TY - THES A1 - Schatz, Nicole T1 - Identifizierung und Charakterisierung des BARB-4 Antigens T1 - Identification and characterization of BARB-4 antigen N2 - Der humane, monoklonale IgG Antikörper BARB-4 konnte mit Hilfe der Hybridomatechnologie aus einem an Magenkarzinom erkrankten Patienten isoliert werden. BARB-4 stellt aufgrund seiner Keimbahnkodierung einen Bestandteil der innaten Immunität dar und ist eines der wenigen tumorspezifischen IgG Immunglobuline, die diesem Teil des Immunsystems zugeordnet werden können. Innerhalb dieser Arbeit konnte die Zielstruktur des Antikörpers identifiziert und näher charakterisiert werden. Das BARB-4 Antigen wurde hierbei über ein affinitätschromatographisches Verfahren aus Tumorzellmembranextrakten aufgereinigt und anschließend mittels MALDI-MS über die Peptidmassen-Fingerprint Methode analysiert. Das dabei isolierte Protein konnte eindeutig als humanes TAF15 identifiziert werden. Diese auf der Zellmembran von Tumoren exprimierte TAF15 Variante besitzt ein Molekulargewicht von etwa 78 kDa. Sie kommt im Gegensatz zum Wildtyp exklusiv in Tumorzellen vor und konnte nicht in Normalgewebe nachgewiesen werden. Immunhistochemische Untersuchungen mit BARB-4 und Anti-TAF15 Antikörper auf Tumor- und Normalgewebe deuteten dabei auf eine Koexistenz von Wildtyp und tumorspezifischer TAF15-Variante in malignem Gewebe hin und legten somit eine tumorspezifische Modifikation des TAF15BARB-4 nahe. Ein Carbohydrat-Epitop, wie es sehr häufig bei den natürlichen IgM Antikörpern vorkommt, konnte hier jedoch ausgeschlossen werden. In funktionellen Analysen konnte gezeigt werden, dass die Bindung des BARB-4 Antikörpers auf Tumorzellen einen Einfluss auf diverse zelluläre Prozesse ausübt. Durch die Bindung hemmte der Antikörper das Zellwachstum von Tumorzellen und induzierte deren Apoptose. Weitere interessante Eigenschaften des BARB-4, die bei Tumorzellen beobachtet werden konnten, sind vor allem für metastasierende Zellen von Bedeutung. Nach erfolgter Antikörperinkubation konnte bei Tumorzellen eine Inhibierung der Zelladhäsion und der Zellbeweglichkeit nachgewiesen werden. Diese beiden zellulären Prozesse sind wichtig für sich im Körper ausbreitende, maligne Zellen. In allen durchgeführten Analysen handelte es sich um vom Antikörper direkt vermittelte Effekte. Weitere Untersuchungen wurden durchgeführt, um das Bindungsverhalten des Antikörpers genauer charakterisieren zu können. Immunfluoreszenzanalysen zeigten dabei, dass der Antikörper BARB-4 nach der Bindung an die Tumorzellmembran internalisiert wird. Die Erforschung des BARB-4 Antikörpers und seiner Zielstruktur TAF15BARB-4 auf Krebszellen ermöglicht sowohl neue Einblicke in die Funktionsweise der innaten Immunität als auch neue Optionen für die zielgerichtete Tumortherapie. Die Identifizierung einer extrazellulären, tumorspezifischen TAF15 Variante bietet eine neue Möglichkeit für Diagnostik- und Therapieansätze. Durch die exklusive Expression auf Tumorzellen ermöglicht diese TAF15-Variante gezielt maligne Zellen zu attackieren ohne dabei gesunde Zellen zu beeinflussen. Durch das Vorkommen des TAF15BARB-4 in den verschiedensten Tumorentitäten könnte diese Zielstruktur für die Therapie vieler unterschiedlicher, maligner Erkrankungen genutzt werden. Aufgrund seiner funktionellen Eigenschaften, wie der Hemmung der Tumorzellmotilität und Tumorzelladhäsion, könnte der BARB-4 Antikörper besonders für die Prävention einer Metastasierung von Bedeutung sein. N2 - BARB-4, a human monoclonal IgG antibody originally isolated from a stomach cancer patient using human hybridoma technology, is a germ-line encoded and innate immunity-related antibody, as are only few other tumor-specific IgG immunoglobulins. In this study, the antigen of the BARB-4 antibody was identified and characterized. The potential target was isolated from tumor cell membrane extracts using affinity chromatography and further analyzed by a peptide mass fingerprint method (MALDI-MS). By this approach, we identified a human TAF15 protein with a molecular weight of approximately 78 kDa. In contrast to the wild-type TAF15 protein, this TAF15 variant is exclusively present in tumor cells and could not be detected in normal tissue. Immunohistochemical stainings revealed a coexistence of wild-type TAF15 and tumor-specific TAF15BARB-4 in malignant tissue suggesting a tumor-specific modification of BARB-4 antigen. Importantly, a carbohydrate as potential epitope, typical for natural IgM antibodies, could be excluded. Functional analyses demonstrated that BARB-4 inhibits proliferation of tumor cells and induces apoptosis. In addition, incubation of tumor cells with BARB-4 diminished cell adhesion and motility, which are crucial steps during formation of metastases. We applied additional assays to obtain more detailed information about the binding properties of the antibody. Specifically, immunofluorescence approaches confirmed binding of BARB-4 to the tumor cell surface and its subsequent internalisation by endocytosis. All these findings appear to be directly antibody-mediated effects. The characterization of the BARB-4 antibody and its target TAF15BARB-4 may lead to deeper insights into the function of the innate immune system. Moreover, the identification of a tumor-specific antibody offers novel opportunities for the diagnosis of malignant tumors and may foster the development of novel, antibody-based therapeutic approaches. Based on the exclusive expression of TAF15BARB-4 on tumor cell surface, BARB-4 enables the discrimination of malignant and normal tissues, and the expression of TAF15BARB-4 in various cancer entities might be the basis for the development of tumor-specific therapies. By arresting tumor cell adhesion and tumor cell motility, BARB-4 could be especially useful for the prevention of metastases in malignant tumors. KW - Antigen KW - Immunglobuline KW - Monoklonaler Antikörper KW - Tumorimmunologie KW - Angeborene Immunität KW - natürlicher IgG-Antikörper KW - TAF15 KW - innate immunity KW - tumor immunology KW - natural IgG antibody KW - TAF15 Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53631 ER - TY - THES A1 - Rasche, Leo T1 - Tumortherapie mit Cocktails aus humanen monoklonalen Antikörpern T1 - Cancer Immunotherapy with Cocktails of Human Monoclonal Antibodies N2 - Humane oder humanisierte monoklonale Antikörper haben sich in den letzten zehn Jahren als Arzneimittel etabliert. Sie sind hochspezifisch und zeigen in ihrer Anwendung im Vergleich zu konventionellen Therapeutika viel weniger Nebenwirkungen. In den 80er Jahren gelang es am Pathologischen Institut der Universität Würzburg eine Reihe von humanen Antikörpern aus Patienten zu isolieren, die hochspezifisch mit malignen Zellen reagieren und diese sowohl in vitro als auch im experimentellen Tiermodel selektiv durch Induktion von Apoptose töten. Um die Wirkungsweise von monoklonalen Antikörpern in der Krebstherapie zu erhöhen, werden die meisten in Kombination mit herkömmlichen Methoden, wie Chemotherapie, eingesetzt. Die ideale Therapieform sind hinsichtlich der Nebenwirkungen sog. Cocktails aus verschiedenen monoklonalen Antikörpern. Allerdings sind die Studien hierzu noch wenig fortgeschritten. Das Ziel dieser Arbeit war es, in präklinischen Versuchsreihen den Einsatz verschiedener tumorspezifischer humaner monoklonaler Antikörper als Cocktail und in Kombination mit Chemotherapie zu evaluieren. Hierzu wurden neun Antikörper in 32 verschiedenen Antikörperkombinationen hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die in vitro Proliferation einer Pankreaskarzinom-Zellinie untersucht. In Immunfluoreszenz-Aufnahmen ließ sich zeigen, dass kombinierte Antikörper an unterschiedlichen Stellen an der Zelle binden, was eindeutig auf verschiedene Zielstrukturen hinweist. Einige werden dabei endozytiert, während andere auf der Zellmembran bleiben. Interessanterweise ließen sich Kombinationen identifizieren, deren antiproliferative Wirkung sowohl additiv als auch synergistisch ist, das heißt größer als die Summe ihrer Einzelaktivitäten. Wurden Antikörper mit Zytostatika (5-Flurouracil) kombiniert, so ließen sich ebenfalls synergistische Effekte beobachten. In FACS-Analysen zeigt sich ein gesteigertes Bindungsverhalten der Antikörper, wenn die Zellen mit 5-FU vorinkubiert wurden. Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die Beobachtung, dass die Wirkung humaner monoklonaler Antikörper in Kombination mit Chemotherapie erhöht werden kann. Für die Zukunft humaner Antikörper als Therapiemittel gegen maligne Erkrankungen mag allerdings noch wichtiger sein, dass Antiköper in Cocktails tatsächlich synergistische Wirkung zeigen können. N2 - Cancer patients receiving antibodies as mono-therapy have benefited from these treatments. However, significant improvements could be made if the antibodies were used in combination with conventional chemotherapy. Having learned from the natural oligoclonal antibody response that cancer patients mount to their own tumours, we suppose that cocktails of monoclonal antibodies could be even more active in treating cancer. We have isolated a series of human monoclonal IgM antibodies from cancer patients, which bind to different tumor-specific surface receptors and induce apoptosis in vitro and in vivo. To study the antibody-mediated effects in cocktails, the antibodies were applied in different combinations to pancreas carcinoma cells and analyzed in cytotoxic assays. Depending on their target, it was found that some combinations showed a significant additive or synergistic killing effect, when compared to mono-therapy. We also investigated a combinatorial treatment with chemotherapy on pancreas and colon cancer cells and found that a pretreatment with 5-FU sensitizes the cancer cells to antibody treatment. Based on our own results and data from other laboratories, it is likely that the next phase of antibody immunotherapy will include cocktails of monoclonal antibodies. KW - Monoklonaler Antikörper KW - Bauchspeicheldrüsenkrebs KW - Immunfluoreszenz KW - Hybridom KW - Immunglobulin M KW - Krebs KW - Immuntherapie KW - Pathologie KW - Colonkrebs KW - Fluoreszenzaktivierter Zellsortierer KW - Immuncytochemie KW - SAM-6 KW - LM-1 KW - NORM-1 KW - Cocktail KW - Humane Antikörper KW - Immunotherapy KW - pancreatic cancer KW - human antibodies KW - IgM isotyp Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35809 ER -