TY - THES A1 - Hallhuber, Matthias T1 - Inhibition of Nuclear Import of Calcineurin Prevents the Development of Myocardial Hypertrophy T1 - Inhibition des nukleären Imports von Calcineurin verhindert die Entwicklung myokardialer Hypertrophie N2 - The Calcineurin/NFAT signaling cascade is a crucial transducer of cellular function. It has recently been emerged that in addition to the transcription factor NFAT, the phosphatase Calcineurin is also translocated to the nucleus. Our traditional understanding of Calcineurin activation via sustained high Ca2+-levels was also advanced by recent findings from this working group (AG Ritter), which showed that Calcineurin is activated by proteolysis of the C-terminal autoinhibitory domain. This leads to the constitutive activation and nuclear translocation of Calcineurin. Therefore, Calcineurin is not only responsible for dephosphorylating of NFAT in the cytosol thus enabling its nuclear import, its presence in the nucleus is also significant in ensuring the full transcriptional activity of NFAT. Formation of complexes between transcription factors and DNA regulates the transcriptional process. Therefore, the time that transcription factors remain nuclear is a major determinant of transcriptional activity. The movement of proteins over ~40 kDa into and out of the nucleus is governed by the nuclear pore complex (NPC). Transcription factors and enzymes that regulate the activity of these proteins are shuttled across the nuclear envelope by proteins that recognize nuclear localization signals (NLS) and nuclear export signals (NES) within the amino acid sequence of these transcription factors. In this study, the precise mechanisms of Calcineurin nuclear import and export were identified. Additionally to the nuclear localization sequence (NLS) and the nuclear export sequence (NES) within the sequence of Calcineurin, the respective nuclear cargo proteins, responsible for nuclear import, Importinβ1, and for nuclear export, CRM1, were identified. Inhibition of the Calcineurin/importin interaction by a competitive peptide, called Import Blocking Peptide (IBP), which mimicked the Calcineurin NLS, prevented nuclear entry of Calcineurin. A non-inhibitory control peptide showed no effect. Using this approach, it was able to prevent the development of myocardial hypertrophy. In Angiotensin II stimulated cardiomyocytes, both the transcriptional and the translational level was suppressed. Additionally, cell size and expression of Brain natriuretic peptide (as molecular marker for hypertrophy) were significantly reduced compared untreated controls. IBP worked dose-dependent, but did not affect the Calcineurin phosphatase activity. In conclusion, Calcineurin is not only capable of dephosphorylating NFAT, thus enabling its nuclear import, its presence in the nucleus is also important for full NFAT transcriptional activity. Using IBP to prevent the nuclear import of Calcineurin is a completely new approach to prevent the development of myocardial hypertrophy. N2 - Die Calcineurin/NFAT – Signalkaskade spielt eine wichtige Rolle innerhalb der zellulären Funkionalität. Es wurde bereits gezeigt, dass neben NFAT auch die Phosphatase Calcineurin in den Zellkern transportiert wird. Die bisherigen Vorstellungen zur Aktivierung von Calcineurin durch erhöhte intrazelluläre Ca2+-Konzentrationen wurden durch aktuellste Ergebnisse dieser Arbeitsgruppe (AG Ritter) neu diskutiert. Es wurde gezeigt, dass Calcineurin durch gezielte Proteolyse der autoinhibitorischen Domäne konstitutiv aktiviert werden kann und in den Zellkern transportiert wird. Calcineurin ist daher nicht nur verantwortlich für die im Zytosol stattfindende Dephosphorylierung von NFAT, sondern übernimmt auch eine wichtige Funktion im Zellkern. Die nukleäre Lokalisation von Calcineurin ist essentiell für die vollständige transkriptionelle Aktivität von NFAT. Die Komplexbildung zwischen Transkriptionsfaktoren und DNA reguliert die Transkription. Aus diesem Grund spielt die nukleäre Verweildauer diverser Transkriptionsfaktoren eine tragende Rolle. Der Transport von Proteinen (> 40 kDa) in den und aus dem Zellkern erfolgt über nukleäre Porenkomplexe, wobei die zu transportierenden Proteine mittels nukleärer Lokalisationssequenzen (NLS) / nukleärer Exportsequencen (NES) durch die entsprechenden Transportportproteine (Karyopherine) erkannt werden. In dieser Arbeit wurden die genauen Mechanismen des Imports und des Exports von Calcineurin identifiziert. Zusätzlich konnten die NLS/NES von Calcineurin und die entsprechenden Karyopherine, Importinβ1 für den Import bzw. CRM1 für den Export, ermittelt werden. Die Inhibition der Calcineurin/Importin Interaktion durch ein kompetitives Peptid, welches als Import Blocking Peptide (IBP) bezeichnet wurde und der NLS von Calcineurin entspricht, verhinderte den nukleären Import von Calcineurin. Durch diesen Mechanismus war es möglich, die Entwicklung kardialer Hypertrophie zu verhindern. In Angiotensin II stimulierten Kardiomyozyten konnten sowohl die transkriptionelle, als auch die translationelle Aktivität reduziert werden. Des Weiteren wurden das Zellwachstum und die Expression von BNP unterdrückt. Das Blockpeptid wirkte konzentrationsabhängig, beeinflusste aber die Phosphatase-Eigenschaft von Calcineurin nicht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Calcineurin, nicht nur verantwortlich für die Dephosphorylierung von NFAT ist, sondern die nukleäre Lokalisierung ebenfalls eine entscheidende Rolle für die volle transkriptionelle Aktivität von NFAT spielt. Die Verwendung von IBP, um den nukleären Import von Calcineurin zu verhindern, stellt ein völlig neues Konzept dar, die Entwicklung kardialer Hypertrophie zu unterdrücken. KW - Calcineurin KW - Inhibition KW - Blockpeptid KW - myokardiale Hypertrophie KW - Calcineurin KW - Inhibition KW - Blocking Peptide KW - Myocardial Hypertrophy Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23536 ER - TY - THES A1 - Kirsch, Isabel Christina T1 - Untersuchungen über die Effekte von Testosteron bei Reperfusion nach myokardialer Ischämie auf die linksventrikuläre Funktion bei der Ratte T1 - Examinations to the effects of testosterone on leftventricular function in reperfusion after myocardial ischemia in rats. N2 - In dieser Arbeit untersuchten wir den Einfluss von Testosteron auf den myokardialen Ischämie- Reperfusions-Schaden und den entsprechenden intrazellulären Calciumstoffwechsel ([Ca2+]i ). Non-orchiektomierte geschlechtsreife männliche Wistar-Ratten wurden zufällig Gruppen mit verschiedener hormoneller Behandlung zugewiesen; einer Placebo-Gruppe, einer Gruppe mit Testosteronundecanoat-Behandlung und einer Gruppe mit 5- Dihydrotestosteron-Behandlung. Zusätzlich wurden in weiteren Serien orchiektomierte Ratten mit Placebo behandelt. Zwei Wochen nach der jeweiligen hormonellen Behandlung wurden die Herzen entnommen und in eine Langendorff-Apparatur platziert. Die isolierten, mit Puffer perfundierten Herzen wurden 30 Minuten lang einer no-flow-Ischämie-Phase und anschließend einer 30minütigen Reperfusionsphase ausgesetzt. Die Wiederherstellung der myokardialen Funktion wurde gemessen durch Untersuchungen des prä- und postischämischen linksventrikulären (LV) systolischen bzw. diastolischen Drucks, des koronaren Perfusiondrucks und der Veränderungen der [Ca2+]i (mittels Aequorin-Lumineszenz-Methode). Calciumregulierende Proteine wurden mittels Westernblotting analysiert. Der Quotient aus linksventrikulärem Gewicht zum Körpergewicht (LVG/KG) stieg unter Testosteronbehandlung im Vergleich zu den orchiektomierten Ratten an. Die Wiederherstellung der kontraktilen Funktion war verbessert bei den mit Testosteron behandelten Tieren: Am Ende der Reperfusion war bei den testosteron-behandelten Ratten der linksventrikuläre systolische Druck höher und der enddiastolische Druck niedriger. Die endischämische [Ca2+]i und die intrazelluläre Calciumüberladung erwiesen sich ebenfalls nach Reperfusion als signifikant niedriger bei den testosteronbehandelten Tieren im Vergleich zu den orchiektomierten Ratten. Jedoch blieben die Niveaus der calciumregulierenden Proteine unberührt. Zusammenfassend kann man nun sagen, dass die Gabe von Testosteron zur Erhaltung der akuten mechanischen myokardialen Funktion nach globaler Ischämie führt. Dieser begünstigende Effekt war mit einer Verminderung der reperfusionsinduzierten intrazellulären Calciumüberladung assoziiert. N2 - In this study we investigated the impact of testosterone on myocardial ischemiareperfusion injury and corresponding intracellular calcium metabolism (Ca2+]i ). Non-orchiectomized mature male Wistar rats were randomly assigned to either placebo, a single dose of testosterone undecanoate, or 5-dihydrotestosterone. In a further series, orchiectomized rats were treated with placebo. After two weeks of treatment the heart were removed and placed in a Langendorff-setup. The isolated, buffer-perfused hearts were subjected to 30 minutes of no-flow ischemia and 30 minutes of reperfusion. Recovery of myocardial function was measured by analyzing pre- and postischemic left ventricular systolic/diastolic pressure and coronary perfusion pressure, simultaneously together with intracellular calcium handling (aequorin luminescence). Calcium regulatory proteins were analyzed by western blotting. Left ventricular weight/bodyweight ratio was increased after administration of testosterone vs. orchiectomized rats. The recovery of contractile function was improved in testosterone treated rats: at the end of reperfusion left ventricular systolic pressure was higher and enddiastolic pressure was lower in testosterone treated rats. End-ischemic [Ca2+]i and [Ca2+]i overload upon reperfusion was significantly lower in testosterone vs. orchiectomized rats too. However, levels of calcium regulatory proteins remained unaffected. In conclusion, administration of tesosterone significantly improves recovery from global ischemia. These beneficial effects are associated with an attenuation of reperfusion induced [Ca2+]i overload. KW - Myokardischämie KW - Reperfusion KW - Testosteron KW - Calcium KW - myocardial ischemia KW - reperfusion KW - testosterone KW - calcium Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21218 ER - TY - THES A1 - Gimmler, Carsten T1 - Einfluss einer kombinierten Hemmung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems auf das kardiale Remodeling nach experimentellem Myokardinfarkt T1 - Effects of a combined inhibition of the renin-angiotensin-aldosterone-system on cardiac remodeling in experimental myocardial infarction N2 - Bei Ratten mit chronischen Myokardinfarkt wurde der Einfluss des Mineralokortikoidrezeptor (MR)-Anta¬gonisten Spironolacton alleine und in Kombination mit einem Angiotensin-Converting-Enzyme (ACE)-Hemmer oder einem Angiotensin II Typ 1 (AT1)-Antagonisten, bzw. der Kombination aller drei Medikamente auf das kardiale Remodeling untersucht. Ab dem zehnten Tag nach Koronarligatur wurden die Tiere für neun Wochen mit Placebo (P), Spironolacton (S, 10mg/kg/d), den Kombi¬na¬tionen aus Spironolacton und Trandolapril (S+T; T:0,3mg/kg/d), Spirono¬lacton und Irbesartan (S+I, I: 50mg/kg/d) bzw. der Dreifach¬kombination aus Spironolacton, Irbesartan und Trandolapril (S+I+T) behandelt. Die Infarktgröße war in allen Behandlungsgruppen vergleichbar. Eine intensivierte Blockade des Renin–Angiotensin–Aldo¬steron–Systems (RAAS) mittels Dreifachkombination (S+I+T) verbesserte die linksventrikuläre Dilatation und Fibrose am effektivsten. Die Kollagen Typ I RNA–Expression und die Expression des atrialen natriuretischen Faktors war bei S+I+T signifi¬kant niedriger als bei P (p<0,001) oder als bei S (p<0,05). Auch die sarcoplasmatische retikuläre Calcium-ATPase- und die ACE-Expression ver¬besserten sich unter S+I+T mehr als unter Mono- oder Zweifachtherapie. Diese positiven Effekte zeigten sich auch in einem verbesserten linksventrikulären systolischen und enddia¬stolischen Druck (P 23,6±2,7 vs. S+I+T 12,7±2,3mmHg), einer höheren maximalen Druckanstiegsgeschwindigkeit bzw. maximalen Druckabfallsge¬schwindigkeit des linken Ventrikels bei S+I+T. Das rechtsventrikuläre Gewicht konnte durch S+I+T gegenüber der P-Gruppe (p<0,001) sowie der S-Gruppe (p<0,05) hochsignifikant ge¬senkt werden. Die vorliegende Studie analysiert erstmals systematisch eine Dreifachinhibition des RAAS im Rattenmodell der Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt. Das kardiale Remodeling konnte am effektivsten durch die Kombination aus ACE-Hemmer, AT1-Antagonist und MR-Blocker verhindert werden. Systematische klinische Untersuchungen hierzu stehen allerdings noch aus. N2 - The effects of the mineralocorticoid receptor (MR) antagonist spironolactone alone and in combination with angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibition and / or angiotensin II type 1 receptor blocker (ARB), respectively the combination of all three drugs on cardiac remodeling in rats with left ventricular (LV) dysfunction after extensive myocardial infarction were investigated in this study. Starting 10 days after coronary ligature, rats were treated with placebo (P), spironolactone (S, 10 mg/kg/day), the combinations of spironolactone and trandolapril (S+T; T: 0.3 mg/kg/d), spironolactone and irbesartan (S+I, I: 50 mg/kg/d) or a combination of all three drugs (S+I+T) for nine weeks. Infarct size was comparable in all groups. Intensified inhibition of the renin-angiotensin-aldosterone-system (RAAS) by triple-combination (S+I+T) most effectively ameliorated LV dilatation and fibrosis. Collagen type I and atrial natriuretic factor mRNA-expression was significantly (p<0.001 vs. P and p<0.05 vs. S) reduced in S+I+T. In addition expression of the sarcoplasmic reticulum calcium-ATPase and ACE were improved more in triple than in dual therapy. Those positive effects were paralleled by an improved LV systolic and enddiastolic pressure (P 23.6±2.7 vs. S+I+T 12.7±2.3mmHg) and in a faster maximum rate of LV pressure rise respectively maximum rate of LV pressure decline in S+I+T treated animals. S+I+T treatment highly significantly decreased right ventricular weight compared with Placebo (p<0.001) or S (p<0.05). This study provides the first systematic analysis of neurohumoral triple inhibition of the RAAS on LV remodeling and LV failure after myocardial infarction in rats. Cardiac remodeling was most effectively improved by the combination of ACE-inhibitor, ARB and MR-antagonist. KW - Myokardinfarkt KW - Ventrikuläres Remodeling KW - Renin-Angiotensin-Aldosteron System KW - Aldosteron Antagonisten KW - Ratte KW - Myocardial Infarction KW - Ventricular Remodeling KW - Renin-angiotensin System KW - Aldosterone Antagonists KW - Rat Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18220 ER - TY - THES A1 - Eckstein, Susanne T1 - Stimulation humaner V-Gamma-9-V-Delta-2-T-Lymphozyten : Untersuchungen zur Wirkung Stickstoff-haltiger Bisphosphonate und zu bakteriellen Phosphoantigenen T1 - Stimulation of human Vgamma9 Vdelta2 T Lymphocytes: Effects of Nitrogen Containing Bisphosphonates and Phosphoantigens N2 - In der vorliegenden Arbeit werden Studien zu verschiedenen Aspekten der Stimulation von humanen Vg9Vd2-T-Lymphozyten vorgestellt. Ein Schwerpunkt war die Charakterisierung der Erkennung von Bisphosphonaten durch Vg9Vd2-T-Zellen. Weder die Alkylmonophosphonate Ethyl- und Propylphosphonat noch 3-Aminopropylphosphonat bewirkten eine Stimulation von Vg9Vd2 T-Lymphozyten. Anscheinend ist also für die gd-T-Zell-stimulierende Aktivität von Aminobisphosphonaten das Vorhandensein sowohl der Methylenbisphosphonat-Gruppe als auch des Amino-Stickstoffs entscheidend. Es wurden verschiedene Pamidronat-Derivate untersucht, die sich durch Substituenten am Stickstoffatom unterscheiden. Die meisten dieser Verbindungen konnten Vg9Vd2-T-Zellen aktivieren, die Art der Substituenten hatte aber großen Einfluss darauf, welche Konzentration des jeweiligen Bisphosphonats für eine gd-T-Zell-Antwort nötig war. Besonders negativ auf die gd-T-Zell-stimulierende Aktivität wirkte sich aus, wenn das Stickstoffatom Teil einer Säureamidbindung war. Das lässt darauf schließen, dass die Gegenwart einer positiven Ladung (durch Protonierung des Stickstoffatoms) von Bedeutung für die Bioaktivität dieser Verbindungen ist. Beim Vergleich verschiedener Bisphosphonate mit stickstoffenthaltenden Heteroaromaten (Fünfringe mit ein bis drei Stickstoffatomen) zeigte sich, dass sowohl die Position des basischen Stickstoffatoms im Ring als auch Art und Position von Ringsubstituenten Einfluss auf deren gd-T-Zell-stimulierende Aktivität haben. Es ergaben sich Hinweise, dass sich eine gesteigerte Neigung eine positive Ladung in der Seitenkette zu tragen bei diesen Verbindungen genau wie bei Aminobisphosphonaten günstig auf das gd-T-Zell-aktivierende Potential auswirkt. Durch Behandlung mit Zoledronat wurde die monozytäre Zelllinie THP-1 stimulierend für Vg9Vd2-T-Zellen. Auch weitere Zelllinien und Lymphozyten des peripheren Bluts (PBL) konnten nach Vorinkubation mit Zoledronat Vg9Vd2-T-Zellen aktivieren. Dabei genügten bei den PBL deutlich geringere Zoledronat-Konzentrationen um einen Effekt zu erzielen als bei den untersuchten Zelllinien. Für die indirekte Stimulation von Vg9Vd2-T-Zellen durch Zoledronat mittels THP-1 Zellen oder PBL war Zell-Zell-Kontakt zwischen den präsentierenden Zellen und den gd-T-Zellen Voraussetzung. Die Anwesenheit von alkalischer Phosphatase hatte keine Auswirkungen auf die gd-T-Zell-Aktivierung durch Zoledronat. Dies spricht dafür, dass Vg9Vd2-T-Zellen Oberflächenstrukturen auf anderen Zellen erkennen und dass freie Phosphoantigene bei der gd-T-Zell-Stimulierung durch Stickstoff enthaltende Bisphosphonate keine Rolle spielen. Wurde die Vorinkubation von THP-1 Zellen mit Zoledronat in Gegenwart von Saponin, einem Detergenz das die Durchlässigkeit der Zellmembran reversibel erhöht, durchgeführt, reichten deutlich niedrigere Konzentrationen des Bisphosphonats aus, um die THP-1 Zellen stimulierend für gd-T-Lymphozyten zu machen. Das ist ein Hinweis darauf, dass für die Aktivierung von Vg9Vd2-T-Zellen durch Zoledronat intrazelluläre Vorgänge in den „antigenpräsentierenden“ Zellen verantwortlich sein könnten. Beim Vergleich verschiedener N-BPs hinsichtlich ihrer Aktivität gegenüber gd-T-Zellen und ihrer antiresorptiven Potenz ergab sich eine erstaunlich gute Korrelation. Dies könnte darauf hinweisen, dass beide Effekte durch den gleichen Mechanismus – die Hemmung der Farnesylpyrophosphat-Synthase – zustande kommen. Die Gegenwart von Farnesol oder Geranylgeraniol während der Vorinkubation von THP-1 Zellen mit Zoledronat verringerte deren gd-T-Zell-stimulierendes Potential nicht, so dass vielleicht nicht die Verarmung an längerkettigen Isoprenoiden sondern die Anreicherung von Vorläufern zu Veränderungen in den Zellen führt, die diese schließlich erkennbar für Vg9Vd2-T-Zellen machen. Zusätzlich wurden im Rahmen dieser Arbeit einige Versuche zu bakteriellen Phosphoantigenen durchgeführt. Mittels einer selektiven HPLC-MS/MS-Methode gelang uns in einer E. coli-Probe der Nachweis eines Vg9Vd2-T-Zell-stimulierenden Pyrophosphats mit der molekularen Masse von 3-Formyl-1-butyl-pyrophosphat, einem Phosphoantigen das in Mykobakterien gefunden worden war (Belmant und Mitarbeiter, 1999). Eine weitere Strukturaufklärung war aufgrund der äußerst geringen Konzentration des Phosphoantigens nicht möglich. 2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphat (MEcPP) ist ein Zwischenprodukt des 2-C-Methylerythritol-4-phosphat- (MEP) Wegs der Isoprenoidbiosynthese. Es wird in manchen Bakterien – z. B. Corynebacterium ammoniagenes – bei oxidativem Stress verursacht durch Benzylviologen (BV) akkumuliert. Es konnte gezeigt werden, dass Extrakte aus C. ammoniagenes, die in Gegenwart von BV kultiviert wurden, in einem höherem Maße Vg9Vd2-T-Zellen stimulieren als Proben von Bakterien, die ohne BV-Zusatz wuchsen; MEcPP wirkte selbst nicht als Phosphoantigen. Dies war ein weiterer Hinweis darauf, dass bakterielle Phosphoantigene mit dem MEP-Weg assoziiert sind. N2 - The present work focuses on different aspects of human Vg9Vd2 T lymphocyte stimulation. A main focus of this work was the characterisation of bisphosphonate recognition by Vg9Vd2 T cells. Neither the alkyl monophosphonates ethyl and propyl phosphonate nor 3-aminopropylphosphonate were able to stimulate Vg9Vd2 T lymphocytes. Apparently both the methylene bisphosphonate group and the amino group are crucial for the Vg9Vd2 T cell stimulating ability of aminobisphosphonates. We examined pamidronate derivates bearing different substituents at the nitrogen atom. Most of these compounds activated Vg9Vd2 T cells. But the nature of the substituent greatly influenced the bisphosphonate concentration necessary for gd T cell stimulation. When the nitrogen was part of an amide bond, there was a pronounced negative effect on the Vg9Vd2 T cell stimulating capacity. It can be concluded that the bioactivity of bisphosphonates depends on the presence of a positive charge (through protonation of the nitrogen atom). Comparing different bisphosphonates with nitrogen containing heteroaromatic side chains (five membered rings containing one to three nitrogen atoms) we found that the position of the basic nitrogen in the ring as well as the nature and position of ring substituents influenced their gd T cell stimulating activity. There was evidence that a higher tendency towards a positive charge in the side chain had a positive effect on the Vg9Vd2 T cell activating potential of these compounds, as we also found for aminobisphosphonates. Zoledronat pulsed cells of the monocytic cell line THP-1 stimulated Vg9Vd2 T cells. Other cell lines and peripheral blood lymphocytes (PBL) also activated Vg9Vd2 T cells after incubation with zoledronate. There was a distinctly lower concentration of zoledronate needed for PBL to become stimulatory as for the analyzed cell lines. Cell-cell-contact between the presenting cells and the Vg9Vd2 T cells was necessary for the indirect stimulation by zoledronate pulsed THP-1 cells or PBL. Alkaline phosphatase did not abolish the gd T cell activation by zoledronate. That points to the possibility that Vg9Vd2 T cells recognize surface structures on other cells and that free phosphoantigens are not involved in gd T cell stimulation by nitrogen containing bisphosphonates. When THP-1 cells were incubated with zoledronic acid in the presence of saponin, a detergent that reversibly enhances the permeability of the cell membrane, the bisphosphonate concentration needed for rendering THP-1 cells gd T cell stimulating was clearly reduced. That indicated that intracellular events caused by zoledronate (and other nitrogen containing bisphosphonates) in the “antigen presenting cells” could result in their stimulating activity. Comparing the gd T cell stimulating activity of various N-BPs with their antiresorptive potency produced an amazingly good correlation. This could indicate that both effects are based on the same mechanism – the inhibition of farnesyl pyrophosphate synthase. The presence of farnesol or geranylgeraniol during the incubation of THP-1 cells with zoledronate did not diminish their gd T cell stimulating potential. So maybe not the depletion of longer chain isoprenoids but the accumulation of precursors results in changes that finally render the cells recognisable by Vg9Vd2 T lymphocytes. Within the scope of this work we also conducted experiments concerning bacterial phosphoantigens. Using a selective HPLC-MS/MS method we detected in Escherichia coli a Vg9Vd2 T cell stimulating pyrophosphate with the molecular mass of 3-Formyl-1-butyl pyrophosphate, a phopsphoantigen found in mycobacteria (Belmant et al., 1999). Due to the exceedingly low concentration of the phosphoantigen no further structure determination was possible. 2-C-Methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate (MEcPP) is an intermediate of the 2-C-Methylerythritol 4-phosphate (MEP) pathway of isoprenoid biosyntheses. In some bacteria like Corynebacterium ammoniagenes this compound is accumulated under conditions of oxidative stress caused by benzyl viologen (BV). We showed that C. ammoniagenes extracts from bacteria cultivated in the presence of BV had a higher Vg9Vd2 T cell stimulating capacity than from bacteria growing without addition of BV. MEcPP itself was not a phosphoantigen. That was further evidence for the association of bacterial phosphoantigens with the MEP-pathway. KW - T-Lymphozyt KW - Diphosphonate KW - Antigen KW - gamma delta KW - T-Zellen KW - T-Lymphozyten KW - Bisphosphonate KW - Phosphoantigene KW - gamma delta KW - T cells KW - T lymphocytes KW - bisphosphonates KW - phosphoantigens Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12140 ER - TY - THES A1 - Visan, Ioana Andreea T1 - The CD23 receptor-regulation of expression and signal transduction N2 - Bisher sind zwei Isoformen des humanen CD23 (CD23a und CD23b) beschrieben. Beide unterscheiden sich lediglich in 6-7 Resten im N-terminalen, zytoplasmatischen Anteil. CD23a wird ausschließlich auf B-Zellen exprimiert, während CD23b sowohl auf B-Zellen als auch auf Monozyten, eosinophilen Granulozyten, Makrophagen und zahlreichen anderen Zelltypen durch Stimulation mit IL-4 induziert werden kann. Die beiden Isoformen vermitteln wahrscheinlich unterschiedliche Funktionen. CD23a gilt als Isoform, welche vornehmlich mit der Endozytose von IgE-Immunkomplexen und der Vermittlung von Antigen-Präsentation auf B-Zellen assoziiert ist. CD23b besitzt ein Phagozytose-Motiv und scheint bei der Phagozytose IgE besetzter Partikel, der Freisetzung von Zytokinen und der Bildung von Peroxiden eine Rolle zu spielen. Frühere Untersuchungen legen die Vermutung nahe, dass die beiden Isoformen zwei getrennte Signalübertragungswege miteinander verbinden. Die Gegenüberstellung von Ereignissen, welche in Zellen, die nur eine einer oder beide Isoformen von CD23 besitzen, stattfinden, legt die Vermutung nahe, dass CD23b cAMP und iNOS hochreguliert, wohingegen CD23a einen Anstieg des intrazellulären Kalziums vermittelt. Im ersten Teil unserer Untersuchungen haben wir die Regulation der B-Zell-spezifischen Expression von CD23a analysiert. Pax-5 ist ein auf B-Zellen beschränkter Transkriptionsfaktor, welcher für die frühe und späte B-Zellentwicklung von entscheidender Bedeutung ist. Mögliche Pax-5 Bindungsstellen wurden in den proximalen Abschnitten des CD23a Promotors vermutet. Die Analyse des CD23a Promotors ergab drei mutmaßliche Pax-5 Bindungsstellen mit mehr als 50% Homologie zur Konsensus-Sequenz. Eine dieser Bindungsstellen, namens CD23-1, kann mit einer hochaffinen Pax-5 Bindungsstelle konkurrieren oder direkt das Pax-5 Protein in Elektromobilitäts Experimenten (EMSA) binden. Das Einfügen von Mutationen an dieser Stelle verhindert die Bindung. Ein weiterer Versuch, bei dem die gesamte Länge des CD23a Promotors durch überlappende Peptide in einem kompetitiven Verfahren gegenüber hoch affinen Bindungsstellen getestet wurde, zeigt ebenso CD23-1 als die einzige Stelle, welche direkt Pax-5 binden kann. In weiteren Experimenten führte die Expression von Pax-5 in 293 Zellen zu einer 7fachen Aktivierung eines CD23a Kernpromotor Konstrukts. Die Kotransfektion zusammen mit STAT6 zeigte, dass Pax-5 mit diesem Transkriptionsfaktor kooperiert, indem es die Transkriptionsrate eines vergrößerten CD23a Promotorkonstrukts erhöht. Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, dass die ektope Expression von Pax-5 in der monozytären Zelllinie U-937, die normalerweise nur die CD23b Isoform exprimiert, dann zu einer Expression von CD23a nach Stimulation mit IL-4 und PMA führte. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Pax-5 in der auf B-Zellen beschränkten Expression der CD23 Isoform eine Schlüsselrolle zukommt. Im zweiten Teil des Projekts haben wir ein “Zwei-Hefen-Hybrid-System“ (Cyto-Trap von Stratagene) verwendet, um nach zytoplasmatischen Interaktionspartnern für den CD23 Rezeptor zu suchen. Das System wurde modifiziert um eine hohe Effizienz an Transformation zu erzielen. Unterschiedliche „Köder“-Vektorkonstrukte wurden hergestellt. Das Screening wurde mittels einer humanen Milzbibliothek mit dem Zielvektor des Systems durchgeführt. Die anfangs benutzten Konstrukte –pSosCD23a und pSosCD23b – exprimierten sehr kurze (22 Aminosäuren) zytoplasmatischen Reste der Isoformen am C-terminalen Ende des Fusionsproteins (humanes SOS). Verbesserte Konstrukte (pSos CD23a+Linker und pSosCD23b+Linker) exprimierten den zytoplasmatischen Anteil von CD23a/b am N-terminalen Ende des humanen SOS und hatten folglich den N-terminalen Anteil als Andockstelle frei, entsprechend den Bedingungen in vivo. Eine flexible Verbindungsregion trennte die Fusionsproteine, um auf diese Weise die kurze Aminosäurekette deutlich „sichtbar“ werden zu lassen. Annähernd drei Millionen Klone wurden mittels der verschiedenen Konstrukte untersucht. Dabei konnte keine tatsächlich positive Interaktion gefunden werden. Stattdessen fand sich eine vergleichsweise hohe Zahl falsch-positiver Klone. Diese wiederum wurden in einem zweiten “Zwei-Hefen-Hybrid-System“ getestet. In Zukunft wird ein neues Konstrukt als Köder verwendet werden. Hierbei wurde ein Tyrosin-Rest im zytoplasmatischen Anteil von CD23a durch Glutamat ersetzt. Das System wurde bereits dazu verwendet, die Interaktion zwischen CD23 und p59fyn - einem Mitglied der Src-Familie von Proteinkinasen, welches mit CD23a assoziiert sein soll – zu testen. Jedoch konnte im CytoTrap “Zwei-Hefen-Hybrid-System“ keine Wechselwirkung nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigt das zentrale Ergebnis der Arbeit, dass Pax-5 der Schlüsselregulator ist, der die B-Zell-spezifische Expression von CD23a ermöglicht. Zusätzlich wurde ein “Zwei-Hefen-Hybrid-System“ etabliert, mit dem zytoplasmatische Interaktionspartner für die CD23 Isoformen gefunden werden können. N2 - Two isoforms of human CD23 (CD23a and CD23b) have been described. They differ by only 6-7 residues in the N-terminal cytoplasmic tail. CD23a is restrictively expressed on B-cells while CD23b is inducible on B-cells, as well as monocytes, eosinophils, macrophages and a variety of other cell types, after IL-4 stimulation. The two isoforms seems to have different functions. CD23a appears to be the isoform associated with endocytosis of IgE immune complexes and mediating antigen presentation on B-cells. CD23b has a phagocytosis motif and seems to be involved in the phagocytosis of IgE-coated particles, cytokine release and the generation of superoxides. Previous studies indicate that the two isoforms connect to different signal transduction pathways. Comparing the cells that express only one or both CD23 isoforms suggests that CD23b is involved in upregulating cAMP and iNOS, whereas CD23a mediates an increase in intracellular calcium. In the main part of the study we investigated how the CD23a B-cell specific expression is regulated. Pax-5 is a B-cell restricted transcription factor with an essential role in early and late B-cell development. Putative Pax-5 binding sites have been predicted in the CD23a proximal promoter. Analyses of the CD23a promoter revealed three putative Pax-5 binding sites with more than 50% homology to the consensus sequence. One of these sites, named CD23-1 can compete a high affinity Pax-5 binding site or can directly bind Pax-5 protein in electrophoretic mobility shift assays. Introducing mutations into this site abrogates the binding. A different approach, in which overlapping peptides covering the length of the CD23a promoter were tested in competition assays against a high affinity binding site, also revealed CD23-1 as the only site that directly binds Pax-5 protein. Expression of Pax-5 in 293 cells resulted in a 7-fold activation of a CD23a core promoter construct. Co-transfection together with STAT6 showed that Pax-5 cooperates with this transcription factor in enhancing the level of transcription of a CD23a extended promoter construct. Most importantly, ectopic expression of Pax-5 in the monocytic cell line U-937 that regularly expresses only the CD23b isoform enabled a significant CD23a expression after stimulation with IL-4 and PMA. Our results suggest that Pax-5 is a key regulator of the B-cell restricted expression of the CD23a isoform. In the second part of the project, we used a yeast two-hybrid system (CytoTrapTM from Stratagene) in order to look for cytoplasmic interaction partners for the CD23 receptor. The system was established in order to reach a high efficiency of transformation and different bait vector constructs were made. The screening was performed using a human spleen library cloned in the target vector of the system. The first bait constructs used (pSosCD23a and pSosCD23b) expressed the very short (22 amino acids) cytoplasmic tails of the isoforms at the C-terminal end of the fusion protein (human SOS). Improved bait constructs, (pSosCD23a+Linker and pSos CD23b+Linker) expressed the cytoplasmic tail of CD23a/b at the N-terminal side of the human SOS and had in consequence the N-terminal part free as a bait, as it occurs in vivo. A flexible linker region separated the fusion proteins in order to make the small amino acid bait chain more obvious. Approximately three million library clones were screened with these various constructs. No “true positive” interaction was detected. A relatively high number of “false positive” clones were obtained and checked in another two-hybrid system. A new bait construct, in which the tyrosine residue in the cytoplasmic tail of CD23a was replaced by a glutamic acid residue will be used for future screening. The system was also used in order to test the interaction between CD23 and p59fyn, a member of the Src family of protein kinases that was mentioned to associate with CD23a. No interaction was detected by using the CytoTrap two-hybrid system. In conclusion, the key result of the study demonstrates that Pax-5 is a main regulator of the B-cell specific expression of the CD23a isoform. In addition, a two-hybrid system was established and employed in order to look for cytoplasmic interaction partners for CD23. KW - Antigen CD23 KW - Promotor KW - Genregulation KW - CD23 KW - Pax-5 KW - Zwei-Hefen-Hybrid-System KW - Promotor Regulation KW - CD23 KW - Pax-5 KW - promoter regulation KW - two-hybrid system Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5556 ER - TY - THES A1 - Christensen, Morten Overby T1 - Dynamics of human DNA Topoisomerases I and II T1 - Dynamic von Human DNA Topoisomerases I and II N2 - The first goal of this study was to develop cell lines with a stable expression of bio-fluorescent topo II and topo I. This was successfully achieved using a bicistronic vector system. Control experiments showed that proteins of expected size were expressed, and that GFP-tagged topos I, IIa, and IIb were active in the cells and fully integrated in the endogenous pools of the enzymes. These cell-lines provided a novel tool for investigating the cell biology of human DNA topoisomerases. Our most important finding was, that both types of mammalian topoisomerases are entirely mobile proteins that are in continuous and rapid flux between all compartments of the nucleus and between the cytososl and the chromosomes of mitotic cells. This was particularly surprising with regard to topo II, which is considered to be a structural component of the nuclear matrix and the chromosome scaffold. We must conclude that if this was the case, then these architectural structures appear to be much more dynamic than believed until now. In this context it should also be mentioned, that the alignment of topo II with the central axes of the chromosome arms, which has until now been considered a hall-mark of the enzyme’s association with the chromosomal scaffold, is not seen in vivo and can be demonstrated to be to some extent an artefact of immunohistochemistry. Furthermore, we show that the two isoforms of topo II (a and b) have a different localisation during mitotic cell division, supporting the general concept that topo II functions at mitosis are exclusively assigned to the a-form, whereas at interphase the two isoenzymes work in concert. Despite unrestricted mobility within the entire nuclear space, topoisomerases I and II impose as mostly nucleolar proteins. We show that this is due to the fact that in the nucleoli they are moving slower than in the nucleoplasm. The decreased nucleolar mobility cannot be due to DNA-interactions, because compounds that fix topoisomerases to the DNA deplete them from the nucleoli. Interestingly, the subnucleolar distribution of topoisomerases I and II was complementary. The type II enzyme filled the entire nucleolar space, but excluded the fibrial centers, whereas topo I accumulated at the fibrial centers, an allocation directed by the enzyme’s N-terminus. During mitosis, it also mediates association with the nucleolar organising regions of the acrocentric chromosomes. Thus, topo I stays associated with the rDNA during the entire cell-cycle and consistently colocalizes there with RNA-polymerase I. Finally, we show that certain cancer drugs believed to act by stabilising covalent catalytic DNA-intermediates of topoisomerases, do indeed immobilize the enzymes in living cells. Interestingly, these drugs do not target topoisomerases in the nucleoli but only in the nucleoplasm. N2 - Diese Arbeit hatte zunächst zum Ziel, humane Zelllinien zu etablieren, in denen GFP-Chimären der humanen DNS-Topoiosmerasen I, IIa und IIb stabil und constitutiv exprimiert werden. Dies wurde mit Hilfe eines bicistronischen Expressionsvektors erreicht, der eine quasi physiologische Expression der GFP-Chimären in humanen Zellen ermöglichte. Wir zeigen, dass die chimärischen Proteine die erwartete Größe haben, aktiv sind, und vollständig in die jeweiligen endogenen Enzympopulationen integriert werden. Damit halten wir ein ideales Werkzeug zur Untersuchung der Zellbiologie der Topoisomerasen in Händen. Sowohl Topoisomerase I, als auch die beiden Typ II-Enzyme innerhalb des Zellkerns vollständig mobil sind und zwischen Nukleoplasma und Nukleolen, sowie zwischen Zytosol und Chromosmen mitotischer Zellen ständig austauschen. Dieser Befund ist insbesondere hinsichtlich der Topoisomerase II erstaunlich, da man bisher davon ausgeht, dass dieses Enzym eine zentrale Rolle bei der Konstituierung der Kernmatrix bzw. des Chromosomengerüstes spielt, was mit einem vollständig und rasch beweglichen Protein unvereinbar scheint. Falls Topoisomerase II tatsächlich eine solche Rolle spielen sollte, müssen die Kernmatrix und das Chromosomengerüst sehr viel dynamischere Strukturen sein, als bisher angenommen. Es sei in diesem Zusammenhang auch darauf hingewiesen, dass wir in der lebenden Zelle keine Konzentrierung der Topoisomerase entlang der zentralen Längsachsen der Chromosmenarme gesehen haben, was bisher als Markenzeichen von deren Gerüstfunktion galt. Vielmehr konnten wir zeigen, dass eine solche axiale Anordnung überwiegend ein Artefakt immunhistologischer Methoden darstellt. Wir zeigen weiterhin, dass die beiden Isoformen der Topoisomerase II (a und b) während der Zellteilung unterschiedlich lokalisiert sind, was mit dem generellen Konzept zusammenpasst, dass nur die a-Form mitotische Funktionen wahrnimmt, während die beiden Isoenzyme in der Interphase konzertiert arbeiten. Ungeachtet ihrer unbegrenzten Mobilität innerhalb des gesamten Zellkerns, imponieren Topoiosmerase I und II in der lebende Zelle als überwiegend nukleoläre Proteine, was damit zusammenhängt, dass sie sich hier etwas langsamer bewegen, als im Nukleoplasma. Diese relative Abbremsung kann nicht auf DNS-Interaktionen beruhen, weil chemische Susbtanzen, die Topoisomerasen an der DNS fixieren, eine Entleerung der Nukleolen bewirken. Interessanterweise ist die subnukleoläre Verteilung von Topoisomerase I und II komplementär. Die Typ II- Enzyme füllen den gesamten nukleolären Raum aus, sparen aber die fibrillären Zentren aus, während das Typ I- Enzym fast ausschließlich an den fibrillären Zentren zu finden ist. Diese Assoziation wird durch den N-Terminus des Enzyms vermittelt, der darüber hinaus während der Mitose auch die Bindung an die nukelolären Organisationszentren der akrozentrischen Chromosomen bewirkt. So bleibt Topoisomerase I über den gesamten Zellzyklus hinweg mit der rDNS physisch verbunden und kolokalisiert hier mit der RNS-Polymerase I. Schließlich konnten wir zeigen, das bestimmte Tumnortherapeutika, von denen man annimt, dass sie über eine Stabilisierung der kovalenten katalytischen DNS-Intermediate der Topoiosmerasen wirken, diese Enzyme in der lebenden Zelle tatsächlich immobil machen. Interssanterweise treffen diese Substanzen überwiegend im Nukleolplasma und nicht in den Nukleolen. KW - Mensch KW - DNS-Topoisomerasen KW - Molekulargenetik KW - Topoisomerase I KW - Topoisomerase II KW - Mobilitet KW - Drogen KW - Krebs KW - Topoisomerases I KW - Topoisomerase II KW - Mobility KW - Drugs KW - Cancer Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4927 ER - TY - THES A1 - Grue, Pernille T1 - The physiological role of the two isoforms of DNA topoisomerase II in human cells T1 - Die Physiologische Rolle der beiden Isoformen der DNS Topoisomerase II in humanen Zellen N2 - Unique functions of DNA topoisomerase IIalpha and IIbeta have been suggested. A human cell line which carries a homozygeous mutation of the nuclear localization sequence of the topoisomerase IIalpha gene expresses the isoform outside the nucleus at the onset of mitosis. At mitosis topoisomerase IIbeta diffused away from the chromatin despite the nuclear lack of the IIalpha-form. Chromosome condensation and disjunction was performed with the aid of cytosolic topoisomerase IIalpha which bound to the mitotic chromatin with low affinity. Consequently an increased rate of nondisjunction is observed in these cells. It is concluded that high affinity chromatin binding of topoisomerase IIalpha is essential for chromosome condensation/disjunction and that topoisomerase IIbeta does not adopt these functions. A centrosomal protein was recognized by topoisomerase IIalpha. This topoisomerase IIalpha-like protein resembles a modified form of topoisomerase IIalpha with an apparent size of 205 kDa compared to 170 kDa. The expression of the protein is constant in all stages of the cell cycle and it appears in proliferating as well as in resting cells. If there is not sufficient topoisomerase IIalpha present at mitosis the centrosomal proteins might adopt the function and a mitotic catastrophe in the cells could therefore be prevented. N2 - Die exakt Funktion der zwei Isoformen der DNS Topoisomerase II, genannt Topoisomerase IIalpha und Topoisomerase IIbeta ist bisher unbekannt. Eine humanen Zelllinie hatte eine homozygote Deletion in der Nukleären Lokalisations Sequenz im Topoisomerase IIalpha Gen. In dieser Zelllinie wurde Topoisomerase IIalpha während der Interphase außerhalb des Kerns exprimiert. Während der Mitose diffundierte die gesamte Topoisomerase IIbeta trotz intranukleärem Mangel an IIalpha-Isoform vom Chromatin ab. Die Kondensation der Chromosomen und die Disjunktion mit der Hilfe von zytosolischen Topoisomerase IIalpha fand statt, die sich mit niedriger Affinität an mitotisches Chromatin bindet. Folglich kann eine zunehmende Rate von non-Disjunktion in diesen Zellen festgestellt werden. Daraus kann geschlossen werden, daß die hohe Affinität der Chromatin-Bindung von Topoisomerase IIalpha essentiell für die chromosomomale Kondensation und Disjunktion ist. Außerdem konnte Topoisomerase IIbeta nicht die Funktionen der IIalpha-Isoform übernehmen. Ein zentrosomales Protein wird von der humanen Topoisomerase IIalpha erkannt. Das Topoisomerase IIalpha-ähnliche Protein gleicht einer modifizierten Form von Topoisomerase IIalpha mit einer vermeintlichen Größe von 205 kDa im Vergleich zu 170 kDa. Die Expression der Topoisomerase IIalpha ist konstant in allen Phasen des Zellzyklus und es taucht in proliferierenden und in ruhende Zellen auf. Folglich könnte aktive Topoisomerase II von diesen Pool an aktiven Enzymen bei Anfang der Mitose freigesetzt werden, um die fehlende Enzymaktivität zu ersetzen. KW - DNS-Gyrase KW - DNS-Topoisomerasen KW - Physiologie KW - Topoisomerase II alpha KW - Mitose KW - Kondensation KW - non-Disjunktion KW - zentrosomales Protein KW - topoisomerase II alpha KW - mitosis KW - condensation KW - non-disjunction KW - centrosomal protein Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1369 ER -