TY - JOUR A1 - Okuda, Takumi A1 - Lenz, Ann-Kathrin A1 - Seitz, Florian A1 - Vogel, Jörg A1 - Höbartner, Claudia T1 - A SAM analogue-utilizing ribozyme for site-specific RNA alkylation in living cells JF - Nature Chemistry N2 - Post-transcriptional RNA modification methods are in high demand for site-specific RNA labelling and analysis of RNA functions. In vitro-selected ribozymes are attractive tools for RNA research and have the potential to overcome some of the limitations of chemoenzymatic approaches with repurposed methyltransferases. Here we report an alkyltransferase ribozyme that uses a synthetic, stabilized S-adenosylmethionine (SAM) analogue and catalyses the transfer of a propargyl group to a specific adenosine in the target RNA. Almost quantitative conversion was achieved within 1 h under a wide range of reaction conditions in vitro, including physiological magnesium ion concentrations. A genetically encoded version of the SAM analogue-utilizing ribozyme (SAMURI) was expressed in HEK293T cells, and intracellular propargylation of the target adenosine was confirmed by specific fluorescent labelling. SAMURI is a general tool for the site-specific installation of the smallest tag for azide-alkyne click chemistry, which can be further functionalized with fluorophores, affinity tags or other functional probes. KW - Alkyltransferase Ribozyme SAMURI KW - Site-specific RNA labelling KW - bioorthogonal SAM analogue ProSeDMA KW - Chemical modification KW - RNA Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-328762 ER - TY - THES A1 - Matera, Gianluca T1 - Global mapping of RNA-RNA interactions in \(Salmonella\) via RIL-seq T1 - Globale Analyse der RNA-RNA-Interaktionen in \(Salmonella\) mittels RIL-seq N2 - RNA represents one of the most abundant macromolecules in both eukaryotic and prokaryotic cells. Since the discovery that RNA could play important gene regulatory functions in the physiology of a cell, small regulatory RNAs (sRNAs) have been at the center of molecular biology studies. Functional sRNAs can be independently transcribed or derived from processing of mRNAs and other non-coding regions and they often associate with RNA-binding proteins (RBPs). Ever since the two major bacterial RBPs, Hfq and ProQ, were identified, the way we approach the identification and characterization of sRNAs has drastically changed. Initially, a single sRNA was annotated and its function studied with the use of low-throughput biochemical techniques. However, the development of RNA-seq techniques over the last decades allowed for a broader identification of sRNAs and their functions. The process of studying a sRNA mainly focuses on the characterization of its interacting RNA partner(s) and the consequences of this binding. By using RNA interaction by ligation and sequencing (RIL-seq), the present thesis aimed at a high-throughput mapping of the Hfq-mediated RNA-RNA network in the major human pathogen Salmonella enterica. RIL-seq was at first performed in early stationary phase growing bacteria, which enabled the identification of ~1,800 unique interactions. In- depth analysis of such complex network was performed with the aid of a newly implemented RIL-seq browser. The interactome revealed known and new interactions involving sRNAs and genes part of the envelope regulon. A deeper investigation led to the identification of a new RNA sponge of the MicF sRNA, namely OppX, involved in establishing a cross-talk between the permeability at the outer membrane and the transport capacity at the periplasm and the inner membrane. Additionally, RIL-seq was applied to Salmonella enterica grown in SPI-2 medium, a condition that mimicks the intracellular lifestyle of this pathogen, and finally extended to in vivo conditions during macrophage infection. Collectively, the results obtained in the present thesis helped unveiling the complexity of such RNA networks. This work set the basis for the discovery of new mechanisms of RNA-based regulation, for the identification of a new physiological role of RNA sponges and finally provided the first resource of RNA interactions during infection conditions in a major human pathogen. N2 - RNA ist eines der am häufigsten vorkommenden Makromoleküle sowohl in eukaryontischen als auch in prokaryontischen Zellen. Seit der Entdeckung, dass RNA wichtige genregulatorische Funktionen in der Physiologie einer Zelle spielen könnte, stehen kleine regulatorische RNAs (sRNAs) im Mittelpunkt molekularbiologischer Studien. Funktionelle sRNAs können alleinstehend von nicht-codierenden oder codierenden Bereichen des Genoms transkribiert werden, aber sie können auch durch die Prozessierung einer mRNA entstehen. Des Weiteren sind sRNAs häufig mit RNA- bindenden Proteinen (RBPs) assoziiert. Seitdem die beiden wichtigsten bakteriellen RBPs, Hfq und ProQ, identifiziert wurden, hat sich die Art und Weise, wie wir an die Identifizierung und Charakterisierung von sRNAs herangehen, drastisch verändert. Ursprünglich wurden sRNAs annotiert und anschließend für einzelne sRNAs die Funktion mit biochemischen Techniken untersucht. Die Entwicklung von RNA-seq-Techniken in den letzten Jahrzehnten ermöglichte nun jedoch eine globale Identifizierung von sRNAs und ihren Funktionen. Der Prozess der Untersuchung einer sRNA konzentriert sich hauptsächlich auf die Charakterisierung ihrer interagierenden RNA-Partner und die Folgen dieser Bindung. Mit Hilfe der RNA-Interaktion durch Ligation und Sequenzierung (RIL-seq) wurde in der vorliegenden Arbeit eine Hochdurchsatzkartierung des Hfq-vermittelten RNA-RNA-Netzwerks in dem wichtigen humanen Krankheitserreger Salmonella enterica durchgeführt. RIL-seq wurde zunächst in Bakterien in der frühen stationären Wachstumsphase durchgeführt, was die Identifizierung von ~1.800 einzigartigen Interaktionen ermöglichte. Mit Hilfe eines neu implementierten RIL-seq-Browsers wurde daraufhin eine eingehende Analyse dieses komplexen Netzwerks durchgeführt. Das Interaktom enthüllte bekannte und neue Interaktionen zwischen sRNAs und mRNAs, die Teil des Zellwand-Regulons sind. Eine tiefergehende Untersuchung führte zur Identifizierung eines neuen RNA-Schwammes, OppX, welcher mit der sRNA MicF bindet und so die Herstellung eines Cross-Talks zwischen der Permeabilität an der äußeren Membran und der Transportkapazität am Periplasma und der inneren Membran ermöglicht. Darüber hinaus wurde RIL-seq für Salmonella enterica angewandt, welche in SPI-2-Medium gewachsen waren, wobei diese Bedingung, die den intrazellulären Lebensstil dieses Erregers nachahmt. Durch die Infektion von Makrophagen mit dem Bakterium, wurde das RIL-seq Protokoll des Weiteren unter in vivo Bedingungen getestet. Insgesamt trugen die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse dazu bei, die Komplexität solcher RNA- Netzwerke zu enthüllen. Diese Arbeit bildete die Grundlage für die Entdeckung neuer Mechanismen der RNA-basierten Regulierung als auch für die Identifizierung einer neuen physiologischen Rolle von RNA- Schwämmen und lieferte letztendlich die erste Untersuchung für RNA- Interaktionen unter Infektionsbedingungen in einem wichtigen menschlichen Krankheitserreger. KW - Small RNA KW - RNA KW - infection biology KW - Salmonella KW - MicF Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-268776 ER - TY - THES A1 - Hör, Jens T1 - Discovery of RNA/protein complexes by Grad-seq T1 - Ermittlung von RNA/Protein-Komplexen mittels Grad-seq N2 - Complex formation between macromolecules constitutes the foundation of most cellular processes. Most known complexes are made up of two or more proteins interacting in order to build a functional entity and therefore enabling activities which the single proteins could otherwise not fulfill. With the increasing knowledge about noncoding RNAs (ncRNAs) it has become evident that, similar to proteins, many of them also need to form a complex to be functional. This functionalization is usually executed by specific or global RNA-binding proteins (RBPs) that are specialized binders of a certain class of ncRNAs. For instance, the enterobacterial global RBPs Hfq and ProQ together bind >80 % of the known small regulatory RNAs (sRNAs), a class of ncRNAs involved in post-transcriptional regulation of gene expression. However, identification of RNA-protein interactions so far was performed individually by employing low-throughput biochemical methods and thereby hindered the discovery of such interactions, especially in less studied organisms such as Gram-positive bacteria. Using gradient profiling by sequencing (Grad-seq), the present thesis aimed to establish high-throughput, global RNA/protein complexome resources for Escherichia coli and Streptococcus pneumoniae in order to provide a new way to investigate RNA-protein as well as protein-protein interactions in these two important model organisms. In E. coli, Grad-seq revealed the sedimentation profiles of 4,095 (∼85 % of total) transcripts and 2,145 (∼49 % of total) proteins and with that reproduced its major ribonucleoprotein particles. Detailed analysis of the in-gradient distribution of the RNA and protein content uncovered two functionally unknown molecules—the ncRNA RyeG and the small protein YggL—to be ribosomeassociated. Characterization of RyeG revealed it to encode for a 48 aa long, toxic protein that drastically increases lag times when overexpressed. YggL was shown to be bound by the 50S subunit of the 70S ribosome, possibly indicating involvement of YggL in ribosome biogenesis or translation of specific mRNAs. S. pneumoniae Grad-seq detected 2,240 (∼88 % of total) transcripts and 1,301 (∼62 % of total) proteins, whose gradient migration patterns were successfully reconstructed, and thereby represents the first RNA/protein complexome resource of a Gram-positive organism. The dataset readily verified many conserved major complexes for the first time in S. pneumoniae and led to the discovery of a specific interaction between the 3’!5’ exonuclease Cbf1 and the competence-regulating ciadependent sRNAs (csRNAs). Unexpectedly, trimming of the csRNAs by Cbf1 stabilized the former, thereby promoting their inhibitory function. cbf1 was further shown to be part of the late competence genes and as such to act as a negative regulator of competence. N2 - Makromoleküle, die Komplexe bilden, sind die Grundlage der meisten zellulären Prozesse. Die meisten bekannten Komplexe bestehen aus zwei oder mehr Proteinen, die interagieren, um eine funktionelle Einheit zu bilden. Diese Interaktionen ermöglichen Funktionen, die die einzelnen Proteine nicht erfüllen könnten. Wachsende wissenschaftliche Erkenntnisse über nichtkodierende RNAs (ncRNAs) haben gezeigt, dass, analog zu Proteinen, auch viele ncRNAs Komplexe bilden müssen, um ihre Funktionen ausüben zu können. Diese Funktionalisierung wird normalerweise von spezifischen oder globalen RNA-bindenden Proteinen (RBPs), die auf eine bestimmte Klasse an ncRNAs spezialisiert sind, durchgeführt. So binden beispielsweise die in Enterobakterien verbreiteten globalen RBPs Hfq und ProQ zusammen >80 % der bekannten kleinen regulatorischen RNAs (sRNAs)—eine Klasse der ncRNAs, die in die posttranskriptionelle Genexpressionsregulation involviert ist. RNA-Protein-Interaktionen wurden bisher anhand einzelner Moleküle und mithilfe von biochemischen Methoden mit niedrigem Durchsatz identifiziert, was die Entdeckung solcher Interaktionen erschwert hat. Dies gilt insbesondere für Organismen, die seltener Gegenstand der Forschung sind, wie beispielsweise grampositive Bakterien. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, mittels gradient profiling by sequencing (Grad-seq) globale Hochdurchsatzkomplexomdatensätze der RNA-ProteinInteraktionen in Escherichia coli und Streptococcus pneumoniae zu generieren. Diese Datensätze ermöglichen es auf eine neue Art und Weise RNA-Protein- und ProteinProtein-Interaktionen in diesen wichtigen Modellorganismen zu untersuchen. Die E. coli Grad-seq-Daten beinhalten die Sedimentationsprofile von 4095 Transkripten (∼85 % des Transkriptoms) und 2145 Proteinen (∼49 % des Proteoms), mit denen die wichtigsten Ribonukleoproteine reproduziert werden konnten. Die detaillierte Analyse der Verteilung von RNAs und Proteinen im Gradienten zeigte, dass zwei Moleküle, deren Funktionen bisher unbekannt waren—die ncRNA RyeG und das kleine Protein YggL—ribosomenassoziiert sind. Durch weitere Charakterisierung konnte gezeigt werden, dass RyeG für ein toxisches Protein mit einer Länge von 48 Aminosäuren kodiert, das bei Überexpression die Latenzphase drastisch verlängert. Für YggL konnte eine Interaktion mit der 50S Untereinheit von 70S Ribosomen nachgewiesen werden, was auf eine potenzielle Funktion in der Biogenese von Ribosomen oder bei der Translation bestimmter mRNAs hindeutet. Die S. pneumoniae Grad-seq Daten beinhalten 2240 Transkripte (∼88 % des Transkriptoms) und 1301 Proteine (∼62 % des Proteoms), deren Migrationsprofile im Gradienten erfolgreich rekonstruiert werden konnten. Dieser RNA/ProteinKomplexomdatensatz eines grampositiven Organismus ermöglichte erstmalig die Verifizierung der wichtigsten konservierten Komplexe von S. pneumoniae. Weiterhin konnte eine spezifische Interaktion der 3’!5’-Exonuklease Cbf1 mit den ciadependent sRNAs (csRNAs), die an der Regulation von Kompetenz beteiligt sind, nachgewiesen werden. Überraschenderweise stabilisiert das von Cbf1 durchgeführte Kürzen der csRNAs die selbigen, was deren inhibitorische Funktion unterstützt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass cbf1 eines der späten Kompetenzgene ist und als solches als negativer Regulator der Kompetenz agiert. KW - Multiproteinkomplex KW - RNS-Bindungsproteine KW - RNS KW - Escherichia coli KW - Streptococcus pneumoniae KW - Complexome KW - RNA-binding protein KW - RNA KW - Escherichia coli KW - Streptococcus pneumoniae KW - Grad-seq KW - Bacteria Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211811 ER - TY - JOUR A1 - Heidrich, Nadja A1 - Bauriedl, Saskia A1 - Barquist, Lars A1 - Li, Lei A1 - Schoen, Christoph A1 - Vogel, Jörg T1 - The primary transcriptome of Neisseria meningitidis and its interaction with the RNA chaperone Hfq JF - Nucleic Acids Research N2 - Neisseria meningitidis is a human commensal that can also cause life-threatening meningitis and septicemia. Despite growing evidence for RNA-based regulation in meningococci, their transcriptome structure and output of regulatory small RNAs (sRNAs) are incompletely understood. Using dRNA-seq, we have mapped at single-nucleotide resolution the primary transcriptome of N. meningitidis strain 8013. Annotation of 1625 transcriptional start sites defines transcription units for most protein-coding genes but also reveals a paucity of classical σ70-type promoters, suggesting the existence of activators that compensate for the lack of −35 consensus sequences in N. meningitidis. The transcriptome maps also reveal 65 candidate sRNAs, a third of which were validated by northern blot analysis. Immunoprecipitation with the RNA chaperone Hfq drafts an unexpectedly large post-transcriptional regulatory network in this organism, comprising 23 sRNAs and hundreds of potential mRNA targets. Based on this data, using a newly developed gfp reporter system we validate an Hfq-dependent mRNA repression of the putative colonization factor PrpB by the two trans-acting sRNAs RcoF1/2. Our genome-wide RNA compendium will allow for a better understanding of meningococcal transcriptome organization and riboregulation with implications for colonization of the human nasopharynx. KW - RNA KW - Neisseria meningitidis KW - dRNA-seq KW - transcriptome KW - RNA chaperone Hfq Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170828 VL - 45 IS - 10 ER - TY - JOUR A1 - Schmidtke, Cornelius A1 - Findeiß, Sven A1 - Sharma, Cynthia M. A1 - Kuhfuss, Juliane A1 - Hoffmann, Steve A1 - Vogel, Jörg A1 - Stadler, Peter F. A1 - Bonas, Ulla T1 - Genome-wide transcriptome analysis of the plant pathogen Xanthomonas identifies sRNAs with putative virulence functions JF - Nucleic Acids Research N2 - The Gram-negative plant-pathogenic bacterium Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) is an important model to elucidate the mechanisms involved in the interaction with the host. To gain insight into the transcriptome of the Xcv strain 85-10, we took a differential RNA sequencing (dRNA-seq) approach. Using a novel method to automatically generate comprehensive transcription start site (TSS) maps we report 1421 putative TSSs in the Xcv genome. Genes in Xcv exhibit a poorly conserved -10 promoter element and no consensus Shine-Dalgarno sequence. Moreover, 14% of all mRNAs are leaderless and 13% of them have unusually long 5'-UTRs. Northern blot analyses confirmed 16 intergenic small RNAs and seven cis-encoded antisense RNAs in Xcv. Expression of eight intergenic transcripts was controlled by HrpG and HrpX, key regulators of the Xcv type III secretion system. More detailed characterization identified sX12 as a small RNA that controls virulence of Xcv by affecting the interaction of the pathogen and its host plants. The transcriptional landscape of Xcv is unexpectedly complex, featuring abundant antisense transcripts, alternative TSSs and clade-specific small RNAs. KW - SUBSP carotovora KW - regulatory RNA KW - gene-cluster KW - campestris PV vesicatoria KW - escherichia coli KW - determines pathgenicity KW - hypersensitive response KW - ralstonia solanacearum KW - extracellular enzymes KW - secretion systems KW - transcription initiation site KW - RNA sequence analyses KW - messanger RNA KW - plants KW - libraries KW - genome KW - genes KW - gene expression profiling KW - genetic transcription KW - northern blotting KW - untranslated regions KW - xanthomonas KW - xanthomonas campestris KW - bacteria KW - virulence KW - pathogenetic organism KW - RNA KW - small RNA KW - pathogenicity KW - type III secretion system pathways KW - maps KW - consesus KW - host (organism) KW - type III protein secretion system complex Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-131781 VL - 40 IS - 5 SP - 2020 EP - 2031 ER -