuring Hydration Level Using Human Skin Models
Tissue dehydration results in three major types of exsiccosis—hyper-, hypo-, or isonatraemia. All three types entail alterations of salt concentrations leading to impaired biochemical processes, and can finally cause severe morbidity. The aim of our study was to demonstrate the feasibility of a microwave-based sensor technology for the non-invasive measurement of the hydration status. Electromagnetic waves at high frequencies interact with molecules, especially water. Hence, if a sample contains free water molecules, this can be detected in a reflected microwave signal. To develop the sensor system, human three-dimensional skin equivalents were instituted as a standardized test platform mimicking reproducible exsiccosis scenarios. Therefore, skin equivalents with a specific hydration and density of matrix components were generated and microwave measurements were performed. Hydration-specific spectra allowed deriving the hydration state of the skin models. A further advantage of the skin equivalents was the characterization of the impact of distinct skin components on the measured signals to investigate mechanisms of signal generation. The results demonstrate the feasibility of a non-invasive microwave-based hydration sensor technology. The sensor bears potential to be integrated in a wearable medical device for personal health monitoring.
PLoS ONE
10.1371/journal.pone.0153145
urn:nbn:de:bvb:20-opus-179934
PLoS ONE 2016, 11(4):e0153145. DOI: 10.1371/journal.pone.0153145
false
true
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Rico Brendtke
Michael Wiehl
Florian Groeber
Thomas Schwarz
Heike Walles
Jan Hansmann
eng
uncontrolled
gels
eng
uncontrolled
microwave radiation
eng
uncontrolled
collagens
eng
uncontrolled
skin physiology
eng
uncontrolled
reflection
eng
uncontrolled
skin anatomy
eng
uncontrolled
epidermis
eng
uncontrolled
antennas
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/17993/Brendtke_Plos_One.PDF
17930
2019
deu
doctoralthesis
1
2019-04-15
--
2019-04-11
Einsatz der Raman-Spektroskopie zur Analyse der mitochondrialen Funktion im Ischämie-Reperfusions-Schaden des Herzens
Use of Raman spectroscopy for analyzing mitochondrial function in ischemia reperfusion injury of the heart
Der myokardiale Ischämie-Reperfusions-Schaden (IR) hat eine hohe Relevanz in der Kardiologie und Herzchirurgie. Trotz intensiver Forschung ist es bislang nicht gelungen, eine
effektive Therapie des IR in den klinischen Alltag zu implementieren.
Mitochondrien spielen im IR eine wichtige Rolle. Die Raman-Spektroskopie mit Laserquellen von 785 nm Wellenlänge erlaubt die nicht-invasive Analyse pathophysiologischer Prozesse in vitro in Echtzeit. Daher eignet sich die Raman-spektroskopische Analyse von Mitochondrien möglicherweise dazu, notwendige neue Einblicke in die Pathophysiologie des myokardialen IR zu gewinnen.
Die vorliegende Arbeit analysierte die mitochondriale Funktion von subsarkolemmalen Mitochondrien im IR mit Hilfe bekannter Methoden. Anschließend erfolgte ein Vergleich der etablierten Methode „Clark-Elektrode“ mit der neu etablierten Raman-Spektroskopie zur Analyse der mitochondrialen Funktion im IR.
Myocardial ischemia reperfusion injury (IR) has a high relevance in cardiology and heart surgery. Despite intense research, an effective treatment of IR has to date not been implemented in clinical routine.
Mitochondria play an important role in IR. Raman spectroscopy with 785 nm laser wavelength permits the non-invasive analysis of pathophysiological processes in vitro and real-time. Therefore, Raman-spectroscopic analysis of mitochondria might be able to create new necessary insights in the pathophysiology of myocardial ischemia reperfusion injury.
This work analysed mitochondrial function of subsarcolemmal mitochondria in IR using well-established methods. Afterwards, a comparison of the well-established method “Clark-Elektrode” with freshly established raman spectroscopy was performed to analyse the mitochondrial function in IR.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-179302
10.25972/OPUS-17930
X 128127
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Simon Ruppert
deu
swd
Ischämie
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swd
Reperfusion
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swd
Raman-Spektroskopie
Medizin und Gesundheit
open_access
Klinik und Poliklinik für Thorax-, Herz- u. Thorakale Gefäßchirurgie
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/17930/Ruppert_Simon_Raman_Spektroskopie_Ischaemie_Reperfusion.pdf
17412
2019
eng
doctoralthesis
1
2018-12-13
--
2018-12-12
Establishment of a 3D tumour model and targeted therapy of BRAF-mutant colorectal cancer
Entwicklung eines 3D Tumormodells und zielgerichtete Behandlung von BRAF-mutiertem kolorektalen Karzinom
Cancer remains after cardiovascular diseases the leading cause of death worldwide and an estimated 8.2 million people died of it in 2012. By 2030, 13 million cancer deaths are expected due to the growth and ageing of the population. Hereof, colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer in men and the second in women with a wide geographical variation across the world. Usually, CRC begins as a non-cancerous growth leading to an adenomatous polyp, or adenoma, arising from glandular cells. Since research has brought about better understanding of the mechanisms of cancer development, novel treatments such as targeted therapy have emerged in the past decades. Despite that, up to 95% of anticancer drugs tested in clinical phase I trials do not attain a market authorisation and hence these high attrition rates remain a key challenge for the pharmaceutical industry, making drug development processes enormously costly and inefficient. Therefore, new preclinical in vitro models which can predict drug responses in vivo more precisely are urgently needed. Tissue engineering not only provides the possibility of creating artificial three-dimensional (3D) in vitro tissues, such as functional organs, but also enables the investigation of drug responses in pathological tissue models, that is, in 3D cancer models which are superior to conventional two-dimensional (2D) cell cultures on petri dishes and can overcome the limitations of animal models, thereby reducing the need for preclinical in vivo models. In this thesis, novel 3D CRC models on the basis of a decellularised intestinal matrix were established. In the first part, it could be shown that the cell line SW480 exhibited different characteristics when grown in a 3D environment from those in conventional 2D culture. While the cells showed a mesenchymal phenotype in 2D culture, they displayed a more pronounced epithelial character in the 3D model. By adding stromal cells (fibroblasts), the cancer cells changed their growth pattern and built tumour-like structures together with the fibroblasts, thereby remodelling the natural mucosal structures of the scaffold. Additionally, the established 3D tumour model was used as a test system for treatment with standard chemotherapeutic 5-fluorouracil (5-FU). The second part of the thesis focused on the establishment of a 3D in vitro test system for targeted therapy. The US Food and Drug Administration has already approved of a number of drugs for targeted therapy of specific types of cancer. For instance, the small molecule vemurafenib (PLX4032, Zelboraf™) which demonstrated impressive response rates of 50–80% in melanoma patients with a mutation of the rapidly accelerated fibrosarcoma oncogene type B (BRAF) kinase which belongs to the mitogen active protein kinase (MAPK) signalling pathway. However, only 5% of CRC patients harbouring the same BRAF mutation respond to treatment with vemurafenib. An explanation for this unresponsiveness could be a feedback activation of the upstream EGFR, reactivating the MAPK pathway which sustains a proliferative signalling. To test this hypothesis, the two early passage cell lines HROC24 and HROC87, both presenting the mutation BRAF V600E but differing in other mutations, were used and their drug response to vemurafenib and/or gefitinib was assessed in conventional 2D cell culture and compared to the more advanced 3D model. Under 3D culture conditions, both cell lines showed a reduction of the proliferation rate only in the combination therapy approach. Furthermore, no significant differences between the various treatment approaches and the untreated control regarding apoptosis rate and viability for both cell lines could be found in the 3D tumour model which conferred an enhanced chemoresistance to the cancer cells. Because of the observed unresponsiveness to BRAF inhibition by vemurafenib as can be seen in the clinic for patients with BRAF mutations in CRC, the cell line HROC87 was used for further xenografting experiments and analysis of activation changes in the MAPK signalling pathway. It could be shown that the cells presented a reactivation of Akt in the 3D model when treated with both inhibitors, suggesting an escape mechanism for apoptosis which was not present in cells cultured under conventional 2D conditions. Moreover, the cells exhibited an activation of the hepatocyte growth factor receptor (HGFR, c-Met) in 2D and 3D culture, but this was not detectable in the xenograft model. This shows the limitations of in vivo models. The results suggest another feedback activation loop than that to the EGFR which might not primarily be involved in the resistance mechanism. This reflects the before mentioned high attrition rates in the preclinical drug testing.
Krebs ist nach Herz- und Kreislauferkrankungen die führende Todesursache weltweit und 2012 starben daran geschätzt 8,2 Millionen Menschen. Für das Jahr 2030 werden 13 Millionen Krebstote erwartet, was auf das Bevölkerungswachstum und deren Überalterung zurückzuführen ist. Dabei ist das kolorektale Karzinom (engl. colorectal cancer, CRC) der dritthäufigste Krebs bei Männern und der zweithäufigste bei Frauen. Für gewöhnlich entwickelt sich CRC aus einem nicht-kanzerösen Wachstum, das zu einem adenomatösen Polyp bzw. Adenom führt, welches aus Drüsenzellen hervorgeht. Da die Forschung in den vergangenen Jahrzehnten ein besseres Verständnis für die Mechanistik der Krebsentstehung hervorgebracht hat, entstanden neuartige Behandlungsformen, wie die zielgerichtete Krebstherapie. Hohe Versagensraten, welche den Medikamentenentwicklungsprozess sehr kostenaufwendig und ineffizient machen, bleiben eine entscheidende Herausforderung für die pharmazeutische Industrie. Deshalb werden dringend neue präklinische in vitro Modelle, die bessere in vivo Wirkungsvorhersagen liefern, benötigt. Das Tissue Engineering bietet die Möglichkeit künstliche dreidimensionale (3D) in vitro Gewebe herzustellen, z.B. funktionelle Organe, aber es ermöglicht auch, die Reaktion auf ein Medikament in pathologischen Gewebemodellen, wie beispielsweise Krebsmodelle, zu untersuchen. Diese sind der konventionellen zweidimensionalen (2D) Zellkultur in Petrischalen überlegen und können die begrenzten Möglichkeiten von Tiermodellen erweitern, was zudem die Notwendigkeit für präklinische in vivo Modelle vermindert. In der vorliegenden Arbeit wurden neuartige 3D CRC Modelle auf Basis einer dezellularisierten intestinalen Matrix entwickelt. Im ersten Teil konnte gezeigt werden, dass die Zelllinie SW480 verschiedene Charakteristika bezüglich des Wachstums in der konventionellen 2D Zellkultur oder der 3D Umgebung aufwies. Im Gegensatz zu den mesenchymalen Eigenschaften der Zellen in der 2D Zellkultur, zeigten sie im 3D Modell einen betonteren epithelialen Charakter. Durch das Hinzufügen von Fibroblasten änderten die Krebszellen ihr Wachstumsverhalten und sie bildeten zusammen tumorartige Strukturen aus, wobei die natürlichen Strukturen der Darmmatrix, Krypten und Villi, umgebaut wurden. Zusätzlich wurde das entwickelte 3D Tumormodell als Testsystem für das Standardchemotherapeutikum 5-Fluorouracil (5-FU) herangezogen. Der zweite Teil der Dissertation konzentrierte sich auf die Entwicklung eines 3D in vitro Testsystems für die zielgerichtete Behandlung. Es gibt schon eine Reihe von der US Food and Drug Administration zugelassenen Medikamente für die zielgerichtete Behandlung spezifischer Tumorentitäten, wie z.B. Vemurafenib (PLX4032, Zelboraf™), das eindrucksvolle Ansprechraten von 50–80% bei Melanompatienten mit BRAF-Mutation erzielt. Trotzdem sprechen nur 5% der CRC-Patienten mit der gleichen BRAF-Mutation auf die Behandlung mit Vemurafenib an. Gründe für diese Unempfindlichkeit könnte eine Rückkoppelung zum aufwärtsgelegenen EGFR sein, der das Signal zur Proliferation aufrecht erhält. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden die zwei Zelllinien HROC24 und HROC87, die beide die BRAF V600E-Mutation tragen aber sich in anderen Mutationen unterscheiden, mit Vemurafenib und/oder Gefitinib behandelt und das Ansprechen auf die Substanzen in der herkömmlichen 2D Zellkultur sowie im fortschrittlicheren 3D Modell verglichen. In 3D Kulturbedingungen zeigten beide Zelllinien eine Senkung der Proliferation nur im Kombinationstherapie-Ansatz. Außerdem wurden bei den 3D Modellen keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Behandlungsansätzen und der unbehandelten Kontrolle, hinsichtlich der Apoptoserate und Viabilität, gefunden. Das deutet auf eine erhöhte Chemoresistenz der Krebszellen in der 3D Umgebung hin. Wegen der vorhandenen Unempfindlichkeit der Zelllinie HROC87 gegenüber der BRAF-Inhibierung mit Vemurafenib, wie es auch in der Klinik im Fall von Patienten mit BRAF-Mutation des CRC beobachtet werden kann, wurden diese Zellen für weitere Xenograft-Experimente und Analysen von Aktivierungsunterschieden im MAPK-Signaltransduktionsweg herangezogen. Weiterhin zeigten die Zellen eine Aktivierung des „hepatocyte growth factor receptor“ (HGFR, c-Met) in 2D und 3D Zellkultur, der jedoch nicht im Xenograft-Modell zu sehen war, was die limitierte Übertragbarkeit von Ergebnissen des Tiermodells auf den Menschen verdeutlicht. Dies spiegelt wiederum die obenstehend erwähnten hohen Versagensraten in der präklinischen Medikamententestung wider. Zusammengefasst kann das Tissue Engineering Möglichkeiten zur Herstellung und Entwicklung neuartiger 3D Testsysteme bieten, welche besser die in vivo Situation abbilden. Für eine Medikamententestung in Übereinstimmung mit personalisierter Medizin eröffnet das 3D Tumormodell vielversprechende Wege, welche in Zukunft das präklinische Screening verbessern sowie die hohen Versagensraten und Tierversuche vermindern könnten.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-174129
10.25972/OPUS-17412
X 128494
CC BY-NC: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Nicht kommerziell 4.0 International
Florentin Philipp Baur
deu
swd
Dickdarmtumor
deu
swd
Therapie
eng
uncontrolled
BRAF-mutant
eng
uncontrolled
colorectal cancer
eng
uncontrolled
targeted therapy
eng
uncontrolled
3D tumour model
deu
uncontrolled
BRAF-mutiert
deu
uncontrolled
kolorektales Karzinom
deu
uncontrolled
zielgerichtete Behandlung
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uncontrolled
3D Tumormodell
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swd
In vitro
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uncontrolled
3D
deu
uncontrolled
tumour
Biowissenschaften; Biologie
open_access
Fakultät für Biologie
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/17412/Baur_Florentin_Dissertation.pdf
12755
2013
eng
e1003846
10
9
article
1
2016-02-22
--
--
A GDF5 Point Mutation Strikes Twice - Causing BDA1 and SYNS2
Growth and Differentiation Factor 5 (GDF5) is a secreted growth factor that belongs to the Bone Morphogenetic Protein (BMP) family and plays a pivotal role during limb development. GDF5 is a susceptibility gene for osteoarthritis (OA) and mutations in GDF5 are associated with a wide variety of skeletal malformations ranging from complex syndromes such as acromesomelic chondrodysplasias to isolated forms of brachydactylies or multiple synostoses syndrome 2 (SYNS2). Here, we report on a family with an autosomal dominant inherited combination of SYNS2 and additional brachydactyly type A1 (BDA1) caused by a single point mutation in GDF5 (p.W414R). Functional studies, including chondrogenesis assays with primary mesenchymal cells, luciferase reporter gene assays and Surface Plasmon Resonance analysis, of the GDF5 W-414R variant in comparison to other GDF5 mutations associated with isolated BDA1 (p.R399C) or SYNS2 (p.E491K) revealed a dual pathomechanism characterized by a gain-and loss-of-function at the same time. On the one hand insensitivity to the main GDF5 antagonist NOGGIN (NOG) leads to a GDF5 gain of function and subsequent SYNS2 phenotype. Whereas on the other hand, a reduced signaling activity, specifically via the BMP receptor type IA (BMPR1A), is likely responsible for the BDA1 phenotype. These results demonstrate that one mutation in the overlapping interface of antagonist and receptor binding site in GDF5 can lead to a GDF5 variant with pathophysiological relevance for both, BDA1 and SYNS2 development. Consequently, our study assembles another part of the molecular puzzle of how loss and gain of function mutations in GDF5 affect bone development in hands and feet resulting in specific types of brachydactyly and SYNS2. These novel insights into the biology of GDF5 might also provide further clues on the pathophysiology of OA.
PLOS Genetics
10.1371/journal.pgen.1003846
1553-7404
urn:nbn:de:bvb:20-opus-127556
PLoS Genetics 9(10): e1003846. doi:10.1371/journal.pgen.1003846
Elisa Degenkolbe
Jana König
Julia Zimmer
Maria Walther
Carsten Reißner
Joachim Nickel
Frank Plöger
Jelena Raspopovic
James Sharpe
Katharina Dathe
Jacqueline T. Hecht
Stefan Mundlos
Sandra C. Doelken
Petra Seemann
eng
uncontrolled
dominant-negative mutatio
eng
uncontrolled
morphogenetic protein receptors
eng
uncontrolled
brachtydacyly type A2
eng
uncontrolled
BMP
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uncontrolled
gene encoding noggin
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uncontrolled
growth factor beta
eng
uncontrolled
signal tranduction
eng
uncontrolled
molecular mechanism
eng
uncontrolled
crystal-structure
eng
uncontrolled
differentiation
Menschliche Anatomie, Zytologie, Histologie
open_access
Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/12755/059_Degenkolbe_Plos_Genetics.pdf
12456
2012
eng
e3977
63
article
1
2016-01-19
--
--
Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy
Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 °C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 °C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.
Journal of Visual Expression
10.3791/3977
urn:nbn:de:bvb:20-opus-124569
Journal of Visual Expression (63), e3977, doi:10.3791/3977 (2012)
Miriam Votteler
Daniel A. Carvajal Berrio
Marieke Pudlas
Heike Walles
Katja Schenke-Layland
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uncontrolled
tissue engineering
eng
uncontrolled
label-free analysis
eng
uncontrolled
raman spectroscopy
eng
uncontrolled
bioengineering
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uncontrolled
living cells
eng
uncontrolled
extracellular matrix
Licht, Infrarot- und Ultraviolettphänomene
Analytische Chemie
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/12456/jove-63-3977.pdf
12473
2012
eng
725-735
3
347
article
1
2016-01-21
--
--
In situ guided tissue regeneration in musculoskeletal diseases and aging
In situ guided tissue regeneration, also addressed as in situ tissue engineering or endogenous regeneration, has a great potential for population-wide “minimal invasive” applications. During the last two decades, tissue engineering has been developed with remarkable in vitro and preclinical success but still the number of applications in clinical routine is extremely small. Moreover, the vision of population-wide applications of ex vivo tissue engineered constructs based on cells, growth and differentiation factors and scaffolds, must probably be deemed unrealistic for economic and regulation-related issues. Hence, the progress made in this respect will be mostly applicable to a fraction of post-traumatic or post-surgery situations such as big tissue defects due to tumor manifestation. Minimally invasive procedures would probably qualify for a broader application and ideally would only require off the shelf standardized products without cells. Such products should mimic the microenvironment of regenerating tissues and make use of the endogenous tissue regeneration capacities. Functionally, the chemotaxis of regenerative cells, their amplification as a transient amplifying pool and their concerted differentiation and remodeling should be addressed. This is especially important because the main target populations for such applications are the elderly and diseased. The quality of regenerative cells is impaired in such organisms and high levels of inhibitors also interfere with regeneration and healing. In metabolic bone diseases like osteoporosis, it is already known that antagonists for inhibitors such as activin and sclerostin enhance bone formation. Implementing such strategies into applications for in situ guided tissue regeneration should greatly enhance the efficacy of tailored procedures in the future.
Cell and Tissue Research
10.1007/s00441-011-1237-z
urn:nbn:de:bvb:20-opus-124738
Cell Tissue Research (2012) 347:725–735. DOI 10.1007/s00441-011-1237-z
241719
Franz Jakob
Regina Ebert
Maximilian Rudert
Ulrich Nöth
Heike Walles
Denitsa Docheva
Matthias Schieker
Lorenz Meinel
Jürgen Groll
eng
uncontrolled
in situ guided tissue regeneration
eng
uncontrolled
stem cells
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uncontrolled
scaffolds
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uncontrolled
regenerative medicine
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uncontrolled
mesenchymal tissues
Krankheiten
open_access
Lehrstuhl für Orthopädie
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
OpenAIRE
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/12473/Jakob2Fs00441-011-1237-z.pdf
12555
2015
eng
77
13
article
1
2016-01-26
--
--
GDF-5 can act as a context-dependent BMP-2 antagonist
Background
Bone morphogenetic protein (BMP)-2 and growth and differentiation factor (GDF)-5 are two related transforming growth factor (TGF)-β family members with important functions in embryonic development and tissue homeostasis. BMP-2 is best known for its osteoinductive properties whereas GDF-5—as evident from its alternative name, cartilage derived morphogenetic protein 1—plays an important role in the formation of cartilage. In spite of these differences both factors signal by binding to the same subset of BMP receptors, raising the question how these different functionalities are generated. The largest difference in receptor binding is observed in the interaction with the type I receptor BMPR-IA. GDF-5, in contrast to BMP-2, shows preferential binding to the isoform BMPR-IB, which is abrogated by a single amino acid (A57R) substitution. The resulting variant, GDF-5 R57A, represents a “BMP-2 mimic” with respect to BMP receptor binding. In this study we thus wanted to analyze whether the two growth factors can induce distinct signals via an identically composed receptor.
Results
Unexpectedly and dependent on the cellular context, GDF-5 R57A showed clear differences in its activity compared to BMP-2. In ATDC-5 cells, both ligands induced alkaline phosphatase (ALP) expression with similar potency. But in C2C12 cells, the BMP-2 mimic GDF-5 R57A (and also wild-type GDF-5) clearly antagonized BMP-2-mediated ALP expression, despite signaling in both cell lines occurring solely via BMPR-IA. The BMP-2- antagonizing properties of GDF-5 and GDF-5 R57A could also be observed in vivo when implanting BMP-2 and either one of the two GDF-5 ligands simultaneously at heterotopic sites.
Conclusions
Although comparison of the crystal structures of the GDF-5 R57A:BMPR-IAEC- and BMP-2:BMPR-IAEC complex revealed small ligand-specific differences, these cannot account for the different signaling characteristics because the complexes seem identical in both differently reacting cell lines. We thus predict an additional component, most likely a not yet identified GDF-5-specific co-receptor, which alters the output of the signaling complexes. Hence the presence or absence of this component then switches GDF-5′s signaling capabilities to act either similar to BMP-2 or as a BMP-2 antagonist. These findings might shed new light on the role of GDF-5, e.g., in cartilage maintenance and/or limb development in that it might act as an inhibitor of signaling events initiated by other BMPs.
BMC Biology
10.1186/s12915-015-0183-8
urn:nbn:de:bvb:20-opus-125550
BMC Biology (2015) 13:77 DOI 10.1186/s12915-015-0183-8
Uwe Klammert
Thomas D. Müller
Tina V. Hellmann
Kristian K. Wuerzler
Alexander Kotzsch
Anna Schliermann
Werner Schmitz
Alexander C. Kuebler
Walter Sebald
Joachim Nickel
eng
uncontrolled
growth and differentiation factor 5
eng
uncontrolled
ligand-receptor complex
eng
uncontrolled
crystal structure
eng
uncontrolled
antagonist
Biowissenschaften; Biologie
open_access
Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Plastische Gesichtschirurgie
Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften
Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Förderzeitraum 2015
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/12555/Nickel_10.1186_s12915-015-0183-8.pdf
11830
2014
eng
276
6
article
1
2015-08-21
--
--
Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection
The enteric nervous system (ENS) poses the intrinsic innervation of the gastrointestinal tract and plays a critical role for all stages of postnatal life. There is increasing scientific and clinical interest in acquired or age-related gastrointestinal dysfunctions that can be manifested in diseases such as gut constipation or fecal incontinence. In this study, we sought to analyze age-dependent changes in the gene expression profile of the human ENS, particularly in the myenteric plexus. Therefore, we used the laser microdissection technique which has been proven as a feasible tool to analyze distinct cell populations within heterogeneously composed tissues. Full biopsy gut samples were prepared from children (4–12 months), middle aged (48–58 years) and aged donors (70–95 years). Cryosections were histologically stained with H&E, the ganglia of the myenteric plexus identified and RNA isolated using laser microdissection technique. Quantitative PCR was performed for selected neural genes, neurotransmitters and receptors. Data were confirmed on protein level using NADPH-diaphorase staining and immunohistochemistry. As result, we demonstrate age-associated alterations in site-specific gene expression pattern of the ENS. Thus, in the adult and aged distal parts of the colon a marked decrease in relative gene expression of neural key genes like NGFR, RET, NOS1 and a concurrent increase of CHAT were observed. Further, we detected notable regional differences of RET, CHAT, TH, and S100B comparing gene expression in aged proximal and distal colon. Interestingly, markers indicating cellular senescence or oxidative stress (SNCA, CASP3, CAT, SOD2, and TERT) were largely unchanged within the ENS. For the first time, our study also describes the age-dependent expression pattern of all major sodium channels within the ENS. Our results are in line with previous studies showing spatio-temporal differences within the mammalian ENS.
Frontiers in Aging Neuroscience
10.3389/fnagi.2014.00276
1663-4365
urn:nbn:de:bvb:20-opus-118308
Frontiers in Aging Neuroscience 6:276. doi:10.3389/fnagi.2014.00276
Susan Hetz
Ali Acikgoez
Corinna Moll
Heinz-Georg Jahnke
Andrea A. Robitzki
Roman Metzger
Marco Metzger
eng
uncontrolled
enteric nervous system
eng
uncontrolled
myenteric plexus
eng
uncontrolled
aging
eng
uncontrolled
sodium channels
eng
uncontrolled
laser microdissection
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/11830/018_Hetz_Frontiers_in_aging_neuroscience.pdf
21909
2021
deu
doctoralthesis
1
2020-12-17
--
2020-12-14
Markierung von humanen mesenchymalen Stammzellen mit für die Magnet-Partikel-Spektroskopie geeigneten Eisenoxidnanopartikeln, Untersuchung des Zellverhaltens in dreidimensionaler Umgebung und nicht-invasive Analyse mittels Raman-Spektroskopie
Labeling of human mesenchymal stem cells using iron oxide nanoparticles which are traceable by magnetic particle spectroscopy, examination of cell behaviour in a 3D environment and non-invasive analysis using raman spectroscopy
Stem cell research has already been challenged for years by the question how to design tissues or even whole organs in vitro. Human mesenchymal stem cells (hMSC) seem to be very promising for this task as they can be extracted in many cases directly from the recipient. Thus potential graft rejections are avoided. For further research on the behaviour of stem cells in vivo it is essential to be able to track them non-invasively. This is for example possible by Magnetic Particle Imaging (MPI). For this purpose stem cells have to be labelled with a suitable substance, for example with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Presently there are no SPION approved by FDA or EMA that are able to enter hMSC without transfection agent (TA). Therefore the aim of this dissertation was to identify at least one SPION that possesses an optimal interaction with hMSC and can be tracked by MPI as well as by Raman-Spectroscopy. Furthermore the identified SPION should be detectable for a longer period of time and should not have any influence on hMSC. This dissertation was performed within the framework of the EU-wide `IDEA-project´. hMSC have been labelled with the iron oxide nanoparticles M4E, M4F, M4F2 and M3A-PDL in varying concentrations. For M3A-PDL and M4E examinations were done with concentrations of 0.5 mg/ml in standard cell culture as well as in a three-dimensional environment on a matrix of small intestinal submucosae (SIS-ser). Furthermore chondrogenic differentiation of M4E labelled hMSC was examined. Additionally Magnetic Particle Spectroscopy (MPS) and Raman-Spectroscopy were used as non-invasive detection systems. Histologically SPION uptake was proven by Prussian blue staining. Cell viability and proliferation were examined by Trypan blue staining and Ki67 antibody staining. In order to prove that also labelled cells proliferate, a special staining protocol combining Prussian blue and immunohistochemical stainings was established. The success of chondrogenic differentiation was histologically verified by Alcian blue staining, Aggrecan and Collagen II antibody staining. It could be demonstrated, that M4E has a very good cell-particle interaction when used for labelling hMSC. In contrast to M3A, which is only taken up into hMSC when covered by a TA, M4E can be used without TA.
Both particles do not influence cell viability or proliferation. M4F and M4F2 are not suitable to lable hMSC. SPION could be detected at least for four weeks after labelling in a three-dimensional environment which is significantly longer than the maximum detection time of two weeks in cell culture. Chondrogenic differentiation is influenced by cell labelling with 0.5 mg/ml M4E. M3A-PDL can be detected by MPS. Raman-Spectroscopy is suitable to differentiate between M3A-PDL labelled and unlabelled hMSC. This dissertation has been able to identify an iron oxide nanoparticle with an excellent cell-particle interaction that allows intense cell labelling without TA and can be detected by MPS. In further studies at the institute it could already be shown that Raman-Spectroscopy can differentiate also between
M4E labelled and unlabelled cells. However, chondrogenic differentiation of hMSC was inhibited in this dissertation. In literature several authors came to the conclusion that there is a dose-dependent inhibition of differentiation. Therefore further experiments are necessary to find out whether inhibition of differentiation might be less immanent when using smaller SPION concentrations. Additionally it should be evaluated if smaller SPION concentrations remain detectable by MPS for several weeks. Finally further studies should be done in testing systems that are more similar to the situation in vivo. Such systems are for example the dynamic environment of a BioVaSc-TERM®. This is important to make better predictions of the behaviour of labelled hMSC in vivo.
Die Stammzellforschung beschäftigt sich bereits seit Jahren mit der Frage, wie Gewebe oder sogar Organe im Labor hergestellt werden können. Als besonders vielversprechend erscheinen hierfür humane Mesenchymale Stammzellen (hMSC), da diese in vielen Fällen direkt vom Empfänger gewonnen werden können und so keine Organ- oder Gewebeabstoßung durch Abwehrreaktionen zu erwarten ist. Für die weitere Erforschung des Verhaltens von Stammzellen in vivo ist es notwendig, diese nicht-invasiv darstellen zu können. Dies ist zum Beispiel mittels Magnetischer Partikel Bildgebung (MPI) möglich. Hierfür müssen die Stammzellen mit einer geeigneten Substanz markiert werden. Eine solche sind beispielsweise superparamagnetische Eisenoxidnanopartikel (SPION). Derzeit gibt es keine von den medizinischen Zulassungsbehörden zugelassenen SPION die ohne TA in hMSC aufgenommen werden. In der hier vorliegenden Arbeit sollte also im Rahmen des
EU-weiten „IDEA-Projekts“ ein geeigneter SPION identifiziert werden, der eine optimale Zell-Partikel-Interaktion aufweist und sowohl mittels MPI als auch mit Raman-Spektroskopie nachweisbar ist. Zudem sollte die Nachweisbarkeit des SPION über einen längeren Zeitraum gegeben und kein Einfluss auf die hMSC feststellbar sein. Es wurden hMSC mit den Eisenoxidnanopartikeln M4E, M4F, M4F2 und M3A-PDL in unterschiedlichen Konzentrationen markiert. Für M3A-PDL und M4E erfolgten bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml Untersuchungen in Zellkultur sowie auf SIS-ser als Matrix im 3D-Modell. Desweiteren wurde das Differenzierungsverhalten der mit M4E markierten hMSC bei chondrogener Differenzierung untersucht. Außerdem kamen Magnetische Partikel Spektroskopie (MPS) und Raman-Spektroskopie als nicht-invasive Nachweisverfahren zum Einsatz. Der SPION-Nachweis erfolgte histologisch mittels Berliner Blau Färbung. Untersuchungen zu Zellviabilität und Proliferation erfolgten durch Trypanblau sowie Ki67-Antikörper-Färbung. Um Nachzuweisen ob auch markierte Zellen proliferieren wurde eigens ein kombiniertes Färbeprotokoll zur Kombination von Berliner Blau und immunhistochemischer Färbung
etabliert. Der Erfolg der chrondrogenen Differenzierung wurde mittels Alcianblau, Aggrecan- und Kollagen-II-Antikörper Färbung überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass M4E bei der Markierung von hMSC eine sehr gute Zell-Partikel-Interaktion aufweist und im Gegensatz zu M3A auch ohne TA in die Zellen aufgenommen wird. Durch beide Partikel werden Zellviabilität und Proliferation nicht beeinflusst. M4F sowie M4F2 ist zur Markierung nicht geeignet. Die Markierung ließ sich im 3D-Modell mit vier Wochen deutlich länger nachweisen als in 2D Zellkultur mit maximal zwei Wochen. Die chondrogene Differenzierung wird durch die Markierung mit 0,5 mg/ml M4E beeinflusst. M3A-PDL sind durch MPS nachweisbar. Die Raman-Spektroskopie eignet sich zur Differenzierung zwischen mit M3A-PDL markierten und unmarkierten hMSC. Es ist im Rahmen dieser Arbeit gelungen, einen
Eisenoxidnanopartikel mit hervorragender Zell-Partikel-Interaktion zu identifizieren, der ohne zusätzliches TA eine intensive Markierung der hMSC ermöglicht und mit MPS nachweisbar ist. Für M4E konnte in weiteren Arbeiten am Institut bereits gezeigt werden, dass auch eine Differenzierung zwischen markierten und unmarkierten Zellen mittels Raman-Spektroskopie möglich ist. Die chondrogene Differenzierung der hMSC wurde in der vorliegenden Arbeit allerdings beeinträchtigt. In der Literatur finden sich Hinweise auf eine dosisabhängige Inhibition der Differenzierung. Es sind daher weitere Versuche notwendig, um herauszufinden, ob die Inhibition der Differenzierung möglicherweise bei geringerer SPION-Konzentration weniger ausgeprägt ist. Zudem sollte untersucht werden, ob auch geringere Konzentrationen in den Zellen über mehrere Wochen mittels MPS nachweisbar bleiben. Desweiteren sollten Untersuchungen in, der in vivo Situation ähnlicheren,
Systemen, wie dem dynamischen Umfeld einer BioVaSc-TERM® durchgeführt werden um bessere Vorhersagen zum Verhalten markierter hMSC in vivo treffen zu können.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-219095
10.25972/OPUS-21909
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X 129144
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Katrin Barbara von der Assen [geb. Weiß]
deu
swd
Stammzellforschung
deu
uncontrolled
Eisenoxid-Nanopartikel
deu
uncontrolled
Magnet-Partikel-Spektroskopie
deu
uncontrolled
Raman-Spektroskopie
deu
uncontrolled
3D-Kultur
deu
uncontrolled
humane mesenchymale Stammzellen
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/21909/vonderAssen_Katrin_Dissertation.pdf
24013
2021
eng
doctoralthesis
1
2021-06-16
--
2021-06-14
Effect of Mechanical Stress On Stem Cells to Improve Better Bone Regeneration
Die Auswirkung von mechanischer Belastung auf Stammzellen zur Verbesserung der Knochenregeneration
Critical size bone defects and nonunion fractures remain difficult to treat. Although cell‐loaded bone substitutes have improved bone ingrowth and formation, the lack of methods for achieving viability and the uniform distribution of cells in the scaffold limits their use as bone grafts. In addition, the predominant mechanical stimulus that drives early osteogenic cell maturation has not been clearly identified. Further, it is challenging to evaluate mechanical stimuli (i.e., deformation and fluid–flow-induced shear stress) because they are interdependent. This thesis compares different mechanical stimuli applied to cell-seeded scaffolds to develop bone grafts efficiently for the treatment of critical size bone defects. It also seeks to understand how deformation strain and interstitial fluid–flow-induced shear stress promote osteogenic lineage commitment. In this thesis, different scaffolds were seeded with primary human bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) from different donors and subjected to static and dynamic culture conditions. In contrast with the static culture conditions, homogenous cell distributions were accomplished under dynamic culture conditions. Additionally, the induction of osteogenic lineage commitment without the addition of soluble factors was observed in the bioreactor system after one week of cell culture. To determine the role of mechanical stimuli, a bioreactor was developed to apply mechanical deformation force to a mesenchymal stem sell (MSC) line (telomerase reverse transcriptase (TERT)) expressing a strain-responsive AP-1 luciferase reporter construct on porous scaffolds. Increased luciferase expression was observed in the deformation strain compared with the shear stress strain. Furthermore, the expression of osteogenic lineage commitment markers such as osteonectin, osteocalcin (OC), osteopontin, runt-related transcription factor 2 (RUNX2), alkaline phosphate (AP), and collagen type 1 was significantly downregulated in the shear stress strain compared with the deformation strain. These findings establish that the deformation strain was the predominant stimulus causing skeletal precursors to undergo osteogenesis in earlier stages of osteogenic cell maturation. Finally, these findings were used to develop a bioreactor in vitro test system in which the effect of medication on osteoporosis could be tested. Primary human BM-MSCs from osteoporotic donors were subjected to strontium ranelate (an osteoporotic drug marketed as Protelos®). Increased expression of collagen type 1 and calcification was seen in the drugtreated osteoporotic stem cells compared with the nondrug-treated osteoporotic stem cells. Thus, this bioreactor technology can easily be adapted into an in vitro osteoporotic drug testing system.
Knochendefekte kritischer Größe und Frakturen mit Pseudoarthrose bleiben schwierig zu behandeln. Obwohl zellbeladene Knochenersatzprodukte das Einwachsen und die Bildung von Knochen verbessert haben, schränken fehlende Methoden zur Erreichung der Lebensfähigkeit und der gleichmäßigen Verteilung der Zellen im Gerüst die Verwendung von Knochenersatzprodukten als Knochentransplantate ein. Ebenfalls konnte der vorherrschende mechanische Reiz, der die frühe osteogene Zellreifung antreibt nicht eindeutig identifiziert werden. Ferner ist es schwierig, mechanische Reize (d. H. Verformung und durch Flüssigkeitsströmung induzierte Scherbeanspruchung) zu bewerten, da diese Größen sie voneinander abhängig sind. Diese Arbeit vergleicht die Auswirkung verschiedener mechanischer Reize auf mit Zellen besiedelte Gerüste, um herauszufinden, ob Knochentransplantate effizient entwickelt werden können damit sie für die Behandlung von Knochendefekten einsetzbar sind. Des Weiteren wird versucht zu verstehen, wie Verformungsdehnung und durch interstitielle Flüssigkeitsströmung induzierte Scherbeanspruchung die Bindung osteogener Linien fördern. In dieser Arbeit wurden verschiedene Gerüste mit primären mesenchymalen Knochenmarkstammzellen (BM-MSCs) von verschiedenen Spendern ausgesät und statischen und dynamischen Kulturbedingungen ausgesetzt. Im Gegensatz zu den statischen Kulturbedingungen wurde unter dynamischen Kulturbedingungen eine homogene Zellverteilungen erreicht. Zusätzlich wurde im Bioreaktorsystem nach einer Woche Zellkultur eine Formung einer osteogenen Linienbindung auch ohne Zusätze von löslichen Faktoren beobachtet. Um die Rolle mechanischer Stimuli zu bestimmen, wurde ein Bioreaktor entwickelt, um auf porösen Scaffolds eine mechanische Verformungskraft auf eine mesenchymale Stammzelllinie (MSC) (Telomerase Reverse Transkriptase (TERT)) auszuüben. Diese exprimiert ein auf Dehnung ansprechendes AP-1-Luciferase-Reporterkonstrukt. Eine erhöhte LuciferaseExpression wurde in der Verformungsdehnung im Vergleich zur Scherspannungsdehnung beobachtet. Darüber hinaus war die Expression von osteogenen Linien Marker wie Osteonektin, Osteocalcin (OC), Osteopontin, Runt-verwandtem Transkriptionsfaktor 2 (RUNX2), alkalischem Phosphat (AP) und Kollagen Typ 1 in der Scherbeanspruchungsbelastung im Vergleich zur Verformungsdehnung signifikant herabreguliert. Diese Befunde belegen, dass die Verformungsdehnung der vorherrschende Stimulus war, der dazu führte, dass Skelettvorläufer in früheren Stadien der osteogenen Zellreifung eine Osteogenese durchliefen. Schließlich wurden diese Ergebnisse verwendet, um ein Bioreaktor-In-vitro-Testsystem zu entwickeln, in dem die Wirkung von Medikamenten auf Osteoporose getestet werden konnte. Primäre humane BM-MSCs von osteoporotischen Spendern wurden Strontiumranelat (einem als Protelos® vertriebenen Arzneimittel zur Therapie der Osteoporose) ausgesetzt. Eine erhöhte Expression von Kollagen Typ 1 und Verkalkung wurde in den mit Arzneimitteln behandelten osteoporotischen Stammzellen im Vergleich zu den nicht mit Arzneimitteln behandelten osteoporotischen Stammzellen beobachtet. Somit kann diese Bioreaktortechnologie leicht in ein in vitro Arzneimitteltestsystem angepasst werden.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-240134
10.25972/OPUS-24013
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X 129437
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Ramkumar Ramani Mohan
eng
uncontrolled
Bioreactor
eng
uncontrolled
Mechanical deformation
eng
uncontrolled
Scaffold bone implant
Medizin und Gesundheit
open_access
Graduate School of Life Sciences
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/24013/Ramani_Mohan_Thesis.pdf
24410
2022
eng
doctoralthesis
1
2021-09-01
--
2021-04-22
Establishment of an intestinal tissue model for pre-clinical screenings
Etablierung eines Darmgewebemodells für Präklinische Screenings
The small intestine represents a strong barrier separating the lumen from blood circulation thereby playing a major role in the absorption and the transport of pharmacological agents prior to their arrival on the respective target site. In order to gain more knowledge about specialized uptake mechanisms and risk assessment for the patient after oral admission of drugs, intestinal in vitro models demonstrating a close similarity to the in vivo situation are needed.
In the past, cell line-based in vitro models composed of Caco-2 cells cultured on synthetic cell carriers represented the “gold standard” in the field of intestinal tissue engineering. Expressive advantages of these models are a reproducible, cost-efficient and standardized model set up, but cell function can be negatively influenced by the low porosity or unwanted molecular adhesion effects of the artificial scaffold material. Natural extracellular matrices (ECM) such as the porcine decellularized small intestinal submucosa (SIS) are used as alternative to overcome some common drawbacks; however, the fabrication of these scaffolds is time- and cost-intensive, less well standardized and the 3Rs (replacement, reduction, refinement) principle is not entirely fulfilled. Nowadays, biopolymer-based scaffolds such as the bacterial nanocellulose (BNC) suggest an interesting option of novel intestinal tissue engineered models, as the BNC shows comparable features to the native ECM regarding fiber arrangement and hydrophilic properties. Furthermore, the BNC is of non-animal origin and the manufacturing process is faster as well as well standardized at low costs.
In this context, the first part of this thesis analyzed the BNC as alternative scaffold to derive standardized and functional organ models in vitro. Therefore, Caco-2 cells were cultured on two versions of BNC with respect to their surface topography, the unmodified BNC as rather smooth surface and the surface-structured BNC presenting an aligned fiber arrangement. As controls, Caco-2 in vitro models were set up on PET and SIS matrices. In this study, the BNC-based models demonstrated organ-specific properties comprising typical cellular morphologies, a characteristic tight junction protein expression profile, representative ultrastructural features and the formation of a tight epithelial barrier together with a corresponding transport activity. In summary, these results validated the high quality of the BNC-based Caco-2 models under cost-efficient conditions and their suitability for pre-clinical research purposes. However, the full functional diversity of the human intestine cannot be presented by Caco-2 cells due to their tumorigenic background and their exclusive representation of mature enterocytes.
Next to the scaffold used for the setup of in vitro models, the cellular unit mainly drives functional performance, which demonstrates the crucial importance of mimicking the cellular diversity of the small intestine in vitro. In this context, intestinal primary organoids are of high interest, as they show a close similarity to the native epithelium regarding their cellular diversity comprising enterocytes, goblet cells, enteroendocrine cells, paneth cells, transit amplifying cells and stem cells. In general, such primary organoids grow in a 3D Matrigel® based environment and a medium formulation supplemented with a variety of growth factors to maintain stemness, to inhibit differentiation and to stimulate cell migration supporting long term in vitro culture.
Intestinal primary spheroid/organoid cultures were set up as Transwell®-like models on both BNC variants, which resulted in a fragmentary cell layer and thereby unfavorable properties of these scaffold materials under the applied circumstances. As the BNC manufacturing process is highly flexible, surface properties could be adapted in future studies to enable a good cell adherence and barrier formation for primary intestinal cells, too. However, the application of these organoid cultures in pre-clinical research represents an enormous challenge, as the in vitro culture is complex and additionally time- and cost-intensive.
With regard to the high potential of primary intestinal spheroids/organoids and the necessity of a simplified but predictive model in pre-clinical research purposes, the second part of this thesis addressed the establishment of a primary-derived immortalized intestinal cell line, which enables a standardized and cost-efficient culture (including in 2D), while maintaining the cellular diversity of the organoid in vitro cultures. In this study, immortalization of murine and human intestinal primary organoids was induced by ectopic expression of a 10- (murine) or 12 component (human) pool of genes regulating stemness and the cell cycle, which was performed in cooperation with the InSCREENeX GmbH in a 2D- and 3D-based transduction strategy. In first line, the established cell lines (cell clones) were investigated for their cell culture prerequisites to grow under simplified and cost-efficient conditions. While murine cell clones grew on uncoated plastic in a medium formulation supplemented with EGF, Noggin, Y-27632 and 10% FCS, the human cell clones demonstrated the necessity of a Col I pre coating together with the need for a medium composition commonly used for primary human spheroid/organoid cultures. Furthermore, the preceding analyses resulted in only one human cell clone and three murine cell clones for ongoing characterization. Studies regarding the proliferative properties and the specific gene as well as protein expression profile of the remaining cell clones have shown, that it is likely that transient amplifying cells (TACs) were immortalized instead of the differentiated cell types localized in primary organoids, as 2D, 3D or Transwell®-based cultures resulted in slightly different gene expression profiles and in a dramatically reduced mRNA transcript level for the analyzed marker genes representative for the differentiated cell types of the native epithelium. Further, 3D cultures demonstrated the formation of spheroid-like structures; however without forming organoid-like structures due to prolonged culture, indicating that these cell populations have lost their ability to differentiate into specific intestinal cell types. The Transwell®-based models set up of each clone exhibit organ-specific properties comprising an epithelial-like morphology, a characteristic protein expression profile with an apical mucus-layer covering the villin-1 positive cell layer, thereby representing goblet cells and enterocytes, together with representative tight junction complexes indicating an integer epithelial barrier. The proof of a functional as well as tight epithelial barrier in TEER measurements and in vivo-like transport activities qualified the established cell clones as alternative cell sources for tissue engineered models representing the small intestine to some extent. Additionally, the easy handling and cell expansion under more cost-efficient conditions compared to primary organoid cultures favors the use of these newly generated cell clones in bioavailability studies.
Altogether, this work demonstrated new components, structural and cellular, for the establishment of alternative in vitro models of the small intestinal epithelium, which could be used in pre-clinical screenings for reproducible drug delivery studies.
Der Dünndarm bildet eine starke Barriere aus, welche das Lumen vom Blutkreislauf trennt, und dadurch maßgeblich an der Absorption und dem Transport von pharmakologischen Wirkstoffen beteiligt ist, bevor diese ihren Wirkort erreichen. Um ein detaillierteres Wissen über die speziellen Aufnahmemechanismen zu erlangen und zur Risikoabschätzung für den Patienten nach oraler Aufnahme dieser Medikamente, sind intestinale in vitro Modelle erforderlich, die eine große Ähnlichkeit mit der Situation in vivo aufweisen.
In der Vergangenheit stellten Caco-2 Zelllinien-basierte in vitro Modelle, die auf synthetischen Trägerstrukturen aufgebaut sind, den „Goldstandard“ auf dem Gebiet der intestinalen Geweberekonstruktion dar. Bedeutende Vorteile dieser Modelle sind der reproduzierbare, kosteneffiziente und standardisierte Modellaufbau, jedoch können die zellulären Funktionen durch die geringe Porosität oder die unerwünschten molekularen Adhäsionseffekte des künstlichen Trägermaterials negativ beeinflusst werden. Um einige häufige Nachteile zu überwinden werden natürliche extrazelluläre Matrizen (ECM) wie die porzine dezellularisierte Dünndarm-submukosa (SIS) verwendet, jedoch ist die Herstellung dieser Trägerstrukturen zeit- und kostenintensiv, weniger gut standardisiert und entspricht nicht ganzheitlich dem 3R-Prinzip (Replace = Vermeiden, Reduce = Verringern, Refine = Verbessern). Heutzutage ermöglichen biopolymer-basierte Trägerstrukturen wie die bakterielle Nanozellulose (BNC) die Entwicklung von neuartigen intestinalen Gewebemodellen, da die BNC eine große Ähnlichkeit hinsichtlich der Faseranordnung und der hydrophilen Eigenschaften mit der nativen ECM aufweist. Darüber hinaus ist die BNC nicht tierischen Ursprungs und der Herstellungsprozess schneller, gut standardisiert als auch kostengünstig.
In diesem Zusammenhang wurde im ersten Teil dieser Arbeit nachgewiesen, dass die BNC als alternative Trägerstruktur für standardisierte und funktionelle Organmodelle in vitro geeignet ist. Dafür wurden Caco-2 Zellen auf zwei Varianten der BNC kultiviert, die sich in ihrer Oberflächentopographie unterscheiden, wobei die nicht-modifizierte BNC eine glatte Oberfläche und die oberflächen-strukturierte BNC eine ausgerichtete Faseranordnung aufweist. Als Kontrollen dienten Caco 2 zellbasierte in vitro Modelle, die auf PET- oder SIS Matrizes aufgebaut wurden. In dieser Studie wiesen die BNC-basierten Modelle die wichtigsten organ-spezifischen Eigenschaften auf, darunter eine typische zelluläre Morphologie, ein charakteristisches Expressionsprofil der Tight Junction Proteine, repräsentative ultrastrukturelle Merkmale und die Bildung einer dichten epithelialen Barriere verbunden mit einer entsprechenden Transportaktivität. Zusammenfassend bestätigten diese Ergebnisse die hohe Qualität der BNC-basierten Caco-2 Modelle unter kosteneffizienten Herstellbedingungen und ihre Eignung für präklinische Forschungszwecke. Allerdings kann die volle Funktionsvielfalt des menschlichen Darms durch Caco-2 Zellen aufgrund ihres kanzerogenen Ursprungs und der exklusiven Repräsentanz von Enterozyten nicht abgebildet werden.
Neben der Trägerstruktur die für den Aufbau der in vitro Modelle verwendet wird, trägt auch die zelluläre Einheit zur Etablierung von funktionalen Modellen bei, weshalb es von großer Bedeutung ist, die zelluläre Vielfalt des Dünndarms in diesen Modellen in vitro nachzuahmen. In diesem Zusammenhang sind die primären intestinalen Organoide, die sich hauptsächlich aus Enterozyten, Becherzellen, enteroendokrinen Zellen, Paneth Zellen, Vorläuferzellen und Stammzellen zusammensetzen, von großem Interesse, da die zelluläre Komponente eine große Ähnlichkeit zum nativen Epithel aufweist. Derartige primäre Organoide werden üblicherweise in einer 3D-Matrigel® Umgebung und einer speziellen Formulierung des Mediums, die mit einer Vielzahl an Wachstumsfaktoren ergänzt wird, um das Stammzellpotenzial zu erhalten, die Differenzierung zu hemmen, die Zellmigration zu stimulieren und somit eine langfristige in vitro-Kultivierung zu unterstützt.
Intestinale primäre Sphäroid-/Organoidkulturen wurden auf beiden BNC Varianten als Transwell®-ähnliche Modelle aufgebaut. Dabei zeigte sich eine fragmentierte Zellschicht was darauf schließen lässt, dass die Matrix unter diesen Bedingungen für den Modellaufbau ungeeignet ist. Da der BNC-Herstellungsprozess sehr flexibel ist, könnten die Oberflächen-eigenschaften in zukünftigen Studien angepasst werden, um so eine gute Zelladhäsion auch für primäre Darmzellen zu ermöglichen. Die Anwendung dieser Organoid-basierten Kulturen stellt jedoch für die präklinische Forschung eine enorme Herausforderung dar, da die Kultivierung komplex und zudem sehr zeit- und kosten-intensiv ist.
Im Hinblick auf das hohe Potenzial der primären intestinalen Sphäroide/Organoide und der Notwendigkeit eines vereinfachten aber prädiktiven Modells für präklinische Forschungs-zwecke, befasste sich der zweite Teil der Arbeit mit der Etablierung einer primären immortalisierten intestinalen Zelllinie, die eine standardisierte und kosteneffiziente Kultur ermöglicht, wobei die zelluläre Vielfalt der in vitro Organoid-Kulturen erhalten bleibt. In dieser Studie wurden primäre Organoide aus dem murinen und dem menschlichen Dünndarm durch die ektopische Expression eines 10- (murin) bzw. 12 Komponenten (human) Pools von Genen, welche im Hinblick auf die Regulation der Stammzellen und dem Zellzyklus bekannt sind, in Zusammenarbeit mit der InSCREENeX GmbH in einer 2D- und 3D-basierten Transduktionsstrategie immortalisiert. In erster Linie wurden die etablierten Zelllinien (Zellklone) auf ihren Bedarf an Wachstumsfaktoren für die Kultivierung unter vereinfachten und kosteneffizienten Bedingungen hin untersucht. Während die murinen Zellklone auf unbeschichteten Kunststoff in einer Mediumformulierung mit hEGF, mNoggin, Y-27632 und 10% FCS wuchsen, zeigten die humanen Zellklone eine Notwendigkeit für eine Col I-Vorbeschichtung zusammen mit einer Zusammensetzung des Mediums, wie sie üblicherweise für primäre humane Sphäroide/Organoide verwendet wird. Darüber hinaus führten diese vorangegangenen Analysen dazu, dass nur ein humaner Zellklon und drei murine Zellklone umfänglich charakterisiert wurden. Studien zu proliferativen Eigenschaften und spezifischen Gen- sowie Proteinexpressionsprofilen dieser Klone haben gezeigt, dass vermutlich Vorläuferzellen (TACs) anstelle der differenzierten Zelltypen der primären Organoide immortalisiert wurden, da die Kultivierung in 2D, 3D oder in Transwell®-basierten Modellen zu einem geringfügig veränderten Genexpressionsprofil im Vergleich untereinander und zudem zu einem stark reduzierten mRNA-Transkriptionswert für die analysierten Markergene, welche die differenzierten Zelltypen des nativen Epithels repräsentieren, die Folge war. Weiterhin zeigte die 3D-Kultivierung die Bildung von Sphäroid-ähnlichen Strukturen, jedoch keine Organoid-ähnlichen Strukturen unter verlängerten Kultur-bedingungen, was darauf hinweist, dass diese Zellpopulationen ihre Eigenschaft zur Differenzierung hin zu spezifischen intestinalen Zelltypen eingebüßt haben. Die Transwell®-basierten Modelle, welche für jeden Klon etabliert wurden, weisen zudem Organ-spezifische Eigenschaften auf, wie eine epitheliale Morphologie, ein charakteristisches Protein-expressionsprofil mit einer apikalen Schleimschicht, welche den Villin-1 positiven Zelllayer bedeckt und somit den Nachweis erbringt, dass die entstandenen immortalisierten Zellpopulationen zu einem gewissen Anteil aus Becherzellen und Enterozyten bestehen. Zudem konnten repräsentative Tight-Junction Komplexe, die auf eine dichte epitheliale Barriere hinweisen, in entsprechenden Proteinexpressionsprofilanalysen nachgewiesen werden. Der Nachweis einer sowohl dichten als auch funktionellen epithelialen Barriere konnte weitergehend durch TEER-Messungen und in vivo-ähnliche Transportmechanismen für die etablierten Zellklone qualifiziert werden, wodurch diese Zellen als alternative Zellquelle für in vitro Modelle des Dünndarms verwendet werden können. Darüber hinaus begünstigt die einfache Handhabung und Zellexpansion unter kostengünstigeren Bedingungen im Vergleich zu primären Organoidkulturen den Einsatz dieser neu-generierten Zellklone für Bioverfügbarkeits-Studien.
Zusammenfassend zeigte diese Arbeit neue Komponenten, strukturelle und zelluläre, für die Etablierung alternativer in vitro-Modelle des Dünndarmepithels, die in präklinischen Screenings für reproduzierbare Studien hinsichtlich der Medikamententestung verwendet werden können.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-244107
10.25972/OPUS-24410
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X 129913
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Christina Fey
deu
swd
Dünndarm
deu
swd
In vitro
deu
swd
Tissue Engineering
eng
uncontrolled
intestinal in vitro model
eng
uncontrolled
bacterial nanocellulose
eng
uncontrolled
primary-cell-derived immortalized cell line
deu
uncontrolled
in vitro Modelle
deu
uncontrolled
Bakterielle Nanocellulose
deu
uncontrolled
Primär-basierte immortalisierte Zelllinie
Biowissenschaften; Biologie
open_access
Graduate School of Life Sciences
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/24410/Fey_Christina_Intestinal_tissue_model.pdf
24248
2021
deu
doctoralthesis
1
2021-07-30
--
2021-07-28
Entwicklung und Validierung eines quantitativen Verfahrens zur Beurteilung der Viabilität von entsprechend der GMP-Richtlinien hergestellter Knorpelimplantate für das Knie
Development and validation of a quantitative assay for a viability test of cultivated knee cartilage implants
Due to the reversing age pyramid in Germany, more and more people are already suffering from joint cartilage damage. But not only age, but also accidents and sports injuries and being overweight can lead to irreversible cartilage defects. Although there are various treatment options, the previous methods cannot be considered a permanent cure. As part of the international research project BIO-CHIP, a promising treatment method with novel drugs was to be investigated.
The patient's own cartilage cells from the nose serve as the starting material for the drug, a manufactured cartilage implant. These are isolated, multiplied and ultimately cultivated on a matrix to form a cartilage implant. In addition to toxicological and biological safety tests, an essential prerequisite for the approval of the implant is the assessment of the viability. This was previously carried out on the basis of histology from the pathology department.
The aim of the present work was the development and validation of a standardized and objective viability test for the chondrocytes within the cartilage matrix. For this, the LDH was used as a marker for irreversibly damaged cells. The LDH concentration could be measured with the CyQuant LDH assay by measuring the absorption. It could be proven that LDH has the required stability and detectability in the medium. With the help of the lysis, of cultivated mini-cartilage implants, the maximum achievable LDH concentrations could be determined. A calibration curve was generated using these concentrations. This serves to assess the viability of future measured absorptions of the supernatant medium.
The developed method does not require any invasive interventions on the implant and is characterized by its simple implementation, since only the protrusion has to be measured. The validation of the method certified a high level of robustness, linearity, accuracy and precision.
Aufgrund der sich umkehrenden Alterspyramide in Deutschland leiden bereits jetzt immer mehr Menschen an Gelenkknorpelschäden. Doch nicht nur das Alter, sondern auch Unfälle und Sportverletzungen und Übergewicht können zu irreversiblen Knorpeldefekten führen. Obwohl es diverse Behandlungsmöglichkeiten gibt, können die bisherige Methoden nicht als dauerhafte Heilung betrachtet werden. Im Rahmen des internationalen Forschungsprojektes BIO-CHIP sollte eine vielsprechende Behandlungsmethode mit neuartigen Arzneimitteln untersucht werden.
Als Ausgangsmaterial des Arzneimittels, ein hergestelltes Knorpelimplantat, dienen patienteneigene Knorpelzellen aus der Nase. Diese werden isoliert, vermehrt und letztlich auf einer Matrix zu einem Knorpelimplantat kultiviert. Wesentliche Voraussetzung für die Implantatfreigabe stellt neben toxikologischen und biologischen Unbedenklichkeitstests die Beurteilung der Viabilität dar. Diese wurde bisher anhand von Histologieschnitten von der Pathologie durchgeführt.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Validierung eines standardisierten und objektiven Viabilitätstests für die Chondrozyten innerhalb der Knorpelmatrix. Hierfür wurde die LDH als Marker für irreversibel geschädigte Zellen verwendet. Die LDH Konzentration konnte mit dem CyQuant LDH-Assay durch die Messung der Absorption gemessen werden. Es konnte nachgewiesen werden, dass LDH die erforderliche Stabilität und Nachweisbarkeit im Medium besitzt. Mithilfe der Lyse, analog zum Herstellungsprozess, gezüchteter Mini-Knorpelimplantate, konnten die maximal erreichbaren LDH Konzentrationen ermittelt werden. Mithilfe dieser Konzentrationen wurde eine Eichkurve generiert. Diese dient als Beurteilung der Viabilität zukünftig gemessener Absorptionen des Überstandmediums.
Das entwickelte Verfahren erfordert keine invasiven Eingriffe am Implantat und zeichnet sich durch eine einfache Durchführung aus, da nur der Überstand gemessen werden muss. Die durchgeführte Validierung der Methode bescheinigte eine hohe Robustheit, Linearität, Genauigkeit und Präzision.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-242481
10.25972/OPUS-24248
Fraunhofer
publish
X 129524
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Gabriel Bleuel
deu
swd
Hyaliner Knorpel
deu
swd
Lactatdehydrogenase
deu
swd
Kniegelenk
deu
swd
Zellkultur
deu
uncontrolled
Entwicklung
eng
uncontrolled
development
deu
uncontrolled
Validierung
deu
uncontrolled
LDH-assay
deu
uncontrolled
Knorpelimplantate
eng
uncontrolled
validation
eng
uncontrolled
cartilage
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/24248/bleuel_gabriel_ldhassay.pdf
13541
2012
eng
7
3
article
1
2016-06-24
--
--
Stem cell- and growth factor-based regenerative therapies for avascular necrosis of the femoral head
Avascular necrosis (AVN) of the femoral head is a debilitating disease of multifactorial genesis, predominately affects young patients, and often leads to the development of secondary osteoarthritis. The evolving field of regenerative medicine offers promising treatment strategies using cells, biomaterial scaffolds, and bioactive factors, which might improve clinical outcome. Early stages of AVN with preserved structural integrity of the subchondral plate are accessible to retrograde surgical procedures, such as core decompression to reduce the intraosseous pressure and to induce bone remodeling. The additive application of concentrated bone marrow aspirates, ex vivo expanded mesenchymal stem cells, and osteogenic or angiogenic growth factors (or both) holds great potential to improve bone regeneration. In contrast, advanced stages of AVN with collapsed subchondral bone require an osteochondral reconstruction to preserve the physiological joint function. Analogously to strategies for osteochondral reconstruction in the knee, anterograde surgical techniques, such as osteochondral transplantation (mosaicplasty), matrix-based autologous chondrocyte implantation, or the use of acellular scaffolds alone, might preserve joint function and reduce the need for hip replacement. This review summarizes recent experimental accomplishments and initial clinical findings in the field of regenerative medicine which apply cells, growth factors, and matrices to address the clinical problem of AVN.
Stem Cell Research & Therapy
10.1186/scrt98
urn:nbn:de:bvb:20-opus-135413
Stem Cell Research & Therapy 2012, 3:7. doi:10.1186/scrt98
242175
Deutsches Urheberrecht
Lars Rackwitz
Lars Eden
Stephan Reppenhagen
Johannes C. Reichert
Franz Jakob
Heike Walles
Oliver Pullig
Rocky S. Tuan
Maximilian Rudert
Ulrich Nöth
eng
uncontrolled
osteochondral allografts
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uncontrolled
autologous chondrocyte implantation
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uncontrolled
osteogenesis imperfecta
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uncontrolled
segmental collapse
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uncontrolled
mesenchymal cells
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progenitor cells
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uncontrolled
stromal cells
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sheep model
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uncontrolled
colony-stimulating factor
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uncontrolled
core depression
Humanphysiologie
open_access
Lehrstuhl für Orthopädie
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
OpenAIRE
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/13541/Rackwitz_scrt98_2012.pdf
13955
2015
eng
e0139345
10
10
article
1
2016-10-18
--
--
In Vitro Generation of Functional Liver Organoid-Like Structures Using Adult Human Cells
In this study we used differentiated adult human upcyte (R) cells for the in vitro generation of liver organoids. Upcyte (R) cells are genetically engineered cell strains derived from primary human cells by lenti-viral transduction of genes or gene combinations inducing transient proliferation capacity (upcyte (R) process). Proliferating upcyte (R) cells undergo a finite number of cell divisions, i.e., 20 to 40 population doublings, but upon withdrawal of proliferation stimulating factors, they regain most of the cell specific characteristics of primary cells. When a defined mixture of differentiated human upcyte (R) cells (hepatocytes, liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) and mesenchymal stem cells (MSCs)) was cultured in vitro on a thick layer of Matrigel\(^{TM}\), they self-organized to form liver organoid-like structures within 24 hours. When further cultured for 10 days in a bioreactor, these liver organoids show typical functional characteristics of liver parenchyma including activity of cytochromes P450, CYP3A4, CYP2B6 and CYP2C9 as well as mRNA expression of several marker genes and other enzymes. In summary, we hereby describe that 3D functional hepatic structures composed of primary human cell strains can be generated in vitro. They can be cultured for a prolonged period of time and are potentially useful ex vivo models to study liver functions.
PLoS One
10.1371/journal.pone.0139345
urn:nbn:de:bvb:20-opus-139552
PLoS ONE 10 (10): e0139345. doi:10.1371/journal.pone.0139345
304961
266777
Sarada Devi Ramachandran
Katharina Schirmer
Bernhard Münst
Stefan Heinz
Shahrouz Ghafoory
Stefan Wölfl
Katja Simon-Keller
Alexander Marx
Cristina Ionica Øie
Matthias P. Ebert
Heike Walles
Joris Braspenning
Katja Breitkopf-Heinlein
eng
uncontrolled
adults
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uncontrolled
enzyme metabolism
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uncontrolled
albumins
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uncontrolled
primary cells
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uncontrolled
induction
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uncontrolled
expression
eng
uncontrolled
human heptocytes
eng
uncontrolled
mesenchymal stem cells
eng
uncontrolled
oragnoids
eng
uncontrolled
heptaocytes
eng
uncontrolled
drug metabolism
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
OpenAIRE
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/13955/Ramachandran.pdf
13227
2013
eng
e50460
78
article
1
2016-04-15
--
--
Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System
Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.
Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).
Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.
In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.
Journal of Visualized Experiments
10.3791/50460
http://www.jove.com/video/50460
urn:nbn:de:bvb:20-opus-132277
Journal of Visualized Experiments (78), e50460, doi:10.3791/50460 (2013)
Corinna Moll
Jenny Reboredo
Thomas Schwarz
Antje Appelt
Sebastian Schürlein
Heike Walles
Sarah Nietzer
eng
uncontrolled
bioengineering
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uncontrolled
biomedical engineering
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uncontrolled
tissue engineering
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uncontrolled
biotechnology
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uncontrolled
cultured
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uncontrolled
tumor cells
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uncontrolled
cell culture
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uncontrolled
3D in vitro models
eng
uncontrolled
bioreactor
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uncontrolled
dynamic culture conditions
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uncontrolled
tumor test system
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primary cell isolation
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uncontrolled
BioVaSc
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uncontrolled
decellularization
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uncontrolled
equipment and supplies
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uncontrolled
cellular microenvironment
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uncontrolled
culture techniques
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uncontrolled
cell engineering
eng
uncontrolled
anatomy
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uncontrolled
physiology
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uncontrolled
molecular biology
eng
uncontrolled
cellular biology
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/13227/155_Moll_Jounal_of_Visualized_Experiments.pdf
13189
2013
eng
12
6
article
1
2016-04-12
--
--
Cellular re- and de-programming by microenvironmental memory: why short TGF-β1 pulses can have long effects
Background
Fibrosis poses a substantial setback in regenerative medicine. Histopathologically, fibrosis is an excessive accumulation of collagen affected by myofibroblasts and this can occur in any tissue that is exposed to chronic injury or insult. Transforming growth factor (TGF)-β1, a crucial mediator of fibrosis, drives differentiation of fibroblasts into myofibroblasts. These cells exhibit α-smooth muscle actin (α-SMA) and synthesize high amounts of collagen I, the major extracellular matrix (ECM) component of fibrosis. While hormones stimulate cells in a pulsatile manner, little is known about cellular response kinetics upon growth factor impact. We therefore studied the effects of short TGF-β1 pulses in terms of the induction and maintenance of the myofibroblast phenotype.
Results
Twenty-four hours after a single 30 min TGF-β1 pulse, transcription of fibrogenic genes was upregulated, but subsided 7 days later. In parallel, collagen I secretion rate and α-SMA presence were elevated for 7 days. A second pulse 24 h later extended the duration of effects to 14 days. We could not establish epigenetic changes on fibrogenic target genes to explain the long-lasting effects. However, ECM deposited under singly pulsed TGF-β1 was able to induce myofibroblast features in previously untreated fibroblasts. Dependent on the age of the ECM (1 day versus 7 days’ formation time), this property was diminished. Vice versa, myofibroblasts were cultured on fibroblast ECM and cells observed to express reduced (in comparison with myofibroblasts) levels of collagen I.
Conclusions
We demonstrated that short TGF-β1 pulses can exert long-lasting effects on fibroblasts by changing their microenvironment, thus leaving an imprint and creating a reciprocal feed-back loop. Therefore, the ECM might act as mid-term memory for pathobiochemical events. We would expect this microenvironmental memory to be dependent on matrix turnover and, as such, to be erasable. Our findings contribute to the current understanding of fibroblast induction and maintenance, and have bearing on the development of antifibrotic drugs.
Fibrogenesis Tissue Repair
10.1186/1755-1536-6-12
urn:nbn:de:bvb:20-opus-131898
Fibrogenesis & Tissue Repair 2013, 6:12. DOI:10.1186/1755-1536-6-12
Ariel Bing-Shi Tan
Sebastian Kress
Leticia Castro
Allan Sheppard
Michael Raghunath
eng
uncontrolled
cytokine
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uncontrolled
fibrosis
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uncontrolled
transforming growth factor-beta 1
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extracellular matrix
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memory
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uncontrolled
pulses
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phenotype
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uncontrolled
kinetics
Krankheiten
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/13189/132_Than_Fibrogenesis_Tissue_Repair.pdf
13090
2013
eng
e67214
6
8
article
1
2016-03-31
--
--
Identification of a Novel TGF-beta-Binding Site in the Zona Pellucida C-terminal (ZP-C) Domain of TGF-\(\beta\)-Receptor-3 (TGFR-3)
The zona pellucida (ZP) domain is present in extracellular proteins such as the zona pellucida proteins and tectorins and participates in the formation of polymeric protein networks. However, the ZP domain also occurs in the cytokine signaling co-receptor transforming growth factor beta (TGF-\(\beta\)) receptor type 3 (TGFR-3, also known as betaglycan) where it contributes to cytokine ligand recognition. Currently it is unclear how the ZP domain architecture enables this dual functionality. Here, we identify a novel major TGF-beta-binding site in the FG loop of the C-terminal subdomain of the murine TGFR-3 ZP domain (ZP-C) using protein crystallography, limited proteolysis experiments, surface plasmon resonance measurements and synthetic peptides. In the murine 2.7 angstrom crystal structure that we are presenting here, the FG-loop is disordered, however, well-ordered in a recently reported homologous rat ZP-C structure. Surprisingly, the adjacent external hydrophobic patch (EHP) segment is registered differently in the rat and murine structures suggesting that this segment only loosely associates with the remaining ZP-C fold. Such a flexible and temporarily-modulated association of the EHP segment with the ZP domain has been proposed to control the polymerization of ZP domain-containing proteins. Our findings suggest that this flexibility also extends to the ZP domain of TGFR-3 and might facilitate co-receptor ligand interaction and presentation via the adjacent FG-loop. This hints that a similar C-terminal region of the ZP domain architecture possibly regulates both the polymerization of extracellular matrix proteins and cytokine ligand recognition of TGFR-3.
PLoS ONE
10.1371/journal.pone.0067214
urn:nbn:de:bvb:20-opus-130904
PLoS ONE 8(6): e67214. doi:10.1371/journal.pone.0067214
Uschi Diestel
Marcus Resch
Kathrin Meinhardt
Sigrid Weiler
Tina V. Hellmann
Thomas D. Mueller
Joachim Nickel
Jutta Eichler
Yves A. Muller
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uncontrolled
coreceptor
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receptor type III
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uncontrolled
growth factor beta
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uncontrolled
ligand binding
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uncontrolled
betaglycan
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uncontrolled
proteins
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uncontrolled
mutagenesis
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uncontrolled
polymerization
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uncontrolled
glycoprotein
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uncontrolled
superfamily
Medizin und Gesundheit
open_access
Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/13090/078_Diestel_Plos_One.pdf
11679
2014
eng
e93605
4
9
article
1
2015-07-25
--
--
In Vivo Transplantation of Neurosphere-Like Bodies Derived from the Human Postnatal and Adult Enteric Nervous System: A Pilot Study
Recent advances in the in vitro characterization of human adult enteric neural progenitor cells have opened new possibilities for cell-based therapies in gastrointestinal motility disorders. However, whether these cells are able to integrate within an in vivo gut environment is still unclear. In this study, we transplanted neural progenitor-containing neurosphere-like bodies (NLBs) in a mouse model of hypoganglionosis and analyzed cellular integration of NLB-derived cell types and functional improvement. NLBs were propagated from postnatal and adult human gut tissues. Cells were characterized by immunohistochemistry, quantitative PCR and subtelomere fluorescence in situ hybridization (FISH). For in vivo evaluation, the plexus of murine colon was damaged by the application of cationic surfactant benzalkonium chloride which was followed by the transplantation of NLBs in a fibrin matrix. After 4 weeks, grafted human cells were visualized by combined in situ hybridization (Alu) and immunohistochemistry (PGP9.5, GFAP, SMA). In addition, we determined nitric oxide synthase (NOS)-positive neurons and measured hypertrophic effects in the ENS and musculature. Contractility of treated guts was assessed in organ bath after electrical field stimulation. NLBs could be reproducibly generated without any signs of chromosomal alterations using subtelomere FISH. NLB-derived cells integrated within the host tissue and showed expected differentiated phenotypes i.e. enteric neurons, glia and smooth muscle-like cells following in vivo transplantation. Our data suggest biological effects of the transplanted NLB cells on tissue contractility, although robust statistical results could not be obtained due to the small sample size. Further, it is unclear, which of the NLB cell types including neural progenitors have direct restoring effects or, alternatively may act via 'bystander' mechanisms in vivo. Our findings provide further evidence that NLB transplantation can be considered as feasible tool to improve ENS function in a variety of gastrointestinal disorders.
PLOS ONE
10.1371/journal.pone.0093605
24699866
urn:nbn:de:bvb:20-opus-116793
PLoS ONE 9(4): e93605. doi:10.1371/journal.pone.0093605
Susan Hetz
Ali Acikgoez
Ulrike Voss
Karen Nieber
Heidrun Holland
Cindy Hegewald
Holger Till
Roman Metzger
Marco Metzger
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uncontrolled
Hirschsprung disease
eng
uncontrolled
benzalkonium chloride
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uncontrolled
progenitors
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uncontrolled
GUT
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uncontrolled
rat
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uncontrolled
colon
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uncontrolled
biology
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therapy
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uncontrolled
neural stem-cell
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uncontrolled
motility disorders
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/11679/095_Hetz_PLOS_ONE.pdf
11782
2014
eng
441-477
4
31
article
1
2015-08-13
--
--
State-of-the-Art of 3D Cultures (Organs-on-a-Chip) in Safety Testing and Pathophysiology
Integrated approaches using different in vitro methods in combination with bioinformatics can (i) increase the success rate and speed of drug development; (ii) improve the accuracy of toxicological risk assessment; and (iii) increase our understanding of disease. Three-dimensional (3D) cell culture models are important building blocks of this strategy which has emerged during the last years. The majority of these models are organotypic, i.e., they aim to reproduce major functions of an organ or organ system. This implies in many cases that more than one cell type forms the 3D structure, and often matrix elements play an important role. This review summarizes the state of the art concerning commonalities of the different models. For instance, the theory of mass transport/metabolite exchange in 3D systems and the special analytical requirements for test endpoints in organotypic cultures are discussed in detail. In the next part, 3D model systems for selected organs liver, lung, skin, brain are presented and characterized in dedicated chapters. Also, 3D approaches to the modeling of tumors are presented and discussed. All chapters give a historical background, illustrate the large variety of approaches, and highlight up- and downsides as well as specific requirements. Moreover, they refer to the application in disease modeling, drug discovery and safety assessment. Finally, consensus recommendations indicate a roadmap for the successful implementation of 3D models in routine screening. It is expected that the use of such models will accelerate progress by reducing error rates and wrong predictions from compound testing.
ALTEX - Alternatives to Animal Experimentation
25027500
2014; http://dx.doi.org/10.14573/altex1406111
urn:nbn:de:bvb:20-opus-117826
ALTEX 31, 4 (2014), S. 441-477
Deutsches Urheberrecht
Natalie Alepee
Anthony Bahinski
Mardas Daneshian
Bart De Weyer
Ellen Fritsche
Alan Goldberg
Jan Hansmann
Thomas Hartung
John Haycock
Helena T. Hogberg
Lisa Hoelting
Jens M. Kelm
Suzanne Kadereit
Emily McVey
Robert Landsiedel
Marcel Leist
Marc Lübberstedt
Fozia Noor
Christian Pellevoisin
Dirk Petersohn
Uwe Pfannenbecker
Kerstin Reisinger
Tzutzuy Ramirez
Barbara Rothen-Rutishauser
Monika Schäfer-Korting
Katrin Zeilinger
Marie-Gabriele Zurich
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uncontrolled
3D models
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uncontrolled
organotypic
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organ-on-a-chip
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multicellular tumor spheroids
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primary human hepatocytes
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embryonic stem cell
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reconstructed human epidermis
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uncontrolled
in-vitro models
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full thickness skin
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necrosis-factor-alpha
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metabolic flux analysis
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long-term
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uncontrolled
human liver cells
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/11782/145_Alepee_ALTEX_ALTERNATIVES_TO_ANIMAL_EXPERIMENTATION.pdf
11800
2014
eng
510285
article
1
2015-08-17
--
--
Current Treatment Limitations in Age-Related Macular Degeneration and Future Approaches Based on Cell Therapy and Tissue Engineering
Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the Western world. With an ageing population, it is anticipated that the number of AMD cases will increase dramatically, making a solution to this debilitating disease an urgent requirement for the socioeconomic future of the European Union and worldwide. The present paper reviews the limitations of the current therapies as well as the socioeconomic impact of the AMD. There is currently no cure available for AMD, and even palliative treatments are rare. Treatment options show several side effects, are of high cost, and only treat the consequence, not the cause of the pathology. For that reason, many options involving cell therapy mainly based on retinal and iris pigment epithelium cells as well as stem cells are being tested. Moreover, tissue engineering strategies to design and manufacture scaffolds to mimic Bruch's membrane are very diverse and under investigation. Both alternative therapies are aimed to prevent and/or cure AMD and are reviewed herein.
Journal of Ophtamology
10.1155/2014/510285
2090-0058
urn:nbn:de:bvb:20-opus-118004
Journal of Ophthalmology Volume 2014, Article ID 510285, 13 pages. doi:10.1155/2014/510285
P. Fernandez-Robredo
A. Sancho
S. Johnen
S. Recalde
N. Gama
G. Thumann
J. Groll
A. Garcia-Layana
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uncontrolled
endothelial growth factor
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pluripotent stem cells
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subfoveal choroidal neovascularization
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human bruchs membrane
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ciliary neurotrophic factor
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randomized clinical trial
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dystrophic RCS rats
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subretinal space
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uncontrolled
in-vitro
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uncontrolled
retinal pigment epithelium
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/11800/154_Ferandez-Robredo_Journal_of_ Opthalmology.pdf
11391
2014
deu
doctoralthesis
1
2015-05-30
--
2015-05-29
In-vitro-Untersuchungen zur Biokompatibilität modifizierter Silikonoberflächen
In-vitro characterization on compability testing of modified silicon surfaces
Hintergrund
Jede Implantation alloplastischer Materialien führt durch Aktivierung der körpereigenen Immunabwehr zu einer Fremdkörperreaktion. An der Synthese der Extrazellulärmatrix und der entstehenden Kollagenkapsel sind insbesondere Makrophagen und Fibroblasten beteiligt. Diese Reaktionen können die Material-Funktionsfähigkeit abschwächen, aufheben oder zu deren operativer Entfernung zwingen.
Fragestellung und Ziele
Spinnenseide ist ein Material mit hoher Biokompatibilität. Nachdem es gelungen ist, Spinnenseide rekombinant herzustellen, soll untersucht werden, wie sich die Verträglichkeit alloplastischer Materialien durch eine Beschichtung mit biotechnologisch hergestellter Spinnenseide beeinflussen lässt.
Eine weitere Möglichkeit ist der TGF-β-Synthese-Inhibitor Halofuginon, der ebenfalls hinsichtlich seiner Potenz, die Ausbildung einer Fibrosekapsel zu vermindern, untersucht werden soll.
Methodik
Anhand von in-vitro-Untersuchungen wurden die bei der Fremdkörperreaktion beteiligten Zelltypen auf ihr Proliferationsverhalten und die Expression unterschiedlicher Genprodukte hinsichtlich bestehender Unterschiede zwischen den jeweiligen Oberflächenbeschichtungen untersucht. Es wurden immunhistochemische Färbungen zum Nachweis spezifischer Oberflächenantigene, Bestimmungen von ATP- und DNA-Gehalt als Maß für die Zellzahl, sowie molekulargenetische Untersuchungen hinsichtlich der Expression relevanter Markergene (rtPCR) durchgeführt.
Ergebnisse
Eine Beschichtung mit rekombinanter Spinnseide führt - im Vergleich zu reinen Silikonimplantaten - zu einer verzögerten und reduzierten Immunreaktion. Die EZM-Synthese und die damit verbundene fremdkörperassoziierte Fibrose werden vermindert und so die Biokompatibilität alloplastischer Materialien gesteigert.
Introduction:
Optimisation of the biocompatibility of silicone implants and reduction of capsule formaiton around the surface of such implants are in the focus of plastic surgical biomaterial research. In addition to its extraordinary physical and biochemical properties, spider silk shows high biocompatibility. Therefore, the coating of silicone implant surfaces with recombinant spider silk wwas analysed regarding foreign body reactions. Another possibility to modify the surface is a coating with chinazolinone derivative halofuginone which is a type I collagen synthesis
inhibitor that interferes with the TGF-beta signaling pathway.
Methods:
We compared proliferation and expression of different gene products in-vitro by immunhistochemistry, content of ATP and DNA, and rtPCR.
Conclusion: The results confirmed a decrease in foreign body responses to spider silk or
halofuginone surface-modified silicone implants and mark their potential for
obtaining a lessened capsular fibrosis by way of a local antifibrotic effect.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-113911
X 126536
Ann-Kathrin Berninger
deu
swd
Fibrose
deu
swd
Silikon
deu
uncontrolled
rekombinante Spinnseide
deu
uncontrolled
Halofuginon
deu
uncontrolled
fremdkörper assoziierte Reaktion
Chirurgie und verwandte medizinische Fachrichtungen
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/11391/Dissertation_Berninger_Ann-Kathrin.pdf
11428
2014
eng
3087 - 3096
10
article
1
2015-06-10
--
--
Conjugates of methylated cyclodextrin derivatives and hydroxyethyl starch (HES): Synthesis, cytotoxicity and inclusion of anaesthetic actives
The mono-6-deoxy-6-azides of 2,6-di-O-methyl-beta-cyclodextrin (DIMEB) and randomly methylated-beta-cyclodextrin (RAMEB) were conjugated to propargylated hydroxyethyl starch (HES) by Cu+-catalysed [2 + 3] cycloaddition. The resulting water soluble polymers showed lower critical solution temperatures (LCST) at 52.5 degrees C (DIMEB-HES) and 84.5 degrees C (RAMEB-HES), respectively. LCST phase separations could be completely avoided by the introduction of a small amount of carboxylate groups at the HES backbone. The methylated CDs conjugated to the HES backbone exhibited significantly lower cytotoxicities than the corresponding monomeric CD derivatives. Since the binding potentials of these CD conjugates were very high, they are promising candidates for new oral dosage forms of anaesthetic actives.
Beilstein Journal of Organic Chemistry
10.3762/bjoc.10.325
1860-5397
25670977
urn:nbn:de:bvb:20-opus-114280
Beilstein Journal of Organic Chemistry 2014, 10, 3087–3096. doi:10.3762/bjoc.10.325
Lisa Markenstein
Antje Appelt-Menzel
Marco Metzger
Gerhard Wenz
eng
uncontrolled
midazolam
eng
uncontrolled
supermolecular carrier systems
eng
uncontrolled
beta-cyclodextrin
eng
uncontrolled
pharmaceutical applications
eng
uncontrolled
gamma-cyclodextrin
eng
uncontrolled
anaesthetics
eng
uncontrolled
complexation
eng
uncontrolled
cyclodextrin
eng
uncontrolled
LCST
eng
uncontrolled
lower critical solution temperature
eng
uncontrolled
acid dissociation
eng
uncontrolled
drug
eng
uncontrolled
rat
eng
uncontrolled
cycloaddition
eng
uncontrolled
occupancy
eng
uncontrolled
polymer
eng
uncontrolled
sevoflurane
eng
uncontrolled
solubility
eng
uncontrolled
starch
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/11428/004_Markenstein_Beilstein_Journal_of_Organic_Chemistry.pdf
23555
2023
deu
doctoralthesis
1
2021-04-25
--
2021-03-25
Biomechanische Eigenschaften eines biomaterialbasierten Kreuzbandkonstruktes in-vivo und in-vitro
Biomechanical properties of a biomaterial-based cruciate ligament construct in-vivo and in-vitro
Kreuzbandrupturen stellen nach wie vor eine Herausforderung in der klinischen Praxis hinsichtlich kurz- und langfristiger unerwünschter Nebenwirkungen dar (z.B. Reruptur und Arthrosebildung).
In der vorliegenden Arbeit wird der entwickelte Ansatz eines Kollagen-I-basierten künstlichen Kreuzbandkonstruktes hinsichtlich der Reißfestigkeit, Lagerung, Verstärkungsmöglichkeit mittels Fiber-tape und langfristigen Arthroseentstehung untersucht mittels in-vitro und in-vivo Untersuchungen unter zur Hilfe nahme des Minipig Tiermodels.
Die Ergebnisse zeigen keinen Einfluss der Lagerungstemperatur sowie des Lagerungszeitraums auf die Reißfestigkeit des Konstruktes, sowie eine mögliche initiale Verstärkung mittels Fibertape im Minipig. Darüber hinaus wurde mikroskopisch wie makroskopische Arthroseentstehung nachgewiesen. Das Ausmaß der Arthroseentstehung ist diesbezüglich mit einer Abweichung der Konstruktimplantation von der ursprünglichen Kreuzbandinsertion mittels MRT bestätigt worden.
Cruciate ligament ruptures remain a challenge in clinical practice with regard to short- and long-term undesirable side effects (e.g. rerupture and osteoarthritis formation).
In the present study, the developed approach of a collagen-I-based artificial cruciate ligament construct is investigated with regard to tear strength, storage, reinforcement possibility by means of fibre-tape and long-term arthrosis development by means of in vitro and in vivo investigations using the Minipig animal model.
The results show no influence of the storage temperature and the storage period on the tensile strength of the construct, as well as a possible initial reinforcement by means of fibre-tape in the Minipig. Furthermore, both microscopic and macroscopic osteoarthritis was detected. The extent of osteoarthritis development was confirmed in this regard with a deviation of the construct implantation from the original cruciate ligament insertion by means of MRI.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-235555
10.25972/OPUS-23555
publish
X 130379
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Johannes Konrad
deu
swd
Ligamentum cruciatum anterius
deu
swd
Osteoarthritis
eng
uncontrolled
ACL construct
eng
uncontrolled
Minipig
deu
uncontrolled
Kreuzbandersatz
deu
uncontrolled
Arthroseentstehung
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/23555/Konrad_Johannes_Dissertation.pdf
22335
2021
deu
doctoralthesis
1
2021-02-07
--
2021-01-18
Etablierung eines dreidimensionalen Tumormodells für das orale Plattenepithelkarzinom unter Einsatz von Tissue Engineering
Establishment of a three-dimensional tumor model for oral squamous cell carcinoma using tissue engineering
Gegenstand dieser Arbeit war die Etablierung eines dreidimensionalen in vitro Tumormodells, welches ein orales in vivo Plattenepithelkarzinom nachbilden sollte. Dabei standen Aufbau, Reproduzierbarkeit und Reliabilität an vorderster Stelle. Als Zellquelle sollten sowohl Tumorzellen aus den Zelllinien FaDu, HLaC79 und HLaC79 Clone 1 als auch primäre Zellen aus karzinogenem Primärgewebe dienen. Als Referenz wurden dabei stets Modelle aus primär isolierten Zellen herangezogen, die ein Äquivalent zur gesunden Mundschleimhaut bildeten. Während der Isolationsvorgang von pathologischen Zellen primärer Plattenepithelkarzinomen aus der Mundhöhle und dem Pharynx aufgrund zahlreicher Kontaminationen und Stagnationen des Zellwachstums keinen Erfolg erzielte und der Versuch eingestellt wurde, war es mit den Tumorzelllinien FaDu und HLaC79 möglich, dreidimensionale in vitro Tumormodelle herzustellen. Ihre Malignität wurde durch die besonderen histologischen Architekturstörungen wie die geringere Epitheldicke, das Fehlen einer Parakeratinisierung im Stratum corneum und die Invasion von Tumorzellen in die Submukosa verdeutlicht. Um einen eindeutigen Vergleich zu den Mukosaäquivalenten zu ziehen, fand eine Immunhistochemie mit unterschiedlichen Markern statt, die vor allem den gestörten Epithelaufbau des Tumormodells verdeutlichte. Als Maß für die Zell-Zell-Kontakte, die im Laufe der Kultivierung entstanden, diente der transepitheliale elektrische Widerstand. Die Behandlung der Tumorzellen und Tumormodelle mit dem klinisch bewährten Zytostatikum Paclitaxel und dem neuen Polyether-Antibiotikum Salinomycin erzielte vor allem in der zweidimensionalen Kultivierung große Erfolge. Hier wurde verdeutlicht, dass Paclitaxel toxisch auf die HLaC79 Tumorzellen wirkt, während die paclitaxelresistenten HLaC79 Clone 1 Tumorzellen immun gegen dieses Medikament sind. Salinomycin hingegen sorgte für eine Verringerung der Zellviabilität bei beiden Zelllinien. Die histologischen Untersuchungen nach der 24-stündigen Medikamentenapplikation mit Paclitaxel bei den Tumormodellen zeigten keine signifikanten Unterschiede, während der transepitheliale elektrische Widerstand stieg und auf eine verstärkte Barriere nach Paclitaxelgabe schließen ließ.
The subject of this work was the establishment of a three-dimensional in vitro tumor model, which should simulate an oral in vivo squamous cell carcinoma. Structure, reproducibility and reliability were paramount. Both tumor cells from the FaDu, HLaC79 and HLaC79 Clone 1 cell lines and primary cells from carcinogenic primary tissue should serve as the cell source. Models from primary isolated cells, which are equivalent to healthy oral mucosa, were used as a reference. While the isolation process of pathological cells of primary squamous cell carcinomas from the oral cavity and the pharynx was unsuccessful due to numerous contamination and stagnation of cell growth, the FaDu and HLaC79 tumor cell lines made it possible to produce three-dimensional in vitro tumor models. Their malignancy was illustrated by the histological architectural disorders such as the reduced epithelial thickness, the lack of parakeratinization in the stratum corneum and the invasion of tumor cells into the submucosa. To make a clear comparison with the mucosa equivalents, an immunohistochemistry with different markers was carried out, which above all clarified the disturbed epithelial structure of the tumor model. The transepithelial electrical resistance was used as a measure of the cell-cell contacts that developed during cultivation. The treatment of tumor cells and tumor models with the clinically proven cytostatic agent paclitaxel and the new polyether antibiotic salinomycin achieved great success, especially in two-dimensional cultivation. It was made clear here that paclitaxel has a toxic effect on the HLaC79 tumor cells, while the paclitaxel-resistant HLaC79 clone 1 tumor cells are immune to this drug. Salinomycin, however, reduced the cell viability of both cell lines. The histological examinations after the 24-hour drug application with paclitaxel in the tumor models showed no significant differences, while the transepithelial electrical resistance increased and suggested a stronger barrier after paclitaxel administration.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-223356
10.25972/OPUS-22335
publish
X 129219
Deutsches Urheberrecht
Andrea Birgit Kunze
deu
swd
Tissue Engineering
deu
swd
Plattenepithelcarcinom
deu
swd
Mundschleimhaut
deu
uncontrolled
in-vitro-Modell
deu
uncontrolled
Tumorzelllinien
deu
uncontrolled
in-vitro-Testsysteme
deu
uncontrolled
Paclitaxel
deu
uncontrolled
Salinomycin
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/22335/Kunze_Andrea_TERM_Dissertation.pdf
25407
2015
eng
3
10
article
1
--
--
--
In vitro elastogenesis: instructing human vascular smooth muscle cells to generate an elastic fiber-containing extracellular matrix scaffold
Elastic fibers are essential for the proper function of organs including cardiovascular tissues such as heart valves and blood vessels. Although (tropo)elastin production in a tissue-engineered construct has previously been described, the assembly to functional elastic fibers in vitro using human cells has been highly challenging. In the present study, we seeded primary isolated human vascular smooth muscle cells (VSMCs) onto 3D electrospun scaffolds and exposed them to defined laminar shear stress using a customized bioreactor system. Increased elastin expression followed by elastin deposition onto the electrospun scaffolds, as well as on newly formed fibers, was observed after six days. Most interestingly, we identified the successful deposition of elastogenesis-associated proteins, including fibrillin-1 and -2, fibulin-4 and -5, fibronectin, elastin microfibril interface located protein 1 (EMILIN-1) and lysyl oxidase (LOX) within our engineered constructs. Ultrastructural analyses revealed a developing extracellular matrix (ECM) similar to native human fetal tissue, which is composed of collagens, microfibrils and elastin. To conclude, the combination of a novel dynamic flow bioreactor and an electrospun hybrid polymer scaffold allowed the production and assembly of an elastic fiber-containing ECM.
Biomedical Materials
10.1088/1748-6041/10/3/034102
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2022-01-27T01:58:56+00:00
sword
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Biomedical Materials 2015, 10(3):034102. DOI: 10.1088/1748-6041/10/3/034102
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Svenja Hinderer
Nian Shen
Léa-Jeanne Ringuette
Jan Hansmann
Dieter P Reinhardt
Sara Y Brucker
Elaine C Davis
Katja Schenke-Layland
eng
uncontrolled
elastin
eng
uncontrolled
elastic fibers
eng
uncontrolled
electrospinning
eng
uncontrolled
tissue engineering
eng
uncontrolled
regenerative medicine
eng
uncontrolled
heart valve
eng
uncontrolled
cardiovascular
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Import
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/25407/bmm_10_3_034102.pdf
27465
2022
deu
doctoralthesis
1
2022-06-01
--
2021-12-20
Etablierung eines 3D Gewebemodells für die translationale Forschung am Malignen Pleuramesotheliom
Establishment of a 3-dimensional human tissue model to study the malignant pleural mesothelioma
Einleitung:
Das maligne Pleuramesotheliom (MPM) ist ein aggressiver von den Mesothelzellen der Pleura ausgehender Tumor, der in der Regel Folge einer Exposition mit Asbest ist. Aufgrund der häufig für ein chirurgisches Vorgehen zu späten Diagnose und des nur unzureichenden Ansprechens des Tumors auf Chemotherapie und Bestrahlung ist die Prognose sehr schlecht. Die präklinische Entwicklung und Testungen neuer Wirkstoffe ist aufgrund eines Mangels an geeigneten in vivo und in vitro Modellen für die biomedizinische Forschung schwierig. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war der Aufbau eines 3D Gewebemodells, das die physiologischen Wachstumsverhältnisse und die Tumormikroumgebung des MPM wiedergibt und das als mögliches präklinisches Testmodell eingesetzt werden kann.
Methoden:
Zwei etablierte Zelllinien des MPM, JL-1 und MSTO-211H, wurden auf in Zellkronen eingespannten Segmenten aus azellulärem porzinen Jejunum unter statischen Kulturbedingungen und unter kontinuierlicher Perfusion in einem Bioreaktorsystem kultiviert. Die 3D Gewebemodelle wurden mit 2D Kulturmodellen des Pleuramesothelioms verglichen. Aus OP-Präparaten wurden tumor-assoziierte Fibroblasten (TAF) isoliert, die zum Aufbau von Kokulturmodellen verwendet wurden. Die Modelle wurden histologisch und immunhistologisch charakterisiert (Calretinin etc.).
Ergebnisse:
Die beiden verwendeten Zelllinien bildeten in der statischen Kultur ein mehrschichtiges Gewebe auf der apikalen Oberfläche der Matrix. Im Vergleich mit der 2D Kultur war ein homogeneres Wachstumsmuster der Zellen und eine erniedrigte Proliferationsrate zu beobachten. Die unter dynamischen Bedingungen kultivierten Modelle zeigten deutlich mehr Tumorzellmasse auf der Matrix. Aus Gewebebiopsien eines malignen Pleuramesothelioms von Patienten wurden TAF isoliert und damit 3D Kokulturmodelle aufgebaut. In den Kokulturmodellen migrierten die TAF in die Matrix, während die Tumorzellen weiterhin auf der apikalen Seite wuchsen.
Diskussion
Durch die Kombination mit einem Bioreaktorsystem, das eine bessere Nährstoffversorgung und die Erzeugung von Scherstress ermöglicht, wird das Tumorzellwachstum positiv beeinflusst. Das Wachstum primärer Zellen auf und deren Migration in die Matrix zeigt das Potential für den Aufbau patienten-spezifischer Modelle auf. Die generierten Gewebemodelle stellen eine Grundlage für gewebespezifische Weiterentwicklungen der Modelle für tumorspezifische mechanistische und letztlich auch therapeutische Fragestellungen dar.
Introduction:
Treatment of malignant pleural mesothelioma (MPM) remains challenging as the tumor is often diagnosed at a late stage and only inadequately responds to chemotherapy and radiation. Preclinical testing of new pharmaceutical and immunological treatment approaches proves to be difficult due to a lack of appropriate in vitro tumor models. Consequently, we aimed to establish a 3-dimensional MPM tissue model reflecting the physiological environment of the MPM.
Methods:
Two MPM cell lines, MSTO211H and JL-1, were cultured on a decellularized porcine scaffold (SISser) fixed in cell crowns. Culture conditions were static and dynamic applying a specially designed bioreactor set-up. Cancer associated fibroblasts (TAF) were isolated from surgical tumor specimen and co-cultured with MPM cells on the matrix. The resulting models were characterized histologically and immunhistologically (Calretinin etc).
Results:
Both cell lines formed multiple layers on the apical surface of the SIS after 14 days of static culture. Compared to 2D culture the cells grew more homogeneously and the proliferation rate declined. The models cultured in a bioreactor under dynamic conditions exhibited an increased tumor cell mass on top of the matrix. In the co-culture models, the CAFs migrated into the matrix while the tumour cells only grew on the apical side.
Discussion:
Dynamic 3D-culture conditions provide a microenvironment similar to in vivo conditions for MPM cell lines and primary TAF to form tumor tissue in vitro. The combination of a bioreactor systems to warrant tissue nutrition and induce shear-stress paces MPM cells to show in vitro a less artificial and clinically more realistic growth pattern. MPM cell growth and TAF tissue infiltration show a potential for the generation of patient specific MPM tumor models.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-274656
10.25972/OPUS-27465
publish
X 130072
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Eva Maria Rampeltshammer
deu
swd
Pleuramesotheliom
deu
swd
Tissue Engineering
eng
uncontrolled
tumormicroenvironment
deu
uncontrolled
Pleuramesotheliom
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/27465/Rampeltshammer_Eva_Pleuramesotheliom.pdf
15899
2017
eng
e0185720
10
12
article
1
2018-03-14
--
--
The anti-myeloma activity of bone morphogenetic protein 2 predominantly relies on the induction of growth arrest and is apoptosis-independent
Multiple myeloma (MM), a malignancy of the bone marrow, is characterized by a pathological increase in antibody-producing plasma cells and an increase in immunoglobulins (plasmacytosis). In recent years, bone morphogenetic proteins (BMPs) have been reported to be activators of apoptotic cell death in neoplastic B cells in MM. Here, we use bone morphogenetic protein 2 (BMP2) to show that the "apoptotic" effect of BMPs on human neoplastic B cells is dominated by anti-proliferative activities and cell cycle arrest and is apoptosis-independent. The anti-proliferative effect of BMP2 was analysed in the human cell lines KMS12-BM and L363 using WST-1 and a Coulter counter and was confirmed using CytoTox assays with established inhibitors of programmed cell death (zVAD-fmk and necrostatin-1). Furthermore, apoptotic activity was compared in both cell lines employing western blot analysis for caspase 3 and 8 in cells treated with BMP2 and FasL. Additionally, expression profiles of marker genes of different cell death pathways were analysed in both cell lines after stimulation with BMP2 for 48h using an RT-PCR-based array. In our experiments we observed that there was rather no reduction in absolute cell number, but cells stopped proliferating following treatment with BMP2 instead. The time frame (48–72 h) after BMP2 treatment at which a reduction in cell number is detectable is too long to indicate a directly BMP2-triggered apoptosis. Moreover, in comparison to robust apoptosis induced by the approved apoptotic factor FasL, BMP2 only marginally induced cell death. Consistently, neither the known inhibitor of apoptotic cell death zVAD-fmk nor the necroptosis inhibitor necrostatin-1 was able to rescue myeloma cell growth in the presence of BMP2.
PLoS ONE
10.1371/ journal.pone.0185720
urn:nbn:de:bvb:20-opus-158993
PLoS ONE 12(10): e0185720 (2017). DOI: 10.1371/ journal.pone.0185720
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Charlotte Lagler
Mohamed El-Mesery
Alexander Christian Kübler
Urs Dietmar Achim Müller-Richter
Thorsten Stühmer
Joachim Nickel
Thomas Dieter Müller
Harald Wajant
Axel Seher
eng
uncontrolled
apoptosis
eng
uncontrolled
gene expression
deu
uncontrolled
necrotic cell death
deu
uncontrolled
multiple myeloma
deu
uncontrolled
cell metabolism
deu
uncontrolled
cell cycle and cell division
deu
uncontrolled
B cells
Medizin und Gesundheit
open_access
Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Plastische Gesichtschirurgie
Abteilung für Molekulare Innere Medizin (in der Medizinischen Klinik und Poliklinik II)
Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Förderzeitraum 2017
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/15899/Lagler_Plos_One.pdf
20264
2019
eng
12297
9
article
1
2020-04-09
--
--
Automated real-time monitoring of human pluripotent stem cell aggregation in stirred tank reactors
The culture of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) at large scale becomes feasible with the aid of scalable suspension setups in continuously stirred tank reactors (CSTRs). Innovative monitoring options and emerging automated process control strategies allow for the necessary highly defined culture conditions. Next to standard process characteristics such as oxygen consumption, pH, and metabolite turnover, a reproducible and steady formation of hiPSC aggregates is vital for process scalability. In this regard, we developed a hiPSC-specific suspension culture unit consisting of a fully monitored CSTR system integrated into a custom-designed and fully automated incubator. As a step towards cost-effective hiPSC suspension culture and to pave the way for flexibility at a large scale, we constructed and utilized tailored miniature CSTRs that are largely made from three-dimensional (3D) printed polylactic acid (PLA) filament, which is a low-cost material used in fused deposition modelling. Further, the monitoring tool for hiPSC suspension cultures utilizes in situ microscopic imaging to visualize hiPSC aggregation in real-time to a statistically significant degree while omitting the need for time-intensive sampling. Suitability of our culture unit, especially concerning the developed hiPSC-specific CSTR system, was proven by demonstrating pluripotency of CSTR-cultured hiPSCs at RNA (including PluriTest) and protein level.
Scientific Reports
10.1038/s41598-019-48814-w
urn:nbn:de:bvb:20-opus-202649
Scientific Reports (2019) 9:12297. https://doi.org/10.1038/s41598-019-48814-w
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true
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Ivo Schwedhelm
Daniela Zdzieblo
Antje Appelt-Menzel
Constantin Berger
Tobias Schmitz
Bernhard Schuldt
Andre Franke
Franz-Josef Müller
Ole Pless
Thomas Schwarz
Philipp Wiedemann
Heike Walles
Jan Hansmann
eng
uncontrolled
Biomedical engineering
eng
uncontrolled
Stem-cell biotechnology
Biowissenschaften; Biologie
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Förderzeitraum 2019
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/20264/Schwedhelm_ScientificReports_2019.pdf
19386
2019
eng
1579
12
8
article
1
--
2019-12-05
--
Specification of BMP signaling
Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) together with the Growth and Differentiation Factors (GDFs) form the largest subgroup of the Transforming Growth Factor (TGF)β family and represent secreted growth factors, which play an essential role in many aspects of cell communication in higher organisms. As morphogens they exert crucial functions during embryonal development, but are also involved in tissue homeostasis and regeneration in the adult organism. Their involvement in maintenance and repair processes of various tissues and organs made these growth factors highly interesting targets for novel pharmaceutical applications in regenerative medicine. A hallmark of the TGFβ protein family is that all of the more than 30 growth factors identified to date signal by binding and hetero-oligomerization of a very limited set of transmembrane serine-threonine kinase receptors, which can be classified into two subgroups termed type I and type II. Only seven type I and five type II receptors exist for all 30plus TGFβ members suggesting a pronounced ligand-receptor promiscuity. Indeed, many TGFβ ligands can bind the same type I or type II receptor and a particular receptor of either subtype can usually interact with and bind various TGFβ ligands. The possible consequence of this ligand-receptor promiscuity is further aggravated by the finding that canonical TGFβ signaling of all family members seemingly results in the activation of just two distinct signaling pathways, that is either SMAD2/3 or SMAD1/5/8 activation. While this would implicate that different ligands can assemble seemingly identical receptor complexes that activate just either one of two distinct pathways, in vitro and in vivo analyses show that the different TGFβ members exert quite distinct biological functions with high specificity. This discrepancy indicates that our current view of TGFβ signaling initiation just by hetero-oligomerization of two receptor subtypes and transduction via two main pathways in an on-off switch manner is too simplified. Hence, the signals generated by the various TGFβ members are either quantitatively interpreted using the subtle differences in their receptor-binding properties leading to ligand-specific modulation of the downstream signaling cascade or additional components participating in the signaling activation complex allow diversification of the encoded signal in a ligand-dependent manner at all cellular levels. In this review we focus on signal specification of TGFβ members, particularly of BMPs and GDFs addressing the role of binding affinities, specificities, and kinetics of individual ligand-receptor interactions for the assembly of specific receptor complexes with potentially distinct signaling properties.
Cells
2073-4409
10.3390/cells8121579
urn:nbn:de:bvb:20-opus-193869
Cells 2019, 8(12), 1579; https://doi.org/10.3390/cells8121579
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true
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Joachim Nickel
Thomas D. Mueller
eng
uncontrolled
TGFβ/BMP signaling
eng
uncontrolled
ligand-receptor promiscuity
eng
uncontrolled
signal specification
Medizin und Gesundheit
open_access
Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Import
Förderzeitraum 2019
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/19386/cells-08-01579-v2.pdf
17749
2018
eng
15049
8
article
1
2019-02-27
--
--
Replacing the Draize eye test: impedance spectroscopy as a 3R method to discriminate between all GHS categories for eye irritation
Highly invasive animal based test procedures for risk assessment such as the Draize eye test are under increasing criticism due to poor transferability for the human organism and animal-welfare concerns. However, besides all efforts, the Draize eye test is still not completely replaced by alternative animal-free methods. To develop an in vitro test to identify all categories of eye irritation, we combined organotypic cornea models based on primary human cells with an electrical readout system that measures the impedance of the test models. First, we showed that employing a primary human cornea epithelial cell based model is advantageous in native marker expression to the primary human epidermal keratinocytes derived models. Secondly, by employing a non-destructive measuring system based on impedance spectroscopy, we could increase the sensitivity of the test system. Thereby, all globally harmonized systems categories of eye irritation could be identified by repeated measurements over a period of 7 days. Based on a novel prediction model we achieved an accuracy of 78% with a reproducibility of 88.9% to determine all three categories of eye irritation in one single test. This could pave the way according to the 3R principle to replace the Draize eye test.
Scientific Reports
10.1038/s41598-018-33118-2
urn:nbn:de:bvb:20-opus-177492
Scientific Reports (2018) 8:15049. DOI: 10.1038/s41598-018-33118-2
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true
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
C. Lotz
L. Kiesewetter
F. F. Schmid
J. Hansmann
H. Walles
F. Groeber-Becker
eng
uncontrolled
biological models
eng
uncontrolled
electrical and electronic engineering
eng
uncontrolled
regenerative medicine
eng
uncontrolled
tissue engineering
eng
uncontrolled
toxicology
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Förderzeitraum 2018
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/17749/Lotz_Scientific_Reports.pdf
14427
2015
eng
327-378
4
32
article
1
2017-02-09
--
--
Non-animal models of epithelial barriers (skin, intestine and lung) in research, industrial applications and regulatory toxicology
Models of the outer epithelia of the human body namely the skin, the intestine and the lung have found valid applications in both research and industrial settings as attractive alternatives to animal testing. A variety of approaches to model these barriers are currently employed in such fields, ranging from the utilization of ex vivo tissue to reconstructed in vitro models, and further to chip-based technologies, synthetic membrane systems and, of increasing current interest, in silico modeling approaches. An international group of experts in the field of epithelial barriers was convened from academia, industry and regulatory bodies to present both the current state of the art of non-animal models of the skin, intestinal and pulmonary barriers in their various fields of application, and to discuss research-based, industry-driven and regulatory-relevant future directions for both the development of new models and the refinement of existing test methods. Issues of model relevance and preference, validation and standardization, acceptance, and the need for simplicity versus complexity were focal themes of the discussions. The outcomes of workshop presentations and discussions, in relation to both current status and future directions in the utilization and development of epithelial barrier models, are presented by the attending experts in the current report.
ALTEX: Alternatives to Animal Experimentation
10.14573/altex.1510051
urn:nbn:de:bvb:20-opus-144275
ALTEX 32(4), 2015, 327-378. DOI: 10.14573/altex.1510051
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Sarah Gordon
Mardas Daneshian
Joke Bouwstra
Francesca Caloni
Samuel Constant
Donna E. Davies
Gudrun Dandekar
Carlos A. Guzman
Eric Fabian
Eleonore Haltner
Thomas Hartung
Nina Hasiwa
Patrick Hayden
Helena Kandarova
Sangeeta Khare
Harald F. Krug
Carsten Kneuer
Marcel Leist
Guoping Lian
Uwe Marx
Marco Metzger
Katharina Ott
Pilar Prieto
Michael S. Roberts
Erwin L. Roggen
Tewes Tralau
Claudia van den Braak
Heike Walles
Claus-Michael Lehr
eng
uncontrolled
on-a-chip
eng
uncontrolled
asthmatic bronchial epithelium
eng
uncontrolled
vesicle-based barrier
eng
uncontrolled
pulmonary drug-delivery
eng
uncontrolled
epithelial cell culture
eng
uncontrolled
cytotoxicity
eng
uncontrolled
transport studies
eng
uncontrolled
permeability
eng
uncontrolled
in vitro models
eng
uncontrolled
air-liquid interface
eng
uncontrolled
respiratory syncytial virus
eng
uncontrolled
reconstructed human epidermis
eng
uncontrolled
artificial membrane-permeability
eng
uncontrolled
embryonic stem cells
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/14427/155_Gordon_Altex.pdf
26473
2021
eng
9
16
article
1
2022-03-29
--
--
Pilot study on the value of Raman spectroscopy in the entity assignment of salivary gland tumors
Background
The entity assignment of salivary gland tumors (SGT) based on histomorphology can be challenging. Raman spectroscopy has been applied to analyze differences in the molecular composition of tissues. The aim of this study was to evaluate the suitability of RS for entity assignment in SGT.
Methods
Raman data were collected in deparaffinized sections of pleomorphic adenomas (PA) and adenoid cystic carcinomas (ACC). Multivariate data and chemometric analysis were completed using the Unscrambler software.
Results
The Raman spectra detected in ACC samples were mostly assigned to nucleic acids, lipids, and amides. In a principal component-based linear discriminant analysis (LDA) 18 of 20 tumor samples were classified correctly.
Conclusion
In this proof of concept study, we show that a reliable SGT diagnosis based on LDA algorithm appears possible, despite variations in the entity-specific mean spectra. However, a standardized workflow for tissue sample preparation, measurement setup, and chemometric algorithms is essential to get reliable results.
PLoS One
10.1371/journal.pone.0257470
urn:nbn:de:bvb:20-opus-264736
publish
PLoS One (2021) 16:9, e0257470. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0257470
false
true
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Till Jasper Meyer
Elena Gerhard-Hartmann
Nina Lodes
Agmal Scherzad
Rudolf Hagen
Maria Steinke
Stephan Hackenberg
eng
uncontrolled
Head and neck cancers
eng
uncontrolled
salivary gland tumors
eng
uncontrolled
salivary glands
eng
uncontrolled
cancers and neoplasms
eng
uncontrolled
malignant tumors
eng
uncontrolled
lipids
eng
uncontrolled
raman spectroscopy
eng
uncontrolled
surgical oncology
Medizin und Gesundheit
open_access
Klinik und Poliklinik für Hals-, Nasen- und Ohrenkrankheiten, plastische und ästhetische Operationen
Pathologisches Institut
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Förderzeitraum 2021
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/26473/journal.pone.0257470.pdf
27295
2022
eng
doctoralthesis
1
2022-05-19
--
2022-05-05
Vascularization Strategies for Full-Thickness Skin Equivalents to Model Melanoma Progression
Vaskularisierungsstrategien für Vollhautäquivalente zur Modellierung der Melanom-Progression
Malignant melanoma (MM) is the most dangerous type of skin cancer with rising incidences worldwide. Melanoma skin models can help to elucidate its causes and formation or to develop new treatment strategies. However, most of the current skin models lack a vasculature, limiting their functionality and applicability. MM relies on the vascular system for its own supply and for its dissemination to distant body sites via lymphatic and blood vessels. Thus, to accurately study MM progression, a functional vasculature is indispensable. To date, there are no vascularized skin models to study melanoma metastasis in vitro, which is why such studies still rely on animal experimentation.
In the present thesis, two different approaches for the vascularization of skin models are employed with the aim to establish a vascularized 3D in vitro full-thickness skin equivalent (FTSE) that can serve as a test system for the investigation of the progression of MM.
Initially, endothelial cells were incorporated in the dermal part of FTSEs. The optimal seeding density, a spheroid conformation of the cells and the cell culture medium were tested. A high cell density resulted in the formation of lumen-forming shapes distributed in the dermal part of the model. These capillary-like structures were proven to be of endothelial origin by staining for the endothelial cell marker CD31. The established vascularized FTSE (vFTSE) was characterized histologically after 4 weeks of culture, revealing an architecture similar to human skin in vivo with a stratified epidermis, separated from the dermal equivalent by a basement membrane indicated by collagen type IV. However, this random capillary-like network is not functional as it cannot be perfused.
Therefore, the second vascularization approach focused on the generation of a perfusable tissue construct. A channel was molded within a collagen hydrogel and seeded with endothelial cells to mimic a central, perfusable vessel. The generation and the perfusion culture of the collagen hydrogel was enabled by the use of two custom-made, 3D printed bioreactors. Histological assessment of the hydrogels revealed the lining of the channel with a monolayer of endothelial cells, expressing the cell specific marker CD31.
For the investigation of MM progression in vitro, a 3D melanoma skin equivalent was established. Melanoma cells were incorporated in the epidermal part of FTSEs, representing the native microenvironment of the tumor. Melanoma nests grew at the dermo-epidermal junction within the well stratified epidermis and were characterized by the expression of common melanoma markers. First experiments were conducted showing the feasibility of combining the melanoma model with the vFTSE, resulting in skin models with tumors at the dermo-epidermal junction and lumen-like structures in the dermis.
Taken together, the models presented in this thesis provide further steps towards the establishment of a vascularized, perfusable melanoma model to study melanoma progression and metastasis.
Das maligne Melanom (MM) ist die gefährlichste Form von Hautkrebs mit weltweit steigender Inzidenz. Melanom-Hautmodelle können helfen, seine Ursachen und Entstehung aufzuklären oder neue Behandlungsstrategien zu entwickeln. Den meisten bisherigen Hautmodellen fehlt jedoch ein Gefäßsystem, was ihre Funktionalität und Anwendbarkeit einschränkt. Das MM ist auf das Gefäßsystem angewiesen, sowohl für die eigene Versorgung als auch für die Ausbreitung über Lymph- und Blutgefäße zu entfernten Körperstellen. Um die Entwicklung des MM genau zu studieren, ist daher eine funktionelles Gefäßsystem unabdingbar. Bislang gibt es keine vaskularisierten Hautmodelle, um die Melanommetastasierung in vitro zu untersuchen, weshalb solche Studien immer noch auf Tierversuche angewiesen sind.
In der vorliegenden Arbeit werden zwei unterschiedliche Ansätze zur Vaskularisierung von Hautmodellen mit dem Ziel verfolgt, ein vaskularisiertes 3D in vitro Vollhautmodell (full-thickness skin equivalent, FTSE) zu etablieren, das als Testsystem zur Untersuchung der Entwicklung des MM dienen kann.
Einerseits wurden Endothelzellen in den dermalen Teil von FTSEs integriert. Die optimale Aussaatdichte, eine sphäroidale Konformation der Zellen und das Zellkulturmedium wurden getestet. Eine hohe Zelldichte führte zur Bildung von lumenbildenden Formen, die im dermalen Teil des Modells verteilt waren. Diese kapillarähnlichen Strukturen wurden durch Färbung für den Endothelzellmarker CD31 als endothelialen Ursprungs nachgewiesen. Das etablierte vaskularisierte FTSE (vFTSE) wurde nach 4 Wochen Kultur histologisch charakterisiert und zeigte eine der menschlichen Haut in vivo ähnliche Architektur mit einer geschichteten Epidermis, die vom dermalen Äquivalent durch eine Basalmembran, gezeigt durch Kollagen Typ IV, getrennt ist. Dieses zufällige kapillarartige Netzwerk ist jedoch nicht funktional, da es nicht durchblutet werden kann.
Daher konzentrierte sich der zweite Vaskularisierungsansatz auf die Erzeugung eines perfundierbaren Gewebekonstrukts. Ein Kanal wurde in einem Kollagenhydrogel geformt und mit Endothelzellen besiedelt, um ein zentrales, perfundierbares Gefäß zu imitieren. Die Erzeugung und die Perfusionskultur des Kollagenhydrogels wurde durch die Verwendung von zwei speziell angefertigten, 3D-gedruckten Bioreaktoren ermöglicht. Die histologische Beurteilung der Hydrogele zeigte die Auskleidung des Kanals mit einer Einzelschicht von Endothelzellen, die den zellspezifischen Marker CD31 exprimieren.
Für die Untersuchung der MM-Progression in vitro wurde ein 3D-Melanom-Hautäquivalent hergestellt. Melanomzellen wurden in den epidermalen Teil von FTSEs integriert, was die native Mikroumgebung des Tumors darstellt. Die Melanomnester wuchsen an der dermo-epidermalen Grenzfläche innerhalb der gut stratifizierten Epidermis und wurden durch die Expression gängiger Melanommarker charakterisiert. Zusätzlich konnte die Kombination des Melanom-Modells mit dem vFTSE gezeigt werden, was zu Hautmodellen mit Tumoren an der dermo-epidermalen Grenzfläche und lumenartigen Strukturen in der Dermis führte.
Alles in allem bieten die in dieser Arbeit vorgestellten Modelle weitere Schritte hin zur Entwicklung eines vaskularisierten, perfundierbaren Melanommodell zur Erforschung der Melanomprogression und Metastasierung.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-272956
10.25972/OPUS-27295
publish
X 129937
CC BY-NC-ND: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Nicht kommerziell, Keine Bearbeitungen 4.0 International
Anna Leikeim
deu
swd
Tissue Engineering
deu
swd
In-vitro-Kultur
deu
swd
Melanom
eng
uncontrolled
skin model
eng
uncontrolled
vascularization
deu
uncontrolled
in vitro-Testsystem
eng
uncontrolled
perfused hydrogel
Biowissenschaften; Biologie
open_access
Graduate School of Life Sciences
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/27295/Leikeim_Anna_Dissertation.pdf
14510
2015
eng
17576
5
article
1
2017-03-02
--
--
Inhibition of lysyl oxidases improves drug diffusion and increases efficacy of cytotoxic treatment in 3D tumor models
Tumors are characterized by a rigid, highly cross-linked extracellular matrix (ECM), which impedes homogeneous drug distribution and potentially protects malignant cells from exposure to therapeutics. Lysyl oxidases are major contributors to tissue stiffness and the elevated expression of these enzymes observed in most cancers might influence drug distribution and efficacy. We examined the effect of lysyl oxidases on drug distribution and efficacy in 3D in vitro assay systems. In our experiments elevated lysyl oxidase activity was responsible for reduced drug diffusion under hypoxic conditions and consequently impaired cytotoxicity of various chemotherapeutics. This effect was only observed in 3D settings but not in 2D-cell culture, confirming that lysyl oxidases affect drug efficacy by modification of the ECM and do not confer a direct desensitizing effect. Both drug diffusion and efficacy were strongly enhanced by inhibition of lysyl oxidases. The results from the in vitro experiments correlated with tumor drug distribution in vivo, and predicted response to therapeutics in murine tumor models. Our results demonstrate that lysyl oxidase activity modulates the physical barrier function of ECM for small molecule drugs influencing their therapeutic efficacy. Targeting this process has the potential to significantly enhance therapeutic efficacy in the treatment of malignant diseases.
Scientific Reports
10.1038/srep17576
urn:nbn:de:bvb:20-opus-145109
Scientific Reports 5:17576 (2015). DOI: 10.1038/srep17576
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Friedrich Schütze
Florian Röhring
Sandra Vorlová
Sabine Gätzner
Anja Kuhn
Süleyman Ergün
Erik Henke
eng
uncontrolled
human osteosarcoma xenografts
eng
uncontrolled
factor binding profiles
eng
uncontrolled
open-access database
eng
uncontrolled
vascular normalization
eng
uncontrolled
solid tumors
eng
uncontrolled
transcapillary pressure gradient
eng
uncontrolled
hypoxia inducible factor 1
eng
uncontrolled
breast cancer cells
eng
uncontrolled
beta-aminopropionitrile
eng
uncontrolled
pancreatic cancer
Medizin und Gesundheit
open_access
Institut für Klinische Biochemie und Pathobiochemie
Institut für Anatomie und Zellbiologie
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/14510/088_Schuetze_Scientific_Reports.pdf
31330
2023
eng
13
article
1
--
--
--
Software JimenaE allows efficient dynamic simulations of Boolean networks, centrality and system state analysis
The signal modelling framework JimenaE simulates dynamically Boolean networks. In contrast to SQUAD, there is systematic and not just heuristic calculation of all system states. These specific features are not present in CellNetAnalyzer and BoolNet. JimenaE is an expert extension of Jimena, with new optimized code, network conversion into different formats, rapid convergence both for system state calculation as well as for all three network centralities. It allows higher accuracy in determining network states and allows to dissect networks and identification of network control type and amount for each protein with high accuracy. Biological examples demonstrate this: (i) High plasticity of mesenchymal stromal cells for differentiation into chondrocytes, osteoblasts and adipocytes and differentiation-specific network control focusses on wnt-, TGF-beta and PPAR-gamma signaling. JimenaE allows to study individual proteins, removal or adding interactions (or autocrine loops) and accurately quantifies effects as well as number of system states. (ii) Dynamical modelling of cell–cell interactions of plant Arapidopsis thaliana against Pseudomonas syringae DC3000: We analyze for the first time the pathogen perspective and its interaction with the host. We next provide a detailed analysis on how plant hormonal regulation stimulates specific proteins and who and which protein has which type and amount of network control including a detailed heatmap of the A.thaliana response distinguishing between two states of the immune response. (iii) In an immune response network of dendritic cells confronted with Aspergillus fumigatus, JimenaE calculates now accurately the specific values for centralities and protein-specific network control including chemokine and pattern recognition receptors.
Scientific Reports
10.1038/s41598-022-27098-7
urn:nbn:de:bvb:20-opus-313303
@articleKaltdorf.2023, author = Kaltdorf, Martin and Breitenbach, Tim and Karl, Stefan and Fuchs, Maximilian and Kessie, David Komla and Psota, Eric and Prelog, Martina and Sarukhanyan, Edita and Ebert, Regina and Jakob, Franz and Dandekar, Gudrun and Naseem, Muhammad and Liang, Chunguang and Dandekar, Thomas, year = 2023, title = Software JimenaE allows efficient dynamic simulations of Boolean networks, centrality and system state analysis, pages = 1855, volume = 13, number = 1, journal = Scientific Reports, doi = 10.1038/s41598-022-27098-7,
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2023-05-03T15:09:13+00:00
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bibtex
64527919ca3338.53025015
Scientific Reports (2022) 13:1855. https://doi.org/10.1038/s41598-022-27098-7
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true
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Martin Kaltdorf
Tim Breitenbach
Stefan Karl
Maximilian Fuchs
David Komla Kessie
Eric Psota
Martina Prelog
Edita Sarukhanyan
Regina Ebert
Franz Jakob
Gudrun Dandekar
Muhammad Naseem
Chunguang Liang
Thomas Dandekar
eng
uncontrolled
cellular signalling networks
eng
uncontrolled
computer modelling
Medizin und Gesundheit
open_access
Fakultät für Mathematik und Informatik
Kinderklinik und Poliklinik
Lehrstuhl für Orthopädie
Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Förderzeitraum 2022
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/31330/s41598-022-27098-7.pdf
28056
2023
deu
doctoralthesis
1
2022-07-24
--
2022-03-07
Charakterisierung von Zellen aus dem vorderen Kreuzband nach Vorderer- Kreuzband-Ruptur im Hinblick auf das Rupturalter
Characterisation of cells isolated from the ruptured anterior cruciate ligament in regard to the time since rupture
Die Vordere Kreuzband (VKB)-Ruptur ist eine häufige Verletzung, welche eine hohe individuelle und sozioökonomische Belastung verursacht. Eine etablierte Therapie ist die VKB-Plastik, problematisch sind jedoch die hohen Rerupturraten nach operativer Versorgung. In der Annahme, dass Mesenchymale Stammzellen (MSC) eine bedeutende Rolle für die Heilung spielen, sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob ein Zusammenhang zwischen Zahl und Qualität der aus dem VKB isolierten MSC sowie der Latenz zwischen Ruptur und Rekonstruktion besteht und so ein optimaler Therapiezeitraum eingegrenzt werden kann.
Zunächst erfolgte die Zellisolierung aus intraoperativ gewonnenen VKB-Biopsien. Je nach Latenz zwischen Ruptur und Operation wurden drei Gruppen (akute ≙ ≤ 30 d, subakute ≙ 31-90 d, verzögerte Rekonstruktion ≙ > 90 d) gebildet. Zum Nachweis von MSC wurden die Zellen hinsichtlich ihrer Plastikadhärenz, eines multipotenten Differenzierungspotentials sowie eines spezifischen Oberflächenantigenmusters (CD73+, CD90+, CD105+, CD34-) untersucht. Zudem wurde ihr Einflusses auf die biomechanischen und histologischen Eigenschaften eines analysiert.
Der Nachweis von MSC war in allen Gruppen möglich. Das Proliferationspotential war in Gruppe II am größten, ebenso der Anteil der MSC an allen Zellen. Er war 5,4% (4,6% - 6,3%, 95% CI; p < 0,001) höher als in Gruppe I und 18,9% (18,2% - 19,6%, 95% CI; p < 0,001) höher als in Gruppe III. In den mit Zellen kultivierten Bandkonstrukten konnte im Gegensatz zu zellfreien Konstrukten humanes Kollagen I nachgewiesen werden. Die Stabilität nahm bei Kultivierung mit Zellen ab.
Die Ergebnisse legen nahe, dass das Regenerationspotential bei subakuter VKB-Rekonstruktion (31-90 d) am höchsten ist. Potenziell ursächlich sind die Regeneration hemmende Entzündungsprozesse zu Beginn sowie degenerative Prozesse im längerfristigen Verlauf. Zudem konnte gezeigt werden, dass die isolierten Zellen die Eigenschaften eines Bandkonstruktes durch Bildung von Kollagen I und Reduktion der Stabilität im kurzfristigen Verlauf verändern und dementsprechend den Therapieerfolg beeinflussen könnten. Zur Verifizierung der Ergebnisse bedarf es weiterer Untersuchungen.
A ruptured Anterior Cruciate Ligament (ACL) can significantly impact an individual’s health and cause great socioeconomic repercussions. Despite a well-established surgical treatment, the rate of secondary rupture remains high. Previous research has highlighted the important role of Mesenchymal Stem Cells (MSC) in ligament regeneration. This study sets out to analyse possible correlations between the quality and quantity of MSC and the time between rupture and repair, and thus defining the optimal time for surgery.
Cells were isolated from ACL biopsies gained intraoperatively. Three groups (acute ≙ ≤ 30d, subacute ≙ 31-90d and delayed reconstruction ≙ > 90d) were defined based on the time from trauma to surgery. To prove the presence of MSC the cells were analysed for proliferative capacity, adherence to plastic, multilineage differentiation potential, as well as the presence of specific surface antigens (CD73+, CD90+, CD105+ and CD34-). The cells’ ability to support healing was assessed through biomechanical tests and histological analysis of ligament models created using isolated ACL cells and a rat collagen type I-based scaffold.
Cells that fulfil MSC criteria were isolated in all three groups. In the subacute reconstruction group the proportion of cells which fulfilled the criteria was 5.4% (4,6% - 6,3%, 95% CI; p < 0,001) higher than in the acute reconstruction group and 18.9% (18,2% - 19,6%, 95% CI; p < 0,001) higher than in the delayed reconstruction group. Human collagen I could be isolated in ligament models cultivated using ACL cells. However, the stability of the ligament models decreased after cell cultivation.
The results described above suggest that the potential for regeneration is highest in the subacute reconstruction group. This may be because the post traumatic inflammation slows regeneration, while degenerative processes set in in the weeks to months following the rupture. The fact that the presence of human collagen I in the ligament models was associated with decreased stability suggests that the concentration of MSC can affect the surgical outcome. More research into the subject is required to further explore these preliminary findings.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-280568
10.25972/OPUS-28056
publish
X 130315
Deutsches Urheberrecht mit Print on Demand
Eva Katharina Kupczyk
deu
swd
Ligamentum cruciatum anterius
deu
swd
Tissue Engineering
deu
swd
Zellkultur
deu
swd
Kollagen
deu
swd
Stammzelle
deu
uncontrolled
Mesenchymale Stammzellen
deu
uncontrolled
Vorderes Kreuzband
eng
uncontrolled
Anterior Cruciate Ligament
eng
uncontrolled
Mesenchymal Stem Cell
eng
uncontrolled
colllagen
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/28056/Kupczyk_Eva_Dissertation.pdf
17012
2019
deu
doctoralthesis
1
2018-10-26
--
2018-10-23
Entwicklung eines Augenirritationstests zur Identifikation aller GHS-Kategorien für den Endpunkt Augenreizung
Development of an eye irritation test to identify all GHS categories of eye irritation
Die Risikobewertung von Chemikalien ist für die öffentliche Gesundheit von entschei-dender Bedeutung, weshalb strenge Testverfahren zu deren toxikologischer Begutach-tung angewandt werden. Die ursprünglich tierbasierten Testverfahren werden aufgrund von neuen wissenschaftlichen Erkenntnissen und wegen ökonomischer Ineffizienz sowie ethischer Fragwürdigkeit immer mehr durch alternative Methoden ohne Tiermodelle ersetzt. Für den toxikologischen Endpunkt der Augenreizung wurden bereits die ersten alternativen Testsysteme auf der Basis von ex vivo- oder in vitro-Modellen entwickelt. Jedoch ist bis dato kein alternatives Testsystem in der Lage, das gesamte Spektrum der verschiedenen Kategorien der Augenreizungen nach dem global harmonisierten System zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien (GHS) vorherzusagen und damit den tierbasierten Draize-Augenreizungstest vollends zu ersetzen. Gründe hierfür sind fehlende physiologische Merkmale im Modell sowie eine destruktive Analysemethode.
Aufgrund dessen wurden in dieser Studie die Hypothesen getestet, ob ein verbessertes In-vitro-Modell oder eine zerstörungsfreie, hochsensitive Analysemethode die Vorher-sagekraft des Augenreizungstests verbessern können. Dafür wurden zunächst neue Mo-delle aus humanen Hornhaut- und Hautepithelzellen entwickelt. Die Modelle aus pri-mären cornealen Zellen zeigten eine gewebespezifische Expression der Marker Zytokera-tin 3 und 12 sowie Loricrin. In beiden Modellen konnte durch die Verkürzung der Kul-turdauer die Ausbildung einer Hornschicht verhindert werden. Die Modelle wiesen dadurch eine sensiblere Barriere vergleichbar der nativen Cornea auf. Darüber hinaus konnte durch die chemische Quervernetzung mit Polyethylenglykolsuccinimidylglutara-tester ein transparentes, nicht kontrahierendes Stroma-Äquivalent etabliert werden. Der Stroma-Ersatz konnte zur Generierung von Hemi- und Voll-Cornea-Äquivalenten einge-setzt werden und lieferte somit erste Ansatzpunkte für die Rekonstruktion der nativen Hornhaut.
Parallel dazu konnte ein zerstörungsfreies Analyseverfahren basierend auf der Impe-danzspektroskopie entwickelt werden, das wiederholte Messungen der Gewebeintegri-tät zulässt. Zur verbesserten Messung der Barriere in dreidimensionalen Modelle wurde hierfür ein neuer Parameter, der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) bei der Frequenz von 1000 Hz, der TEER1000 Hz definiert, der eine genauere Aussage über die Integrität der Modelle zulässt. Durch die Kombination der entwickelten cornealen Epithelzellmodelle mit der TEER1000 Hz-Messung konnte die Prädikitivität des Augenrei-zungstests auf 78 - 100 % erhöht werden. Von besonderer Bedeutung ist dabei, dass die nicht destruktive Messung des TEER1000 Hz zum ersten Mal erlaubte, die Persistenz von Irritationen durch wiederholte Messungen in einem in vitro-Modell zu erkennen und somit die GHS-Kategorie 1 von GHS-Kategorie 2 zu unterscheiden. Der wissenschaftli-che Gewinn dieser Forschungsarbeit ist ein neues Testverfahren, das alle GHS-Kategorien in einem einzigen in vitro-Test nachweisen und den Draize-Augenreizungstest gänzlich ersetzen kann.
The assessment of the risk of chemicals is of crucial importance for public health. Hence, strict test procedures have been developed for toxicological evaluation of consumer products. The original animal-based test methods are being replaced by alternative methods due to new scientific findings, economic inefficiency and ethical doubts. For the toxicological endpoint of eye irritation, the first alternative test systems based on ex vivo or in vitro models have been developed. However, to date no alternative test meth-od has been able to predict the entire spectrum of eye irritation categories specified in the globally harmonized system for the classification and labelling of chemicals (GHS). Thus, no stand-alone test methods can replace the animal-based Draize eye irritation test resulting in the need of complex integrated testing strategies. Reasons for this are the lack of key physiological characteristics of the implemented models, species specific differences and the employed destructive analysis method.
Therefore, this study tested whether a refinement of the used models or a more sensitive analytical method could improve the predictive power of the eye irritation test. First, new models of human corneal and skin epithelial cells were developed. Since a key fea-ture of the human cornea is a lack of cornification, several parameters such as calcium and retinoic acid to reduce the cornification were investigated. In both models the for-mation of a stratum corneum could be prevented most effectively by shortening the cul-ture time. Hence, the models had a more sensitive barrier comparable to the native cor-nea. However, only the model based on primary cornea cells showed a cornea-specific expression of the markers cytokeratin 3 and 12 as well as loricrin. Models based on skin keratinocytes retained a skin-specific phenotype. In addition, a stromal matrix was de-veloped to allow for the generation of a full-thickness cornea model. For this a cell-seeded collagen hydrogel was chemically cross-linkined via a polyethylene glycol suc-cinimidyl glutarate generating a transparent, non-contracting stroma equivalent.
In parallel, a non-destructive highly sensitive analysis method based on impedance spec-troscopy was developed that allows repeated measurements of the tissue integrity. To improve the measurement of the barrier in three-dimensional models, a new parameter, the transepithelial electrical resistance (TEER) at the frequency of 1000 Hz, the TEER1000 Hz was defined. By combining the developed corneal epithelial cell models with the TEER1000 Hz measurement, the predictivity of the eye irritation test could be increased to 78 - 100 %. Moreover, the TEER1000 Hz allowed for the first time to detect the persistence of irritative effects by repeated measurements in an in vitro model and thus to distinguish between all GHS categories. The scientific yield of this research work is therefore a new test method that can detect all GHS categories in a single in vitro test and holds the possibility to completely replace the Draize eye irritation test.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-170126
10.25972/OPUS-17012
X 128395
CC BY-SA: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Weitergabe unter gleichen Bedingungen 4.0 International
Christian Lotz
deu
swd
Tissue Engineering
eng
uncontrolled
Eye irritation
Biowissenschaften; Biologie
Medizin und Gesundheit
open_access
Graduate School of Life Sciences
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/17012/Lotz_Christian_Eye_Irritation.pdf
19379
2020
eng
28
1
12
article
1
--
2019-12-20
--
Connecting cancer pathways to tumor engines: a stratification tool for colorectal cancer combining human in vitro tissue models with boolean in silico models
To improve and focus preclinical testing, we combine tumor models based on a decellularized tissue matrix with bioinformatics to stratify tumors according to stage-specific mutations that are linked to central cancer pathways. We generated tissue models with BRAF-mutant colorectal cancer (CRC) cells (HROC24 and HROC87) and compared treatment responses to two-dimensional (2D) cultures and xenografts. As the BRAF inhibitor vemurafenib is—in contrast to melanoma—not effective in CRC, we combined it with the EGFR inhibitor gefitinib. In general, our 3D models showed higher chemoresistance and in contrast to 2D a more active HGFR after gefitinib and combination-therapy. In xenograft models murine HGF could not activate the human HGFR, stressing the importance of the human microenvironment. In order to stratify patient groups for targeted treatment options in CRC, an in silico topology with different stages including mutations and changes in common signaling pathways was developed. We applied the established topology for in silico simulations to predict new therapeutic options for BRAF-mutated CRC patients in advanced stages. Our in silico tool connects genome information with a deeper understanding of tumor engines in clinically relevant signaling networks which goes beyond the consideration of single drivers to improve CRC patient stratification.
Cancers
2072-6694
10.3390/cancers12010028
urn:nbn:de:bvb:20-opus-193798
Cancers 2020, 12(1), 28; https://doi.org/10.3390/cancers12010028
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Florentin Baur
Sarah L. Nietzer
Meik Kunz
Fabian Saal
Julian Jeromin
Stephanie Matschos
Michael Linnebacher
Heike Walles
Thomas Dandekar
Gudrun Dandekar
eng
uncontrolled
in silico simulation
eng
uncontrolled
3D tissue models
eng
uncontrolled
colorectal cancer
eng
uncontrolled
BRAF mutation
eng
uncontrolled
targeted therapy
eng
uncontrolled
stratification
Medizin und Gesundheit
open_access
Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Import
Förderzeitraum 2019
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/19379/cancers-12-00028-v2.pdf
22521
2018
eng
e0194052, 1-17
3
13
article
1
2021-02-18
--
--
Structure-Function relationships of equine menisci
Meniscal pathologies are among the most common injuries of the femorotibial joint in both human and equine patients. Pathological forces and ensuing injuries of the cranial horn of the equine medial meniscus are considered analogous to those observed in the human posterior medial horn. Biomechanical properties of human menisci are site-and depth-specific. However, the influence of equine meniscus topography and composition on its biomechanical properties is yet unknown. A better understanding of equine meniscus composition and biomechanics could advance not only veterinary therapies for meniscus degeneration or injuries, but also further substantiate the horse as suitable translational animal model for (human) meniscus tissue engineering. Therefore, the aim of this study was to investigate the composition and structure of the equine knee meniscus in a site-and age-specific manner and their relationship with potential site-specific biomechanical properties. The meniscus architecture was investigated histologically. Biomechanical testing included evaluation of the shore hardness (SH), stiffness and energy loss of the menisci. The SH was found to be subjected to both age and site-specific changes, with an overall higher SH of the tibial meniscus surface and increase in SH with age. Stiffness and energy loss showed neither site nor age related significant differences. The macroscopic and histologic similarities between equine and human menisci described in this study, support continued research in this field.
PLoS ONE
10.1371/journal.pone.0194052
urn:nbn:de:bvb:20-opus-225214
publish
PLoS ONE 13(3): e0194052 (2018)
true
true
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Iris Ribitsch
Christian Peham
Nicole Ade
Julia Duerr
Stephan Handschuh
Johannes Peter Schramel
Claus Vogl
Heike Walles
Monika Egerbacher
Florian Jenner
eng
uncontrolled
Human Medial Meniscus
eng
uncontrolled
Articular-Cartilage
eng
uncontrolled
Biomechanical Properties
eng
uncontrolled
Compressive Properties
eng
uncontrolled
Human Knee
eng
uncontrolled
Collagen
eng
uncontrolled
Injuries
eng
uncontrolled
Models
eng
uncontrolled
Repair
eng
uncontrolled
Osteoarthritis
Biowissenschaften; Biologie
Medizin und Gesundheit
open_access
Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/22521/Structure-Function_relationships.pdf
24606
2021
eng
9
9
article
1
--
2021-09-03
--
A 3D in vitro model for burn wounds: monitoring of regeneration on the epidermal level
Burns affect millions every year and a model to mimic the pathophysiology of such injuries in detail is required to better understand regeneration. The current gold standard for studying burn wounds are animal models, which are under criticism due to ethical considerations and a limited predictiveness. Here, we present a three-dimensional burn model, based on an open-source model, to monitor wound healing on the epidermal level. Skin equivalents were burned, using a preheated metal cylinder. The healing process was monitored regarding histomorphology, metabolic changes, inflammatory response and reepithelialization for 14 days. During this time, the wound size decreased from 25% to 5% of the model area and the inflammatory response (IL-1β, IL-6 and IL-8) showed a comparable course to wounding and healing in vivo. Additionally, the topical application of 5% dexpanthenol enhanced tissue morphology and the number of proliferative keratinocytes in the newly formed epidermis, but did not influence the overall reepithelialization rate. In summary, the model showed a comparable healing process to in vivo, and thus, offers the opportunity to better understand the physiology of thermal burn wound healing on the keratinocyte level.
Biomedicines
2227-9059
10.3390/biomedicines9091153
urn:nbn:de:bvb:20-opus-246068
2021-10-01T12:33:58+00:00
sword
swordwue
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Biomedicines (2021) 9:9, 1153. https://doi.org/10.3390/biomedicines9091153
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CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Verena Schneider
Daniel Kruse
Ives Bernardelli de Mattos
Saskia Zöphel
Kendra-Kathrin Tiltmann
Amelie Reigl
Sarah Khan
Martin Funk
Karl Bodenschatz
Florian Groeber-Becker
eng
uncontrolled
skin models
eng
uncontrolled
open-source epidermis
eng
uncontrolled
wound model
eng
uncontrolled
impedance spectroscopy
eng
uncontrolled
wound physiology
eng
uncontrolled
burn wound
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Import
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/24606/biomedicines-09-01153.pdf
17967
2016
eng
8
11
article
1
2019-04-24
--
--
Human Organotypic Lung Tumor Models: Suitable For Preclinical \(^{18}\)F-FDG PET-Imaging
Development of predictable in vitro tumor models is a challenging task due to the enormous complexity of tumors in vivo. The closer the resemblance of these models to human tumor characteristics, the more suitable they are for drug-development and –testing. In the present study, we generated a complex 3D lung tumor test system based on acellular rat lungs. A decellularization protocol was established preserving the architecture, important ECM components and the basement membrane of the lung. Human lung tumor cells cultured on the scaffold formed cluster and exhibited an up-regulation of the carcinoma-associated marker mucin1 as well as a reduced proliferation rate compared to respective 2D culture. Additionally, employing functional imaging with 2-deoxy-2-[\(^{18}\)F]fluoro-D-glucose positron emission tomography (FDG-PET) these tumor cell cluster could be detected and tracked over time. This approach allowed monitoring of a targeted tyrosine kinase inhibitor treatment in the in vitro lung tumor model non-destructively. Surprisingly, FDG-PET assessment of single tumor cell cluster on the same scaffold exhibited differences in their response to therapy, indicating heterogeneity in the lung tumor model. In conclusion, our complex lung tumor test system features important characteristics of tumors and its microenvironment and allows monitoring of tumor growth and -metabolism in combination with functional imaging. In longitudinal studies, new therapeutic approaches and their long-term effects can be evaluated to adapt treatment regimes in future.
PLoS ONE
10.1371/journal.pone.0160282
urn:nbn:de:bvb:20-opus-179678
PLoS ONE 2016, 11(8):e0160282. DOI:10.1371/journal.pone.0160282
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CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
David Fecher
Elisabeth Hofmann
Andreas Buck
Ralph Bundschuh
Sarah Nietzer
Gudrun Dandekar
Thorsten Walles
Heike Walles
Katharina Lückerath
Maria Steinke
eng
uncontrolled
lung and intrathoracic tumors
eng
uncontrolled
trachea
eng
uncontrolled
adenocarcinoma of the lung
eng
uncontrolled
cancer treatment
eng
uncontrolled
secondary lung tumors
eng
uncontrolled
pulmonary imaging
eng
uncontrolled
extracellular matrix
eng
uncontrolled
collagens
Medizin und Gesundheit
open_access
Klinik und Poliklinik für Thorax-, Herz- u. Thorakale Gefäßchirurgie
Klinik und Poliklinik für Nuklearmedizin
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/17967/Fecher_Plos_One.pdf
19791
2019
eng
1740
10
article
1
--
2019-07-31
--
Biomimetic human tissue model for long-term study of Neisseria gonorrhoeae infection
Gonorrhea is the second most common sexually transmitted infection in the world and is caused by Gram-negative diplococcus Neisseria gonorrhoeae. Since N. gonorrhoeae is a human-specific pathogen, animal infection models are only of limited use. Therefore, a suitable in vitro cell culture model for studying the complete infection including adhesion, transmigration and transport to deeper tissue layers is required. In the present study, we generated three independent 3D tissue models based on porcine small intestinal submucosa (SIS) scaffold by co-culturing human dermal fibroblasts with human colorectal carcinoma, endometrial epithelial, and male uroepithelial cells. Functional analyses such as transepithelial electrical resistance (TEER) and FITC-dextran assay indicated the high barrier integrity of the created monolayer. The histological, immunohistochemical, and ultra-structural analyses showed that the 3D SIS scaffold-based models closely mimic the main characteristics of the site of gonococcal infection in human host including the epithelial monolayer, the underlying connective tissue, mucus production, tight junction, and microvilli formation. We infected the established 3D tissue models with different N. gonorrhoeae strains and derivatives presenting various phenotypes regarding adhesion and invasion. The results indicated that the disruption of tight junctions and increase in interleukin production in response to the infection is strain and cell type-dependent. In addition, the models supported bacterial survival and proved to be better suitable for studying infection over the course of several days in comparison to commonly used Transwell® models. This was primarily due to increased resilience of the SIS scaffold models to infection in terms of changes in permeability, cell destruction and bacterial transmigration. In summary, the SIS scaffold-based 3D tissue models of human mucosal tissues represent promising tools for investigating N. gonorrhoeae infections under close-to-natural conditions.
Frontiers in Microbiology
1664-302X
10.3389/fmicb.2019.01740
urn:nbn:de:bvb:20-opus-197912
Frontiers in Microbiology 2019, 10:1740. doi: 10.3389/fmicb.2019.01740
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Motaharehsadat Heydarian
Tao Yang
Matthias Schweinlin
Maria Steinke
Heike Walles
Thomas Rudel
Vera Kozjak-Pavlovic
eng
uncontrolled
3D tissue model
eng
uncontrolled
small intestinal submucosa scaffold
eng
uncontrolled
co-culture
eng
uncontrolled
infection
eng
uncontrolled
Neisseria gonorrhoeae
Biowissenschaften; Biologie
Medizin und Gesundheit
open_access
Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Import
Förderzeitraum 2019
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/19791/fmicb-10-01740.pdf
15814
2017
eng
e0174884
5
12
article
1
2018-02-27
--
--
Utilizing BMP-2 muteins for treatment of multiple myeloma
Multiple myeloma (MM) represents a haematological cancer characterized by the pathological hyper proliferation of antibody-producing B-lymphocytes. Patients typically suffer from kidney malfunction and skeletal disorders. In the context of MM, the transforming growth factor β (TGFβ) member Activin A was recently identified as a promoter of both accompanying symptoms. Because studies have shown that bone morphogenetic protein (BMP)-2-mediated activities are counteracted by Activin A, we analysed whether BMP2, which also binds to the Activin A receptors ActRII and ActRIIB but activates the alternative SMAD-1/5/8 pathway, can be used to antagonize Activin A activities, such as in the context of MM. Therefore three BMP2 derivatives were generated with modified binding activities for the type II (ActRIIB) and/or type I receptor (BMPRIA) showing either increased or decreased BMP2 activity. In the context of MM these BMP2 muteins show two functionalities since they act as a) an anti-proliferative/apoptotic agent against neoplastic B-cells, b) as a bone-formation promoting growth factor. The molecular basis of both activities was shown in two different cellular models to clearly rely on the properties of the investigated BMP2 muteins to compete for the binding of Activin A to the Activin type II receptors. The experimental outcome suggests new therapeutic strategies using BMP2 variants in the treatment of MM-related pathologies.
PLoS ONE
10.1371/journal.pone.0174884
urn:nbn:de:bvb:20-opus-158144
PLoS ONE 12(5): e0174884 (2017). DOI: 10.1371/journal.pone.0174884
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Axel Seher
Charlotte Lagler
Thorsten Stühmer
Urs Dietmar Achim Müller-Richter
Alexander Christian Kübler
Walter Sebald
Thomas Dieter Müller
Joachim Nickel
eng
uncontrolled
multiple myeloma
eng
uncontrolled
signaling
eng
uncontrolled
cell proliferation
eng
uncontrolled
cell binding
eng
uncontrolled
membrane receptor signaling
eng
uncontrolled
BMP
eng
uncontrolled
gene expression
eng
uncontrolled
B cell receptors
eng
uncontrolled
B cells
Medizin und Gesundheit
open_access
Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Plastische Gesichtschirurgie
Abteilung für Molekulare Innere Medizin (in der Medizinischen Klinik und Poliklinik II)
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Förderzeitraum 2017
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/15814/Seher_Plos_One.pdf
16935
2020
eng
doctoralthesis
1
2018-10-19
--
2018-10-09
Induction of ectopic bone formation by site directed immobilized BMP2 variants \(in\) \(vivo\)
Induktion ektoper Knochenbildung durch gerichtet immobilisierte BMP2-Varianten \(in\) \(vivo\)
In contrast to common bone fractures, critical size bone defects are unable to self-regenerate and therefore external sources for bone replacement are needed. Currently, the gold standard to treat critical size bone fractures, resulting from diseases, trauma or surgical interventions, is the use of autologous bone transplantation that is associated with several drawbacks such as postoperative pain, increased loss of blood during surgery and extended operative time.
The field of bone tissue engineering focuses on the combination of biomaterials and growth factors to circumvent these adverse events and thereby to improve critical size bone defects treatment.
To this aim, a promising approach is represented by using a collagen sponge soaked with one of the most powerful osteoinductive proteins, the bone morphogenetic protein 2 (BMP2). After the approval by the Food and Drug Administration (FDA), BMP2 was used to successfully treat several severe bone defects. However, the use of BMP2 delivery systems is associated with severe side effects such as inflammation, swelling, ectopic bone formation outside of the site of implantation and breathing problems if implanted in the area of the cervical spine. The occurrence of severe side effects is related to the supraphysiological amounts of the applied protein at the implantation site. The BMP2 is typically adsorbed into the scaffold and diffuses rapidly after implantation. Therefore, intensive research has been conducted to improve the protein’s retention ability, since a prolonged entrapment of the BMP2 at the implantation site would induce superior bone formation in vivo due to a minimized protein release. By controlling the release from newly designed materials or changing the protein immobilization methods, it seems possible to improve the osteoinductive properties of the resulting BMP2-functionalized scaffolds.
The combination of biocompatible and biodegradable scaffolds functionalized with a covalently immobilized protein such as BMP2 would constitute a new alternative in bone tissue engineering by eliminating the aforementioned severe side effects. One of the most common immobilization techniques is represented by the so-called EDC/NHS chemistry. This coupling technique allows covalent biding of the growth factor but in a non-site direct manner, thus producing an implant with uncontrollable and unpredictable osteogenic activities. Therefore, the generation of BMP2 variants harboring functional groups that allow a site-directed immobilization to the scaffold, would enable the production of implants with reproducible osteogenic activity.
The new BMP2 variants harbor an artificial amino acid at a specific position of the mature polypeptide sequence. The presence of the unnatural amino acid allows to use particular covalent immobilization techniques in a highly specific and site directed manner. The two selected BMP2 variants, BMP2 E83Plk and BMP2 E83Azide, were expressed in E. coli, renatured and purified by cation exchange chromatography. The final products were intensively analyzed in terms of purity and biological activity in vitro. The two BMP2 variants enabled the application of different coupling techniques and verify the possible options for site directed immobilization to the scaffold.
Intensive analyses on the possible side effects caused by the coupling reactions and on the quantification of the coupled protein were performed. Both click chemistry reactions showed high reaction efficacies when the BMP2 variants were coupled to functionalized fluorophores. Quantification by ELISA and scintillation counting of radioactively labeled protein revealed different outcomes. Moreover, the amounts of protein detected for the BMP2 variants coupled to microspheres were similar to that of the wild type protein. Therefore, it was not possible to conclude whether the BMP2 variants were covalently coupled or just adsorbed.
BMP2 variants being immobilized to various microspheres induced osteogenic differentiation of C2C12 cells in vitro, but only in those cells that were located in close proximity to the functionalized beads. This selectivity strongly indicates that the protein is for a great portion covalently coupled and not just adsorbed. Moreover, the difference between the covalently coupled BMP2 variants and the adsorbed BMP2 WT was confirmed in vivo. Injection of the BMP2-functionalized microspheres in a rat model induced subcutaneous bone formation.
The main aim of the animal experiment was to prove whether covalently coupled BMP2 induces bone formation at significant lower doses if compared to the amount being required if the protein is simply adsorbed. To this aim, several BMP2 concentrations were tested in this animal experiment. The BMP2 variants, being covalently immobilized, were hypothesized to be retained and therefore bio-available at the site of implantation for a prolonged time. However, in the animal experiments, lower doses of either coupled or adsorbed protein were unable to induce any bone formation within the 12 weeks.
In contrast, the highest doses induced bone formation that was first detected at week 4. During the 12 weeks of the experiment, an increase in bone density and a steady state bone volume was observed. These results were obtained only for the covalently coupled BMP2 E83Azide but not for BMP2 E83Plk that did not induce bone formation in any condition. The negative outcome after application of BMP2 E83Plk suggested that the coupling reaction might have provoked changes in the protein structure that extremely influenced its osteogenic capabilities in vivo.
However, the histological examination of the different ossicles induced either by BMP2 WT or BMP2 E83Azide, revealed clear morphological differences. BMP2 WT induced a bone shell-like structure, while the covalently coupled protein induced uniform bone formation also throughout the inner part. The differences between the two newly formed bones can be clearly associated with the different protein delivery mechanisms. Thus, the developed functionalized microspheres constitute a new interesting strategy that needs further investigations in order to be able to be used as replacement of the currently used BMP2 WT loaded medical devices.
Knochendefekte kritischer Größe sind im Vergleich zu normalen Knochenfrakturen nicht in der Lage selbst zu heilen. Daher werden zusätzlich Knochenersatzmaterialien zu deren Heilung benötigt. Der derzeitige Goldstandard in der Behandlung dieser Defekte, die durch Krankheiten, Traumata oder durch chirurgische Eingriffe hervorgerufen werden können, ist Transplantation autologen Knochens, was jedoch mit einigen Nachteilen verbunden ist. Als Alternative können neuartige biokompatible Materialien mit intrinsischem osteogenen Potential verwendet werden. Solche Materialien können Wachstumsfaktoren beinhalten welche aktiv die Heilung des beschädigten Knochens fördern.
Ein vielversprechender Ansatz um dieses Ziel zu erreichen, ist der Einsatz eines Kollagenträgers, welcher mit einem der stärksten osteoinduktiven Proteine, dem Bone Morphogenic Protein 2 (BMP2) dotiert ist. Nach der Genehmigung durch die Food and Drug Administration (FDA), wurde BMP2 erfolgreich bei der Behandlung von schwerwiegenden Knochendefekten eingesetzt. Daher wird es als bisher beste Alternative zu autologen Transplantaten sowie als beste Möglichkeit zur Anregung der Knochenneubildung angesehen. Nichtdestotrotz geht der Einsatz von mit BMP2 beladenen Trägersystemen mit Nebenwirkungen, wie Entzündungen Schwellungen, Knochenwucherungen abseits des behandelten Defektes sowie Atembeschwerden bei Behandlungen im Bereich der Halswirbelsäule einher. Die Nebenwirkungen werden durch die supraphysiologische Menge an Protein, mit der die Trägerstruktur beladen wird hervorgerufen. Jedoch ist solch eine Menge an Protein nötig, da die Abgabe des Proteins an der Transplantationsstelle sehr schnell abläuft. Deshalb konzentriert sich die Forschung auf die Verbesserung der Freisetzungskinetik, da ein längerer Verbleib des BMP2 an der Implantationsstelle sowie eine verringerte Freisetzung des Proteins eine bessere Knochenbildung in vivo herbeiführt. Die Freisetzungskinetik kann durch die Eigenschaften neu entwickelter Materialien selbst oder durch alternative Methoden der Kopplung des Proteins an die Trägerstruktur verändert werden.
Die Kombination aus biokompatiblen sowie biodegradierbaren Trägerstrukturen, an die über kovalente Bindungen BMP2 gebunden wird, stellt eine vielversprechende Alternative dar, welche die vorgenannten Nebenwirkungen bei der Knochenregeneration eliminiert. Die am häufigsten eingesetzte Methode zur kovalenten Anbindung von Proteinen an Trägerstukturen erfolgt über die sogenannte EDC/NHS-Chemie. Diese Technik erlaubt die allerdings nur eine ungerichtete Anbindung wodurch die standardisierte Reproduktion eines möglichen Medizinproduktes erschwert wird. Als Resultat entstehen sehr wahrscheinlich Implantate mit unvorhersehbaren osteogenen Eigenschaften. Die Herstellung von BMP2-Varianten, welche gerichtet an Trägerstrukturen gekoppelt werden können, ermöglicht die Herstellung von Implantaten mit reproduzierbarer osteogener Aktivität.
Alle hier vorgestellte Varianten beinhalten eine artifizielle Aminosäure an einer bestimmten Stelle in der Polypeptidsequenz. Die künstliche Aminosäure ermöglicht den Einsatz spezieller Kopplungschemien für kovalente Bindungen, welche dadurch per Definition spezifisch und gerichtet sind. Für weiterführende Experimente wurden die folgende BMP2-Varianten ausgewählt: BMP2 E83Plk und BMP2 E83Azide. Diese wurden durch Expression in E. coli gewonnen, renaturiert und mittels Ionenchromatographie aufgereinigt. Die gewonnenen Produkte wurden hinsichtlich ihrer Reinheit und biologischen Aktivität in vitro untersucht. Beide BMP2 Varianten ermöglichen den Einsatz verschiedener Kopplungstechniken an geeignete Trägerstrukturen.
Analysen hinsichtlich möglicher Nebenwirkungen aufgrund der Kupplungsreaktion sowie die genaue Quantifizierung der gekoppelten Proteine auf den Mikrosphären wurden durchgeführt. Beide Kopplungsstrategien zeigten eine hohe Effizienz wobei für die Quantifizierung der Proteinmengen mittels ELISA und Szintillationszählung unterschiedliche Werte gemessen wurden. Des Weiteren war die gemessene Proteinmenge von an Mikrosphären gekoppelten BMP2 Varianten in einem ähnlichen Bereich, wie die bei der ungekoppelten BMP2 WT Kontrolle gemessen wurden. Daher war es nicht möglich zu bestimmen, inwieweit die verwendeten BMP2-Varianten kovalent gebunden oder lediglich adsorbiert waren.
Die BMP2 Varianten, die anhand der verwendeten Kopplungschemie in kovalent gebundener Form vorliegenden sollten, induzierten unabhängig vom jeweils verwendeten Material der Sphären die osteogene Differenzierung von C2C12 Zellen die in unmittelbarem Kontakt zu diesen Sphären standen. Im Falle von BMP2 WT beinhaltenden Sphären wurde auch Zelldifferenzierung in Distanz zu den einzelnen Sphären beobachten, was auf Diffusionsprozesse hindeutet. Da dies im Falle der kovalent gekoppelten BMP-2 Varianten nicht beobachtet werden konnte zeigt, dass das Protein hier zum Großteil kovalent gebunden vorliegt und nicht nur adsorbiert wird. Unterschiede zwischen den kovalent gebundenen BMP2 Varianten und dem adsorbierten Wildtyp zeigten sich auch in den Tierexperimenten. Mikrosphären, welche mit BMP2 WT oder einem der beiden BMP2 Varianten beladenen waren, wurden einer Ratte subkutan injiziert, was zu einer ektopen Knochenbildung führte. Das Ziel des Tierversuches war, zu überprüfen, ob geringere Dosen an kovalent gebundenem BMP2, verglichen mit der hohen benötigten Menge an adsorbiertem Protein diese Knochenneubildung induzieren kann. Dabei wurden verschiedene BMP2 Konzentrationen getestet.
Die Hypothese war, dass die kovalent gebundenen BMP2 Varianten zurückgehalten werden beziehungsweise langsamer freigesetzt werden und daher über einen längeren Zeitraum an der Implantationsstelle wirksam sind. Allerdings konnte im Tierversuch weder durch niedrig dosiertes (< 10 μg) kovalent gebundenes noch durch adsorbiertes Protein innerhalb von 12 Wochen ektope Knochenbildung induziert werden.
Dagegen konnte mit der höchsten Dosis bereits nach 4 Wochen Knochenbildung nachgewiesen werden. Während des zwölfwöchigen Experiments konnte ein Anstieg der Knochendichte und ein Steady State des Knochenvolumens beobachtet werden. Dies traf jedoch nur für das kovalent gebundene BMP2 E83Azide zu, jedoch nicht für das BMP2 E83Plk, welches bei allen Dosen kein Knochenwachstum hervorrufen konnte. Das negative Ergebnis nach der Gabe von BMP2 E83Plk deutet darauf hin, dass die hier verwendete Kopplungschemie möglicherweise eine Veränderung der Proteinstruktur bewirkt und dadurch die biologische Aktivität des Proteins verloren geht.
Allerdings zeigten histologische Untersuchungen der gebildeten Knochenstrukturen, welche durch BMP2 WT oder durch BMP2 E83Azide hervorgerufen wurden, deutliche morphologische Unterschiede. BMP2 WT erzeugt eine solide schalenförmige Strukturen während das kovalent gebundene Protein ein eher gleichförmiges Knochenwachstum induziert, auch im Inneren der gebildeten Knochenstruktur, welches hier Reste implantierten Mikrosphären umschließt. Dies konnte nicht in den durch BMP2 WT induzierten Knochenstrukturen nachgewiesen werden. Der Unterschied zwischen den zwei Formen neu gebildeten Knochens kann mit den verschiedenen Freisetzungsmechanismen in Verbindung gebracht werden. Daher stellt die Entwicklung funktionalisierter Mikrosphären eine neue interessante Strategie dar, welche weiterführende Untersuchungen benötigt, um die aktuell genutzten BMP2 WT beinhaltenden Medizinprodukte zu ersetzen.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-169359
10.25972/OPUS-16935
X 128999
CC BY-NC-ND: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Nicht kommerziell, Keine Bearbeitungen 4.0 International
Claudia Siverino
eng
uncontrolled
Bone morphogenetic protein 2
eng
uncontrolled
ectopic bone formation
eng
uncontrolled
site directed immobilization
eng
uncontrolled
bone regeneration
eng
uncontrolled
in vivo study
Biowissenschaften; Biologie
Medizin und Gesundheit
open_access
Graduate School of Life Sciences
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/16935/Siverino_Claudia_Dissertation.pdf
22862
2018
eng
1-7
1,1700344
13
article
1
2021-03-02
--
--
In Vivo-Like Culture Conditions in a Bioreactor Facilitate Improved Tissue Quality in Corneal Storage
The cornea is the most-transplanted tissue worldwide. However, the availability and quality of grafts are limited due to the current methods of corneal storage. In this study, a dynamic bioreactor system is employed to enable the control of intraocular pressure and the culture at the air-liquid interface. Thereby, in vivo-like storage conditions are achieved. Different media combinations for endothelium and epithelium are tested in standard and dynamic conditions to enhance the viability of the tissue. In contrast to culture conditions used in eye banks, the combination of the bioreactor and biochrom medium 1 allows to preserve the corneal endothelium and the epithelium. Assessment of transparency, swelling, and the trans-epithelial-electrical-resistance (TEER) strengthens the impact of the in vivo-like tissue culture. For example, compared to corneas stored under static conditions, significantly lower optical densities and significantly higher TEER values were measured (p-value <0.05). Furthermore, healing of epithelial defects is enabled in the bioreactor, characterized by re-epithelialization and initiated stromal regeneration. Based on the obtained results, an easy-to-use 3D-printed bioreactor composed of only two parts was derived to translate the technology from the laboratory to the eye banks. This optimized bioreactor facilitates noninvasive microscopic monitoring. The improved storage conditions ameliorate the quality of corneal grafts and the storage time in the eye banks to increase availability and reduce re-grafting.
Biotechnology Journal
10.1002/biot.201700344
urn:nbn:de:bvb:20-opus-228620
publish
Biotechnol. J. 2018, 13, 1700344
true
true
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Richard Schmid
Ioana-Sandra Tarau
Angela Rossi
Stefan Leonhardt
Thomas Schwarz
Sebastian Schuerlein
Christian Lotz
Jan Hansmann
eng
uncontrolled
bioreactor
eng
uncontrolled
corneal endothelium
eng
uncontrolled
corneal epithelium
eng
uncontrolled
corneal storage
eng
uncontrolled
tissue culture
Medizin und Gesundheit
open_access
Augenklinik und Poliklinik
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/22862/In_Vivo-Like_Culture_Conditions.pdf
17347
2017
eng
7
article
1
2018-12-03
--
--
miR-16 and miR-103 impact 5-HT4 receptor signalling and correlate with symptom profile in irritable bowel syndrome
Irritable bowel syndrome (IBS) is a gut-brain disorder involving alterations in intestinal sensitivity and motility. Serotonin 5-HT4 receptors are promising candidates in IBS pathophysiology since they regulate gut motor function and stool consistency, and targeted 5-HT4R selective drug intervention has been proven beneficial in subgroups of patients. We identified a single nucleotide polymorphism (SNP) (rs201253747) c.*61 T > C within the 5-HT4 receptor gene \(HTR4\) to be predominantly present in diarrhoea-IBS patients (IBS-D). It affects a binding site for the miR-16 family and miR-103/miR-107 within the isoforms \({HTR4b/i}\) and putatively impairs \(HTR4\) expression. Subsequent miRNA profiling revealed downregulation of miR-16 and miR-103 in the jejunum of IBS-D patients correlating with symptoms. \(In\) \(vitro\) assays confirmed expression regulation via three 3′UTR binding sites. The novel isoform \(HTR4b\_2\) lacking two of the three miRNA binding sites escapes miR-16/103/107 regulationin SNP carriers. We provide the first evidence that \(HTR4\) expression is fine-tuned by miRNAs, and that this regulation is impaired either by the SNP c.*61 T > C or bydiminished levels of miR-16 and miR-103 suggesting that \(HTR4\) might be involved in the development of IBS-D.
Scientific Reports
10.1038/s41598-017-13982-0
29089619
urn:nbn:de:bvb:20-opus-173478
Scientific Reports (2017) 7:14680. https://doi.org/10.1038/s41598-017-13982-0
true
true
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Carolin Wohlfarth
Stefanie Schmitteckert
Janina D. Härtle
Lesley A. Houghton
Harsh Dweep
Marina Fortea
Ghazaleh Assadi
Alexander Braun
Tanja Mederer
Sarina Pöhner
Philip P. Becker
Christine Fischer
Martin Granzow
Hubert Mönnikes
Emeran A. Mayer
Gregory Sayuk
Guy Boeckxstaens
Mira M. Wouters
Magnus Simrén
Greger Lindberg
Bodil Ohlsson
Peter Thelin Schmidt
Aldona Dlugosz
Lars Agreus
Anna Andreasson
Mauro D'Amato
Barbara Burwinkel
Justo Lorenzo Bermejo
Ralph Röth
Felix Lasitschka
Maria Vicario
Marco Metzger
Javier Santos
Gudrun A. Rappold
Cristina Martinez
Beate Niesler
eng
uncontrolled
Medicine
eng
uncontrolled
Gene regulation
eng
uncontrolled
Irritable bowel syndrome
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/17347/Wohlfahrt_s41598-017-13982-0.pdf
15376
2017
eng
doctoralthesis
1
2017-10-03
--
2017-05-23
Site Directed Immobilization of BMP-2: Two Approaches for the Production of Osteoinductive Scaffolds
Gerichtete Immobilisierung von BMP-2: Zwei Ansätze zur Herstellung osteogener Trägerstrukturen
Bone fractures typically heal without surgical intervention. However, pathological situations exist which impede the healing process resulting in so-called non-union fractures. Such fractures are nowadays treated with scaffold material being introduced into the defect area. These scaffolds can be doped with osteogenic factors, such as bone morphogenetic protein (BMP)2. BMP2 belongs to the most osteogenic growth factors known to date. Its medical use, efficiency and safety have been approved by FDA for certain applications. Currently, BMP2 is distributed with a stabilizing scaffold, which is simply soaked with the growth factor. Due to fast release kinetics supraphysiological high doses of BMP2 are required which are causally associated with severe side effects observed in certain applications being most harmful in the area of the cervical spine. These side-effects include inflammation, swelling and breathing problems, leading to disastrous consequences or secondary surgical interventions. Since it could be shown that a retardation of BMP2 release from the scaffold resulted in superior bone forming properties in vivo, it seems obvious to further reduce this release to a minimum. This can be achieved by covalent coupling which in the past was already elaborated using mainly classical EDC/NHS chemistry. Using this technique coupling of the protein occurs non-site-directedly leading mainly to an unpredictable product outcome with variable osteogenic activities. In order to improve the reproducibility of scaffold functionalization by BMP2 we created variants one of which contains a unique unnatural amino acid substitution within the mature polypeptide sequence (BMP2-K3Plk) and another, BMP2-A2C, in which an N-terminal alanine has been substituted by cysteine. These modifications enable site-specific and covalent immobilization of BMP2 e.g. onto polymeric beads. Both proteins were expressed in E. coli, renatured and purified by cation-exchange chromatography. Both variants were extensively analyzed in terms of purity and biological activity which was tested by in vitro interaction analyses as well as in cell based assays. Both proteins could be successfully coupled to polymeric beads. The different BMP2 functionalized beads were shown to interact with the ectodomain of the type I receptor BMPR-IA in vitro indicating that the biological activity of both BMP2 variants retained upon coupling. Both functionalized beads induced osteogenic differentiation C2C12 cells but only of those cells which have been in close contact to the particular beads. This strongly indicates that the BMP2 variant are indeed covalently coupled and not just adsorbed.
We claim that we have developed a system for a site-specific and covalent immobilization of BMP-2 onto solid scaffolds, potentially eliminating the necessity of high-dose scaffold loading. Since immobilized proteins are protected from removal by extracellular fluids, their activities now rely mainly on the half-life of the used scaffold and the rate of proteolytic degradation. Assuming that due to prolonged times much lower loading capacities might be required we propose that the immobilization strategy employed in this work may be further refined and optimized to replace the currently used BMP2-containing medical products.
Knochenbrüche heilen typischerweise ohne die Notwendigkeit chirurgischer Eingriffe. Es gibt jedoch pathologische Situationen, in denen keine Heilung erfolgt was zur Ausbildung sogenannter non-union Frakturen führt. Solche Frakturen werden heutzutage mit Trägermaterialen versorgt, welche in die Defektzonen eingebracht werden. Diese Trägermaterialien können mit osteogen wirkenden Faktoren dotiert sein, z.B. mit bone morphogenetic protein (BMP)2. BMP2 gehört zu den am meisten osteogen wirkenden Faktoren, welche derzeit bekannt sind. Die Nutzung dieses Faktors als Medikament, wurde aufgrund seiner Effizienz und der Sicherheit in der Anwendung von der FDA für bestimmte Anwendungsgebiete zugelassen. Derzeit wird BMP2 mit einer stabilisierenden Trägerstruktur vertrieben, wobei diese einfach mit dem Wachstumsfaktor getränkt wird. Aufgrund schneller Freisetzungskinetiken werden unphysiologisch hohe Mengen von BMP2 gebraucht, welche in Beziehung zu extremen Nebeneffekten gebracht werden, die bei verschiedenen Anwendungen, speziell im Wirbelsäulenbereich, beobachtet werden konnten. Die Nebeneffekte umfassen Endzündungen, einhergehend mit Schwellungen und Atemprobleme, welche weitere Operationen nach sich ziehen können. Da bereits gezeigt werden konnte, dass eine Verzögerung der BMP2 Freisetzung aus der Trägerstruktur eine Verbesserung der osteogenen Wirkung mit sich bringt erscheint es offensichtlich, diese Freisetzung auf ein Minimum zu reduzieren. Dies kann durch kovalente Anbindung erreicht werden, was bereits in der Vergangenheit durch die Verwendung klassischer EDC/NHS Kopplungschemie versucht wurde. Bei dieser Art der Anbindung wird das Protein ungerichtet gekoppelt, was zu unvorhersagbaren Produktqualitäten mit variablen osteogenen Aktivitäten führt.
Um eine Reproduktion solcher Funktionalisierungen mit BMP2 zu ermöglichen wurden zwei BMP-2 Varianten erzeigt, wobei bei einer der Varianten eine Aminosäure im N-terminalen Teil des reifen Proteinteils gegen eine unnatürliche Aminosäure BMP2-Plk), bei der anderen ein Alanin gegen ein Cystein ausgetauscht wurde BMP2-A2C. Durch diesen Austausch wird es möglich, diese Varianten gerichtet an polymere Strukturen anzubinden. Beide Proteine wurden in E. coli exprimiert, renaturiert und mittels Kationenaustausch-Chromatographie aufgereinigt. Die resultierenden Proteinprodukte wurden intensiv bzgl. ihres Reinheitsgrades sowie ihrer biologischen Aktivität überprüft. Letzteres erfolgte sowohl durch In-vitro Interaktions-Analysen als auch durch zellbasierte Untersuchungen. Beide Proteine konnten erfolgreich an polymere Strukturen ("beads") gekoppelt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die verschiedenen BMP2 funktionalisierten beads mit isolierten Ektodomänen des BMP Typ I Rezeptors (BMPR-IA) interagieren. Dies belegt, dass die biologische Aktivität auch nach der Kopplung erhalten bleibt. Die funktionalisierten beads induzieren die osteogene Differenzierung von C2C12 Zellen. Die Differenzierung erfolgt aber nur in jenen Zellen die im direkten Kontakt zu den beads stehen. Dies legt nahe, dass beide BMP2 Varianten wirklich kovalent gekoppelt und nicht nur adsorbiert sind.
Es kann behauptet werden, dass im Rahmen dieser Arbeit ein System entwickelt wurde, durch das eine gerichtete Immobilisierung von BMP2 an solide Oberflächen möglich ist. Dadurch können möglicherweise die notwendigen BMP2 Mengen reduziert werden, da bereits Subnanogram Mengen der gekoppelten BMP2 Varianten Osteogenese auslösen können. Da gekoppelte Proteine nicht durch interstitielle Flüssigkeiten entfernt werden können unterliegt die Fortdauer ihrer biologischen Aktivität der Halbwertszeit des verwendeten Trägermaterials, was durch die verlängerten Wirkzeiten eine Verringerung der verwendeten Wachstumsfaktormenge ermöglicht. Es wird beabsichtigt diese Kopplungsstrategie weiterzuentwickeln um die derzeit am Markt befindlichen BMP2 beinhaltenden Medizinprodukte ersetzen zu können.
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X 127477
CC BY-NC-ND: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Nicht kommerziell, Keine Bearbeitungen 4.0 International
Barbara Tabisz
deu
swd
Protein chemistry
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uncontrolled
BMP-2
eng
uncontrolled
protein immobilization
eng
uncontrolled
site-specific immobilization
Biowissenschaften; Biologie
Medizin und Gesundheit
open_access
Graduate School of Life Sciences
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
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18741
2016
eng
229-251
2
417
article
1
2019-09-16
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White paper on guidelines concerning enteric nervous system stem cell therapy for enteric neuropathies
Over the last 20 years, there has been increasing focus on the development of novel stem cell based therapies for the treatment of disorders and diseases affecting the enteric nervous system (ENS) of the gastrointestinal tract (so-called enteric neuropathies). Here, the idea is that ENS progenitor/stem cells could be transplanted into the gut wall to replace the damaged or absent neurons and glia of the ENS. This White Paper sets out experts' views on the commonly used methods and approaches to identify, isolate, purify, expand and optimize ENS stem cells, transplant them into the bowel, and assess transplant success, including restoration of gut function. We also highlight obstacles that must be overcome in order to progress from successful preclinical studies in animal models to ENS stem cell therapies in the clinic.
Developmental Biology
10.1016/j.ydbio.2016.04.001
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CC BY-NC-ND: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Nicht kommerziell, Keine Bearbeitungen 4.0 International
Alan J. Burns
Allan M. Goldstein
Donald F. Newgreen
Lincon Stamp
Karl-Herbert Schäfer
Marco Metzger
Ryo Hotta
Heather M. Young
Peter W. Andrews
Nikhil Thapar
Jaime Belkind-Gerson
Nadege Bondurand
Joel C. Bornstein
Wood Yee Chan
Kathryn Cheah
Michael D. Gershon
Robert O. Heuckeroth
Robert M.W. Hofstra
Lothar Just
Raj P. Kapur
Sebastian K. King
Conor J. McCann
Nandor Nagy
Elly Ngan
Florian Obermayr
Vassilis Pachnis
Pankaj J. Pasricha
Mai Har Sham
Paul Tam
Pieter Vanden Berghe
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Neural crest cells
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Rat mynteric plexus
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Intestinal pseudoobstruction
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Hirschsprung disease liability
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Slow-transit constipation
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Oxide synthase gene
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Term follow-up
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Nitric-oxide
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In-vivo
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Enteric neuropathies
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Hirschsprung disease
Biowissenschaften; Biologie
Medizin und Gesundheit
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Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
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21974
2020
eng
8
article
1
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hBMSC-Derived Extracellular Vesicles Attenuate IL-1β-Induced Catabolic Effects on OA-Chondrocytes by Regulating Pro-inflammatory Signaling Pathways
Background: Human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (hBMSCs) provide a promising therapeutic approach in the cell-based therapy of osteoarthritis (OA). However, several disadvantages evolved recently, including immune responses of the host and regulatory hurdles, making it necessary to search for alternative treatment options. Extracellular vesicles (EVs) are released by multiple cell types and tissues into the extracellular microenvironment, acting as message carriers during intercellular communication. Here, we investigate putative protective effects of hBMSC-derived EVs as a cell-free approach, on IL-1β-stimulated chondrocytes obtained from OA-patients.
Methods: EVs were harvested from the cell culture supernatant of hBMSCs by a sequential ultracentrifugation process. Western blot, scanning electron microscopy (SEM), and nanoparticle tracking analysis (NTA) were performed to characterize the purified particles as EVs. Intracellular incorporation of EVs, derived from PHK26-labeled hBMSCs, was tested by adding the labeled EVs to human OA chondrocytes (OA-CH), followed by fluorescence microscopy. Chondrocytes were pre-stimulated with IL-1β for 24 h, followed by EVs treatment for 24 h. Subsequently, proliferation, apoptosis, and migration (wound healing) were analyzed via BrdU assay, caspase 3/7 assay, and scratch assay, respectively. With qRT-PCR, the relative expression level of anabolic and catabolic genes was determined. Furthermore, immunofluorescence microscopy and western blot were performed to evaluate the protein expression and phosphorylation levels of Erk1/2, PI3K/Akt, p38, TAK1, and NF-κB as components of pro-inflammatory signaling pathways in OA-CH.
Results: EVs from hBMSCs (hBMSC-EVs) promote proliferation and reduce apoptosis of OA-CH and IL-1β-stimulated OA-CH. Moreover, hBMSC-EVs attenuate IL-1β-induced reduction of chondrocyte migration. Furthermore, hBMSC-EVs increase gene expression of PRG4, BCL2, and ACAN (aggrecan) and decrease gene expression of MMP13, ALPL, and IL1ß in OA-CH. Notably, COL2A1, SOX9, BCL2, ACAN, and COMP gene expression levels were significantly increased in IL-1β+ EV groups compared with those IL-1β groups without EVs, whereas the gene expression levels of COLX, IL1B, MMP13, and ALPL were significantly decreased in IL-1β+ EV groups compared to IL-1β groups without EVs. In addition, the phosphorylation status of Erk1/2, PI3K/Akt, p38, TAK1, and NF-κB signaling molecules, induced by IL-1β, is prevented by hBMSC- EVs.
Conclusion: EVs derived from hBMSCs alleviated IL-1β-induced catabolic effects on OA-CH via promoting proliferation and migration and reducing apoptosis, probably via downregulation of IL-1ß-activated pro-inflammatory Erk1/2, PI3K/Akt, p38, TAK1, and NF-κB signaling pathways. EVs released from BMSCs may be considered as promising cell-free intervention strategy in cartilage regenerative medicine, avoiding several adverse effects of cell-based regenerative approaches.
Frontiers in Bioengineering and Biotechnology
2296-4185
10.3389/fbioe.2020.603598
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Shushan Li
Sabine Stöckl
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Marietta Herrmann
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Susanne Grässel
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extracellular vesicles
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IL-1ß
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osteoarthritis
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hBMSC
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chondrocytes
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
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Universität Würzburg
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19596
2019
eng
19
12
article
1
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2019-09-24
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Anisotropic cryostructured collagen scaffolds for efficient delivery of RhBMP−2 and enhanced bone regeneration
In the treatment of bone non-unions, an alternative to bone autografts is the use of bone morphogenetic proteins (BMPs), e.g., BMP–2, BMP–7, with powerful osteoinductive and osteogenic properties. In clinical settings, these osteogenic factors are applied using absorbable collagen sponges for local controlled delivery. Major side effects of this strategy are derived from the supraphysiological doses of BMPs needed, which may induce ectopic bone formation, chronic inflammation, and excessive bone resorption. In order to increase the efficiency of the delivered BMPs, we designed cryostructured collagen scaffolds functionalized with hydroxyapatite, mimicking the structure of cortical bone (aligned porosity, anisotropic) or trabecular bone (random distributed porosity, isotropic). We hypothesize that an anisotropic structure would enhance the osteoconductive properties of the scaffolds by increasing the regenerative performance of the provided rhBMP–2. In vitro, both scaffolds presented similar mechanical properties, rhBMP–2 retention and delivery capacity, as well as scaffold degradation time. In vivo, anisotropic scaffolds demonstrated better bone regeneration capabilities in a rat femoral critical-size defect model by increasing the defect bridging. In conclusion, anisotropic cryostructured collagen scaffolds improve bone regeneration by increasing the efficiency of rhBMP–2 mediated bone healing.
Materials
1996-1944
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CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Kai Stuckensen
José M. Lamo-Espinosa
Emma Muiños-López
Purificación Ripalda-Cemboráin
Tania López-Martínez
Elena Iglesias
Gloria Abizanda
Ion Andreu
María Flandes-Iparraguirre
Juan Pons-Villanueva
Reyes Elizalde
Joachim Nickel
Andrea Ewald
Uwe Gbureck
Felipe Prósper
Jürgen Groll
Froilán Granero-Moltó
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rhBMP–2
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collagen sponge
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cryostructured scaffolds
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bone critical size defect
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Abteilung für Funktionswerkstoffe der Medizin und der Zahnheilkunde
OpenAIRE
Import
Universität Würzburg
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23404
2021
eng
6
14
article
1
--
2021-03-12
--
Improvement of the electronic—neuronal interface by natural deposition of ECM
The foreign body reaction to neuronal electrode implants limits potential applications as well as the therapeutic period. Developments in the basic electrode design might improve the tissue compatibility and thereby reduce the foreign body reaction. In this work, the approach of embedding 3D carbon nanofiber electrodes in extracellular matrix (ECM) synthesized by human fibroblasts for a compatible connection to neuronal cells was investigated. Porous electrode material was manufactured by solution coelectrospinning of polyacrylonitrile and polyamide as a fibrous porogen. Moreover, NaCl represented an additional particulate porogen. To achieve the required conductivity for an electrical interface, meshes were carbonized. Through the application of two different porogens, the electrodes' flexibility and porosity was improved. Human dermal fibroblasts were cultured on the electrode surface for ECM generation and removed afterwards. Scanning electron microscopy imaging revealed a nano fibrous ECM network covering the carbon fibers. The collagen amount of the ECM coating was quantified by hydroxyproline-assays. The modification with the natural protein coating on the electrode functionality resulted in a minor increase of the electrical capacity, which slightly improved the already outstanding electrical interface properties. Increased cell numbers of SH-SY5Y cell line on ECM-modified electrodes demonstrated an improved cell adhesion. During cell differentiation, the natural ECM enhanced the formation of neurites regarding length and branching. The conducted experiments indicated the prevention of direct cell-electrode contacts by the modification, which might help to shield temporary the electrode from immunological cells to reduce the foreign body reaction and improve the electrodes' tissue integration.
Materials
1996-1944
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Tobias Weigel
Julian Brennecke
Jan Hansmann
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ECM coating
Medizin und Gesundheit
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Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
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21990
2020
eng
8
article
1
--
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Influence of Extracellular Vesicles Isolated From Osteoblasts of Patients With Cox-Arthrosis and/or Osteoporosis on Metabolism and Osteogenic Differentiation of BMSCs
Background: Studies with extracellular vesicles (EVs), including exosomes, isolated from mesenchymal stem cells (MSC) indicate benefits for the treatment of musculoskeletal pathologies as osteoarthritis (OA) and osteoporosis (OP). However, little is known about intercellular effects of EVs derived from pathologically altered cells that might influence the outcome by counteracting effects from “healthy” MSC derived EVs. We hypothesize, that EVs isolated from osteoblasts of patients with hip OA (coxarthrosis/CA), osteoporosis (OP), or a combination of both (CA/OP) might negatively affect metabolism and osteogenic differentiation of bone-marrow derived (B)MSCs.
Methods: Osteoblasts, isolated from bone explants of CA, OP, and CA/OP patients, were compared regarding growth, viability, and osteogenic differentiation capacity. Structural features of bone explants were analyzed via μCT. EVs were isolated from supernatant of naïve BMSCs and CA, OP, and CA/OP osteoblasts (osteogenic culture for 35 days). BMSC cultures were stimulated with EVs and subsequently, cell metabolism, osteogenic marker gene expression, and osteogenic differentiation were analyzed.
Results: Trabecular bone structure was different between the three groups with lowest number and highest separation in the CA/OP group. Viability and Alizarin red staining increased over culture time in CA/OP osteoblasts whereas growth of osteoblasts was comparable. Alizarin red staining was by trend higher in CA compared to OP osteoblasts after 35 days and ALP activity was higher after 28 and 35 days. Stimulation of BMSC cultures with CA, OP, and CA/OP EVs did not affect proliferation but increased caspase 3/7-activity compared to unstimulated BMSCs. BMSC viability was reduced after stimulation with CA and CA/OP EVs compared to unstimulated BMSCs or stimulation with OP EVs. ALP gene expression and activity were reduced in BMSCs after stimulation with CA, OP, and CA/OP EVs. Stimulation of BMSCs with CA EVs reduced Alizarin Red staining by trend.
Conclusion: Stimulation of BMSCs with EVs isolated from CA, OP, and CA/OP osteoblasts had mostly catabolic effects on cell metabolism and osteogenic differentiation irrespective of donor pathology and reflect the impact of tissue microenvironment on cell metabolism. These catabolic effects are important for understanding differences in effects of EVs on target tissues/cells when harnessing them as therapeutic drugs.
Frontiers in Bioengineering and Biotechnology
2296-4185
10.3389/fbioe.2020.615520
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Tanja Niedermair
Christoph Lukas
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Benjamin Craiovan
Christoph Brochhausen
Marianne Federlin
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Biowissenschaften; Biologie
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Universität Würzburg
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21942
2020
eng
23
17
article
1
--
2020-11-27
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Assessment of human health risks posed by nano-and microplastics is currently not feasible
The exposure of humans to nano-and microplastic particles (NMPs) is an issue recognized as a potential health hazard by scientists, authorities, politics, non-governmental organizations and the general public. The concentration of NMPs in the environment is increasing concomitantly with global plastic production and the usage of plastic materials. NMPs are detectable in numerous aquatic organisms and also in human samples, therefore necessitating a risk assessment of NMPs for human health. So far, a comprehensive risk assessment of NMPs is hampered by limited availability of appropriate reference materials, analytical obstacles and a lack of definitions and standardized study designs. Most studies conducted so far used polystyrene (PS) spheres as a matter of availability, although this polymer type accounts for only about 7% of total plastic production. Differently sized particles, different concentration and incubation times, and various biological models have been used, yielding hardly comparable data sets. Crucial physico-chemical properties of NMPs such as surface (charge, polarity, chemical reactivity), supplemented additives and adsorbed chemicals have been widely excluded from studies, although in particular the surface of NMPs determines the interaction with cellular membranes. In this manuscript we give an overview about the critical parameters which should be considered when performing risk assessments of NMPs, including novel reference materials, taking into account surface modifications (e.g., reflecting weathering processes), and the possible role of NMPs as a substrate and/or carrier for (pathogenic) microbes. Moreover, we make suggestions for biological model systems to evaluate immediate toxicity, long-term effects and the potential of NMPs to cross biological barriers. We are convinced that standardized reference materials and experimental parameters along with technical innovations in (nano)-particle sampling and analytics are a prerequisite for the successful realization of conclusive human health risk assessments of NMPs.
International Journal of Environmental Research and Public Health
1660-4601
10.3390/ijerph17238832
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2020-12-18T18:39:12+00:00
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International Journal of Environmental Research and Public Health (2020) 17:23, 8832. https://doi.org/10.3390/ijerph17238832
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CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Andreas Brachner
Despina Fragouli
Iola F. Duarte
Patricia M. A. Farias
Sofia Dembski
Manosij Ghosh
Ivan Barisic
Daniela Zdzieblo
Jeroen Vanoirbeek
Philipp Schwabl
Winfried Neuhaus
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nanoplastics
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Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Import
Universität Würzburg
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25758
2022
eng
3
223
article
1
2022-02-20
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--
A Transient Initiator for Polypeptoids Postpolymerization α‐Functionalization via Activation of a Thioester Group
Here, a postpolymerization modification method for an α-terminal functionalized poly-(N-methyl-glycine), also known as polysarcosine, is introduced. 4-(Methylthio)phenyl piperidine-4-carboxylate as an initiator for the ring-opening polymerization of N-methyl-glycine-N-carboxyanhydride followed by oxidation of the thioester group to yield an α-terminal reactive 4-(methylsulfonyl)phenyl piperidine-4-carboxylate polymer is utilized. This represents an activated carboxylic acid terminus, allowing straightforward modification with nucleophiles under mild reaction conditions and provides the possibility to introduce a wide variety of nucleophiles as exemplified using small molecules, fluorescent dyes, and model proteins. The new initiator yielded polymers with well-defined molar mass, low dispersity, and high end-group fidelity, as observed by gel permeation chromatography, nuclear magnetic resonance spectroscopy, and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectroscopy. The introduced method can be of great interest for bioconjugation, but requires optimization, especially for protein conjugation.
Macromolecular Chemistry and Physics
10.1002/macp.202100331
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publish
Macromolecular Chemistry and Physics 2022, 223(3):2100331. DOI: 10.1002/macp.202100331
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Solomiia Borova
Christine Schlutt
Joachim Nickel
Robert Luxenhofer
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ring-opening polymerization
eng
uncontrolled
bioconjugation
eng
uncontrolled
functional initiators
eng
uncontrolled
polypeptoids
eng
uncontrolled
postpolymerization modification
Chemie und zugeordnete Wissenschaften
open_access
Institut für Funktionsmaterialien und Biofabrikation
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/25758/Borova_Macro.pdf
16289
2019
deu
doctoralthesis
1
2018-06-14
--
2018-06-11
In vitro Fremdkörpermodellsysteme zur Vorhersage von biomaterialinduzierten Immunreaktionen
In vitro foreign body model systems for prediction of immune reactions to biomaterials
Die Implantation eines Medizinprodukts in den menschlichen Körper ruft eine Immunreaktion hervor, die zur fibrösen Einkapselung führen kann. Makrophagen in direktem Kontakt mit der Oberfläche des Implantats erfassen sensorisch den Fremdkörper und übersetzten das Signal in die Freisetzung zahlreicher löslicher Mediatoren. Das generierte Entzündungsmilieu moduliert die Heilungsreaktion und kann zur Anreicherung von Fibroblasten sowie zur Erhöhung der Matrixsyntheserate in der Wundumgebung führen. Eine dichte fibröse Kapsel um ein Medizinprodukt beeinträchtigt den Ersatz von Körperstrukturen, das Unterstützen physiologischer Körperfunktionen sowie die Effizienz einer medizinischen Therapie. Zur Identifizierung potenzieller Biomaterialkandidaten mit optimalen Eigenschaften ist jedoch eine evidenzbasierte Entscheidungsfindung notwendig und diese wiederum muss durch geeignete Testmethoden unterstützt werden.
Zur Erfassung lokaler Effekte nach Implantation eines Biomaterials begründet die Komplexi-tät der ablaufenden Fremdkörperreaktion die Anwendung von Tiermodellen als Goldstandard. Die Eingliederung von in vitro Modellsystemen in standardisierte Testverfahren scheitert oft an der Verfügbarkeit validierter, verlässlicher und reproduzierbarer Methoden. Demnach ist kein standardisiertes in vitro Testverfahren beschrieben, das die komplexen dreidimensionalen Gewebsstrukturen während einer Fremdkörperreaktion abbildet und sich zur Testung über längere Kontaktphasen zwischen Blutkomponenten und Biomaterialien eignet. Jedoch können in vitro Testungen kosten- und zeiteffizienter sein und durch die Anwendung humaner Zellen eine höhere Übertragbarkeit auf den Menschen aufweisen. Zusätzlich adressiert die Präferenz zu in vitro Testmethoden den Aspekt „Reduzierung“ der 3R-Prinzipien „Replacement, Reduction, Refinement“ (Ersatz, Reduzierung, Verbesserung) von Russel und Burch (1959) zu einer bewussten und begründeten Anwendung von Tiermodellen in der Wissenschaft. Ziel von diesem Forschungsvorhaben war die Entwicklung von humanen in vitro Modellsystemen, die den Kontakt zu Blutkomponenten sowie die Reaktion des umliegenden Bindegewebes bei lokaler Implantation eines Biomaterials abbilden. Referenzmaterialien, deren Gewebsantwort nach Implantation in Tiere oder den Menschen bekannt ist, dienten als Validierungskriterium für die entwickelten Modellsysteme. Die Anreicherung von Zellen sowie die Bildung extrazellulärer Matrix in der Wundumgebung stellen wichtige Teilprozesse während einer Fremdkörperreaktion dar. Für beide Teilprozesse konnte in einem indirekten zellbasierten Modellsystem der Einfluss einer zellvermittelten Konditionierung wie die Freisetzung von löslichen Mediatoren durch materialadhärente Makrophagen auf die gerichtete Wanderung von Fibroblasten sowie den Umbau eines dreidimensionalen Bindegewebsmodells aufgezeigt werden.
Des Weiteren ließ sich das Freisetzungsprofil von Zytokinen durch materialständige Makrophagen unter verschiedenen Testbedingungen wie der Kontamination mit LPS, der Oberflächenbehandlung mit humanem Blutplasma und der Gegenwart von IL-4 bestimmen. Die anschließende vergleichende statistische Modellierung der generierten komplexen multifaktoriellen Datenmatrix ermöglichte die Übersetzung in eine Biomaterialbewertung. Dieses entwickelte Testverfahren eignete sich einerseits zur Validierung von in vitro Testbedingungen sowie andererseits zur Bewertung von Biomaterialien. Darüber hinaus konnte in einem dreidimensionalen Fremdkörpermodell die komplexe dreidimensionale Struktur der extrazellulären Matrix in einer Wunde durch die Kombination unterschiedlicher Zell- und Matrixkomponenten biomimetisch nachgebaut werden. Diese neuartigen dreidimensionalen Fremdkörpermodelle ermöglichten die Testung von Biomaterialien über längere Testphasen und können in anschließenden Studien angewandt werden, um dynamische Prozesse zu untersuchen. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit drei unterschiedliche Teststrategien entwickelt werden, die (I) die Bewertung von Teilprozessen ermöglichen, (II) die Identifizierung verlässlicher Testbedingungen unterstützen und (III) biomimetisch ein Wundgewebe abbilden. Wesentlich ist, dass biomimetisch ein dreidimensionales Gewebemodell entwickelt werden konnte, das eine verlässliche Unterscheidungskapazität zwischen Biomaterialien aufweist.
The implantation of a medical product into the human body induces an immune reaction, which may lead to its fibrous encapsulation. Macrophages in direct contact to the surface sense the foreign body and translate the signal in the secretion of multiple soluble mediators. This generated inflammatory milieu modulates the healing reaction, may induce the accumulation of fibroblasts and lead in the wound microenvironment to an increased matrix synthesis rate. A dense fibrous capsule surrounding a medical product is able to impair the replacement of body structures, the support of physiological body functions as well as the efficiency of a medical therapy. To identify potential biomaterial candidates with optimal characteristics an evidence-based decision making process is necessary and furthermore affords the support by appropriate test procedures.
To study local effects after implantation of biomaterials, the complexity of the foreign body reaction justifies the application of animal models as gold standard. The integration of in vitro test procedures into standardized test strategies often fails by the availability of validated, reliable and reproducible methods. According to that there is no standardized test procedure, which resembles the three-dimensional tissue structures during a foreign body reaction and is suited for longer contact phases in between blood components and biomaterials. In vitro tests are often more cost and time efficient and show as well by applying human cells a high transferability on human beings. Additionally the preference to in vitro test procedures addresses the “reduction” aspect of the Russel and Burch’s (1959) 3R-principles “replace-ment, reduction and refinement” to a conscious and reasoned use of animal models in science. Aim of this research project was the development of human in vitro model systems, which resemble the contact to blood components and the reaction of the surrounding soft tissue following implantation of a biomaterial. Reference materials, whose tissue integration after implantation in animals or humans is described, were applied for the developed model systems as validation criterion. The accumulation of cells and the synthesis of extracellular matrix in the surrounding wound are relevant sub processes during a foreign body reaction. In an indirect cell-based model system the influence of the cell-mediated conditioning initiated by the material-induced and macrophage-mediated liberation of soluble mediators was shown on both sub processes the aligned migration of fibroblasts as well as the remodeling of a three-dimensional tissue model. Additionally, the cytokine secretion profile by material-adherent macrophages was characterized under different test conditions such as the contamination with LPS, the surface treatment with human plasma and the presence of IL-4. The following comparative statistical modelling allowed a transformation of the generated complex multi-factorial data matrix to a biomaterial ranking. The here developed test procedure was suitable for the validation of in vitro test conditions as well as the evaluation of the reference biomaterials. Last, by the combination of different cells and matrix structures the complex three-dimensional structure of the extracellular matrix in a wound was biomimetically reconstructed. Those novel three-dimensional foreign body models enabled the testing of biomaterials over longer test phases and might be applied in following studies to investigate dynamic processes. Summarizing in this research project three different test strategies were developed, which (I) enable the evaluation of sub processes, (II) support the identification of reliable test conditions and (III) biomimetically reconstruct a wound tissue. Most important is, that a three-dimensional tissue model was biomimetically developed, which showed a reliable discriminatory capacity in between biomaterials.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-162893
10.25972/OPUS-16289
X 128372
CC BY-NC-ND: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Nicht kommerziell, Keine Bearbeitungen 4.0 International
Maren Annika Jannasch
deu
swd
Biomaterial
deu
swd
Zellkultur
deu
swd
In vitro
deu
uncontrolled
Fremdkörpermodell
deu
uncontrolled
Gewebemodell
Biowissenschaften; Biologie
open_access
Graduate School of Life Sciences
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/16289/Jannasch_Maren_Annika_Dissertation.pdf
17636
2019
deu
doctoralthesis
1
2019-02-11
--
2019-02-01
Entwicklung von 3D-Herzschrittmacher-Elektroden auf Basis von Kohlenstoffnanofasern
Development of 3D pacemaker electrodes based on carbon nano fibers
Herzschrittmachersysteme sind eine weitverbreitete Möglichkeit Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu behandeln. Wegen der natürlichen Reaktion des Immunsystems auf Fremdkörper, erfolgt aber eine fortschreitende Verkapselung der Herzschrittmacherelektrode. Die Folge ist eine ansteigende Verminderung der Stimulationseffizienz durch Erhöhung der Anregungsschwelle. Die Integration der Elektrode in das Gewebe ist dabei mangelhaft und wird bestimmt durch Implantateigenschaften wie Größe, Flexibilität und Dimensionalität. Um die Integration zu verbessern, stellen dreidimensionale (3D) bzw. gewebeartige Elektroden eine Alternative zu den derzeit verwendeten planaren Metallelektroden dar. Zur Entwicklung einer leitfähigen, 3D und faserförmigen Elektrode wurden in dieser Arbeit Kohlenstoff-Nanofaser-Scaffolds über Elektrospinnen hergestellt. Durch die Modifikation des Fasergerüstes mit Natriumchlorid (NaCl) während der Scaffoldherstellung, konnte das Fasernetzwerk aufgelockert und Poren generiert werden. Die Kohlenstofffaser-Elektroden zeigten einen effizienten Energieübertrag, welcher vergleichbar mit heutigen Titannitrid (TiN) -Elektroden ist. Die Auflockerung des Fasergewebes hatte eine verbesserte Flexibilität des Faserscaffolds zu Folge. Neben der Flexibilität, konnte auch die Infiltration von Zellen in das poröse Faserscaffold erheblich verbessert werden. Dabei konnten Fibroblasten durch das gesamte Scaffold migrieren. Die Kompatibilität mit kardialen Zellen, die Grundvoraussetzung von Herzschrittmacherelektroden, wurde in vitro nachgewiesen. Durch die Kombination aus dem 3D-Elektrodengerüst mit einer Co-Kultur aus humanen Kardiomyozyten, mesenchymalen Stammzellen und Fibroblasten, erfolgte eine Einbettung der Elektrode in funktionelles kardiales Gewebe. Dadurch konnte ein lebender Gewebe-Elektroden-Hybrid generiert werden, welcher möglicherweise die Elektrode vor Immunzellen in vivo abschirmen kann. Eine Zusammenführung der hybriden Elektrode mit einen Tissue-Engineerten humanen kardialen Patch in vitro, führte zu Bildung einer nahtlosen Elektronik-Gewebe-Schnittstelle. Die fusionierte Einheit wurde abschließend auf ihre mechanische Belastbarkeit getestet und konnte über einen Elektroden-Anschluss elektrisch stimuliert werden.
The application of pacemaker systems is a widespread treatment of cardiovascular diseases. The inflammatory interaction of the immune system and the implant results in the formation of a fibrous capsule around the pacemaker’s electrode. The consequence is a progressing reduction of the stimulation efficiency by an increased excitation threshold. The primary cause of the encapsulation is the deficient integration of the electrode into the cardiac tissue, which is induces by the incompatible implant properties like size, flexibility and dimensionality. To improve the electrode’s integration, the application of three dimensional and tissue imitating electrodes represent an improvement of currently implanted planar electrodes. To develop a conductive and fibrous 3D-electrode, carbon nanofiber scaffolds were generated by electrospinning. By modifying the fiber network with NaCl during the scaffold preparation, the mesh openings could be loosened and pores generated. An efficient energy transfer of the resulting carbon fiber electrodes was demonstrated and is comparable to today's TiN electrodes. The loosening of the fiber network resulted in improved flexibility of the scaffold. In addition to the flexibility, the infiltration of cells into the porous fiber scaffold could be significantly enhanced. Thereby, fibroblasts were enabled to migrate through the entire scaffold. For application as a pacemaker electrode, the compatibility of the tissue electrode with cardiac cells in vitro was demonstrated. The combination of the 3D electrode Scaffold with a co-culture of human cardiomyocytes, mesenchymal stem cells and fibroblasts led to a partially embedded electrode in functional cardiac tissue. As a result, a living tissue-electrode hybrid could be generated which could possibly shield the electrode from immune cells in vivo. Implantation of the hybrid electrode into a tissue engineered human heart patch in vitro resulted in a seamless electronic tissue interface. This fused unit was conclusively tested for its functionality, like mechanical stability and the electrical stimulation of the patch by the in grown hybrid electrode.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-176362
10.25972/OPUS-17636
X 128275
CC BY-SA: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Weitergabe unter gleichen Bedingungen 4.0 International
Tobias Maximilian Weigel
deu
swd
Herzschrittmacher
deu
swd
Elektrode
deu
swd
Kohlenstoff
deu
swd
Nanofaser
deu
uncontrolled
3D-Elektrode
eng
uncontrolled
electrode scaffold
deu
uncontrolled
Zell-Migration
deu
uncontrolled
Stimulation
deu
uncontrolled
Kohlenstofffaser
deu
uncontrolled
Elektrospinnen
Medizin und Gesundheit
Liquid-solid interfaces
open_access
Graduate School of Life Sciences
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/17636/Weigel_Tobias_Dissertation.pdf
22942
2020
eng
1
11, 2020
article
1
2021-03-04
--
--
An Advanced Human Intestinal Coculture Model Reveals Compartmentalized Host and Pathogen Strategies during Salmonella Infection
A major obstacle in infection biology is the limited ability to recapitulate human disease trajectories in traditional cell culture and animal models, which impedes the translation of basic research into clinics. Here, we introduce a three-dimensional (3D) intestinal tissue model to study human enteric infections at a level of detail that is not achieved by conventional two-dimensional monocultures. Our model comprises epithelial and endothelial layers, a primary intestinal collagen scaffold, and immune cells. Upon Salmonella infection, the model mimics human gastroenteritis, in that it restricts the pathogen to the epithelial compartment, an advantage over existing mouse models. Application of dual transcriptome sequencing to the Salmonella-infected model revealed the communication of epithelial, endothelial, monocytic, and natural killer cells among each other and with the pathogen. Our results suggest that Salmonella uses its type III secretion systems to manipulate STAT3-dependent inflammatory responses locally in the epithelium without accompanying alterations in the endothelial compartment. Our approach promises to reveal further human-specific infection strategies employed by Salmonella and other pathogens.
IMPORTANCE Infection research routinely employs in vitro cell cultures or in vivo mouse models as surrogates of human hosts. Differences between murine and human immunity and the low level of complexity of traditional cell cultures, however, highlight the demand for alternative models that combine the in vivo-like properties of the human system with straightforward experimental perturbation. Here, we introduce a 3D tissue model comprising multiple cell types of the human intestinal barrier, a primary site of pathogen attack. During infection with the foodborne pathogen Salmonella enterica serovar Typhimurium, our model recapitulates human disease aspects, including pathogen restriction to the epithelial compartment, thereby deviating from the systemic infection in mice. Combination of our model with state-of-the-art genetics revealed Salmonella-mediated local manipulations of human immune responses, likely contributing to the establishment of the pathogen's infection niche. We propose the adoption of similar 3D tissue models to infection biology, to advance our understanding of molecular infection strategies employed by bacterial pathogens in their human host.
mBio
10.1128/mBio.03348-19
urn:nbn:de:bvb:20-opus-229428
publish
mBio 11:e03348-19. https://doi.org/ 10.1128/mBio.03348-19.
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true
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Leon N. Schulte
Matthias Schweinlin
Alexander J. Westermann
Harshavardhan Janga
Sara C. Santos
Silke Appenzeller
Heike Walles
Jörg Vogel
Marco Metzger
eng
uncontrolled
Salmonella
eng
uncontrolled
gene expression
eng
uncontrolled
infectious disease
Medizin und Gesundheit
open_access
Institut für Molekulare Infektionsbiologie
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Förderzeitraum 2020
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/22942/mBio-2020-Schulte-e03348-19.full.pdf
16443
2016
eng
415-422
4
33
article
1
2018-07-16
--
--
A First Vascularized Skin Equivalent as an Alternative to Animal Experimentation
Tissue-engineered skin equivalents mimic key aspects of the human skin, and can thus be employed as wound coverage for large skin defects or as in vitro test systems as an alternative to animal models. However, current skin equivalents lack a functional vasculature limiting clinical and research applications. This study demonstrates the generation of a vascularized skin equivalent with a perfused vascular network by combining a biological vascularized scaffold (BioVaSc) based on a decellularized segment of a porcine jejunum and a tailored bioreactor system. Briefly, the BioVaSc was seeded with human fibroblasts, keratinocytes, and human microvascular endothelial cells. After 14 days at the air-liquid interface, hematoxylin & eosin and immunohistological staining revealed a specific histological architecture representative of the human dermis and epidermis including a papillary-like architecture at the dermal-epidermal-junction. The formation of the skin barrier was measured non-destructively using impedance spectroscopy. Additionally, endothelial cells lined the walls of the formed vessels that could be perfused with a physiological volume flow. Due to the presence of a complex in-vivo-like vasculature, the here shown skin equivalent has the potential for skin grafting and represents a sophisticated in vitro model for dermatological research.
ALTEX - Alternatives to Animal Experimentation
10.14573/altex.1604041
urn:nbn:de:bvb:20-opus-164438
ALTEX 2016, 33(4), 415-422
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CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Florian Groeber
Lisa Engelhardt
Julia Lange
Szymon Kurdyn
Freia F. Schmid
Christoph Rücker
Stephan Mielke
Heike Walles
Jan Hansmann
eng
uncontrolled
alternative to animal testing
eng
uncontrolled
skin equivalents
eng
uncontrolled
tissue engineering
eng
uncontrolled
vascularization
Medizin und Gesundheit
open_access
Medizinische Klinik und Poliklinik II
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/16443/005_Groeber_ALTEX-ALTERNATIVES-TO-ANIMAL-EXPERIMENTION.pdf
17208
2017
eng
253-266
2
34
article
1
2018-11-19
--
--
\({In}\) \({vitro}\) chemotaxis and tissue remodeling assays quantitatively characterize foreign body reaction
Surgical implantation of a biomaterial triggers foreign-body-induced fibrous encapsulation. Two major mechanisms of this complex physiological process are (I) chemotaxis of fibroblasts from surrounding tissue to the implant region, followed by (II) tissue remodeling. As an alternative to animal studies, we here propose a process-aligned \({in}\) \({vitro}\) test platform to investigate the material dependency of fibroblast chemotaxis and tissue remodeling mediated by material-resident macrophages.
Embedded in a biomimetic three-dimensional collagen hydrogel, chemotaxis of fibroblasts in the direction of macrophage-material-conditioned cell culture supernatant was analyzed by live cell imaging. A combination of statistical analysis with a complementary parameterized random walk model allowed quantitative and qualitative characterization of the cellular walk process. We thereby identified an increasing macrophage-mediated chemotactic potential ranking of biomaterials from glass over polytetrafluorethylene to titanium. To address long-term effects of biomaterial-resident macrophages on fibroblasts in a three-dimensional microenvironment, we further studied tissue remodeling by applying macrophage-material-conditioned medium on fibrous \({in}\) \({vitro}\) tissue models. A high correlation of the \({in}\) \({vitro}\) tissue model to state of the art \({in}\) \({vivo}\) study data was found. Titanium exhibited a significantly lower tissue remodeling capacity compared to polytetrafluorethylene. With this approach, we identified a material dependency of both chemotaxis and tissue remodeling processes, strengthening knowledge on their specific contribution to the foreign body reaction.
ALTEX - Alternatives to Animal Experimentation
10.14573/altex.1610071
27725990
urn:nbn:de:bvb:20-opus-172080
ALTEX - Alternatives to Animal Experimentation (2017) 34:2, pp. 253-266. https://doi.org/10.14573/altex.1610071
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CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Maren Jannasch
Tobias Weigel
Lisa Engelhardt
Judith Wiezoreck
Sabine Gaetzner
Heike Walles
Tobias Schmitz
Jan Hansmann
eng
uncontrolled
medicine
eng
uncontrolled
foreign body reaction
eng
uncontrolled
fibroblast chemotaxis
eng
uncontrolled
tissue remodeling
eng
uncontrolled
in vitro
eng
uncontrolled
quanititative characterization
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/17208/Jannasch_54-PDF-89-1-10-20180110.pdf
20156
2019
eng
1181
10
article
1
2020-03-13
--
--
Induced pluripotent stem cell-derived brain endothelial cells as a cellular model to study Neisseria meningitidis infection
Meningococcal meningitis is a severe central nervous system infection that occurs when Neisseria meningitidis (Nm) penetrates brain endothelial cells (BECs) of the meningeal blood-cerebrospinal fluid barrier. As a human-specific pathogen, in vivo models are greatly limited and pose a significant challenge. In vitro cell models have been developed, however, most lack critical BEC phenotypes limiting their usefulness. Human BECs generated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) retain BEC properties and offer the prospect of modeling the human-specific Nm interaction with BECs. Here, we exploit iPSC-BECs as a novel cellular model to study Nm host-pathogen interactions, and provide an overview of host responses to Nm infection. Using iPSC-BECs, we first confirmed that multiple Nm strains and mutants follow similar phenotypes to previously described models. The recruitment of the recently published pilus adhesin receptor CD147 underneath meningococcal microcolonies could be verified in iPSC-BECs. Nm was also observed to significantly increase the expression of pro-inflammatory and neutrophil-specific chemokines IL6, CXCL1, CXCL2, CXCL8, and CCL20, and the secretion of IFN-γ and RANTES. For the first time, we directly observe that Nm disrupts the three tight junction proteins ZO-1, Occludin, and Claudin-5, which become frayed and/or discontinuous in BECs upon Nm challenge. In accordance with tight junction loss, a sharp loss in trans-endothelial electrical resistance, and an increase in sodium fluorescein permeability and in bacterial transmigration, was observed. Finally, we established RNA-Seq of sorted, infected iPSC-BECs, providing expression data of Nm-responsive host genes. Altogether, this model provides novel insights into Nm pathogenesis, including an impact of Nm on barrier properties and tight junction complexes, and suggests that the paracellular route may contribute to Nm traversal of BECs.
Frontiers in Microbiology
10.3389/fmicb.2019.01181
urn:nbn:de:bvb:20-opus-201562
Frontiers in Microbiology 2019, 10:1181. doi: 10.3389/fmicb.2019.01181
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CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Sara F. Martins Gomes
Alexander J. Westermann
Till Sauerwein
Tobias Hertlein
Konrad U. Förstner
Knut Ohlsen
Marco Metzger
Eric V. Shusta
Brandon J. Kim
Antje Appelt-Menzel
Alexandra Schubert-Unkmeir
eng
uncontrolled
Neisseria meningitidis
eng
uncontrolled
meningococcus
eng
uncontrolled
bacteria
eng
uncontrolled
stem cells
eng
uncontrolled
blood-cerebrospinal fluid barrier
eng
uncontrolled
blood-brain barrier
eng
uncontrolled
brain endothelial cells
Medizin und Gesundheit
open_access
Institut für Hygiene und Mikrobiologie
Institut für Molekulare Infektionsbiologie
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Förderzeitraum 2019
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/20156/Gomes_fmicb-10-01181.pdf
17098
2017
eng
894-906
4
8
article
1
2018-11-02
--
--
Establishment of a Human Blood-Brain Barrier Co-culture Model Mimicking the Neurovascular Unit Using Induced Pluri- and Multipotent Stem Cells
In vitro models of the human blood-brain barrier (BBB) are highly desirable for drug development. This study aims to analyze a set of ten different BBB culture models based on primary cells, human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and multipotent fetal neural stem cells (fNSCs). We systematically investigated the impact of astrocytes, pericytes, and NSCs on hiPSC-derived BBB endothelial cell function and gene expression. The quadruple culture models, based on these four cell types, achieved BBB characteristics including transendothelial electrical resistance (TEER) up to 2,500 Ω cm\(^{2}\) and distinct upregulation of typical BBB genes. A complex in vivo-like tight junction (TJ) network was detected by freeze-fracture and transmission electron microscopy. Treatment with claudin-specific TJ modulators caused TEER decrease, confirming the relevant role of claudin subtypes for paracellular tightness. Drug permeability tests with reference substances were performed and confirmed the suitability of the models for drug transport studies.
Stem Cell Reports
10.1016/j.stemcr.2017.02.021
28344002
urn:nbn:de:bvb:20-opus-170982
Stem Cell Reports 2017, 8(4), 894-906. DOI: 10.1016/j.stemcr.2017.02.021
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CC BY-NC-ND: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Nicht kommerziell, Keine Bearbeitungen 4.0 International
Antje Appelt-Menzel
Alevtina Cubukova
Katharina Günther
Frank Edenhofer
Jörg Piontek
Gerd Krause
Tanja Stüber
Heike Walles
Winfried Neuhaus
Marco Metzger
eng
uncontrolled
blood-brain barrier (BBB) model
eng
uncontrolled
human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)
eng
uncontrolled
multipotent fetal neural stem cells (fNSCs)
eng
uncontrolled
neurovascular unit in vitro
Medizin und Gesundheit
open_access
Frauenklinik und Poliklinik
Institut für Anatomie und Zellbiologie
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/17098/082_Appelt-Menzelt_STEM-CELL-RESEARCH.pdf
17634
2018
eng
4719
8
article
1
2019-02-11
--
--
Evaluation of a miniaturized biologically vascularized scaffold in vitro and in vivo
In tissue engineering, the generation and functional maintenance of dense voluminous tissues is mainly restricted due to insufficient nutrient supply. Larger three-dimensional constructs, which exceed the nutrient diffusion limit become necrotic and/or apoptotic in long-term culture if not provided with an appropriate vascularization. Here, we established protocols for the generation of a pre-vascularized biological scaffold with intact arterio-venous capillary loops from rat intestine, which is decellularized under preservation of the feeding and draining vascular tree. Vessel integrity was proven by marker expression, media/blood reflow and endothelial LDL uptake. In vitro maintenance persisted up to 7 weeks in a bioreactor system allowing a stepwise reconstruction of fully vascularized human tissues and successful in vivo implantation for up to 4 weeks, although with time-dependent decrease of cell viability. The vascularization of the construct lead to a 1.5× increase in cellular drug release compared to a conventional static culture in vitro. For the first time, we performed proof-of-concept studies demonstrating that 3D tissues can be maintained within a miniaturized vascularized scaffold in vitro and successfully implanted after re-anastomosis to the intrinsic blood circulation in vivo. We hypothesize that this technology could serve as a powerful platform technology in tissue engineering and regenerative medicine.
Scientific Reports
10.1038/s41598-018-22688-w
urn:nbn:de:bvb:20-opus-176343
Scientific Reports (2018) 8:4719. DOI: 10.1038/s41598-018-22688-w
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true
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Sebastian Kress
Johannes Baur
Christoph Otto
Natalie Burkard
Joris Braspenning
Heike Walles
Joachim Nickel
Marco Metzger
eng
uncontrolled
biological models
eng
uncontrolled
translational research
Medizin und Gesundheit
open_access
Klinik und Poliklinik für Allgemein-, Viszeral-, Gefäß- und Kinderchirurgie (Chirurgische Klinik I)
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Förderzeitraum 2018
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/17634/Kress_Scientific_Reports.pdf
22997
2020
eng
429-440
3
37
article
1
2021-03-09
--
--
Inflammation-Induced Tissue Damage Mimicking GvHD in Human Skin Models as Test Platform for Immunotherapeutics
Due to the rapidly increasing development and use of cellular products, there is a rising demand for non-animal-based test platforms to predict, study and treat undesired immunity. Here, we generated human organotypic skin models from human biopsies by isolating and expanding keratinocytes, fibroblasts and microvascular endothelial cells and seeding these components on a collagen matrix or a biological vascularized scaffold matrix in a bioreactor. We then were able to induce inflammation-mediated tissue damage by adding pre-stimulated, mismatched allogeneic lymphocytes and/or inflammatory cytokine-containing supernatants histomorphologically mimicking severe graft versus host disease (GvHD) of the skin. This could be prevented by the addition of immunosuppressants to the models. Consequently, these models harbor a promising potential to serve as a test platform for the prediction, prevention and treatment of GvHD. They also allow functional studies of immune effectors and suppressors including but not limited to allodepleted lymphocytes, gamma-delta T cells, regulatory T cells and mesenchymal stromal cells, which would otherwise be limited to animal models. Thus, the current test platform, developed with the limitation that no professional antigen presenting cells are in place, could greatly reduce animal testing for investigation of novel immune therapies.
ALTEX
10.14573/altex.1907181
urn:nbn:de:bvb:20-opus-229974
publish
ALTEX 37(3), 429-440. doi:10.14573/altex.1907181
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Julia Wallstabe
Lydia Bussemer
Florian Groeber-Becker
Lukas Freund
Mirian Alb
Mariola Dragan
Ana Maria Waaga-Gasser
Rafael Jakubietz
Hermann Kneitz
Andreas Rosenwald
Silke Rebhan
Heike Walles
Stephan Mielke
eng
uncontrolled
inflammation-induced tissue demage
eng
uncontrolled
immunotherapeutics
Medizin und Gesundheit
open_access
Klinik und Poliklinik für Allgemein-, Viszeral-, Gefäß- und Kinderchirurgie (Chirurgische Klinik I)
Pathologisches Institut
Klinik und Poliklinik für Unfall-, Hand-, Plastische und Wiederherstellungschirurgie (Chirurgische Klinik II)
Klinik und Poliklinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie
Medizinische Klinik und Poliklinik II
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Förderzeitraum 2020
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/22997/1325-PDF-12703-1-10-20200715.pdf
26151
2022
deu
doctoralthesis
1
2022-03-23
--
2022-03-07
Entwicklung eines \(in\) \(vitro\) Modells für Verbrennungen ersten Grades zur Testung einer zellbasierten Wundauflage
Development of an \(in\) \(vitro\) model for first degree burn wounds to test a cell based wound dressing
Mit jährlich circa 11 Millionen Fällen weltweit, stellen schwere Brandwunden bis heute einen großen Anteil an Verletzungen dar, die in Kliniken behandelt werden müssen. Während leichte Verbrennungen meist problemlos heilen, bedarf die Behandlung tieferer Verbrennungen medizinischer Intervention. Zellbasierte Therapeutika zeigen hier bereits große Erfolge, aufgrund der eingeschränkten Übertragbarkeit von Ergebnissen aus Tiermodellen ist jedoch sowohl die Testung neuer Produkte, als auch die Erforschung der Wundheilung bei Brandwunden noch immer schwierig.
Aufgrund dessen wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt: Die Etablierung von Methoden, um ein zellbasiertes Therapeutikum produzieren zu können und die Entwicklung eines Modells zur Untersuchung von Verbrennungswunden. Zunächst wurden hierfür die Kulturbedingungen und -protokolle zur Isolation und Expansion von Keratinozyten so angepasst, dass sie gängigen Regularien zur Produktion medizinischer Produkte entsprechen. Hier zeigten die Zellen auch in anschließenden Analysen, dass charakteristische Merkmale nicht verloren hatten. Darüber hinaus gelang es, die Zellen mithilfe verschiedener protektiver Substanzen erfolgreich einzufrieren und zu konservieren.
Des Weiteren konnte ein Modell etabliert werden, das eine Verbrennung ersten Grades widerspiegelt. Über einen Zeitraum von zwei Wochen wurde seine Regeneration hinsichtlich verschiedener Aspekte, wie der Histomorphologie, dem Metabolismus und der Reepithelialisierungsrate, untersucht. Die Modelle zeigten hier viele Parallelen zur Wundheilung in vivo auf. Um die Eignung der Modelle zur Testung von Wirkstoffen zu ermitteln wurde außerdem eine Behandlung mit 5% Dexpanthenol getestet. Sie resultierte in einer verbesserten Histomorphologie und einer erhöhten Anzahl an proliferativen Zellen in den Modellen, beschleunigte jedoch die Reepithelialisierung nicht. Zusammengefasst konnten in dieser Arbeit zunächst Methoden etabliert werden, um ein medizinisches Produkt aus Keratinozyten herzustellen und zu charakterisieren. Außerdem wurde ein Modell entwickelt, anhand dessen die Wundheilung und Behandlung von Verbrennungen ersten Grades untersucht werden kann und welches als Basis zur Entwicklung von Modellen von tieferen Verbrennungen dienen kann.
With approximately 11 million cases annually worldwide, severe burns still represent a large proportion of injuries requiring hospital treatment. While minor burns usually heal without problems, the treatment of deeper burns requires medical intervention. Cell-based therapeutics have already shown great success in this area, but due to the limited transferability of results from animal models, both the testing of new products and research into wound healing in burn wounds is still difficult.
Due to this, two objectives were pursued in this work: The establishment of methods to enable the production of a cell-based therapeutic and the development of a model to study burn wounds. First, the culture conditions and protocols for the isolation and expansion of keratinocytes were adapted to meet common regulations for the production of medical products. The cells showed in subsequent analyses that characteristic features had not been lost. In addition, the cells were successfully frozen and preserved with the use of different protective substances.
Furthermore, it was possible to establish a model that reflects a first-degree burn wound. Over a period of two weeks, the regeneration of the models was investigated with regard to various aspects, such as histomorphology, metabolism and the rate of reepithelialization. Here, the models showed many parallels to wound healing in vivo. In addition, to determine the suitability of the models for testing active ingredients, a treatment with 5% dexpanthenol was tested. It resulted in an improved histomorphology and increased numbers of proliferative cells in the models, but did not accelerate overall reepithelialization. In summary, this work initially established methods to produce and characterize a medical product from keratinocytes. In addition, an in vitro model was developed that can be used to study wound healing and treatment of first-degree burns and can serve as a basis for developing models of deeper burns.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-261514
10.25972/OPUS-26151
publish
X 129879
CC BY-NC-SA: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Nicht kommerziell, Weitergabe unter gleichen Bedingungen 4.0 International
Verena Weigel [geb. Schneider]
deu
swd
Tissue Engineering
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swd
In-vitro-Kultur
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Wundheilung
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swd
Hautverbrennung
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Kryokonservierung
eng
uncontrolled
skin equivalent
eng
uncontrolled
in vitro model
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uncontrolled
burn wound
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uncontrolled
wound healing
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uncontrolled
cryokonservation
Biowissenschaften; Biologie
open_access
Graduate School of Life Sciences
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/26151/Weigel_Verena_Dissertation.pdf
16926
2018
eng
doctoralthesis
1
2018-10-18
--
2018-10-08
Intestinal stem cells and the Na\(^+\)-D-Glucose Transporter SGLT1: potential targets regarding future therapeutic strategies for diabetes
Intestinale Stammzellen und der Na\(^+\)-D-Glukose Transporter SGLT1: potentielle Ansatzpunkte neuartiger Therapien für Diabetes Patienten
The pancreas and the small intestine are pivotal organs acting in close synergism to regulate glucose metabolism. After absorption and processing of dietary glucose within the small intestine, insulin and glucagon are released from pancreatic islet cells to maintain blood glucose homeostasis. Malfunctions affecting either individual, organ-specific functions or the sophisticated interplay of both organs can result in massive complications and pathologic conditions. One of the most serious metabolic diseases of our society is diabetes mellitus (DM) that is hallmarked by a disturbance of blood glucose homeostasis. Type 1 (T1DM) and type 2 (T2DM) are the main forms of the disease and both are characterized by chronic hyperglycemia, a condition that evokes severe comorbidities in the long-term. In the past, several standard treatment options allowed a more or less adequate therapy for diabetic patients. Albeit there is much effort to develop new therapeutic interventions to treat diabetic patients in a more efficient way, no cure is available so far. In view of the urgent need for alternative treatment options, a more systemic look on whole organ systems, their biological relation and complex interplay is needed when developing new therapeutic strategies for DM.
T1DM is hallmarked by an autoimmune-mediated destruction of the pancreatic β-cell mass resulting in a complete lack of insulin that is in most patients restored by applying a life-long recombinant insulin therapy. Therefore, novel regenerative medicine-based concepts focus on the derivation of bioartificial β-like cells from diverse stem cell sources in vitro that survive and sustain to secrete insulin after implantation in vivo. In this context, the first part of this thesis analyzed multipotent intestinal stem cells (ISCs) as alternative cell source to derive bioartificial, pancreatic β-like cells in vitro. From a translational perspective, intestinal stem cells pose a particularly attractive cell source since intestinal donor tissues could be obtained via minimal invasive endoscopy in an autologous way. Furthermore, intestinal and pancreatic cells both derive from the same developmental origin, the endodermal gut tube, favoring the differentiation process towards functional β-like cells. In this study, pancreas-specific differentiation of ISCs was induced by the ectopic expression of the pancreatic transcription factor 1 alpha (Ptf1a), a pioneer transcriptional regulator of pancreatic fate. Furthermore, pancreatic lineage-specific culture media were applied to support the differentiation process. In general, ISCs grow in vitro in a 3D Matrigel®-based environment. Therefore, a 2D culture platform for ISCs was established to allow delivery and ectopic expression of Ptf1a with high efficiency. Next, several molecular tools were applied and compared with each other to identify the most suitable technology for Ptf1a delivery and expression within ISCs as well as their survival under the new established 2D conditions. Success of differentiation was investigated by monitoring changes in cellular morphology and induction of pancreatic differentiation-specific gene expression profiles. In summary, the data of this project part suggest that Ptf1a harbors the potential to induce pancreatic differentiation of ISCs when applying an adequate differentiation media. However, gene expression analysis indicated rather an acinar lineage-determination than a pancreatic β-cell-like specification. Nevertheless, this study proved ISCs not only as interesting stem cell source for the generation of pancreatic cell types with a potential use in the treatment of T1DM but alsoPtf1a as pioneer factor for pancreatic differentiation of ISCs in general.
Compared to T1DM, T2DM patients suffer from hyperglycemia due to insulin resistance. In T2DM management, the maintenance of blood glucose homeostasis has highest priority and can be achieved by drugs affecting the stabilization of blood glucose levels. Recent therapeutic concepts are aiming at the inhibition of the intestinal glucose transporter Na+-D-Glucose cotransporter 1 (SGLT1). Pharmacological inhibition of SGLT1 results in reduced postprandial blood glucose levels combined with a sustained and increased Glucagon-like peptide 1 (GLP-1) secretion. So far, systemic side effects of this medication have not been addressed in detail. Of note, besides intestinal localization, SGLT1 is also expressed in various other tissues including the pancreas. In context of having a closer look also on the interplay of organs when developing new therapeutic approaches for DM, the second part of this thesis addressed the effects on pancreatic islet integrity after loss of SGLT1. The analyses comprised the investigation of pancreatic islet size, cytomorphology and function by the use of a global SGLT1 knockout (SGLT1-/-) mouse model. As SGLT1-/- mice develop the glucose-galactose malabsorption syndrome when fed a standard laboratory chow, these animals derived a glucose-deficient, fat-enriched (GDFE) diet. Wildtype mice on either standard chow (WTSC) or GDFE (WTDC) allowed the discrimination between diet- and knockout-dependent effects. Notably, GDFE fed mice showed decreased expression and function of intestinal SGLT1, while pancreatic SGLT1 mRNA levels were unaffected. Further, the findings revealed increased isled sizes, reduced proliferation- and apoptosis rates as well as an increased α-cell and reduced β-cell proportion accompanied by a disturbed cytomorphology in islets when SGLT1 function is lost or impaired. In addition, pancreatic islets were dysfunctional in terms of insulin- and glucagon-secretion. Moreover, the release of intestinal GLP-1, an incretin hormone that stimulates insulin-secretion in the islet, was abnormal after glucose stimulatory conditions. In summary, these data show that intestinal SGLT1 expression and function is nutrient dependent. The data obtained from the islet studies revealed an additional and new role of SGLT1 for maintaining pancreatic islet integrity in the context of structural, cytomorphological and functional aspects. With special emphasis on SGLT1 inhibition in diabetic patients, the data of this project indicate an urgent need for analyzing systemic side effects in other relevant organs to prove pharmacological SGLT1 inhibition as beneficial and safe.
Altogether, the findings of both project parts of this thesis demonstrate that focusing on the molecular and cellular relationship and interplay of the small intestine and the pancreas could be of high importance in context of developing new therapeutic strategies for future applications in DM patients.
Das komplexe Zusammenspiel zwischen Pankreas und Dünndarm ist von großer Bedeutung für den Zucker Stoffwechsel. Während der Dünndarm Glukose aus der Nahrung absorbiert, sezerniert der Pankreas Insulin und Glukagon für die Regulation des Blutzuckerspiegels. Bereits kleinste Fehlfunktionen in einem der beiden Organe können das fein abgestimmte Zusammenspiel aus der Balance bringen und zu schwerwiegenden Begleiterscheinungen führen. Die bekannteste Krankheit bezüglich eines gestörten Blutzuckerhaushaltes ist Diabetes mellitus (DM). Die wichtigsten Formen sind Typ1 und Typ 2 Diabetes, welche beide durch chronische Hyperglykämie gekennzeichnet sind, einem Zustand der langfristig zu schweren Komplikationen führt. Derzeit ist keine Heilung möglich, jedoch vermindert eine Vielzahl von Medikamenten und Therapien die auftretenden Symptome, was die Lebensqualität der Patienten erheblich verbessert. Für die Entwicklung von neuen Medikamenten und Therapien für DM Patienten, muss der Fokus vermehrt auf die Gesamtheit der Organ-Organ Interaktionen, sowie den entwicklungsbiologischen Ursprung der einzelnen Organe gerichtet werden.
Bei Typ 1 Diabetes werden die insulinsekretierende β-Zellen vom Immunsystem zerstört, was zu einem Mangel an Insulin führt. Deshalb ist eine regelmäßige Insulingabe unabdingbar, um eine Hyperglykämie vorzubeugen. Ein vielversprechender Ansatz um fehlendes Insulin zu kompensieren besteht darin aus Stammzellen bioartifizielle, insulinsekretierende Zellen zu generieren. In diesem Zusammenhang ist der biologische Ursprung der zu differenzierenden Zellen von großer Bedeutung. In dieser Arbeit werden daher intestinale Stammzellen (ISZ) als mögliche alternative Zellquelle beschrieben, um insulinsekretierende Zellen zu generieren. Aus medizinischer Sicht eigenen sich ISZ besonders gut für regenerative Therapien, da sie patientenspezifisch durch eine minimal-invasive Endoskopie entnommen werden können. Des Weiteren haben die beiden Organe einen gemeinsamen embryologischen Ursprung, die endodermalen Darmröhre, was die pankreatische Differenzierung begünstigen könnte. Mithilfe der ektopischen Expression des pankreatischen Masterregulators pankreatischer Transkriptionsfaktors 1 alpha (Ptf1a), sollen ISZ in insulinsekretierende β-Zell-ähnliche Zelltypen differenziert werden. Zudem soll ein pankreas-spezifisches Differenzierungsmedium die Effizienz der Differenzierung erhöhen. Da ISZ normalerweise in einer 3D Umgebung kultiviert werden, wurde für diese Arbeit eine 2D Zellkultur etabliert, um eine hocheffiziente genetische Manipulation zur ektopischen Expression von Ptf1a zu garantieren. Im nächsten Schritt wurde die bestmögliche Methode evaluiert um Ptf1a in ISZ zu integrieren, welche gleichzeitig aber das Wachstum und Überleben der Zellen nicht beeinträchtigt. Der Erfolg der angewandten Methode wurde basierend auf der Zellmorphologie, sowie der Transkription von pankreasspezifischen Genen überprüft. Die Ergebnisse dieser Studie haben gezeigt, dass die Ptf1a-induzierte Differenzierung in Verbindung mit der Applikation eines spezifischen Differenzierungsmediums das Genexpressionsprofil von Azinär Zellen induziert und nicht wie erwartet, das von endokrinen β-Zellen. Dies bedeutet, dass Ptf1a die Kapazität aufweist, ISZ in pankreatische Zellen zu konvertieren, jedoch bei der Entwicklung in Richtung insulinsekretierende β-Zellen keine Rolle spielt. Letztendlich zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass ISZ eine interessante Alternative zu pluripotenten Stammzellen darstellen.
Im Gegensatz zu Typ 1 leiden Typ 2 Diabetes Patienten an Hyperglykämie infolge von Insulinresistenz, welche oft mit blutzuckerregulierenden Medikamenten behandelt werden können. Eine gute Therapiemöglichkeit ist die Inhibition des intestinalen Glukosetransporters SGLT1, was zu einer drastisch reduzierten postprandialen Glukoseaufnahme führt und gleichzeitig die intestinale Sekretion des Inkretins Glukose-like Peptide 1 (GLP-1) erhöht. Beides wirkt sich positiv auf die Blutzuckerregulation unter diabetischen Verhältnissen aus. Obwohl SGLT1 primär im Dünndarm exprimiert ist, wurde dessen Expression auch in anderen Organen, wie dem Gehirn, dem Herz, der Lunge und in pankreatischen α-Zellen nachgewiesen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde daher der Einfluss des Funktionsverlustes von SGLT1 auf die Integrität pankreatischer Inselzellcluster analysiert. Im diesem Rahmen wurde die Morphologie der pankreatischen Inseln, deren Architektur und Funktion mithilfe eines etablierten murinen SGLT1 Knockout (SGLT1-/-) Modelles untersucht. Da SGLT1-/- Mäuse unter einer Standard Labordiät (SD) ein schweres Glukose-Galaktose Malabsorptions Syndrom entwickeln, erhalten die Tiere eine glukose-freie, fett-angereicherte Diät (GDFE). Um diät- und knockoutspezifische Effekte unterscheiden zu können, wurden als Kontrollen SD- und GDFE-gefütterte Wildtyp Tiere mit den SGLT1-/- Mäusen verglichen. Wildtyptiere unter GDFE Diät zeigten eine verminderte Expression und Funktionalität des intestinalen SGLT1 Transporters, während im Pankreas die SGLT1 mRNA Expression nicht von der Diät beeinflusst wurde. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass in SGLT1-/- Pankreata, die Inseln größer sind, aber auch die Proliferations- und Apoptoserate in den Inselzellen reduziert ist. Zudem befinden sich in SGLT1-/- Inseln mehr α-Zellen und weniger β-Zellen. Des Weiteren ist die typische Anordnung der endokrinen Zellen gestört. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass SGLT1 in pankreatischen Inseln eine wichtige Rolle für die strukturelle Organisation der verschiedenen Zelltypen innerhalb der Inseln spielt. Ergänzend wurde gezeigt, dass isolierte SGLT1-/- Inseln in der Gegenwart von Glukose unfähig sind Insulin oder Glukagon zu sezernieren. Weitere Untersuchungen im Tier haben ergeben, dass auch das insulinsekretionsfördernde Hormon GLP-1 in atypischer Art und Weise sekretiert wird.
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die intestinale SGLT1 Expression und Funktion durch Nährstoffe beeinflusst werden kann. Des Weiteren wurde erstmals eine neue Funktion für SGLT1 bezüglich der strukturellen und zellulären Organisation pankreatischer Inselzellcluster beschrieben. Daten zu neuen klinischen SGLT1 Inhibitoren beschreiben lediglich eine intestinale SGLT1 Blockierung, während die Wirkung in weitern Organen nicht berücksichtigt wurde. Die Daten dieser Arbeit liefern klare Indizien dafür, dass starke Nebenwirkungen und Effekte auch in anderen SGLT1-exprimierenden Geweben und Organen auftreten könnten, wenn die SGLT1 Funktion verloren geht.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Regulation des Blutzuckerspiegels auf einem komplexen Zusammenspiel zwischen Dünndarm und Pankreas basiert. Daher sollten bei zukünftigen SGLT1 Inhibitions-Studien im Menschen die Interaktionen zwischen den beiden Organen unbedingt berücksichtigt werden, um die Wirksamkeit und die Sicherheit solcher Medikamente für Diabetes Patienten besser darzulegen.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-169266
X 127885
CC BY-SA: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Weitergabe unter gleichen Bedingungen 4.0 International
Markus Mühlemann
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swd
Stammzelle
deu
swd
Diabetes mellitus
eng
uncontrolled
Sglt1
eng
uncontrolled
GLP-1
eng
uncontrolled
blood glucose regulation
eng
uncontrolled
Intestinal stem cell
eng
uncontrolled
Lgr5
eng
uncontrolled
islets of Langerhans
eng
uncontrolled
pancreas
eng
uncontrolled
glucose
eng
uncontrolled
insulin
Biowissenschaften; Biologie
Medizin und Gesundheit
open_access
Graduate School of Life Sciences
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/16926/Muehlemann_Markus_doctoralthesis.pdf
17397
2019
eng
doctoralthesis
1
2018-12-11
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2018-12-10
Establishment of endothelialized cardiac tissue using human induced pluripotent stem cells generated cardiomyocytes
Etablierung eines endothelialisierten kardialen Gewebes mittels Kardiomyozyten, differenziert aus induzierten pluripotenten Stammzellen
Cardiovascular diseases are considered the leading cause of death worldwide according to the World Health Organization. Heart failure is the last stage of most of these diseases, where loss of myocardium leads to architectural and functional decline.
The definitive treatment option for patients with CVDs is organ or tissue transplantation, which relies on donor availability. Therefore, generating an autologous bioengineered myocardium or heart could overcome this limitation. In addition, generating cardiac patches will provide ventricular wall support and enable reparative stem cells delivery to damaged areas. Although many hurdles still exist, a good number of researches have attempted to create an engineered cardiac tissue which can induce endogenous cardiac repair by replacing damaged myocardium.
The present study provided cardiac patches in two models, one by a detergent coronary perfusion decellularization protocol that was optimized, and the other that resulted in a 3D cell-free extracellular matrix with intact architecture and preserved s-glycosaminoglycan and vasculature conduits. Perfusion with 1% Sodium dodecyle sulfate (SDS) under constant pressure resulted in cell-free porcine scaffold within two and cell-free rat scaffold in 7 days, whereas scaffold perfused with 4% sodium deoxycholate (SDO) was not able to remove cells completely. Re-reendothelialization of tissue vasculature was obtained by injecting human microvascular endothelial cell and human fibroblast in 2:1 ratio in a dynamic culture. One-week later, CD31 positive cells and endothelium markers were observed, indicating new blood lining. Moreover, functionality test of re-endothelialized tissue revealed improvement in clotting seen in decellularized tissues. When the tissue was ready to be repopulated, porcine induced pluripotent stem cells (PiPSc) were generated by transfected reprogramming of porcine skin fibroblast and then differentiated to cardiac cells following a robust protocol, for an autologous cardiac tissue model. However, due to the limitation in the PiPSc cell number, alternatively, human induced pluripotent stem cells generated cardiac cells were used.
For reseeding a coculture of human iPSc generated cardiac cells, human mesenchymal stem cells and human fibroblast in 2:1:1 ratio respectively were used in a dynamic culture for 6-8 weeks. Contractions at different areas of the tissue were recorded at an average beating rate of 67 beats/min. In addition, positive cardiac markers (Troponin T), Fibroblast (vemintin), and mesenchymal stem cells (CD90) were detected. Not only that, but by week 3, MSC started differentiating to cardiac cells progressively until few CD90 positive cells were very few by week 6 with increasing troponin t positive cells in parallel. Electrophysiological and drug studies were difficult to obtain due to tissue thickness and limited assessment sources. However, the same construct was established using small intestine submucosa (SISer) scaffold, which recorded a spontaneous beating rate between 0.88 and 1.2 Hz, a conduction velocity of 23.9 ± 0.74 cm s−1, and a maximal contraction force of 0.453 ± 0.015 mN. Moreover, electrophysiological studies demonstrated a drug-dependent response on beating rate; a higher adrenalin frequency was revealed in comparison to the untreated tissue and isoproterenol administration, whereas a decrease in beating rate was observed with propranolol and untreated tissue.
The present study demonstrated the establishment of vascularized cardiac tissue, which can be used for human clinical application.
Etablierung eines endothelialisierten kardialen Gewebes mittels Kardiomyozyten, differenziert aus induzierten pluripotenten Stammzellen
urn:nbn:de:bvb:20-opus-173979
10.25972/OPUS-17397
X 128493
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Reem Saud AL-Hijailan
eng
uncontrolled
cardiac tissue
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uncontrolled
biological scaffolds
eng
uncontrolled
decellularization
eng
uncontrolled
induced pluripotent stem cells
Biowissenschaften; Biologie
Medizin und Gesundheit
open_access
Graduate School of Life Sciences
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/17397/AL-Hijailan_Reem-Theses.pdf
17228
2019
eng
doctoralthesis
1
2018-11-20
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2018-11-20
Establishment and optimization of 3-dimensional mamma carcinoma models for therapy simulation and drug testing
Etablierung und Optimierung 3-dimensionaler Mammakarzinommodelle für die Therapiesimulation und die Wirkstofftestung
Breast cancer is the most common cancer among women worldwide and the second most common cause of cancer death in the developed countries. As the current state of the art in first-line drug screenings is highly ineffective, there is an urgent need for novel test systems that allow for reliable predictions of drug sensitivity.
In this study, a tissue engineering approach was used to successfully establish and standardize a 3-dimensional (3D) mamma carcinoma test system that was optimized for the testing of anti-tumour therapies as well as for the investigation of tumour biological issues. This 3D test system is based on the decellularised scaffold of a porcine small intestinal segment and represents the three molecular subsets of oestrogen receptor-positive, HER2/Neu-overexpressing and triple negative breast cancer (TNBC). The characterization of the test system with respect to morphology as well as the expression of markers for epithelial-mesenchymal transition (EMT) and differentiation indicate that the 3D tumour models cultured under static and dynamic conditions reflect tumour relevant features and have a good correlation with in vivo tumour tissue from the corresponding xenograft models. In this respect, the dynamic culture in a flow bioreactor resulted in the generation of tumour models that exhibited best reflection of the morphology of the xenograft material. Furthermore, the proliferation indices of 3D models were significantly reduced compared to 2-dimensional (2D) cell culture and therefore better reflect the in vivo situation. As this more physiological proliferation index prevents an overestimation of the therapeutic effect of cytostatic compounds, this is a crucial advantage of the test system compared to 2D culture. Moreover, it could be shown that the 3D models can recapitulate different tumour stages with respect to tumour cell invasion. The scaffold SISmuc with the preserved basement membrane structure allowed the investigation of invasion over this barrier which tumour cells of epithelial origin have to cross in in vivo conditions during the process of metastasis formation. Additionally, the data obtained from ultrastructural analysis and in situ zymography indicate that the invasion observed is connected to a tumour cell-associated change in the basement membrane in which matrix metalloproteinases (MMPs) are also involved. This features of the model in combination with the mentioned methods of analysis could be used in the future to mechanistically investigate invasive processes and to test anti-metastatic therapy strategies.
The validation of the 3D models as a test system with respect to the predictability of therapeutic effects was achieved by the clinically relevant targeted therapy with the monoclonal antibody trastuzumab which induces therapeutic response only in patients with HER2/Neu-overexpressing mamma carcinomas due to its specificity for HER2. While neither in 2D nor in 3D models of all molecular subsets a clear reduction of cell viability or an increase in apoptosis could be observed, a distinct increase in antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) was detected only in the HER2/NEU-overexpressing 3D model with the help of an ADCC reporter gene assay that had been adapted for the application in the 3D model in the here presented work. This correlates with the clinical observations and underlines the relevance of ADCC as a mechanism of action (MOA) of trastuzumab. In order to measure the effects of ADCC on the tumour cells in a direct way without the indirect measurement via a reporter gene, the introduction of an immunological component into the models was required. This was achieved by the integration of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), thereby allowing the measurement of the induction of tumour cell apoptosis in the HER2/Neu-overexpressing model. Hence, in this study an immunocompetent model could be established that holds the potential for further testing of therapies from the emergent field of cancer immunotherapies.
Subsequently, the established test system was used for the investigation of scientific issues from different areas of application. By the comparison of the sensitivity of the 2D and 3D model of TNBC towards the water-insoluble compound curcumin that was applied in a novel nanoformulation or in a DMSO-based formulation, the 3D test system was successfully applied for the evaluation of an innovative formulation strategy for poorly soluble drugs in order to achieve cancer therapy-relevant concentrations. Moreover, due to the lack of targeted therapies for TNBC, the TNBC model was applied for testing novel treatment strategies. On the one hand, therapy with the WEE1 kinase inhibitor MK 1775 was evaluated as a single agent as well as in combination with the chemotherapeutic agent doxorubicin. This therapy approach did not reveal any distinct benefits in the 3D test system in contrast to testing in 2D culture. On the other hand, a novel therapy approach from the field of cellular immunotherapies was successfully applied in the TNBC 3D model. The treatment with T cells that express a chimeric antigen receptor (CAR) against ROR1 revealed in the static as well as in the dynamic model a migration of T cells into the tumour tissue, an enhanced proliferation of T cells as well as an efficient lysis of the tumour cells via apoptosis and therefore a specific anti-cancer effect of CAR-transduced T cells compared to control T cells. These results illustrate that the therapeutic application of CAR T cells is a promising strategy for the treatment of solid tumours like TNBC and that the here presented 3D models are suitable for the evaluation and optimization of cellular immunotherapies.
In the last part of this work, the 3D models were expanded by components of the tumour stroma for future applications. By coculture with fibroblasts, the natural structures of the intestinal scaffold comprising crypts and villi were remodelled and the tumour cells formed tumour-like structures together with the fibroblasts. This tissue model displayed a strong correlation with xenograft models with respect to morphology, marker expression as well as the activation of dermal fibroblasts towards a cancer-associated fibroblast (CAF) phenotype. For the integration of adipocytes which are an essential component of the breast stroma, a coculture with human adipose-derived stromal/stem cells (hASCs) which could be successfully differentiated along the adipose lineage in 3D static as well as dynamic models was established. These models are suitable especially for the mechanistic analysis of the reciprocal interaction between tumour cells and adipocytes due to the complex differentiation process.
Taken together, in this study a human 3D mamma carcinoma test system for application in the preclinical development and testing of anti-tumour therapies as well as in basic research in the field of tumour biology was successfully established. With the help of this modular test system, relevant data can be obtained concerning the efficacy of therapies in tumours of different molecular subsets and different tumour stages as well as for the optimization of novel therapy strategies like immunotherapies. In the future this can contribute to improve the preclinical screening and thereby to reduce the high attrition rates in pharmaceutical industry as well as the amount of animal experiments.
Brustkrebs ist die häufigste Krebsart bei Frauen und die zweithäufigste Todesursache bei Krebserkrankungen in den Industrienationen. Aufgrund der Ineffizienz der derzeit verwendeten Modelle für die Identifizierung neuer Therapeutika herrscht ein hoher Bedarf an neuartigen Testsystemen, welche aussagekräftige Vorhersagen über die Wirksamkeit ermöglichen.
In dieser Arbeit wurde mit Hilfe des Tissue Engineerings erfolgreich ein 3-dimensionales (3D) Mammakarzinom-Testsystem etabliert, standardisiert und für die Testung von anti-tumoralen Therapien sowie weitere tumorbiologische Fragestellungen optimiert. Dieses 3D Testsystem basiert auf der dezellularisierten Gerüststruktur eines porcinen Dünndarmsegments und repräsentiert die drei molekularen Subtypen des Östrogen-Rezeptor-positiven, HER2/Neu-überexprimierenden sowie des tripel-negativen Brustkrebses (TNBC). Die Charakterisierung des Testsystems anhand der Morphologie sowie der Expression von Markern zur Bestimmung der epithelialen-mesenchymalen Transition (EMT) und der Differenzierung zeigte, dass die statisch und dynamisch kultivierten 3D Modelle Tumor-relevante Charakteristika widerspiegeln und eine deutliche Ähnlichkeit zu in vivo Tumormaterial aus entsprechenden Xenograft-Modellen aufweisen, wobei die dynamische Kultivierung in einem Flussreaktor zur Generierung von Tumormodellen führte, welche die Morphologie des Tumorgewebes aus Xenograft-Modellen am besten repräsentierten. Des Weiteren war die Proliferationsrate in den 3D Modellen im Vergleich zu 2-dimensionalen (2D) Zellkulturen signifikant reduziert und entspricht daher eher der Situation in vivo. Dies ist ein entscheidender Vorteil des Testsystems gegenüber der 2D Zellkultur, da durch die physiologischere Proliferationsrate eine Überschätzung des Therapieeffekts zytostatischer Medikamente vermieden wird. Zudem konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe der 3D Modelle unterschiedliche Tumorstadien in Bezug auf die Tumorzellinvasion abgebildet werden können. Die Gerüststruktur SISmuc mit erhaltener Basalmembranstruktur ermöglichte eine Untersuchung der Invasion über diese Barriere, welche Tumorzellen epithelialen Ursprungs unter in vivo-Bedingungen beim Prozess der Metastasierung überwinden müssen. Zudem deuten die durch ultrastrukturelle Analysen und in situ Zymographie gewonnenen Daten darauf hin, dass die beobachtete Invasion mit einer Tumorzell-assoziierten Veränderung der Basalmembran, an der auch Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) beteiligt sind, einhergeht. Diese Eigenschaften des Modells in Kombination mit den erwähnten Untersuchungsmethoden könnten in Zukunft dazu eingesetzt werden, Invasionsprozesse mechanistisch zu untersuchen sowie neue anti-metastatisch wirkende Therapiestrategien zu testen.
Die Validierung der 3D Modelle als Testsystem bezüglich der Vorhersagbarkeit von Therapieeffekten erfolgte mit Hilfe der klinisch relevanten, zielgerichteten Therapie mit dem monoklonalen Antikörper Trastuzumab, welcher aufgrund seiner Spezifität für HER2/Neu nur in Patienten mit HER2/Neu-überexprimierendem Mammakarzinom einen Therapieerfolg erzielt. Während weder in 2D noch in den 3D Modellen aller molekularer Subtypen eine eindeutige Reduktion der Zellviabilität oder ein Anstieg der Apoptose gemessen werden konnte, zeigte sich mit Hilfe eines ADCC-Reportergenassays, der in dieser Arbeit für die Anwendung im 3D Modell angepasst wurde, ein deutlicher Anstieg der Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizität (ADCC) lediglich für das HER2/Neu-überexprimierende Modell. Dies entspricht den klinischen Beobachtungen und unterstreicht die Relevanz der ADCC als Wirkmechanismus des Antikörpers. Um die direkten Effekte einer ADCC auf die Tumorzellen im 3D Testsystem direkt – ohne den Umweg über ein Reportergen – messbar zu machen, war die Einführung einer immunologischen Komponente notwendig. Dies gelang mit Hilfe der Integration von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), wodurch die Induktion der Apoptose im HER2/Neu-überexprimierenden Modell messbar war. Somit konnte im Rahmen dieser Arbeit ein immunkompetentes Modell etabliert werden, welche das Potenzial für weitere Testungen aus dem aufstrebenden Bereich der Krebsimmuntherapien bietet.
Anschließend wurde das etablierte Testsystem zur Untersuchung von Fragestellungen aus unterschiedlichen Anwendungsbereichen eingesetzt. Durch den Vergleich der Sensitivität von Tumorzellen in 2D und im 3D Modell des TNBC gegenüber des wasserunlöslichen Wirkstoffs Curcumin, welcher in einer neuartigen Nanoformulierung bzw. in einer DMSO-basierten Formulierung appliziert wurde, konnte das 3D Testsystem für die Evaluation einer innovativen Formulierungsstrategie für unlösliche Wirkstoffe angewendet werden, um für die Krebstherapie relevante Dosierungen zu erreichen. Weiterhin wurden aufgrund des Mangels an zielgerichteten Therapien für das tripel-negative Mammakarzinom neuartige Therapiestrategien anhand des 3D Modells getestet. Zum einen wurde die Therapie mit dem WEE1-Kinase Inhibitor MK 1775 als Monotherapie sowie in Kombination mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin evaluiert. Diese zeigte im Gegensatz zu Testungen in 2D Kultur keinen eindeutigen Therapieeffekt im 3D Testsystem. Zum anderen wurde eine neuartige Behandlung aus dem Bereich der zellulären Immuntherapie erfolgreich im TNBC 3D Modell angewendet. Die Behandlung mit T-Zellen, welche einen chimären Antigen-Rezeptor (CAR) gegen ROR1 tragen, zeigte sowohl im statischen als auch im dynamischen Modell eine Migration der T-Zellen in das Tumorgewebe, eine erhöhte Proliferation der T-Zellen sowie eine effiziente Lyse der Tumorzellen mittels Apoptose und damit eine spezifische anti-tumorale Wirkung der CAR-transduzierten T-Zellen im Vergleich zu Kontroll-T-Zellen. Diese Ergebnisse verdeutlichen einerseits, dass die therapeutische Anwendung von CAR-T-Zellen eine vielversprechende Strategie für die Behandlung von soliden Tumoren wie des TNBC ist, zum anderen, dass die hier vorgestellten 3D Modelle als Testsystem für die Evaluierung und Optimierung von zellulären Immuntherapien geeignet sind.
Im letzten Teil der Arbeit wurde das 3D Modell für die zukünftige Anwendung um Komponenten des Tumorstromas erweitert. Durch die Kokultur mit Fibroblasten wurden die natürlichen Strukturen der Darmmatrix, bestehend aus Krypten und Villi, umgebaut und die Krebszellen bildeten zusammen mit den Fibroblasten tumorartige Strukturen aus. Das so erzeugte Gewebemodell zeigte sowohl in morphologischer Hinsicht als auch bezogen auf die Markerexpression und die Aktivierung der dermalen Fibroblasten hin zu Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs) starke Ähnlichkeit mit Xenograft-Modellen. Für die Integration von Adipozyten, welche ein wichtiger Bestandteil des Stromas in der Brust sind, wurde eine Kokultur mit humanen, aus dem Fettgewebe stammenden Stroma-/Stammzellen (hASCs) etabliert, welche sowohl im statischen als auch im dynamischen 3D Modell erfolgreich adipogen differenziert werden konnten. Diese Modelle eignen sich aufgrund des komplexen Differenzierungsprozesses vor allem für die mechanistische Untersuchung der Interaktionen zwischen Tumorzellen und Adipozyten.
Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, ein humanes 3D Mammakarzinom-Testsystem zur Anwendung in der präklinischen Entwicklung und Testung anti-tumoraler Therapien sowie der Grundlagenforschung im Bereich der Tumorbiologie zu etablieren. Mit Hilfe dieses modularen Testsystems können relevante Daten zur Wirksamkeit von Therapien in Tumoren unterschiedlicher molekularer Subtypen sowie unterschiedlich fortgeschrittener Tumorstadien und zur Optimierung neuartiger Therapiestrategien wie Immuntherapien gewonnen werden. Dies kann in Zukunft dazu beitragen das präklinische Screening zu verbessern und somit die hohen klinischen Ausfallraten in der pharmazeutischen Industrie und die Zahl von Tierversuchen zu reduzieren.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-172280
10.25972/OPUS-17228
X 128442
CC BY-SA: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Weitergabe unter gleichen Bedingungen 4.0 International
Lena Nelke
deu
swd
Brustkrebs
deu
swd
Mamma carcinoma
deu
swd
Tissue Engineering
eng
uncontrolled
Drug testing
eng
uncontrolled
3D model
eng
uncontrolled
therapy simulation
deu
uncontrolled
Mammakarzinom
deu
uncontrolled
Wirkstofftestung
deu
uncontrolled
3D Modell
deu
uncontrolled
Therapiesimulation
Biowissenschaften; Biologie
Krankheiten
open_access
Graduate School of Life Sciences
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/17228/Nelke_Lena_Dissertation.pdf
22945
2020
eng
2
16
article
1
2021-03-04
--
--
A three-dimensional intestinal tissue model reveals factors and small regulatory RNAs important for colonization with Campylobacter jejuni
The Gram-negative Epsilonproteobacterium Campylobacter jejuni is currently the most prevalent bacterial foodborne pathogen. Like for many other human pathogens, infection studies with C. jejuni mainly employ artificial animal or cell culture models that can be limited in their ability to reflect the in-vivo environment within the human host. Here, we report the development and application of a human three-dimensional (3D) infection model based on tissue engineering to study host-pathogen interactions. Our intestinal 3D tissue model is built on a decellularized extracellular matrix scaffold, which is reseeded with human Caco-2 cells. Dynamic culture conditions enable the formation of a polarized mucosal epithelial barrier reminiscent of the 3D microarchitecture of the human small intestine. Infection with C. jejuni demonstrates that the 3D tissue model can reveal isolate-dependent colonization and barrier disruption phenotypes accompanied by perturbed localization of cell-cell junctions. Pathogenesis-related phenotypes of C. jejuni mutant strains in the 3D model deviated from those obtained with 2D-monolayers, but recapitulated phenotypes previously observed in animal models. Moreover, we demonstrate the involvement of a small regulatory RNA pair, CJnc180/190, during infections and observe different phenotypes of CJnc180/190 mutant strains in 2D vs. 3D infection models. Hereby, the CJnc190 sRNA exerts its pathogenic influence, at least in part, via repression of PtmG, which is involved in flagellin modification. Our results suggest that the Caco-2 cell-based 3D tissue model is a valuable and biologically relevant tool between in-vitro and in-vivo infection models to study virulence of C. jejuni and other gastrointestinal pathogens.
PLoS Pathogens
10.1371/journal.ppat.1008304
urn:nbn:de:bvb:20-opus-229454
publish
PLoS Pathog 16(2): e1008304. https://doi.org/10.1371/ journal.ppat.1008304
true
true
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Mona Alzheimer
Sarah L. Svensson
Fabian König
Matthias Schweinlin
Marco Metzger
Heike Walles
Cynthia M. Sharma
eng
uncontrolled
in vitro
eng
uncontrolled
stem cells
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uncontrolled
invasion
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uncontrolled
host
eng
uncontrolled
adhesion
eng
uncontrolled
epithelial cells
eng
uncontrolled
translocation
eng
uncontrolled
virulence
eng
uncontrolled
responses
eng
uncontrolled
microenvironment
Medizin und Gesundheit
open_access
Institut für Molekulare Infektionsbiologie
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Förderzeitraum 2020
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/22945/ppat.1008304.pdf
14956
2015
eng
e00161
5
3
article
1
2017-06-02
--
--
Applicability of second-generation upcyte\(^{®}\) human hepatocytes for use in CYP inhibition and induction studies
Human upcyte\(^{®}\) hepatocytes are proliferating hepatocytes that retain many characteristics of primary human hepatocytes. We conducted a comprehensive evaluation of the application of second-generation upcyte\(^{®}\) hepatocytes from four donors for inhibition and induction assays using a selection of reference inhibitors and inducers. CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9, and CYP3A4 were reproducibly inhibited in a concentration-dependent manner and the calculated IC\(_{50}\) values for each compound correctly classified them as potent inhibitors. Upcyte\(^{®}\) hepatocytes were responsive to prototypical CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9, and CYP3A4 inducers, confirming that they have functional AhR-, CAR-, and PXR-mediated CYP regulation. A panel of 11 inducers classified as potent, moderate or noninducers of CYP3A4 and CYP2B6 were tested. There was a good fit of data from upcyte\(^{®}\) hepatocytes to three different predictive models for CYP3A4 induction, namely the Relative Induction Score (RIS), AUC\(_{u}\)/F\(_{2}\), and C\(_{max,u}\)/Ind\(_{50}\). In addition, PXR (rifampicin) and CAR-selective (carbamazepine and phenytoin) inducers of CYP3A4 and CYP2B6 induction, respectively, were demonstrated. In conclusion, these data support the use of second-generation upcyte\(^{®}\) hepatocytes for CYP inhibition and induction assays. Under the culture conditions used, these cells expressed CYP activities that were equivalent to or higher than those measured in primary human hepatocyte cultures, which could be inhibited or induced by prototypical CYP inhibitors and inducers, respectively. Moreover, they can be used to predict in vivo CYP3A4 induction potential using three prediction models. Bulk availability of cells from multiple donors makes upcyte\(^{®}\) hepatocytes suitable for DDI screening, as well as more in-depth mechanistic investigations.
Pharmacology Research & Perspectives
10.1002/prp2.161
PMC4618636
urn:nbn:de:bvb:20-opus-149564
Pharmacology Research & Perspectives 2015, 3(5), e00161. DOI: 10.1002/prp2.161
CC BY-NC-ND: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Nicht kommerziell, Keine Bearbeitungen 4.0 International
Sarada D. Ramachandran
Aurélie Vivarès
Sylvie Klieber
Nicola J. Hewitt
Bernhard Muenst
Stefan Heinz
Heike Walles
Joris Braspenning
eng
uncontrolled
upcyte hepatocytes
eng
uncontrolled
CYP induction
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uncontrolled
CYP inhibition
eng
uncontrolled
human
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/14956/086_Rarnachandran_Pharmacology_Research&Perspectives.pdf
24496
2021
deu
doctoralthesis
1
2021-09-13
--
2021-09-13
Aufbau, Charakterisierung und Validierung eines in vitro Zellkulturmodells des pankreatischen Adenokarzinoms
Structure, characterisation and validation of an in vitro cell culture model of pancreatic adenocarcinoma
Da in den letzten Jahrzehnten nur geringfügige Verbesserungen der Überlebensraten bei an einem Pankreaskarzinom erkrankten Patienten erzielt wurden, besteht ein dringender klinischer Bedarf für die Entwicklung wirksamer therapeutischer Strategien. Dreidimensionale in vitro Modelle sind für das Screening und die Validierung von Therapeutika essenziell.
In der vorliegenden Arbeit konnte mittels der Methoden des Tissue Engineerings ein biolumineszenzbasiertes dreidimensionales in vitro Testsystem des pankreatischen Karzinoms aufgebaut und charakterisiert werden. Für die Detektion von LumineszenzIntensitäten wurde die pankreatische Krebszelllinie PANC-1 zuvor mit firefly luciferase (FLUC) transduziert. PANC-1 FLUC Zellen wurden auf porziner Pankreasmatrix (PanMa) und Dünndarmmatrix (SISser) kultiviert, um den Einfluss unterschiedlicher Matrizen auf das Verhalten der Zellen im Tumormodell zu untersuchen. Darüber hinaus wurden in dieser Arbeit die PANC-1 FLUC mit einem Standardtherapeutikum der Pankreaskarzinomtherapie, Gemcitabin, behandelt und die Wirkung mittels biolumineszenbasierter Bildgebung detektiert.
Es konnte gezeigt werden, dass die Lumineszenz-Intensität von PANC-1 FLUC Zellen einer bestimmten Zellzahl durch biolumineszenzbasierte Messverfahren zugeordnet werden kann. Weiter wurde nachgewiesen, dass die Extrazellulärmatrix einen Einfluss auf die Expression tumorspezifischer Marker hat und PANC-1 FLUC Zellen ein unterschiedlich invasives Wachstum auf organspezifischen Matrizen aufweisen. Die Wirkung von Gemcitabin auf die Tumorzellen kann durch das hier vorgestellte biolumineszenzbasierte Messverfahren detektiert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse sind die Grundlage für die weitere Validierung eines biolumineszenzbasierten dreidimemsionalen in vitro Testystems des pankreatischen Karzinoms für die präklinische Erforschung neuartiger Therapiestrategien.
With only modest improvements in survival rates in pancreatic cancer patients over the past decades, there is an urgent clinical need for the development of effective therapeutic strategies. Three-dimensional in vitro models are essential for screening and validation of therapeutics.
In the present work, a bioluminescence-based three-dimensional in vitro test system of pancreatic carcinoma was constructed and characterised using tissue engineering methods. For the detection of luminescence intensities, the pancreatic cancer cell line PANC-1 was previously transduced with firefly luciferase (FLUC). PANC-1 FLUC cells were cultured on porcine pancreatic matrix (PanMa) and small intestine matrix (SISser) to investigate the influence of different matrices on the behaviour of the cells in the tumour model. Furthermore, in this work, the PANC-1 FLUC were treated with a standard therapeutic agent of pancreatic cancer therapy, gemcitabine, and the effect was detected using bioluminescence-based imaging.
It was shown that the luminescence intensity of PANC-1 FLUC cells can be assigned to a specific cell number by bioluminescence-based measurement techniques. Furthermore, it was demonstrated that the extracellular matrix has an influence on the expression of tumour-specific markers and that PANC-1 FLUC cells show different invasive growth on organ-specific matrices. The effect of gemcitabine on tumour cells can be detected by the bioluminescence-based measurement method presented here. The results presented in this work are the basis for further validation of a bioluminescence-based three-dimensional in vitro test system of pancreatic carcinoma for preclinical research into novel therapeutic strategies.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-244963
10.25972/OPUS-24496
publish
X 129556
CC BY-NC-SA: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Nicht kommerziell, Weitergabe unter gleichen Bedingungen 4.0 International
Jonas Strulik
deu
swd
Zellkulturmodell
deu
swd
Adenokarzinom
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swd
Pankreaskarzinom
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/24496/Strulik_Jonas_Dissertation.pdf
23185
2021
deu
doctoralthesis
1
2021-03-25
--
2021-03-18
Entwicklung, Herstellung und präklinisches Studienprogramm für ein Arzneimittel für neuartige Therapien zur Behandlung der schweren Form der Hämophilie A
Development, manufacturing and preclinical study program for an Advanced Therapy Medicinal Product for the treatment of severe hemophilia A
Bevor ein zellbasiertes GTMP erstmalig beim Menschen angewendet werden kann, müssen verschiedene notwendige nicht-klinische Studien durchgeführt werden. Wichtig ist hier u.a. die Untersuchung der Biodistribution im Tiermodel. Diese umfasst die Verteilung, das Engraftment, die Persistenz, die Eliminierung und gegebenenfalls die Expansion der humanen Zellen in verschiedenen Organen, meistens im Mausmodel. Deshalb wurde eine qPCR-basierte Analysenmethode entwickelt, mit der humane genomische DNA innerhalb von muriner genomischer DNA bestimmt werden kann, und entsprechend den regulatorischen Richtlinien der European Medicines Agency und des International Council for Harmonisation validiert. Anschließend wurde diese Methode innerhalb einer präklinischen worst-case Szenario Biodistributionsstudie angewendet. Das Ziel dieser Studie war die Untersuchung des Biodistributionsprofils von genetisch modifizierten Blood Outgrowth Endothelial Cells von Hämophilie A Patienten 24 Stunden und sieben Tage nach intravenöser Applikation einer Dosis von 2x106 Zellen. Die Isolation, genetische Modifikation und die Expansion der Zellen sollte entsprechend den Richtlinien der Guten Herstellungspraxis durchgeführt werden. Hierbei ist die Auswahl und Anwendung geeigneter und essentieller Rohstoffe wichtig. Gleichermaßen ist die Durchführung einer definierten Qualitätskontrollstrategie notwendig und die Patientenzellen sollten nur innerhalb von nicht-klinischen Studien eingesetzt werden, wenn alle Akzeptanzkriterien erfüllt wurden. Die Validierung der qPCR-Methode zeigte eine hohe Genauigkeit, Präzision und Linearität innerhalb des Konzentrationsintervalls von 1:1x103 bis 1:1x106 humanen zu murinen Genomen. Bei Anwendung dieser Methode für die Biodistributionsstudie konnten nach 24 Stunden humane Genome in vier der acht untersuchten Mausorgane bestimmt werden. Nach sieben Tagen konnten in keinem der acht Organe humane Genome nachgewiesen werden...
The mandatory non-clinical study scheme prior to the first administration of a cell-based gene therapy medicinal product (GTMP) to human subjects includes and requires investigation of the biodistribution, comprising mobilization, persistence, and clearance, of the GTMP in a relevant animal model. Therefore, a qPCR-based method to determine the amount of human DNA in mouse DNA was developed and validated according to the guidelines of the European Medicines Agency and the International Council for Harmonisation. Furthermore, a preclinical worst-case scenario study was performed, in which this method was applied to investigate the biodistribution of 2x106 intravenously administered, genetically modified blood outgrowth endothelial cells from hemophilia A patients after 24 hours and seven days. The isolation, genetic modification and expansion of cells should be performed according to the guidelines on Good Manufacturing Practice. Here, the selection and application of appropriate and necessary raw materials is important. Likewise, the performance of a defined quality control program is mandatory and cells should only be applied within non-clinical studies if they passed all acceptance criteria. The validation of the qPCR method demonstrated high accuracy, precision, and linearity for the concentration interval of 1:1x103 to 1:1x106 human to mouse genomes. The application of this method in the biodistribution study resulted in the detection of human genomes in four out of the eight investigated organs after 24 hours. After seven days, no human DNA was detected in the eight organs analyzed. This biodistribution study provides mandatory data on the toxicokinetic safety profile of an actual cell-based medicinal product candidate. This is a prerequisite for designing and performing the subsequent toxicity studies necessary to ensure patient safety and permit moving the medicinal product towards a first-in-human clinical trial.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-231858
10.25972/OPUS-23185
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X 129287
CC BY-SA: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Weitergabe unter gleichen Bedingungen 4.0 International
Patrick Bittorf
deu
swd
Arzneimittel
deu
swd
QPCR
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GMP
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Validierung
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swd
Hämophilie A
deu
uncontrolled
Neuartige Arzneimittel
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uncontrolled
Präklinische Studien
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uncontrolled
Biodistribution
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uncontrolled
Arzneimittelzulassung
eng
uncontrolled
Advanced Therapy Medicinal Products (ATMP)
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uncontrolled
Preclinical studies
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uncontrolled
Biodistribution
eng
uncontrolled
Marketing authorisation of pharmaceuticals
Naturwissenschaften und Mathematik
open_access
Graduate School of Life Sciences
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
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16444
2016
eng
55-67
1
33
article
1
2018-07-16
--
--
Alternative Methods for the Replacement of Eye Irritation Testing
In the last decades significant regulatory attempts were made to replace, refine and reduce animal testing to assess the risk of consumer products for the human eye. As the original in vivo Draize eye test is criticized for limited predictivity, costs and ethical issues, several animal-free test methods have been developed to categorize substances according to the global harmonized system (GHS) for eye irritation. This review summarizes the progress of alternative test methods for the assessment of eye irritation. Based on the corneal anatomy and current knowledge of the mechanisms causing eye irritation, different ex vivo and in vitro methods will be presented and discussed with regard to possible limitations and status of regulatory acceptance. In addition to established in vitro models, this review will also highlight emerging, full thickness cornea models that might be suited to predict all GHS categories.
ALTEX - Alternatives to Animal Experimentation
10.14573/altex.1508241
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Altex 33(1), 2016, S. 55-67.
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CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Christian Lotz
Freia F. Schmid
Angela Rossi
Szymon Kurdyn
Daniel Kampik
Bart De Wever
Heike Walles
Florian K. Groeber
eng
uncontrolled
eye irritation testing
eng
uncontrolled
alternatives
eng
uncontrolled
Draize eye test
eng
uncontrolled
OECD guideline
eng
uncontrolled
corneal equivalent
Krankheiten
open_access
Augenklinik und Poliklinik
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/16444/006_Lotz_ALTEX-ALTERNATIVES-TO-ANIMAL-EXPERIMENTION.pdf
20849
2020
eng
doctoralthesis
1
2020-07-16
--
2020-07-03
Development of a Dialysis Graft Based on Tissue Engineering Methods
Entwicklung einer Dialysegraft basierend auf Tissue Engineering-Methoden
Despite advancements of modern medicine, the number of patients with the the end-stage kidney disease keeps growing, and surgical procedures to establish and maintain a vascular access for hemodialysis are rising accordingly. Surgical access of choice remains autogenous arteriovenous fistula, whereas approach “fistula first at all costs” leads to failure in certain subgroups of patients. Modern synthetic vascular grafts fail to deliver long-term results comparable with AV fistula. With all that in mind, this work has an aim of developing a new alternative vascular graft, which can be used for hemodialysis access using the methods of TE, especially electrospinning technique. It is hypothesized that electrospun scaffold, made of PCL and collagen type I may assemble mechanical properties similar to native blood vessels. Seeding such electrospun scaffolds with human microvascular endothelial cells (hmvECs) and preconditioning with shear stress and continuous flow might achieve sufficient endothelial lining being able to resist acute thrombosis. One further topic considered on-site infections, which represents one of the most spread complications of dialysis therapy due to continuous needle punctures. The main hypothesis was that during electrospinning process, polymers can be blended with antibiotics with the aim of producing scaffolds with antimicrobial properties, which could lead to reducing the risk of on-site infection on one side, while not affecting the cell viability.
Trotz der Fortschritte in der modernen Medizin wächst die Zahl der Patienten mit Nierenerkrankungen im Endstadium weiter, und die chirurgischen Verfahren zur Herstellung und Aufrechterhaltung eines Gefäßzugangs für die Hämodialyse nehmen entsprechend zu. Der chirurgische Zugang der Wahl bleibt eine autogene arteriovenöse Fistel, während der Ansatz „Fistel zuerst um jeden Preis“ bei bestimmten Untergruppen von Patienten zum Versagen führt. Moderne synthetische Gefäßtransplantate liefern keine mit AV-Fisteln vergleichbaren Langzeitergebnisse. Vor diesem Hintergrund zielt diese Arbeit darauf ab, ein neues alternatives Gefäßtransplantat zu entwickeln, das für den Zugang zur Hämodialyse unter Verwendung der TE-Methoden, insbesondere der Elektrospinntechnik, verwendet werden kann. Es wird angenommen, dass ein elektrogesponnenes Gerüst aus PCL und Kollagen Typ I ähnliche mechanische Eigenschaften wie native Blutgefäße aufweisen kann. Die Besiedelung solcher elektrogesponnener Gerüste mit menschlichen mikrovaskulären Endothelzellen (hmvECs) und das Vorkonditionieren mit Scherbeanspruchung und kontinuierlichem Fluss könnte eine ausreichende Endothelialisierung erreichen, um eine akute Thrombose vermeiden zu können. Ein weiteres Thema waren lokale Infektionen, die eine der am weitesten verbreiteten Komplikationen der Dialysetherapie aufgrund kontinuierlicher Nadelstiche darstellen. Die Haupthypothese war, dass Polymere während des Elektrospinnprozesses mit Antibiotika gemischt werden können, um Gerüste mit antimikrobiellen Eigenschaften herzustellen, die dazu führen können, dass das Risiko einer Infektion vor Ort auf einer Seite verringert wird, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-208492
10.25972/OPUS-20849
X 128806
CC BY-SA: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Weitergabe unter gleichen Bedingungen 4.0 International
Dejan Radakovic
deu
swd
Elektrospinnen
deu
swd
Tissue Engineering
eng
uncontrolled
Electrospinning
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/20849/Radakovic_Dejan_Dissertation.pdf
27511
2022
eng
6
10
article
1
--
2022-05-31
--
Orchestrating the dermal/epidermal tissue ratio during wound healing by controlling the moisture content
A balanced and moist wound environment and surface increases the effect of various growth factors, cytokines, and chemokines, stimulating cell growth and wound healing. Considering this fact, we tested in vitro and in vivo water evaporation rates from the cellulose dressing epicite\(^{hydro}\) when combined with different secondary dressings as well as the resulting wound healing efficacy in a porcine donor site model. The aim of this study was to evaluate how the different rates of water evaporation affected wound healing efficacy. To this end, epicite\(^{hydro}\) primary dressing, in combination with different secondary dressing materials (cotton gauze, JELONET\(^◊\), AQUACEL\(^®\) Extra\(^™\), and OPSITE\(^◊\) Flexifix), was placed on 3 × 3 cm-sized dermatome wounds with a depth of 1.2 mm on the flanks of domestic pigs. The healing process was analyzed histologically and quantified by morphometry. High water evaporation rates by using the correct secondary dressing, such as cotton gauze, favored a better re-epithelialization in comparison with the low water evaporation resulting from an occlusive secondary dressing, which favored the formation of a new and intact dermal tissue that nearly fully replaced all the dermis that was removed during wounding. This newly available evidence may be of great benefit to clinical wound management.
Biomedicines
2227-9059
10.3390/biomedicines10061286
urn:nbn:de:bvb:20-opus-275115
2022-06-05T20:19:12+00:00
sword
swordwue
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2706de9d08ce675f9dce78c62721bf12
Biomedicines (2022) 10:6, 1286. https://doi.org/10.3390/biomedicines10061286
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true
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Alexandru-Cristian Tuca
Ives Bernardelli de Mattos
Martin Funk
Raimund Winter
Alen Palackic
Florian Groeber-Becker
Daniel Kruse
Fabian Kukla
Thomas Lemarchand
Lars-Peter Kamolz
eng
uncontrolled
bacterial cellulose dressing
eng
uncontrolled
secondary wound dressing
eng
uncontrolled
moisture balance
eng
uncontrolled
wound healing
eng
uncontrolled
in vivo experiments
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Import
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/27511/biomedicines-10-01286.pdf
30131
2022
2022
eng
1
13
article
1
--
--
--
Establishment of the SIS scaffold-based 3D model of human peritoneum for studying the dissemination of ovarian cancer
Ovarian cancer is the second most common gynecological malignancy in women. More than 70% of the cases are diagnosed at the advanced stage, presenting as primary peritoneal metastasis, which results in a poor 5-year survival rate of around 40%. Mechanisms of peritoneal metastasis, including adhesion, migration, and invasion, are still not completely understood and therapeutic options are extremely limited. Therefore, there is a strong requirement for a 3D model mimicking the in vivo situation. In this study, we describe the establishment of a 3D tissue model of the human peritoneum based on decellularized porcine small intestinal submucosa (SIS) scaffold. The SIS scaffold was populated with human dermal fibroblasts, with LP-9 cells on the apical side representing the peritoneal mesothelium, while HUVEC cells on the basal side of the scaffold served to mimic the endothelial cell layer. Functional analyses of the transepithelial electrical resistance (TEER) and the FITC-dextran assay indicated the high barrier integrity of our model. The histological, immunohistochemical, and ultrastructural analyses showed the main characteristics of the site of adhesion. Initial experiments using the SKOV-3 cell line as representative for ovarian carcinoma demonstrated the usefulness of our models for studying tumor cell adhesion, as well as the effect of tumor cells on endothelial cell-to-cell contacts. Taken together, our data show that the novel peritoneal 3D tissue model is a promising tool for studying the peritoneal dissemination of ovarian cancer.
Journal of Tissue Engineering
2041-7314
10.1177/20417314221088514
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@articleHerbert.2022, author = Herbert, Saskia-Laureen and Fick, Andrea and Heydarian, Motaharehsadat and Metzger, Marco and Wöckel, Achim and Rudel, Thomas and Kozjak-Pavlovic, Vera and Wulff, Christine, year = 2022, title = Establishment of the SIS scaffold-based 3D model of human peritoneum for studying the dissemination of ovarian cancer, pages = 20417314221088514, volume = 13, issn = 2041-7314, journal = Journal of tissue engineering, doi = 10.1177/20417314221088514,
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2023-01-25T15:20:43+00:00
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CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Saskia-Laureen Herbert
Andrea Fick
Motaharehsadat Heydarian
Marco Metzger
Achim Wöckel
Thomas Rudel
Vera Kozjak-Pavlovic
Christine Wulff
eng
uncontrolled
ovarian cancer
eng
uncontrolled
3D tissue model
eng
uncontrolled
co-culture
eng
uncontrolled
peritoneal metastasis
eng
uncontrolled
cancer dissemination
Biowissenschaften; Biologie
open_access
Frauenklinik und Poliklinik
Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Förderzeitraum 2022
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/30131/20417314221088514.pdf
23146
2021
eng
289-306
38
article
1
2021-03-24
--
--
Modular micro-physiological human tumor/tissue models based on decellularized tissue for improved preclinical testing
High attrition-rates entailed by drug testing in 2D cell culture and animal models stress the need for improved modeling of human tumor tissues. In previous studies our 3D models on a decellularized tissue matrix have shown better predictivity and higher chemoresistance. A single porcine intestine yields material for 150 3D models of breast, lung, colorectal cancer (CRC) or leukemia. The uniquely preserved structure of the basement membrane enables physiological anchorage of endothelial cells and epithelial-derived carcinoma cells. The matrix provides different niches for cell growth: on top as monolayer, in crypts as aggregates and within deeper layers. Dynamic culture in bioreactors enhances cell growth. Comparing gene expression between 2D and 3D cultures, we observed changes related to proliferation, apoptosis and stemness. For drug target predictions, we utilize tumor-specific sequencing data in our in silico model finding an additive effect of metformin and gefitinib treatment for lung cancer in silico, validated in vitro. To analyze mode-of-action, immune therapies such as trispecific T-cell engagers in leukemia, as well as toxicity on non-cancer cells, the model can be modularly enriched with human endothelial cells (hECs), immune cells and fibroblasts. Upon addition of hECs, transmigration of immune cells through the endothelial barrier can be investigated. In an allogenic CRC model we observe a lower basic apoptosis rate after applying PBMCs in 3D compared to 2D, which offers new options to mirror antigen-specific immunotherapies in vitro. In conclusion, we present modular human 3D tumor models with tissue-like features for preclinical testing to reduce animal experiments.
ALTEX
10.14573/altex.2008141
urn:nbn:de:bvb:20-opus-231465
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ALTEX 38(2), 289-306. doi:10.14573/altex.2008141
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CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Johanna Kühnemundt
Heidi Leifeld
Florian Scherg
Matthias Schmitt
Lena C. Nelke
Tina Schmitt
Florentin Bauer
Claudia Göttlich
Maximilian Fuchs
Meik Kunz
Matthias Peindl
Caroline Brähler
Corinna Kronenthaler
Jörg Wischhusen
Martina Prelog
Heike Walles
Thomas Dandekar
Gudrun Dandekar
Sarah L. Nietzer
eng
uncontrolled
modular tumor tissue models
eng
uncontrolled
invasiveness
eng
uncontrolled
bioreactor culture
eng
uncontrolled
combinatorial drug predictions
eng
uncontrolled
immunotherapies
Biowissenschaften; Biologie
Medizin und Gesundheit
open_access
Frauenklinik und Poliklinik
Kinderklinik und Poliklinik
Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Förderzeitraum 2020
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/23146/2021-PDF-16752-1-10-20210420.pdf
20137
2019
eng
e0213994
3
14
article
1
2020-03-12
--
--
Spin echo based cardiac diffusion imaging at 7T: An ex vivo study of the porcine heart at 7T and 3T
Purpose of this work was to assess feasibility of cardiac diffusion tensor imaging (cDTI) at 7 T in a set of healthy, unfixed, porcine hearts using various parallel imaging acceleration factors and to compare SNR and derived cDTI metrics to a reference measured at 3 T. Magnetic resonance imaging was performed on 7T and 3T whole body systems using a spin echo diffusion encoding sequence with echo planar imaging readout. Five reference (b = 0 s/mm\(^2\)) images and 30 diffusion directions (b = 700 s/mm\(^2\)) were acquired at both 7 T and 3 T using a GRAPPA acceleration factor R = 1. Scans at 7 T were repeated using R = 2, R = 3, and R = 4. SNR evaluation was based on 30 reference (b = 0 s/mm\(^2\)) images of 30 slices of the left ventricle and cardiac DTI metrics were compared within AHA segmentation. The number of hearts scanned at 7 T and 3 T was n = 11. No statistically significant differences were found for evaluated helix angle, secondary eigenvector angle, fractional anisotropy and apparent diffusion coefficient at the different field strengths, given sufficiently high SNR and geometrically undistorted images. R≥3 was needed to reduce susceptibility induced geometric distortions to an acceptable amount. On average SNR in myocardium of the left ventricle was increased from 29±3 to 44±6 in the reference image (b = 0 s/mm\(^2\)) when switching from 3 T to 7 T. Our study demonstrates that high resolution, ex vivo cDTI is feasible at 7 T using commercial hardware.
PLoS ONE
10.1371/journal.pone.0213994
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PLoS ONE (2019) 14:3, e0213994. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0213994
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CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
David Lohr
Maxim Terekhov
Andreas Max Weng
Anja Schroeder
Heike Walles
Laura Maria Schreiber
eng
uncontrolled
Heart
eng
uncontrolled
Diffusion tensor imaging
eng
uncontrolled
Eigenvectors
eng
uncontrolled
Cardiac ventricles
eng
uncontrolled
Tractography
eng
uncontrolled
Magnetic resonance imaging
eng
uncontrolled
Data acquisition
eng
uncontrolled
Swine
Medizin und Gesundheit
open_access
Institut für diagnostische und interventionelle Radiologie (Institut für Röntgendiagnostik)
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Deutsches Zentrum für Herzinsuffizienz (DZHI)
Förderzeitraum 2019
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/20137/Lohr_PLoSONE_2019.pdf.pdf
20181
2019
eng
1294
10
article
1
2020-03-16
--
--
Measles virus infection fosters dendritic cell motility in a 3D environment to enhance transmission to target cells in the respiratory epithelium
Transmission of measles virus (MV) from dendritic to airway epithelial cells is considered as crucial to viral spread late in infection. Therefore, pathways and effectors governing this process are promising targets for intervention. To identify these, we established a 3D respiratory tract model where MV transmission by infected dendritic cells (DCs) relied on the presence of nectin-4 on H358 lung epithelial cells. Access to recipient cells is an important prerequisite for transmission, and we therefore analyzed migration of MV-exposed DC cultures within the model. Surprisingly, enhanced motility toward the epithelial layer was observed for MV-infected DCs as compared to their uninfected siblings. This occurred independently of factors released from H358 cells indicating that MV infection triggered cytoskeletal remodeling associated with DC polarization enforced velocity. Accordingly, the latter was also observed for MV-infected DCs in collagen matrices and was particularly sensitive to ROCK inhibition indicating infected DCs preferentially employed the amoeboid migration mode. This was also implicated by loss of podosomes and reduced filopodial activity both of which were retained in MV-exposed uninfected DCs. Evidently, sphingosine kinase (SphK) and sphingosine-1-phosphate (S1P) as produced in response to virus-infection in DCs contributed to enhanced velocity because this was abrogated upon inhibition of sphingosine kinase activity. These findings indicate that MV infection promotes a push-and-squeeze fast amoeboid migration mode via the SphK/S1P system characterized by loss of filopodia and podosome dissolution. Consequently, this enables rapid trafficking of virus toward epithelial cells during viral exit.
Frontiers in Immunology
10.3389/fimmu.2019.01294
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Frontiers in Immunology 2019, 10:1294. doi: 10.3389/fimmu.2019.01294
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CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Shaghayegh Derakhshani
Andreas Kurz
Lukasz Japtok
Fabian Schumacher
Lisa Pilgram
Maria Steinke
Burkhard Kleuser
Markus Sauer
Sibylle Schneider-Schaulies
Elita Avota
eng
uncontrolled
dendritic cell
eng
uncontrolled
cell migration
eng
uncontrolled
measles virus
eng
uncontrolled
3D tissue model
eng
uncontrolled
sphingosine-1-phosphate
Medizin und Gesundheit
open_access
Institut für Virologie und Immunbiologie
Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Förderzeitraum 2019
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/20181/Avota_fimmu-10-01294.pdf
19389
2019
eng
4062
24
12
article
1
--
2019-12-05
--
The radiosensitizing effect of zinc oxide nanoparticles in sub-cytotoxic dosing is associated with oxidative stress in vitro
Radioresistance is an important cause of head and neck cancer therapy failure. Zinc oxide nanoparticles (ZnO-NP) mediate tumor-selective toxic effects. The aim of this study was to evaluate the potential for radiosensitization of ZnO-NP. The dose-dependent cytotoxicity of ZnO-NP\(_{20 nm}\) and ZnO-NP\(_{100 nm}\) was investigated in FaDu and primary fibroblasts (FB) by an MTT assay. The clonogenic survival assay was used to evaluate the effects of ZnO-NP alone and in combination with irradiation on FB and FaDu. A formamidopyrimidine-DNA glycosylase (FPG)-modified single-cell microgel electrophoresis (comet) assay was applied to detect oxidative DNA damage in FB as a function of ZnO-NP and irradiation exposure. A significantly increased cytotoxicity after FaDu exposure to ZnO-NP\(_{20 nm}\) or ZnO-NP\(_{100 nm}\) was observed in a concentration of 10 µg/mL or 1 µg/mL respectively in 30 µg/mL of ZnO-NP\(_{20 nm}\) or 20 µg/mL of ZnO-NP\(_{100 nm}\) in FB. The addition of 1, 5, or 10 µg/mL ZnO-NP\(_{20 nm}\) or ZnO-NP\(_{100 nm}\) significantly reduced the clonogenic survival of FaDu after irradiation. The sub-cytotoxic dosage of ZnO-NP\(_{100 nm}\) increased the oxidative DNA damage compared to the irradiated control. This effect was not significant for ZnO-NP\(_{20 nm}\). ZnO-NP showed radiosensitizing properties in the sub-cytotoxic dosage. At least for the ZnO-NP\(_{100 nm}\), an increased level of oxidative stress is a possible mechanism of the radiosensitizing effect.
Materials
1996-1944
10.3390/ma12244062
urn:nbn:de:bvb:20-opus-193897
Materials 2019, 12(24), 4062; https://doi.org/10.3390/ma12244062
CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Till Jasper Meyer
Agmal Scherzad
Helena Moratin
Thomas Eckert Gehrke
Julian Killisperger
Rudolf Hagen
Gisela Wohlleben
Bülent Polat
Sofia Dembski
Norbert Kleinsasser
Stephan Hackenberg
eng
uncontrolled
zinc oxide nanoparticles
eng
uncontrolled
irradiation
eng
uncontrolled
oxidative DNA damage
eng
uncontrolled
head and neck squamous cell carcinoma
Medizin und Gesundheit
open_access
Klinik und Poliklinik für Hals-, Nasen- und Ohrenkrankheiten, plastische und ästhetische Operationen
Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Import
Förderzeitraum 2019
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/19389/materials-12-04062.pdf
27640
2022
eng
10
34
article
1
--
--
--
Fully Synthetic 3D Fibrous Scaffolds for Stromal Tissues—Replacement of Animal‐Derived Scaffold Materials Demonstrated by Multilayered Skin
The extracellular matrix (ECM) of soft tissues in vivo has remarkable biological and structural properties. Thereby, the ECM provides mechanical stability while it still can be rearranged via cellular remodeling during tissue maturation or healing processes. However, modern synthetic alternatives fail to provide these key features among basic properties. Synthetic matrices are usually completely degraded or are inert regarding cellular remodeling. Based on a refined electrospinning process, a method is developed to generate synthetic scaffolds with highly porous fibrous structures and enhanced fiber‐to‐fiber distances. Since this approach allows for cell migration, matrix remodeling, and ECM synthesis, the scaffold provides an ideal platform for the generation of soft tissue equivalents. Using this matrix, an electrospun‐based multilayered skin equivalent composed of a stratified epidermis, a dermal compartment, and a subcutis is able to be generated without the use of animal matrix components. The extension of classical dense electrospun scaffolds with high porosities and motile fibers generates a fully synthetic and defined alternative to collagen‐gel‐based tissue models and is a promising system for the construction of tissue equivalents as in vitro models or in vivo implants.
Advanced Materials
10.1002/adma.202106780
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2022-06-14T21:45:25+00:00
sword
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Advanced Materials 2022, 34(10):2106780. DOI: 10.1002/adma.202106780
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CC BY-NC: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Nicht kommerziell 4.0 International
Tobias Weigel
Christoph Malkmus
Verena Weigel
Maximiliane Wußmann
Constantin Berger
Julian Brennecke
Florian Groeber‐Becker
Jan Hansmann
eng
uncontrolled
3D scaffolds
eng
uncontrolled
electrospinning
eng
uncontrolled
highly porous materials
eng
uncontrolled
multilayered skin
eng
uncontrolled
stromal tissues
Medizin und Gesundheit
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Import
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/27640/ADMA_ADMA202106780.pdf
20164
2019
eng
1797-1806
9
6
article
1
2020-03-16
--
--
Patient‐derived in vitro skin models for investigation of small fiber pathology
Objective
To establish individually expandable primary fibroblast and keratinocyte cultures from 3‐mm skin punch biopsies for patient‐derived in vitro skin models to investigate of small fiber pathology.
Methods
We obtained 6‐mm skin punch biopsies from the calf of two patients with small fiber neuropathy (SFN) and two healthy controls. One half (3 mm) was used for diagnostic intraepidermal nerve fiber density (IENFD). From the second half, we isolated and cultured fibroblasts and keratinocytes. Cells were used to generate patient‐derived full‐thickness three‐dimensional (3D) skin models containing a dermal and epidermal component. Cells and skin models were characterized morphologically, immunocyto‐ and ‐histochemically (vimentin, cytokeratin (CK)‐10, CK 14, ki67, collagen1, and procollagen), and by electrical impedance.
Results
Distal IENFD was reduced in the SFN patients (2 fibers/mm each), while IENFD was normal in the controls (8 fibers/mm, 7 fibers/mm). Two‐dimensional (2D) cultured skin cells showed normal morphology, adequate viability, and proliferation, and expressed cell‐specific markers without relevant difference between SFN patient and healthy control. Using 2D cultured fibroblasts and keratinocytes, we obtained subject‐derived 3D skin models. Morphology of the 3D model was analogous to the respective skin biopsy specimens. Both, the dermal and the epidermal layer carried cell‐specific markers and showed a homogenous expression of extracellular matrix proteins.
Interpretation
Our protocol allows the generation of disease‐specific 2D and 3D skin models, which can be used to investigate the cross‐talk between skin cells and sensory neurons in small fiber pathology.
Annals of Clinical and Translational Neurology
10.1002/acn3.50871
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Annals of Clinical and Translational Neurology 2019; 6(9): 1797–1806. doi:10.1002/acn3.50871
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CC BY-NC-ND: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Nicht kommerziell, Keine Bearbeitungen 4.0 International
Franziska Karl
Maximiliane Wußmann
Luisa Kreß
Tobias Malzacher
Phillip Fey
Florian Groeber‐Becker
Nurcan Üçeyler
eng
uncontrolled
neurology
Medizin und Gesundheit
open_access
Neurologische Klinik und Poliklinik
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Förderzeitraum 2019
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/20164/Karl_acn3.50871.pdf
22203
2021
deu
doctoralthesis
1
2021-01-24
--
2020-12-18
Charakterisierung und Standardisierung eines in-vitro Modells der oralen Mukosa für die präklinische Forschung
Characterization and standardization of an in-vitro oral mucosa model for preclinical research
Bisherige per Tissue Engineering hergestellte Testsysteme der Mundschleimhaut basieren in der Regel auf allogenen und teils dysplastischen Keratinozyten. Dies schmälert die Aussagekraft der gewonnenen Ergebnisse hinsichtlich des Anspruchs, Nativgewebe bestmöglich nachzubilden.
In der vorliegenden Arbeit sollte daher ein am Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin entwickeltes Protokoll zur Herstellung dreidimensionaler epidermaler Oralmukosaäquivalente auf Basis autologer Keratinozyten auf seine Eigenschaften und Einsatzmöglichkeit als in-vitro Testsystem untersucht werden.
Nach erfolgreicher Isolierung und Kultivierung im Monolayer konnten insgesamt 420 Modelle zu drei verschiedenen Zeitpunkten (Passagen) aufgebaut werden. Die Untersuchung von Histologie, Viabilität und Barrierefunktion mittels MTT, TEER und Natriumfluoresceinpermeabilität konnte einen suffizienten Aufbau von verhorntem, mehrschichtigen oralen Plattenepithel nachweisen. Gleichzeitig konnte eine Abnahme der Epithelqualität mit steigendem Keratinozytenalter festgestellt werden.
Eine sich anschließende Untersuchung von 14 Cytokeratinen sowie Apoptosemarkern per effizienzkorrigierter und normalisierter RT-qPCR konnte die Überlegenheit der dreidimensionalen autologen Oralmukosaäquivalente gegenüber der zweidimensionalen Monolayerkultur auf Genebene zeigen.
Current tissue-engineered oral mucosa test systems are usually based on allogenic, mostly dysplastic keratinocytes. Their ability to mimic native tissue sufficiently is therefore limited.
Hence the aim of the present work was to examine the characteristics and possible applications of an autologous oral mucosa equivalent based on a protocol developed at the Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine.
Following isolation and monolayer cultivation, 420 equivalents could successfully be built at three different time points. Histology as well as viability and barrier assays (MTT, TEER, sodium-fluoresceine-permeability) revealed sufficient stratification and cornification. Concomitantly, decreasing epithelium quality was associated with a prolongated previous monolayer cultivation.
In addition, efficiency corrected and normalized RT-qPCR of 14 cytokeratins and apoptosis marker genes showed the superiority of three dimensional oral mucosa equivalents over two dimensional monolayers on gene level.
urn:nbn:de:bvb:20-opus-222032
10.25972/OPUS-22203
publish
X 129174
CC BY-NC: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung, Nicht kommerziell 4.0 International
Leopold-Maximilian Johannes Waltermann
deu
swd
Tissue Engineering
deu
swd
Mundschleimhaut
deu
swd
Epithel
deu
swd
Real time quantitative PCR
deu
swd
Cytokeratine
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uncontrolled
Oralmukosa
deu
uncontrolled
Mukosamodell
deu
uncontrolled
Oralmukosamodell
deu
uncontrolled
RT-qPCR
deu
uncontrolled
Viabilität
eng
uncontrolled
oral mucosa model
eng
uncontrolled
viability
Medizin und Gesundheit
Menschliche Anatomie, Zytologie, Histologie
open_access
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Universität Würzburg
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/22203/Dissertation_Waltermann_Leopold_In-Vitro-Oralmukosa.pdf
30142
2022
eng
22
article
1
--
--
--
A defined anthocyanin mixture sourced from bilberry and black currant inhibits Measles virus and various herpesviruses
Background
Anthocyanin-containing plant extracts and carotenoids, such as astaxanthin, have been well-known for their antiviral and anti-inflammatory activity, respectively. We hypothesised that a mixture of Ribes nigrum L. (Grossulariaceae) (common name black currant (BC)) and Vaccinium myrtillus L. (Ericaceae) (common name bilberry (BL)) extracts (BC/BL) with standardised anthocyanin content as well as single plant extracts interfered with the replication of Measles virus and Herpesviruses in vitro.
Methods
We treated cell cultures with BC/BL or defined single plant extracts, purified anthocyanins and astaxanthin in different concentrations and subsequently infected the cultures with the Measles virus (wild-type or vaccine strain Edmonston), Herpesvirus 1 or 8, or murine Cytomegalovirus. Then, we analysed the number of infected cells and viral infectivity and compared the data to non-treated controls.
Results
The BC/BL extract inhibited wild-type Measles virus replication, syncytia formation and cell-to-cell spread. This suppression was dependent on the wild-type virus-receptor-interaction since the Measles vaccine strain was unaffected by BC/BL treatment. Furthermore, the evidence was provided that the delphinidin-3-rutinoside chloride, a component of BC/BL, and purified astaxanthin, were effective anti-Measles virus compounds. Human Herpesvirus 1 and murine Cytomegalovirus replication was inhibited by BC/BL, single bilberry or black currant extracts, and the BC/BL component delphinidin-3-glucoside chloride. Additionally, we observed that BC/BL seemed to act synergistically with aciclovir. Moreover, BC/BL, the single bilberry and black currant extracts, and the BC/BL components delphinidin-3-glucoside chloride, cyanidin-3-glucoside, delphinidin-3-rutinoside chloride, and petunidin-3-galactoside inhibited human Herpesvirus 8 replication.
Conclusions
Our data indicate that Measles viruses and Herpesviruses are differentially susceptible to a specific BC/BL mixture, single plant extracts, purified anthocyanins and astaxanthin. These compounds might be used in the prevention of viral diseases and in addition to direct-acting antivirals, such as aciclovir.
BMC Complementary Medicine and Therapies
10.1186/s12906-022-03661-7
urn:nbn:de:bvb:20-opus-301423
@articleSivarajan.2022, author = Sivarajan, Rinu and Oberwinkler, Heike and Roll, Valeria and König, Eva-Maria and Steinke, Maria and Bodem, Jochen, year = 2022, title = A defined anthocyanin mixture sourced from bilberry and black currant inhibits Measles virus and various herpesviruses, pages = 181, volume = 22, number = 1, journal = BMC complementary medicine and therapies, doi = 10.1186/s12906-022-03661-7,
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2023-01-25T15:24:32+00:00
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63d149b08b3437.37860461
BMC Complementary Medicine and Therapies (2022) 22:181. doi:10.1186/s12906-022-03661-7
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CC BY: Creative-Commons-Lizenz: Namensnennung 4.0 International
Rinu Sivarajan
Heike Oberwinkler
Valeria Roll
Eva-Maria König
Maria Steinke
Jochen Bodem
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anthocyanin
eng
uncontrolled
astaxanthin
eng
uncontrolled
bilberry
eng
uncontrolled
black currant
eng
uncontrolled
herpesvirus
eng
uncontrolled
measels virus
Medizin und Gesundheit
open_access
Institut für Virologie und Immunbiologie
Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin
Förderzeitraum 2022
Universität Würzburg
https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/30142/s12906-022-03661-7.pdf