TY  - THES
A1  - Jannasch, Maren Annika
T1  - In vitro Fremdkörpermodellsysteme zur Vorhersage von biomaterialinduzierten Immunreaktionen
T1  - In vitro foreign body model systems for prediction of immune reactions to biomaterials
N2  - Die Implantation eines Medizinprodukts in den menschlichen Körper ruft eine Immunreaktion hervor, die zur fibrösen Einkapselung führen kann. Makrophagen in direktem Kontakt mit der Oberfläche des Implantats erfassen sensorisch den Fremdkörper und übersetzten das Signal in die Freisetzung zahlreicher löslicher Mediatoren. Das generierte Entzündungsmilieu moduliert die Heilungsreaktion und kann zur Anreicherung von Fibroblasten sowie zur Erhöhung der Matrixsyntheserate in der Wundumgebung führen. Eine dichte fibröse Kapsel um ein Medizinprodukt beeinträchtigt den Ersatz von Körperstrukturen, das Unterstützen physiologischer Körperfunktionen sowie die Effizienz einer medizinischen Therapie. Zur Identifizierung potenzieller Biomaterialkandidaten mit optimalen Eigenschaften ist jedoch eine evidenzbasierte Entscheidungsfindung notwendig und diese wiederum muss durch geeignete Testmethoden unterstützt werden.
Zur Erfassung lokaler Effekte nach Implantation eines Biomaterials begründet die Komplexi-tät der ablaufenden Fremdkörperreaktion die Anwendung von Tiermodellen als Goldstandard. Die Eingliederung von in vitro Modellsystemen in standardisierte Testverfahren scheitert oft an der Verfügbarkeit validierter, verlässlicher und reproduzierbarer Methoden. Demnach ist kein standardisiertes in vitro Testverfahren beschrieben, das die komplexen dreidimensionalen Gewebsstrukturen während einer Fremdkörperreaktion abbildet und sich zur Testung über längere Kontaktphasen zwischen Blutkomponenten und Biomaterialien eignet. Jedoch können in vitro Testungen kosten- und zeiteffizienter sein und durch die Anwendung humaner Zellen eine höhere Übertragbarkeit auf den Menschen aufweisen. Zusätzlich adressiert die Präferenz zu in vitro Testmethoden den Aspekt „Reduzierung“ der 3R-Prinzipien „Replacement, Reduction, Refinement“ (Ersatz, Reduzierung, Verbesserung) von Russel und Burch (1959) zu einer bewussten und begründeten Anwendung von Tiermodellen in der Wissenschaft. Ziel von diesem Forschungsvorhaben war die Entwicklung von humanen in vitro Modellsystemen, die den Kontakt zu Blutkomponenten sowie die Reaktion des umliegenden Bindegewebes bei lokaler Implantation eines Biomaterials abbilden. Referenzmaterialien, deren Gewebsantwort nach Implantation in Tiere oder den Menschen bekannt ist, dienten als Validierungskriterium für die entwickelten Modellsysteme. Die Anreicherung von Zellen sowie die Bildung extrazellulärer Matrix in der Wundumgebung stellen wichtige Teilprozesse während einer Fremdkörperreaktion dar. Für beide Teilprozesse konnte in einem indirekten zellbasierten Modellsystem der Einfluss einer zellvermittelten Konditionierung wie die Freisetzung von löslichen Mediatoren durch materialadhärente Makrophagen auf die gerichtete Wanderung von Fibroblasten sowie den Umbau eines dreidimensionalen Bindegewebsmodells aufgezeigt werden. 
Des Weiteren ließ sich das Freisetzungsprofil von Zytokinen durch materialständige Makrophagen unter verschiedenen Testbedingungen wie der Kontamination mit LPS, der Oberflächenbehandlung mit humanem Blutplasma und der Gegenwart von IL-4 bestimmen. Die anschließende vergleichende statistische Modellierung der generierten komplexen multifaktoriellen Datenmatrix ermöglichte die Übersetzung in eine Biomaterialbewertung. Dieses entwickelte Testverfahren eignete sich einerseits zur Validierung von in vitro Testbedingungen sowie andererseits zur Bewertung von Biomaterialien. Darüber hinaus konnte in einem dreidimensionalen Fremdkörpermodell die komplexe dreidimensionale Struktur der extrazellulären Matrix in einer Wunde durch die Kombination unterschiedlicher Zell- und Matrixkomponenten biomimetisch nachgebaut werden. Diese neuartigen dreidimensionalen Fremdkörpermodelle ermöglichten die Testung von Biomaterialien über längere Testphasen und können in anschließenden Studien angewandt werden, um dynamische Prozesse zu untersuchen. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit drei unterschiedliche Teststrategien entwickelt werden, die (I) die Bewertung von Teilprozessen ermöglichen, (II) die Identifizierung verlässlicher Testbedingungen unterstützen und (III) biomimetisch ein Wundgewebe abbilden. Wesentlich ist, dass biomimetisch ein dreidimensionales Gewebemodell entwickelt werden konnte, das eine verlässliche Unterscheidungskapazität zwischen Biomaterialien aufweist.
N2  - The implantation of a medical product into the human body induces an immune reaction, which may lead to its fibrous encapsulation. Macrophages in direct contact to the surface sense the foreign body and translate the signal in the secretion of multiple soluble mediators. This generated inflammatory milieu modulates the healing reaction, may induce the accumulation of fibroblasts and lead in the wound microenvironment to an increased matrix synthesis rate. A dense fibrous capsule surrounding a medical product is able to impair the replacement of body structures, the support of physiological body functions as well as the efficiency of a medical therapy. To identify potential biomaterial candidates with optimal characteristics an evidence-based decision making process is necessary and furthermore affords the support by appropriate test procedures. 
To study local effects after implantation of biomaterials, the complexity of the foreign body reaction justifies the application of animal models as gold standard. The integration of in vitro test procedures into standardized test strategies often fails by the availability of validated, reliable and reproducible methods. According to that there is no standardized test procedure, which resembles the three-dimensional tissue structures during a foreign body reaction and is suited for longer contact phases in between blood components and biomaterials. In vitro tests are often more cost and time efficient and show as well by applying human cells a high transferability on human beings. Additionally the preference to in vitro test procedures addresses the “reduction” aspect of the Russel and Burch’s (1959) 3R-principles “replace-ment, reduction and refinement” to a conscious and reasoned use of animal models in science. Aim of this research project was the development of human in vitro model systems, which resemble the contact to blood components and the reaction of the surrounding soft tissue following implantation of a biomaterial. Reference materials, whose tissue integration after implantation in animals or humans is described, were applied for the developed model systems as validation criterion. The accumulation of cells and the synthesis of extracellular matrix in the surrounding wound are relevant sub processes during a foreign body reaction. In an indirect cell-based model system the influence of the cell-mediated conditioning initiated by the material-induced and macrophage-mediated liberation of soluble mediators was shown on both sub processes the aligned migration of fibroblasts as well as the remodeling of a three-dimensional tissue model. Additionally, the cytokine secretion profile by material-adherent macrophages was characterized under different test conditions such as the contamination with LPS, the surface treatment with human plasma and the presence of IL-4. The following comparative statistical modelling allowed a transformation of the generated complex multi-factorial data matrix to a biomaterial ranking. The here developed test procedure was suitable for the validation of in vitro test conditions as well as the evaluation of the reference biomaterials. Last, by the combination of different cells and matrix structures the complex three-dimensional structure of the extracellular matrix in a wound was biomimetically reconstructed. Those novel three-dimensional foreign body models enabled the testing of biomaterials over longer test phases and might be applied in following studies to investigate dynamic processes. Summarizing in this research project three different test strategies were developed, which (I) enable the evaluation of sub processes, (II) support the identification of reliable test conditions and (III) biomimetically reconstruct a wound tissue. Most important is, that a three-dimensional tissue model was biomimetically developed, which showed a reliable discriminatory capacity in between biomaterials.
KW  - Biomaterial
KW  - Zellkultur
KW  - In vitro
KW  - Fremdkörpermodell
KW  - Gewebemodell
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162893
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kastner, Carolin
T1  - LASP1 – ein neuer, phosphorylierungs-abhängiger Bindungspartner von CrkL in CML
T1  - LASP1 – a new, phosphorylation-dependent binding partner of CrkL in CML
N2  - Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die einer malignen Erkrankung zugrunde liegen, ist der Schlüssel zur Entwicklung zielgerichteter und effektiver therapeutischer Möglichkeiten. Für das LIM und SH3 Domänen Protein 1, LASP1, konnte im Kontext zahl-reicher Tumorerkrankungen wie dem Mamma-Karzinom, dem Prostata-Karzinom oder dem Ovarial-Karzinom eine Überexpression ebenso wie eine Korrelation mit Aggressivität und Prognose der Tumorerkrankung gezeigt werden. Bisher war eine Relevanz von LASP1 jedoch nur für solide Tumorerkrankungen nachgewiesen worden. Kürzlich allerdings wurde lasp1 als eines von 6 Genen identifiziert, die eine exaktere Vorhersage von Krankheitsprogress und -rezidiv bei Patienten mit einer chronischen myeloischen Leukämie (CML) zulassen sollen. Zudem konnte, wie bereits bei zahlreichen anderen, soliden Tumorerkrankungen, eine signifikante Überexpression des lasp1-Gens in CML-Zellen nachgewiesen werden.Basierend auf diesen neuen Erkenntnissen beschäftigte ich mich im Rahmen dieser Arbeit mit der Frage, welche Funktion LASP1 im Netz der einer CML zugrunde liegenden, molekularen Mechanismen übernimmt. Mittels verschiedener Interaktionsassays konnte LASP1 als ein neuer, phosphorylierungs-abhängiger Bindungspartner von CrkL, dem wohl prominentesten Substrat der BCR-ABL-Kinase, identifiziert werden. Dabei impliziert das Attribut „phosphorylierungs-abhängig“ sowohl den Phosphorylierungsstatus von LASP1 als auch des Interaktionspartners CrkL. Wie in Vorarbeiten gezeigt, stellt das Tyrosin 171 in der Aminosäurensequenz von LASP1 eine Phosphorylierungsstelle für die BCR-ABL-Kinase dar; mit LASP1 wurde somit auch ein neues Substrat dieser konstitutiv aktiven Tyrosinkinase entdeckt. Phosphoryliert an Tyrosin 171 kann LASP1 an die SH2-Domäne von CrkL, genauer an das FLVR-Motif innerhalb dieser, binden. Jedoch selbst an Tyrosin 207 durch die BCR-ABL-Kinase phosphoryliert, blockiert CrkL die eigene SH2-Domäne durch intramolekulare Wechselwirkungen für andere Protein-Protein-Interaktionen in gewissem Umfang. Diese neu gewonnenen Erkenntnisse liefern ein weiteres Puzzlestück zum Verständnis des molekularen Netzwerks, das einer CML-Erkrankung zugrunde liegt und tragen so dazu bei, die Therapieoptionen dieser stetig zu verbessern.
N2  - Understanding the molecular mechanisms underlying a malignant disease makes it possible to develop targeted and effective therapeutic options. For numerous malignant disease such as breast cancer, prostata cancer or ovarial cancer it has been shown that the LIM and SH3 domain protein 1, LASP1, is overexpresssed and that there is a correlation with regard to aggressive growth and outcome of the tumour. So far relevance of LASP1 has only been proven for solid tumours. However recently lasp1 was identified as a component of six genes that may allow to predict more reliably disease´s progress and relapse in CML patients. In addition to that a significant overexpression of lasp1 in CML cells has been discov-ered, a phenomenon already known from a lot of solid malignant tumours. Based on these new findings, i dealt with the issue of the function of LASP1 in the network of molecular mechanisms underlying CML. Using different kinds of interaction assays, LASP1 was identified as a new, phosphorylation-dependent ligand of CrkL, the most prominent substrate of the BCR-ABL-kinase. In this case the attribute "phosphorylation-dependent“ refers to the phosphorylation status of LASP1 as well as of its binding-partner CrkL. As shown in preliminary studies, tyrosine 171 is a phosphorylation site for BCR-ABL-kinase within the AS sequence of LASP1; therefore, with LASP1, a new substrate of this constitutive active tyrosine kinase has been discovered. When phosphorylated on tyrosine 171, LASP1 is able to bind to the SH2-domain of CrkL, more exactly to the FLVR-motive within this domain. But when CrkL is phos-phorylated on tyrosine 207 by BCR-ABL-kinase, there are intramolecular interactions that block the SH2-domain of CrkL for other protein-protein-interactions. These new findings help to understand the molecular network under-lying a CML disease and may contribute to continuous improvement of therapeutic options.
KW  - Chronisch-myeloische Leukämie
KW  - Proteinsynthese
KW  - Domäne <Biochemie>
KW  - Proteininteraktion
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-187539
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bach, Matthias
T1  - Massenspektrometrische Analyse der Interaktionen von Protein mit Proteinen und Proteinen mit niedermolekularen Verbindungen
T1  - Protein-protein and small molecule-protein interaction analyzed by mass spectrometry
N2  - Proteine können aufgrund ihrer biochemischen Vielfalt eine Vielzahl von Interaktionen
mit anderen Proteinen oder chemischen Verbindungen eingehen. Im ersten Teil dieser
Arbeit wurden Protein-Protein Interaktionen mittels chemischen Quervernetzens
untersucht. Das Ziel war, neue und verbesserte Methoden zu entwickeln, um
Interaktionsnetzwerke zu erstellen. Im zweiten Teil wurden die Interaktionen von
Proteinen mit niedermolekularen Verbindungen untersucht, um Drug Targets zu
identifizieren und zu validieren.
Die Untersuchung von Protein-Protein Interaktionen mittels Massenspektrometrie (MS)
ist eine leistungsfähige Methode, um alle potentiellen Interaktionen eines Proteins nach
einer Anreicherung (Co-IP) aus einem Zelllysat zu detektieren. Durch das zusätzliche
Quervernetzen dieser Proteine und anschließender MS kann ein Interaktionsnetzwerk
erstellt werden, um direkte von indirekten Interaktionen unterscheiden zu können
(Topology Mapping). Zur Methodenetablierung wurden kommerzielle Crosslinker und
rekombinante Proteine von bekannten Interaktionspartnern mit niedriger Komplexität
verwendet. Die beiden Interaktionspartner NPL4 und UFD1 konnten mit dem Crosslinker
BS3 erfolgreich quervernetzt und anhand der vernetzten Peptide identifiziert werden. Im
nächsten Schritt wurde dieser Arbeitsablauf auf eine Co-IP des Mediatorkomplexes aus
Hefe angewendet. Die Probenkomplexität ist hierbei 500 - 1000-fach höher als bei der
Verwendung von rekombinanten Proteinen. Nach der erfolgreichen Quervernetzung
konnte innerhalb des Komplexes ein Interaktionsnetzwerk erstellt werden. Diese Daten
passen zu dem bereits bekannten Modell des Mediatorkomplexes. Interaktionen zu
bekannten Interaktionspartnern, wie der RNA-Pol II, konnten aufgrund deren
substöchiometrischen Anreicherung nicht identifiziert werden.
Aufgrund der genannten Limitationen beim Quervernetzen von Proteinen wurden
folgende neue und verbesserte Methoden entwickelt:
1. Verwendung des spaltbaren Crosslinkers (DSSO), der während der Messung selektiv
durch niedrige Kollisionsenergie gespalten werden kann, um die Datenbanksuche zu
vereinfachen. Die Funktionalität der DSSO-Strategie konnte erfolgreich am Protein
Cytochrom C getestet werden. Bei der ersten Fragmentierung wird der Linker gespalten, anschließend können die getrennten Peptide separat fragmentiert werden. Die erzeugten
Daten sind mit einer Standarddatenbanksuche kompatibel, was bei gemischten Spektren
von zwei Peptiden nicht der Fall wäre. Beim Quervernetzen der rekombinanten
Interaktionspartner UBX und p97N mit DSSO konnte der zu bestätigende Crosslink
zwischen zwei Lysinen nicht identifziert werden. Grund hierfür könnte eine zu kurze
Linkerlänge von DSSO sein. Diese Versuche brachten jedoch einige Limitationen des
Ansatzes zum Vorschein, wie die Beschränkung auf die Protease Trypsin, aufgrund der
positiven Ladung am C-Terminus und die Notwendigkeit von großen Proteinmengen, da
das Spalten des Linkers einen zusätzlichen Intensitätsverlust für die folgende
Identifizierung der Peptide mit sich bringt.
2. Da die niedrige Abundanz von quervernetzten Peptiden das Hauptproblem bei deren
Identifizierung ist, wurde eine Methode entwickelt, um während der Messung direkt nach
diesen niedrig abundanten Spezies zu suchen. Entscheidendes Kriterium hierfür war, dass
quervernetzte Peptide zwei C-Termini haben. Diese wurden zur Hälfte enzymatisch mit
18O bzw. 16O markiert und wieder vereinigt. Der resultierende Massenunterschied von 8
Da (4 x 18O) kommt ausschließlich bei zwei quervernetzten Peptiden vor und kann
während der Messung direkt gesucht werden. Die vollständige Markierung von Peptiden
mit 18O wurde zunächst am Protein Beta-Galaktosidase getestet. Bereits hier stellte sich
heraus, dass der enzymatische Rücktausch von 18O zu 16O ein Problem darstellt und die
Markierungseffizienz von Aminosäuren beeinflusst wird, die sich C-terminal nach der
Spaltstelle befinden. Mit dieser Strategie ließ sich somit keine vollständige Markierung
für alle Peptide erreichen, was für diese Strategie essentiell gewesen wäre.
3. Um alle Probleme zu umgehen, die bei der Identifizierung von quervernetzten Peptiden
auftreten, wurde eine Methode entwickelt, um quervernetzte Proteine anhand von Profilen
nach einer Auftrennung im Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) zu identifizieren. Durch das
Quervernetzen von Proteinen entstehen zusätzliche Proteinbanden nach einer SDSPAGE,
die im Gel nach oben verschoben sind. Alle Proteine in diesen neu erzeugten
Bereichen stellen somit potentielle Interaktionspartner dar. Als Modellsystem wurde der
Mediatorkomplex verwendet. Er wurde aus einem Zelllysat mittels Co-IP angereichert
und anschließend quervernetzt. Aus den mittels LC-MS/MS gemessenen Gelfraktionen wurden Proteinprofile erstellt und miteinander verglichen. Die Intensitätsmaxima der
Proteine des Mediatorkomplexes konnten in bestimmten zusätzlichen Fraktionen
gefunden werden, was den indirekten Nachweis für eine Interaktion darstellt. Die
Funktionalität der Strategie konnte somit bestätigt werden. Ein verbleibender Nachteil ist
jedoch die zu geringe Trennleistung von Polyacrylamidgelen. Befinden sich mehr als 50
Proteine in einer Fraktion, können potentielle Interaktionspartner nicht eindeutig zu einer
Untereinheit eines Komplexes zugeordnet werden.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde im Rahmen der Klinischen Forschergruppe 216
(CRU216) Interaktionen von Proteinen mit verschiedenen niedermolekularen
Verbindungen massenspektrometrisch untersucht, um potentielle Drug Targets zu
identifizieren. Diese Versuche sind vergleichbar mit Co-IP Experimenten, da sich der
Arbeitsablauf nur durch die Anreicherung mittels chemischer Verbindung unterscheidet.
Hierzu wurden biotinylierte Verbindungen immobilisiert und potentielle Drug Targets
aus einem komplexen Zelllysat angereichert. Die Identifzierung der echten
Bindungspartner wurde über quantitive Massenspektrometrie erreicht. Dabei wurden die
angereicherten Proteine, die an die niedermolekularen Substanzen binden mit einer
geeigneten Kontrollanreicherung verglichen. Mit den getesteten α-acyl
Aminocarboxamiden konnten verschiedene Proteinkomplexe und interagierende Proteine
spezifisch angereichert werden. Hierbei waren die vier Kinasen DNA-PK, ATM, ATR
und mTOR besonders interessant, da sie mit onkogenem Signalling und
Überlebensmechanismen wie der Hitzeschockantwort in Zellen des Multiplen Myeloms
(MM) in Verbidnung stehen. Die Inhibition der DNA-PK, ATM, ATR und mTOR mit α-
acyl Aminocarboxamiden stellt somit einen möglichen Therapieansatz dar, wenn er
zusammen mit hitzestressauslösenden Inhibitoren verwendet wird. Weiterhin konnte
gezeigt werden, dass die Armadillodomäne innerhalb der potentiellen Drug targets
signifkant angereichert wurde. Sie stellt damit eine potentielle Bindestelle der α-acyl
Aminocarboxamide dar.
Abschließend wurden Proteine mit biotinylierten Naphtylisochinolinen aus einem MMZelllysat
angereichert, deren Vorläufersubstanzen eine Wirkung auf Tumorzellen und den Malariaparasit Plasmodium falciparum gezeigt hatten. Hierbei konnten vor allem RNAbindende-
und mRNA-Splicing Proteine identifiziert werden, die zum Teil essentiell für
das Spleißen in-vivo sind. Hierzu gehören mehrere Untereinheiten der Splicing Factoren
3A und 3B. Die Veränderung der transkriptionellen Regulation und der resultierende
Effekt auf Krebszellen konnte bereits in anderen Studien mit dem Inhibitor Spliceostatin
A gezeigt werden, der das Spleißen beeinflusst.
N2  - Based on the huge biochemical variety of proteins they can interact in many different
ways with other proteins or small molecules. The first part of this work is about protein-Protein interactions which were investigated with chemical crosslinking. The aim of this work was the development of new and improved methods for the construction of
interaction networks. The second part is about protein-small molecule interactions to
identify new drug targets with subsequent validation.
Mass spectrometry (MS) is a powerful tool to investigate all protein-protein interactions
after enrichment from a cell lysate (Co-IP). By adding crosslinking to Co-IP experiments
it is possible to create a topology map which is important to differenciate between direct
and indirect interactions. To validate the crosslinking procedure, a commercial available
crosslinker and recombinant proteins of known interaction partners with low sample
complexity were used. The interaction partners NPL4 and UFD1 were successfully
crosslinked with BS3 and crosslinked peptides were identified with MS. Next step was to
apply this workflow on the Co-IP of the yeast mediator complex. Here the sample
complexity is 500 to 1000 times higher than with recombinant proteins. After
successfully crosslinking, a topology map of the subunits of the mediator complex was
created. The result matches the latest model of the complex. Crosslinks to known
interation partners, like the RNA-Pol II, were not identified because of their
substoichiometric enrichment.
Because of the known limitations of protein crosslinking, new and improved methods
were developed:
1. Application of the MS-cleavable crosslinker DSSO, which could be cleaved with low
collision energy, to improve the database search of crosslinked peptides. Proof of concept
was done by crosslinking Cytochrom C. In the first fragmentation step only DSSO is
cleaved. Fragmentation of the separated peptides is done in the next step with higher
energy. Peptid fragments are compatible with a standard database search. The application
of this method on the interacting proteins UBX and p97N failed because the predicted
crosslink could not be identified. This could be due to the lack of linker length of DSSO.
But more important, this experiment revealed the drawbacks of the DSSO approach. Trypsin is needed because this leads to a positive charge on the C-Terminus. Furthermore
large amounts of protein are required to reach the needed intensity for all fragmentation
steps.
2. Since the low abundancy of crosslinked peptides is the main issue for their
identification, a new method was developed to directly search for them during the MS
measurement. The defining criterion for this search was the occurrence of two C-termini
in crosslinked peptides. Samples were splitted, labeled with 18O or 16O, and mixed again
to generate a mass shift of 8 Da which is unique for crosslinked peptides. This mass shift
can be used to directly search for these peptides during the measurement. Proof of
concept was tested by labeling beta-galactosidase. Complete labeling could not be
reached because of enzymatic back-exchange from 18O with 16O. Furthermore the
neighbouring amino acids at the C-termini influence the labeling efficiency. Due to the
incomplete labeling, the method could not be used for identifying crosslinked peptides.
3. To circumvent all problems which occur with the identification of crosslinked peptides,
another method was developed to identifiy crosslinked proteins by their mass shift after
separation on a polyacrylamide gel (SDS-PAGE). By crosslinking proteins additional
protein bands are generated which appear in the upper part of the gel. All proteins in this
region are potential interation partners. Proof of concept was done by enrichment (Co-IP)
of the yeast mediator complex from a cell lysate with subsequent crosslinking. From the
LC-MS/MS data, profiles for every protein of the complex were generated. The
additionally generated crosslink intensity peaks of interacting subunits overlapped with
each other, which is the indirect proof of the functionality of this approach. The main
problem with this strategy is the low separation performance. When about 50 proteins are
located in one fraction, it is not possible to unambiguously match a protein to a specific
subunit of the protein complex.
In the second part of this work, the interactions of proteins with small molecules were
investigated by mass spectrometry, to identify potential drug targets. Biotinylated
versions of active compounds were immobilized to magnetic streptavidin beads and
incubated with INA6 cell lysate. By quantitiative analysis of proteins, which bind to the control beads and proteins, which bind to the inhibitor beads, potential drug targets were
identified.
With the used α-acyl aminocarboxamides several protein complexes and interacting
proteins were specifically enriched. These included the four kinases DNA-PK, ATM,
ATR and mTOR, which are involved in oncogenic signaling and survival mechanisms.
Moreover it is known, that the DNA-PK interacts with HSF1 and therefore regulates the
HSF1-mediated heat shock response. The inhibition of DNA-PK, ATM, ATR and mTOR
with α-acyl aminocarboxamides is a new therapeutic opportunity when it is combined
with other substances which trigger the heat shock response. A potential binding site of
the α-acyl aminocarboxamides is the armadillo domain, because it was significantly
enriched among the potential drug targets.
Several naphtylisochinolines were also biotinylated, immobilized and incubated with
INA6 cell lysate. Precursors of these substances showed activity against multiple
myeloma cells and the malaria pathogen Plasmodium falciparum. Here we could enrich
proteins which are associated with RNA-binding and mRNA splicing, including several
subunits of the splicing factors 3A and 3B, which are essential for splicing. The change of
the transcriptional regulation and the resulting effect on cancer cells by influencing
mRNA splicing is already known and was shown by other inhibitors like Spliceostatin A.
KW  - Massenspektrometrie
KW  - Proteininteraktionen
KW  - Molekulare Zielstrukturen
KW  - Proteinquervernetzungen
KW  - Methodenentwicklung
KW  - Mass spectrometry
KW  - Protein interactions
KW  - Drug targets
KW  - Protein crosslinking
KW  - Method development
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160462
ER  - 
TY  - THES
A1  - König, Eva-Maria
T1  - Pathogenese von Kraniosynostosen
T1  - Pathogenesis of Craniosynostoses
N2  - Das humane Schädeldach besteht aus fünf Schädelplatten, die durch intramembranöse Ossifikation entstehen. Wenn diese in der Embryonalentwicklung aufeinandertreffen, bilden sich Schädelnähte aus, die eine Fusion der Schädelplatten verhindern und damit ein Schädelwachstum parallel zu Gehirnentwicklung ermöglichen. Für diesen Prozess ist eine Balance aus Zellproliferation und Differenzierung nötig, deren Aufrechterhaltung wiederum durch eine komplexe Regulation von verschiedenen Signalwegen gewährleistet wird. Störungen in diesem regulatorischen System können zu einer vorzeitigen Fusion der Schädelplatten, Kraniosynostose genannt, führen. Die Kraniosynostose ist eine der häufigsten kraniofazialen Fehlbildungen beim Menschen. Durch kompensatorisches Wachstum an den nicht fusionierten Suturen entstehen charakteristische Schädeldeformationen, die sekundär einen erhöhten intrakranialen Druck zur Folge haben können. Eine vorzeitige Fusion der Suturen kann sowohl isoliert als auch syndromal zusammen mit weiteren klinischen Auffälligkeiten vorliegen. Bisher sind über 150 verschiedene Kraniosynostose Syndrome beschrieben und insgesamt 25-30% aller Kraniosynostose Patienten sind von einer syndromalen Form betroffen. Da die klinischen Merkmale der Kraniosynostose Syndrome variabel sind und zum Teil überlappen, ist eine klare klinische Diagnose häufig erschwert. Sowohl Umwelteinflüsse als auch genetische Veränderungen können die Ursache für Kraniosynostosen sein. Vor allem bei syndromalen Kraniosynostosen wurden genetische Veränderungen, wie beispielsweise Mutationen in den Genen FGFR2, FGFR3, TWIST1 und EFNB1, identifiziert. Darüber hinaus wurden chromosomale Veränderungen wie partielle Monosomien von 7p, 9p oder 11p sowie partielle Trisomien von 5q, 13q oder 15q mit Kraniosynostose assoziiert. Trotzdem ist in über 50% der Fälle die genetische Ursache unbekannt und die Pathogenese von Kraniosynostosen noch nicht vollständig geklärt.
Ziel dieser Arbeit war es neue genetische Ursachen bei Kraniosynostose Patienten zu identifizieren und so zur Aufklärung der Pathogenese beizutragen. Es wurde die genomische DNA von 83 Patienten molekulargenetisch durch Mikroarray basierte vergleichende Genomhybridisierung (Array-CGH) oder durch ein speziell entworfenes Next Generation Sequencing (NGS) Genpanel untersucht. Bei 30% der Patienten konnte eine potentiell pathogene Veränderung identifiziert werden. Davon waren 23% chromosomale Aberrationen wie unbalancierte Translokationen, isolierte interstitielle Verluste und ein Zugewinn an genomischen Material. Bei zwei Patienten wurden unbalancierte Translokationen mit partieller 5q Trisomie nachgewiesen. Das Gen MSX2 liegt innerhalb des duplizierten Bereichs, sodass möglicherweise eine MSX2 Überexpression vorliegt. Für ein normales Schädelwachstum ist jedoch die richtige Menge an MSX2 kritisch. Des Weiteren wurde eine partielle Deletion von TCF12 detektiert, die in einer Haploinsuffizienz von TCF12 resultiert. TCF12 Mutationen sind mit Koronarnahtsynosten assoziiert. In einem anderen Fall lag das Gen FGF10 innerhalb der duplizierten 5p15.1-p12 Region. Das Gen kodiert für einen Liganden des FGF Signalwegs und wurde bisher noch nicht mit Kraniosynostose assoziiert. Aufgrund dessen wurden Analysen im Tiermodell Danio rerio durchgeführt. Eine simulierte Überexpression durch Injektion der fgf10a mRNA in das 1-Zell Stadium führte zu schweren Gehirn-, Herz- und Augendefekten.
Mittels NGS wurden 77% der potentiell pathogenen genetischen Veränderungen identifiziert. Hierfür wurde in dieser Arbeit ein Genpanel erstellt, das 68 Gene umfasst. Es wurden sowohl bekannte Kraniosynostose- als auch Kandidaten-Gene sowie Gene, die mit der Ossifikation assoziiert sind, in die Analyse eingeschlossen. Das Genpanel wurde durch die Sequenzierung von fünf Kontrollproben mit bekannten Mutationen erfolgreich validiert. Anschließend wurde die genomische DNA von 66 Patienten analysiert. Es konnten 20 (potentiell) pathogene Varianten identifiziert werden. Neben bereits bekannten Mutationen in den Genen FGFR1, FGFR2, FGFR3 und TWIST1, konnten zusätzlich 8 neue, potentiell pathogene Varianten in den Genen ERF, MEGF8, MSX2, PTCH1 und TCF12 identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen dazu bei das Mutationsspektrum dieser Gene zu erweitern. Bei zwei der Varianten handelte es sich um potentielle Spleißvarianten. Für diese konnte in einem in vitro Spleißsystem gezeigt werden, dass sie eine Änderung des Spleißmusters bewirken. Der Nachweis von zwei seltenen Varianten in den Genen FGFR2 und HUWE1 hat außerdem dazu beigetragen die Pathogenität dieser spezifischen Varianten zu bekräftigen. Eine Variante in POR, die aufgrund bioinformatischer Analysen als potentiell pathogen bewertet wurde, wurde nach der Segregationsanalyse als wahrscheinlich benigne eingestuft. Zusammenfassend konnten bei etwa einem Drittel der Patienten, die mit dem NGS Genpanel analysiert wurden, eine genetische Ursache identifiziert werden. Dieses Genpanel stellt somit ein effizientes diagnostisches Tool dar, das zukünftig in der genetischen Routine-Diagnostik von Kraniosynostose-Patienten eingesetzt werden kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass sowohl eine Untersuchung auf CNVs als auch auf Sequenzänderungen bei Kraniosynostose Patienten sinnvoll ist.
N2  - Cranial bones are formed by intramembranous ossification. During development, the cranial bones are separated by fibrous sutures, which function as bone growth sites and therefore, the cranial sutures need to remain patent to allow the expansion of the skull during brain development. Thus, there must be a balance of cell proliferation and differentiation within the suture. This complex process requires a tight regulation of gene expression and interacting signal pathways. Imbalances or dysfunction of the involved factors can result in abnormal skull growth. One of the most common congenital craniofacial disorders by affecting approximately one in 2500 newborns is craniosynostosis. It is defined as the premature ossification of one or more calvarial sutures. Compensatory growth of the skull leads to a characteristic dysmorphic cranial vault and facial asymmetry. Premature ossification of the cranial sutures can occur either as isolated malformation or as part of a syndrome. Isolated craniosynostoses are more frequent, nevertheless, 25-30% of all cases are syndromic craniosynostoses with more than 150 syndromes reported. There is a high intra- and interfamilial variability and clinical overlap of the different syndromes. Environmental influences as well as genetic defects like mutations and chromosomal aberrations are known to cause craniosynostosis. So far genetic causes have been identified mainly for syndromic craniosynostoses, i.e. mutations in FGFR2, FGFR3, TWIST1, and EFNB1. Furthermore, chromosomal rearrangements like i.e. partial monosomy of 7p, 9p, and 11p as well as partial trisomy of 5q, 13q, and 15q, have been reported in 11-15% of the syndromic craniosynostosis cases. However, in more than 50% of the cases the underlying genetic cause remains unknown. Furthermore, the pathogenesis of craniosynostoses is still not fully understood.
In this project 83 craniosynostosis patients were analysed either by microarray-based comparative genomic hybridisation (array-CGH) or gene panel based next generation sequencing (NGS) to further investigate the pathogenesis of craniosynostosis. In a total of 30% of the patients a potential genetic cause was identified. Among those 23% had chromosomal rearrangements which are likely to cause the observed phenotypes, i.e. unbalanced translocations affecting several genes as well as interstitial deletions and an isolated duplication have been detected. Two patients had unbalanced translocations with partial 5q trisomies encompassing MSX2. MSX2 gene dosage is critical for normal growth of the cranial bone plates as loss-of-function mutations lead to delayed and incomplete ossification of the parietal bones. Furthermore, we identified a partial TCF12 deletion which is likely to result in TCF12 haploinsufficiency. TCF12 mutations frequently lead to premature fusion of the coronal sutures, although its pathogenesis is still not fully understood. In another case isolated duplication of 5p15.1-p12 includes FGF10 which is a known ligand of the FGF signalling pathway. So far, no association of FGF10 with craniosynostosis has been made. To investigate its potential role during development and in the pathogenesis of craniosynostosis functional experiments were performed in Danio rerio, an animal model for craniosynostosis. Simulation of fgf10a overexpression by injection of fgf10a RNA at 1-cell stage resulted in severe anomalies of the brain, heart and eyes.
In addition, 77% of the identified genetic causes were detected by NGS. For this study a gene panel was designed comprising 68 genes of known and candidate craniosynostosis genes as well as genes associated with bone development. Performance of the NGS gene panel was validated by sequencing five control patients with known mutations. Subsequently, genomic DNA of 66 patients was analysed by the designed craniosynostosis panel. 20 (potential) pathogenic variants were detected. Although, in most of the cases hot spot sequencing of one or more common craniosynostosis genes was performed prior to including the patients in the study, we determined 9 known mutations in the genes FGFR1, FGFR2, FGFR3, and TWIST1. In addition, 8 novel, potentially disease-causing variants in the genes ERF, MEGF8, MSX2, PTCH1, and TCF12 were identified. This work contributed to extend the mutational spectrum within those genes. Two of those variants were predicted to affect splice sites. Analysis by an in vitro splice assay revealed that those variants result in aberrant splicing. Furthermore, the detection of two rare variants of FGFR2 and HUWE1 adds support to their pathogenicity. An additional variant within POR had to be classified as likely benign after segregation analysis. Overall, in nearly one third of the analysed cases an underlying genetic cause could be identified by the designed gene panel. Thus, the NGS panel presents as an efficient tool for genetic diagnostics of craniosynostoses. The data of this work clearly show both copy number variant and single nucleotide variant analysis should be considered in genetic diagnostics of craniosynostosis patients.
KW  - Kraniosynostose
KW  - Genetik
KW  - Next Generation Sequencing (NGS)
KW  - Mikroarray basierte vergleichende Genomhybridisierung (Array-CGH)
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175181
ER  - 
TY  - THES
A1  - Tiffe, Theresa
T1  - Prävalenz und Determinanten für die Einhaltung der leitliniengerechten Therapie kardiovaskulärer Risikofaktoren in der Primär- und Sekundärprävention von Herz-Kreislauf-Erkrankungen in Deutschland
T1  - Prevalence and determinants for compliance to guidelines recommendations for therapy of cardiovascular risk factors in primary and secondary prevention of cardiovascular diseases in Germany
N2  - Die Einhaltung eines gesunden Lebensstils, einschließlich der Behandlung modifizierbarer kardiovaskulärer Risikofaktoren, beeinflusst maßgeblich die Entstehung und Progression von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (HKE). So reduziert eine ausgewogene Ernährungsweise, ausreichend körperliche Aktivität, Tabakverzicht, das Halten des Normalgewichtes sowie die Behandlung einer Hypertonie, Hyperlipidämie und Diabetes mellitus, die kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität. 
Die vorliegende Arbeit widmet sich (a) der Prävalenz und leitliniengerechten Kontrolle kardiovaskulärer Risikofaktoren von Teilnehmern aus der Allgemeinbevölkerung der STAAB Kohortenstudie („Häufigkeit und Einflussfaktoren auf frühe Stadien A und B der Herzinsuffizienz in der Bevölkerung“) sowie der Schätzung des 10-Jahres Risikos für tödliche HKE in diesem Kollektiv. Weiterhin wurde (b) der Einfluss von medikamentenbezogenen Überzeugungen auf die Blutdruckkontrolle von Teilnehmern der STAAB Kohortenstudie untersucht. Schließlich wurde (c) der Erhalt von ärztlichen Lebensstilempfehlungen sowie deren Determinanten bei Teilnehmern der STAAB Kohortenstudie sowie der EUROASPIRE IV Studie („European Action on Secondary and Primary Prevention by Intervention to Reduce 
Events“) in Deutschland betrachtet. 
Die STAAB Kohortenstudie untersucht die frühen asymptomatischen Formen der Herzinsuffizienz-Stadien A und B in einer repräsentativen Stichprobe von 5.000 Personen 
ohne symptomatische Herzinsuffizienz im Alter von 30 bis 79 Jahren aus der Allgemeinbevölkerung mit Wohnsitz in der Stadt Würzburg.  
Die EUROASPIRE IV Studie untersuchte bei 7.998 Koronarpatienten im Alter von 18 bis 79 
Jahren aus insgesamt 24 Europäischen Ländern (536 Patienten aus Deutschland) im Zeitraum 2012 bis 2013 die Risikofaktoren sowie die Umsetzung der leitliniengerechten Versorgung und Prävention von HKE im europäischen Vergleich.  Die Datenerhebung beider Studien erfolgte durch ein geschultes Studienpersonal nach standardisierten Vorgaben.
Die Prävalenz und Kontrolle kardiovaskulärer Risikofaktoren nach den aktuellen Vorgaben der „European Society of Cardiology“ (ESC) wurde bei insgesamt 1.379 Teilnehmern, die zwischen Dezember 2013 und April 2015 an der STAAB Kohortenstudie teilgenommen haben, untersucht. Es zeigte sich eine hohe Prävalenz der kardiovaskulären Risikofaktoren Hypertonie (31.8%), Hyperlipidämie (57.6%) und Diabetes mellitus (3.5%). Hierbei erreichten 
trotz Pharmakotherapie über die Hälfte der Teilnehmer mit einem Bluthochdruck (52.7%) oder erhöhten LDL-Cholesterinwerten (56.7%) sowie 44.0% der Personen mit einem Diabetes mellitus die empfohlenen Grenzwerte nicht. Weiterhin wurde erstmalig zu Studienbesuch eine Hypertonie (36.0%), Hyperlipidämie (54.2%) oder ein Langzeitzuckerwert (HbA1c) >6.5% (23.3%) detektiert. In der jüngsten Altersgruppe (30-39 Jahre) fand sich der höchste Anteil von unbekanntem Bluthochdruck (76.5%) sowie hohem LDL-Cholesterin (78.0%) und die Altersgruppe 60-69 Jahren wies mit 43.5% die höchste Prävalenz für einen bislang nicht detektierten HbA1c >6.5% auf. Die Akkumulation von drei oder mehr kardiovaskulären Risikofaktoren war mit dem männlichen Geschlecht, einem höheren Alter und einem niedrigeren Bildungsgrad assoziiert. Von 980 mittels SCORE („Systematic Coronary Risk Evaluation“) Risiko-Chart untersuchten Teilnehmern befanden sich jeweils 56.6%, 35.8% und 7.5% in der niedrigen, mittleren und hohen bis sehr hohen SCORE-Risikogruppe für tödliche HKE. Das Hochrisiko-Kollektiv für tödliche HKE war vorwiegend männlich und wies häufiger eine Hypertonie oder ein hohes LDL-Cholesterin auf. 
Der Einfluss von Überzeugungen gegenüber antihypertensiver Medikation auf die Blutdruckkontrolle wurde an 293 Teilnehmern, die von Oktober 2014 bis März 2017 an der STAAB Kohortenstudie teilgenommen haben, untersucht. Auf ihre Medikamente gesundheitlich angewiesen zu sein gaben 87% der Teilnehmer an, 78.1% stimmten der Aussage zu, dass ihre Medikamente sie vor einer Verschlechterung ihrer Gesundheit schützen. Es zeigte sich ein inverser Zusammenhang zwischen einem höheren Maß an Bedenken gegenüber der verordneten blutdrucksenkenden Medikation und einer besseren Blutdruckkontrolle bei Frauen. Ein signifikanter Zusammenhang zwischen Bedenken gegenüber einer antihypertensiven Medikation und der Blutdruckkontrolle bei Männern ließ sich hingegen nicht feststellen. Es konnten keine statistisch signifikanten Assoziationen für die Notwendigkeit von Medikation in der vorliegen Untersuchung gezeigt werden. 
Die Häufigkeit und Determinanten für die Empfehlung eines ärztlichen Lebensstils wurde bei 665 Teilnehmern der STAAB Kohortenstudie ohne vorbestehende HKE (Primärprävention) und bei 536 Koronarpatienten der EUROASPIRE IV Studie (Sekundärprävention) untersucht. 
Mit Ausnahme der Empfehlung zum Rauchverzicht erhielten die Patienten der EUROASPIRE IV Studie häufiger ärztliche Lebensstilempfehlungen verglichen mit Teilnehmern der STAAB Kohortenstudie: (Rauchverzicht: STAAB 44.0%, EUROASPIRE 36.7%; Gewichtsreduktion: STAAB 43.9%, EUROASPIRE 69.2%; körperliche Aktivität steigern: STAAB 52.1%, EUROASPIRE 71.4%; gesundes Ernährungsverhalten: STAAB 43.9%, EUROASPIRE 73.1%). Die Chance für den Erhalt von mindestens 50% aufgrund der individuellen Risikofaktoren adäquaten ärztlichen Lebensstilempfehlungen war bei STAAB Teilnehmern mit offensichtlichen oder beobachtbaren kardiovaskulären Risikofaktoren signifikant erhöht (BMI >25kg/m2, Hypertonie, Hyperlipidämie und Diabetes mellitus). 
Hingegen erhielten Patienten mit einer vorbestehenden HKE signifikant häufiger eine ärztliche Lebensstilempfehlung bei einem Diabetes mellitus, wobei die Empfehlungshäufigkeit mit zunehmendem Alter abnahm. Die weitergehende nicht publizierte Analyse des Interaktions
Modells zeigte, dass der Zusammenhang zwischen dem Alter und der Empfehlungshäufigkeit bei Patienten mit bereits bestehender HKE stärker ausgeprägt war, als bei Teilnehmern der STAAB Kohortenstudie ohne koronare HKE. Weiterhin war der Zusammenhang zwischen einer adäquaten Lebensstilempfehlung und Hyperlipidämie bei Teilnehmern ohne koronares Ereignis signifikant stärker ausgeprägt, im Vergleich zu Patienten mit einer bereits bestehender HKE.  
Die Ergebnisse zeigten ein erhebliches Potenzial für eine verbesserte Umsetzung leitliniengerechter Behandlung modifizierbarer kardiovaskulärer Risikofaktoren in der Primär- und Sekundärprävention. Vor dem Hintergrund einer hohen Anzahl kardiovaskulärer Risikofaktoren bei jungen Erwachsenen sollte die Bedeutung der Langzeitfolgen im Arzt
Patienten-Gespräch hervorgehoben und bei der Erarbeitung von Präventionsstrategien, insbesondere für junge Altersgruppen, Beachtung finden. Geschlechtsspezifische 
Determinanten hinsichtlich der Kontrolle kardiovaskulärer Risikofaktoren sowie Befürchtungen gegenüber der Medikation sollten stärker im Arzt-Patientengespräch berücksichtigt werden. 
Zur Stärkung der Compliance des Patienten bei der Umsetzung eines gesunden Lebensstils, 
sollte der Arzt hinsichtlich der Bedeutung von Lebensstilintervention, aber auch im Umgang mit schwierigen Situationen, wie die Empfehlung einer Gewichtsreduktion, sensibilisiert und bei der richtigen Handhabung der Leitlinienempfehlung stärker unterstützt werden.
N2  - Maintaining a healthy lifestyle, including the treatment of modifiable cardiovascular risk factors,  has a significant impact on the development and progression of cardiovascular diseases (CVD). Thus, a healthy diet, adequate physical activity, tobacco control, maintaining normal weight and the treatment of hypertension, hyperlipidemia and diabetes mellitus, reduce cardiovascular morbidity and mortality.  
The present work focused on (a) the prevalence and guideline-recommended control of cardiovascular risk factors from the general population of the STAAB cohort study (Characteristics and Course of Heart Failure Stages A-B and Determinants of Progression) and their estimation of the 10-year risk of fatal CVD. Furthermore, we investigated, (b) the influence of medication-related beliefs on blood pressure control from participants of the 
STAAB cohort study. Finally, we considered (c) the maintenance of physicians-led lifestyle 
recommendations and their determinants in the STAAB cohort study compared to the EUROASPIRE IV study (European Action on Secondary and Primary Prevention by Intervention to Reduce Events) in Germany. 
The STAAB cohort study examines the early asymptomatic forms of heart failure stages A and B in a representative sample of 5.000 participants aged 30 to 79 years of the general population of the city of Würzburg. 
The EUROASPIRE IV study examined 7.998 patients with CVD aged 18 to 79 years from a total of 24 European countries between 2012 to 2013, including 536 patients from Germany. 
The Study investigated the prevalence of cardiovascular risk factors as well as the guideline recommended control care in coronary patients.  
The data collection of both studies was performed by trained staff according to standardized operating procedures. 
The prevalence and control of cardiovascular risk factors according to the current guidelines of the European Society of Cardiology (ESC) was investigated in 1.379 participants who participated in the STAAB cohort study between December 2013 and April 2015. 
A high prevalence of hypertension (31.8%), hyperlipidemia (57.6%) and diabetes mellitus (3.5%) was observed. Despite pharmacotherapy, more than half of the participants with high blood pressure (52.7%) or elevated LDL cholesterol levels (56.7%) as well as 44.0% of the persons with diabetes mellitus failed to reach the targets recommended in clincial guidelines. 
Furthermore, hypertension, hyperlipidemia and an HbA1c-level >6.5% was detected for the first time during study visit in 36.0%, 54.2% and 23.3%, respectively. The highest proportion of unknown cardiovascular risk factors was found in the youngest age group (30-39 years) for high blood pressure (76.5%), high LDL cholesterol (78.0%), and in the age group of 60-69 years for an undetected HbA1c-level of >6.5%. The accumulation of three or more cardiovascular risk factors was associated with male gender, higher age and educational level. 
Of 980 participants of the STAAB cohort study, 56.6%, 35.8%, and 7.5% were in the low, middle, and high to very high risk group for fatal CHD according to the SCORE risk chart. Participants with a high to very high SCORE risk group were predominantly male and demonstrated a higher prevalence of hypertension or high LDL cholesterol.  
The influence of medication-related beliefs on blood pressure control was investigated in 293 
participants who participated in the STAAB cohort study from October 2014 to March 2017. 
Eighty-seven percent of these participants stated that „I sometimes worry about becoming too dependent on my medicines“, followed by the statement „My medicines protect me from becoming worse“ worse (78.1%). There was an inverse association between a higher level of concern about the prescribed antihypertensive medication and a better blood pressure control in women. However, there was no statistically significant association between concerns about antihypertensive medication and blood pressure control in men. No statistically significant 
associations were found for the necessity of prescribed medication in any model. 
The prevalence and determinants for healthy lifestyle advices by physicians were investigated in 665 participants of the STAAB cohort study without previous CVD (primary prevention) and in 536 coronary patients of the EUROASPIRE IV study (secondary prevention). 
Except for smoking, patients in EUROASPIRE IV received more frequently healthy lifestyle advices than participants in the STAAB cohort study (smoking abstinence: STAAB 44.0%, 
EUROASPIRE 36.7%; weight reduction: STAAB 43.9%, EUROASPIRE 69.2%; physical activity: STAAB 52.1%, EUROASPIRE 71.4%; healthy diet: STAAB 43.9%, EUROASPIRE 73.1%). In addition, patients with a pre-existing CVD received significantly more lifestyle advices for diabetes mellitus, whereas the frequency of lifestyle recommendations decreased with advancing age. The analysis of the interaction model showed that the correlation between age and receiving adequate lifestyle advices was more pronounced in patients with existing CVD than in participants without coronary CVD in the STAAB cohort study. Furthermore, the relationship between receiving adequate lifestyle advices and hyperlipidemia was significantly stronger in participants without a coronary event compared to patients with existing CVD. 
Present results show a considerable potential for improved implementation of guideline recommended control of modifiable cardiovascular risk factors in primary and secondary prevention. Due to the high number of cardiovascular risk factors in young adults, the 
importance of long-term consequences of cardiovascular risk factors should be emphasized in physician-patient conversation and taken into account in the development of prevention strategies, especially for younger age groups. Gender-specific determinants regarding the 
control of cardiovascular risk factors as well as concerns about medication should be given greater consideration in the physician-patient interaction. In order to strengthen the patients compliance of a healthy lifestyle, physicians should be sensitized with regard to the importance of healthy lifestyle advices, but also in dealing with difficult situations, such as the recommendation of weight reduction. Also the correct handling of the guideline 
recommendations by physicians should be more supported.
KW  - Kardiovaskuläre Krankheit
KW  - Herz-Kreislauf-Erkrankung
KW  - kardiovaskuläre Risikofaktoren
KW  - Prävention
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192723
ER  - 
TY  - THES
A1  - Herrmann, Johannes Bernd
T1  - Rolle des Komplement C5a-Rezeptors 1 in der Pathophysiologie der Meningokokken-Sepsis
T1  - Role of complement C5a-Receptor 1 in Pathophysiology of Meningococcal Sepsis
N2  - Das bekapselte, Gram-negative, diplokokkenförmige Bakterium Neisseria meningitidis (Nme) ist ein asymptomatischer Kommensale des oberen Nasenrachenraums im Men-schen. Gerade bei Kindern ist es dem humanspezifischen Pathogen in seltenen Fällen möglich, in den Blutstrom einzuwandern und lebensbedrohliche Krankheitsbilder wie Meningoenzephalitis und Sepsis auszulösen, welche als „Invasive Meningokokkener-krankung“ (IMD) zusammengefasst werden. Jährlich ereignen sich weltweit bis zu 1,2 Mio Fälle von IMD, welche aufgrund des fulminanten Verlaufs und der hohen Letalität gefürchtet sind. In der Bekämpfung der Nme-Sepsis ist das humane Komplementsystem von entscheidender Bedeutung. Vor diesem Hintergrund ist die protektive Rolle des lytischen (Membranangriffskomplex MAK) und opsonisierenden Arms (Opsonine iC3b und C1q) der Komplementkaskade gut dokumentiert. Dagegen ist der Beitrag des in-flammatorischen Arms (Anaphylatoxine C3a und C5a) in der Nme-Sepsis bisher unklar. Aus diesem Grunde wurde mit dieser Arbeit die Rolle des inflammatorischen Arms an-hand des Komplement C5a-Rezeptors 1 (C5aR1) in der Pathophysiologie der Nme-Sepsis am Mausmodell untersucht. Nach Etablierung des murinen, intraperitonealen In-fektionsmodells konnte ein schädlicher Effekt des C5aR1 in der Nme-Sepsis beobachtet werden. Aus der Abwesenheit des C5aR1 resultierte eine höhere Überlebensrate, ein besserer klinischer Zustand, eine niedrigere Bakteriämie und niedrigere Konzentrationen der pro-inflammatorischen Mediatoren IL-6, CXCL-1 und TNF-α. Im Hinblick auf den zellulären Pathomechanismus sprechen Ergebnisse dieser Arbeit dafür, dass der C5aR1 primär eine gesteigerte Freisetzung inflammatorischer Mediatoren durch verschiedene Zellpopulationen triggert (Zytokinsturm), wodurch sekundär Zellparalyse, steigende Bakteriämie und höhere Letalität bedingt sind. Durch Depletionsversuche und Immun-fluoreszenzfärbungen konnte, unabhängig vom C5aR1, eine allgemein protektive Rolle von neutrophilen Granulozyten und Monozyten/Makrophagen in der Nme-Sepsis beo-bachtet werden. Darüber hinaus präsentierte sich der zyklische C5aR1-Antagonist PMX205 als erfolgsversprechende Therapieoption, um Parameter einer murinen Nme-Sepsis zu verbessern. Weitere Untersuchungen sind nötig, um die Wirksamkeit dieser Substanz in der humanen Nme-Sepsis zu erforschen. Zudem könnte das murine, intrape-ritoneale Infektionsmodell zur Klärung der Rolle des C5aR2 in der Nme-Sepsis genutzt werden.
N2  - The encapsulated, Gram-negative diplococcus Neisseria meningitidis (Nme) is an asymp-tomatic commensal in the human upper respiratory tract. In rare cases and especially in children, this human-specific pathogen is able to invade into the blood stream and cause life-threatening disorders like meningoencephalitis and septicemia, which are subsumed as „invasive meningococcal disease“ (IMD). The estimated number of cases is about 1.2 mio per year worldwide. IMD is greatly feared because of its fulminant progression and its high lethality. It is very well known, that the human complement system holds an essential role to fight meningococcal sepsis. In this context, the protective effects of the lytic (membrane attack complex MAC) and opsonizing branches (opsonines iC3b and C1q) are well established. On the contrary, very little is known about the contribution of the inflammatory branch (anaphylatoxines C3a and C5a) in meningococcal sepsis. Therefore, this work focused on the role of the C5a-Receptor 1 (C5aR1) in pathophysi-ology of meningococcal sepsis in a murine model. After having established the para-mount role of complement in murine intraperitoneal infection model, we could observe a detrimental effect of C5aR1 in Meningococcal sepsis. The absence of C5aR1 resulted in a higher overall survival, ameliorated clinical status, lower bacteremia and lower levels of the proinflammatory mediators IL-6, CXCL-1, TNF-α. Particularly with regard to results about the cellular pathomechanism, the C5aR1 seems to cause an increased re-lease of proinflammatory mediators (cytokine storm) exerted by various cell populations. As a consequence, cellular paralysis, increasing bacterial burden and higher lethality rate seems to occur. In reference to depletion experiments and immunofluorescence stain-ings, we could observe protective overall effects of neutrophils and mono-cytes/macrophages, uncorrelated to C5aR1 presence. Ultimately, the cyclic C5aR1-antagonist PMX205 appeared to be a promising option to improve parameters in murine meningococcal sepsis. Further experiments are required to examine the potential of this compound in human meningococcal sepsis. Moreover, the murine, intraperitoneal infec-tion model could be used to clarify the role of C5aR2 in meningococcal sepsis.
KW  - Komplement C5a
KW  - Neisseria meningitidis
KW  - Meningokokken-Sepsis
KW  - Komplement C5a Rezeptor 1
KW  - C5aR1-Antagonist
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184533
ER  - 
TY  - THES
A1  - Röser [geb. Aßmus], Benjamin
T1  - SPRED2 (Sprouty-related EVH1 domain containing 2) reguliert die Autophagie in Kardiomyozyten
T1  - SPRED2 (Sprouty-related EVH1 domain containing 2) regulates autophagy in cardiomyocytes
N2  - Das Sprouty-related, EVH1 domain containing protein 2 (SPRED2) ist ein
inhibitorisches, downstream von Ras wirkendes Protein des MAP-Kinase Signalwegs,
welches entscheidenden Einfluss auf die Regulation von Proliferation, Expression von
Proteinen und der zellulären Homöostase hat. Der kardiale Phänotyp von SPRED2-
defizienten Mäusen zeigt nicht nur eine deutliche linksventrikuläre Hypertrophie,
sondern auch eine erhöhte Fibrosierung des Herzgewebes. Zellulär wird die SPRED2-
Defizienz durch die Akkumulation von vesikulären Strukturen innerhalb der Zelle,
sowie eine markant erhöhte Anzahl von Vesikeln entlang der longitudinalen Reihen
der Mitochondrien gekennzeichnet.
Ziel dieser Arbeit war es, den Charakter dieser vesikulären Strukturen näher zu
beleuchten und festzustellen, in welchem Zusammenhang die subzellulär veränderte
Architektur mit der Hypertrophie der SPRED2-defizienten Tiere steht. Um diese
Fragestellung zu beantworten, wurde zunächst nach einem vesikulären
Degradationsmechanismus gesucht, der in SPRED2-/--Cardiomyocyten betroffen sein
könnte. Die Macroautophagie, im folgenden Autophagie bezeichnet, ist ein solcher
Degradationsmechanismus, bei dem selektiv langlebige Proteine und Zellorganellen
abgebaut werden. Es konnten signifikante Veränderung der Protein-Level an
Schlüsselpositionen der Autophagie identifiziert werden. Das Ubiquitin-aktivierende
(E1) Enzym Homolog Atg7 sowie die Cystein-Protease Atg4B zeigen sich im SPRED2-
KO deutlich reduziert. Ebenso Atg16L, das als essentieller Bestandteil des Atg5-
Atg12-Atg16-Konjugationssystems bei der Konjugation von MAPLC3-II an das
Phospholipid Phosphatidylethanolamin beteiligt ist. Die Autophagie-Rate als
Verhältnis von konjugiertem zu unkonjugiertem MAPLC3 ist ebenfalls reduziert. Die
Akkumulation der autophagischen Vesikel zeigt sich kongruent zu dem erhöhten
Protein-Level der autophagischen Cargo-Rezeptoren SQSTM1 und NBR1, sowie des
lysosomalen Markers CathepsinD. Außer der verringerten Autophagie-Rate zeigt sich
in Einklang mit der Fibrosierung des Herzgewebes eine erhöht aktive Caspase-3 als
Marker für Apoptose. Um die mitochondriale Integrität näher zu beleuchten, wurde die
Menge an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Wildtyp und SPRED2-KO untersucht.
Hierbei zeigte sich eine erhöhte Menge an ROS im KO, was ein Hinweis auf eine
Beeinträchtigung der Mitochondrien darstellt.
 
Letztlich wurde die Hypothese überprüft, ob ein gestörter Transport der Vesikel
durch eine Beeinträchtigung der Motorproteine Dynein und Kinesin vorliegt. In der Tat
zeigte sich die Aktivität der Dynein-ATPase verringert in der Abwesenheit von
SPRED2. Diese Beobachtung wird durch die erhöhten Mengen des vSNARE-Proteins
VTI1b unterstützt, was letztlich die Akkumulation der autophagischen Vesikel mit einer
verringerten Fähigkeit zur Membranfusion und dem ineffizienteren Transport der
Vesikel in Einklang bringt.
Da die gesamten Experimente in einem globalen SPRED2-KO System
durchgeführt wurden, können eventuelle Auswirkungen der beeinflussten hormonellen
Situation der SPRED2-KO Tiere auf den Herzphänotyp nicht final ausgeschlossen
werden. Um die genaue Wirkung einer SPRED2-Defizienz auf das Herzgewebe und
das Herz als Organ zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine SPRED2-
defiziente knockout Mauslinie mit konditionalem Potential generiert, die eine
gesteuerte Deletion von SPRED2 im Herzgewebe erlaubt.
N2  - The Sprouty-related, EVH1 domain containing protein 2 (SPRED2) is a MAP kinase
signaling inhibitor working downstream of Ras. It has a critical influence on regulating
proliferation, differentiation, expression of proteins and cellular hemostasis. The
cardiac phenotype of SPRED2 deficient mice not only shows a significant left
ventricular hypertrophy but also a hightened fibrosis of the heart tissue. On the cellular
level the SPRED2 deficiency is marked by an accumulation of ventricular structures
within the cell, as well as a decisive number of vesicles along the longitudinal rows of
mitochondria.
The aim of this work was to elucidate the properties of these vesicular structures
and to determine in which context the subcellularly modified architecture and the
hypertrophy of the SPRED2 deficient animals stand to each other. To answer this
question, a protein degradation mechanism that could be changed within the SPRED2
deficient cardiomyocytes was identified. Macroautophagy, further called autophagy, is
such a degradation mechanism, which degrades long-lived proteins and cell
organelles. This work identified significant changes made to the protein level of key
regulators of autophagy. The ubiquitin-activating (E1) enzyme homolog Atg7 as well
as the cystein protease Atg4B are reduced in the SPRED2 KO. Similarly, Atg16L,
which acts as an essential part of the Atg5-Atg12-Atg16 conjugation system in the process of conjugating MAPLC3 to the phospholipid phosphatidylethanolamine. The
autophagic flux, as the relation between conjugated and unconjugated MAPLC3, is
reduced in the knockout as well. The accumulation of autophagic vesicles is in
accordance with the elevated protein levels of the cargo receptors SQSTM1 and NBR1
as well as the lysosomal marker CathepsinD. Besides the reduced autophagic flux
there is an elevated protein level of activated caspase-3 as a marker of apoptosis. To
further elucidate the mitochondrial integrity, the endogenous levels of reactive oxygen
species were determined in wildtype and knockout individuals. It was shown that the
SPRED2 knockout contains an elevated level of ROS which could be a sign of reduced
mitochondrial survival.
Finally, it was investigated whether the disturbed transport of vesicles was due to
impaired motor protein efficiency. It was shown that the activity of the dynein ATPase
was reduced when SPRED2 was absent. This observation is supported by the elevated
levels of the vSNARE protein VTI1b, which connects the accumulation of autophagic
vesicles with the reduced ability to membrane fusion and a less efficient transport of
vesicles.
The experiments of this work were conducted in a global SPRED2-KO system.
Possible effects of the changed hormonal situation of the SPRED2 deficient animals
to the heart phenotype cannot be excluded. For that reason a conditional SPRED2
knockout mouse line with conditional potential was created capable of further
elucidating the effect of a SPRED2 deficiency to the heart.
KW  - Spred-Proteine
KW  - Autophagie <Physiologie>
KW  - Herzmuskelzelle
KW  - Autophagozytose
KW  - Autophagosom
KW  - autophagocytosis
KW  - autophagosome
KW  - Kardiomyozyt
KW  - Vesikel
KW  - Lysosom
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-182700
ER  - 
TY  - THES
A1  - Pomper [geb. Müller], Laura Dorothea
T1  - Unterschiede in Frontaler Kortex Oxygenierung in zweierlei Risikogruppen der Alzheimer Demenz
T1  - Differences in Frontal Lobe Oxygenation in Two Risk Groups for Alzheimer's Disease
N2  - Die verbesserte medizinische Versorgung führt zu einer zunehmenden Lebenserwartung unserer Gesellschaft. Damit steigt auch die sozioökonomische Relevanz neurodegenerativer Erkrankungen kontinuierlich. Für die Alzheimer Demenz (AD), die dabei die häufigste Ursache darstellt, stehen bisher keine krankheitsmodifizierenden Behandlungsoptionen zur Verfügung. Die lange präklinische Phase der Erkrankung birgt jedoch großes Potential für die Entwicklung neuer Behandlungsoptionen. Das Untersuchen von Risikogruppen ist für die Identifikation von Prädiktoren einer späteren AD Manifestation von besonderem Interesse. In diesem Zusammenhang werden insbesondere das Vorliegen genetischer Risikokonstellationen, wie dem Apolipoprotein E (APOE) Ɛ4-Allel, sowie kognitiver Risikofaktoren, wie der „leichten kognitiven Beeinträchtigung“ (MCI), diskutiert. Die Identifikation präklinischer Aktivierungsunterschiede in relevanten Gehirnregionen von Risikogruppen kann als Basis für die Entwicklung neurofunktioneller Früherkennungs-Marker dienen. Der präfrontale Kortex (PFC), welcher mit der Steuerung von Exekutivfunktionen assoziiert wird, hat sich in diesem Zusammenhang in bisherigen Studien als eine relevante Schlüsselregion manifestiert. Aufgrund der aufwendigen und kostenintensiven bildgebenden Untersuchungsmethoden, sind die genauen Prozesse jedoch noch unklar.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Unterschiede in der PFC Oxygenierung in zweierlei Risikogruppen der AD mit einer kostengünstigeren Bildgebungsmethode, der funktionellen Nahinfrarot Spektroskopie (fNIRS), zu untersuchen. Dafür wurde in einem ersten Schritt, der Trailmaking Test (TMT), ein weitverbreiteter neuropsychologischer Test zur Erfassung exekutiver Funktionen, für fNIRS implementiert. Als Grundlage für die Untersuchung frühpathologischer Prozesse, wurden zunächst gesunde Alterungsprozesse betrachtet. Der Vergleich von jungen und älteren Probanden (n = 20 pro Gruppe) wies neben der Eignung der Testimplementierung für fNIRS auf eine spezifische bilaterale PFC Oxygenierung hin, welche bei jungen Probanden rechtshemisphärisch lateralisiert war. Ältere Probanden hingegen zeigten bei vergleichbaren Verhaltensdaten insgesamt mehr signifikante Kanäle sowie eine Abnahme der Lateralisierung. Dies kann als zusätzlicher Bedarf an Ressourcen in gesunden Alterungsprozessen interpretiert werden.
Im Rahmen der Hauptstudie wurden anschließend insgesamt 604 ältere Probanden im Alter von 70 bis 76 Jahren untersucht. Zunächst wurde die genetische Risikogruppe der Ɛ4-Allel-Träger (n = 78) mit den neutralen Ɛ3-Allel-Trägern (n = 216) und den Trägern des als protektiv geltenden Ɛ2-Allels (n = 50) verglichen. Hierbei zeigte sich eine geringere Oxygenierung der Risikogruppe bei geringer Aufgabenschwierigkeit, während sich ein erhöhter Oxygenierungsanstieg im medialen PFC mit steigender Aufgabenschwierigkeit zeigte. Dies deutet auf einen erhöhten Bedarf an neuronalen Kontrollmechanismen der Risikogruppe zur Bewältigung der steigenden Aufgabenschwierigkeit hin. Die protektive Gruppe zeigte hingegen eine erhöhte Oxygenierung im ventralen PFC mit steigender Aufgabenschwierigkeit, was möglicherweise auf einen präventiven Effekt hindeuten könnte.  
Weiterführend wurden MCI-Patienten mit gesunden Probanden (n = 57 pro Gruppe) hinsichtlich des kognitiven Risikofaktors verglichen. Hierbei zeigte sich ein punktuell reduzierter Oxygenierunganstieg der MCI Patienten mit steigender Aufgabenschwierigkeit vor allem im ventralen PFC bei ebenfalls stabiler Verhaltensleistung. Die gefundene Reduktion könnte ein Zeichen für eine aufgebrauchte kognitive Reserve sein, welche Einbußen auf Verhaltensebene voranzugehen scheint. 
Diese charakteristischen Unterschiede in den frontalen Oxygenierungsmustern von Risikogruppen (APOE, MCI) könnten als Biomarker zur Früherkennung von AD noch vor dem Auftreten kognitiver Einbußen dienen. Die fNIRS-Untersuchung während der Durchführung des TMT hat sich in diesem Zusammenhang als potentielles Instrument zur Frühdiagnose der präklinischen Phase der AD als geeignet erwiesen. Die Ergebnisse werden unter Einbezug des wissenschaftlichen Kontexts interpretiert und Implikationen für weitere notwendige Studien sowie die klinische Anwendbarkeit diskutiert.
N2  - Due to the improved medical care, the life expectancy of the society steadily rises.  Consequently, the socioeconomic relevance of neurodegenerative disorders increases. In order to treat the Alzheimer’s Disease (AD), as the most frequent cause, disease-modulating treatment options are desperately awaited. The extensive preclinical phase of the disease has the potential for gaining new insights for the development of effective treatment strategies. The investigation of risk groups for AD is of great importance for the identification of preclinical prediction markers for the manifestation of a subsequent AD. Especially the presence of genetic risk factors like the Apolipoprotein E (APOE) Ɛ4-allele and cognitive risk factors such as the “mild cognitive impairment” (MCI) are being discussed in this context. Differences in brain activation patterns of risk groups based on functional brain imaging methods have been shown to be beneficial as potential biomarkers for early AD detection. As such, the prefrontal cortex (PFC) which is important for executive control mechanisms has been identified as a key structure of interest. However, many of the involved processes are still not sufficiently understood since most imaging methods are time-consuming and rather expensive.
The aim of the present dissertation was to identify differences in PFC oxygenation in two different risk groups for AD by applying a cost-effective and easy-conductible imaging method, the functional Nearinfrared Spectroscopy (fNIRS). In a first step, the Trailmaking Test (TMT), which is a commonly used neuropsychological test for the investigation of executive functioning, was implemented for fNIRS. The neural subtracts were investigated as a basis for the subsequent examination of pre-pathological processes. Besides the usability of the suggested TMT implementation for fNIRS, the comparison of young and elderly subjects (n = 20 per group) showed a specific bilateral PFC oxygenation pattern which was right lateralized for the young group. Elderly adults on the other hand showed a decreased lateralization and more significant channels, pointing towards a need for additional resources in healthy aging. 
Subsequently the main study examined 604 elderly subjects aged between 70 and 76 years divided in two risk groups (APOE, MCI). In the first step, the genetic risk group of the Ɛ4-allele carriers (n = 78) was compared with the neutral Ɛ3-allele carriers (n = 216) and the carriers of the possibly protective Ɛ2-allele (n = 50). Thereby a reduced oxygenation of the risk group at low task difficulty has been shown, while a raised level of oxygenation increase in the medial PFC was found with growing task difficulty. This points towards a higher demand for neuronal control mechanisms in the genetic risk group in order to keep the performance level stable while task difficulty is increased.  The protective group however showed a higher oxygenation in the ventral PFC with increasing task difficulty, which could indicate a higher cognitive reserve.
In the second step, the MCI patients were compared with matched healthy control subjects (n = 57 per group). The result showed a reduced increase of oxygenation with increasing task difficulty limited to specific channels mostly within the central PFC while the performance was stable. This reduction could be a sign for the limit of the cognitive reserve, which becomes apparent before the decline of the cognitive performance.
The characteristic differences of frontal oxygenation patterns in risk groups (APOE, MCI) could possibly serve as biomarkers for the early AD detection even before task performance declines. The investigation of neural oxygenation with fNIRS during the completion of the TMT has been shown to be suitable as a potential early diagnosis method in the preclinical phase of AD. The results are embedded in the scientific context and implications for future research as well as the clinical applicability are being discussed.
KW  - Alzheimerkrankheit
KW  - Apolipoprotein E
KW  - Leichte kognitive Beeinträchtigung
KW  - NIR-Spektroskopie
KW  - Präfrontaler Cortex
KW  - Trailmaking Test
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156757
ER  -