TY - THES A1 - Schönmann [geb. Simon], Anna-Lena T1 - Langzeitverlauf der Borreliose bei Kindern und Jugendlichen T1 - Longterm follow up of lyme disease on children and adolescent N2 - In der vorliegenden Arbeit sollten die unterschiedlichen Manifestationsformen der Borreliose anhand verschiedener Parameter verglichen und der Verlauf einer Borrelioseerkrankung analysiert werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass es sich um eine ganzjährige Erkrankung handelt, die jedoch - je nach Manifestationsform - verschiedene jahreszeitliche Gipfel aufweist. So kommen die Neuroborreliose und die Frühborreliose gehäuft im Frühling und im Sommer vor, während die Lyme Arthritis durchweg ganzjährig auftritt. Da die Borrelien erst nach ca. 12 Stunden Latenz auf den Wirt übertragen werden, sind es vor allem die unbemerkten Zeckenstiche, die eine Infektion verursachen. Deshalb ist es nicht verwunderlich, dass sich nur rund 55 % der Patienten an einen zurück liegenden Zeckenstich erinnern konnten. Bei der Untersuchung der verschiedenen Laborparameter ergaben sich keine wesentlichen Unterschiede zwischen den Manifestationsformen bezüglich Hämoglobingehalt, Blutsenkungsgeschwindigkeit, Thrombozyten und Leukozyten im Serum. Desweiteren ergaben sich keine Hinweise auf eine Beteiligung des Rheumafaktors oder antinukleärer Antikörper an den immunologischen Prozessen während einer Lyme Arthritis Erkrankung. IL-17 konnte mittels ELISA weder in Serum/Plasma noch in Synovialflüssigkeit signifikant erhöht nachgewiesen werden. Es bleibt jedoch unklar, ob dies aufgrund einer langen Lagerung der Proben der Fall war oder ob IL-17 tatsächlich nicht signifikant erhöht vorlag. Aus der Literatur kann man entnehmen, dass IL-17 bei den Abläufen einer Infektion mit B. burgdorferi eine wichtige Rolle zu spielen scheint. Dies könnte einen Ansatz für neue Behandlungsmethoden der Lyme Arthritis darstellen, weshalb die Durchführung weitere Untersuchungen wichtig ist. Durch die Analyse der initialen Serologie konnte die Antikörperreaktion während einer Infektion mit B. burgdorferi veranschaulicht werden, die mit der Bildung von IgM- Antikörpern beginnt und dann einen Shift zu IgG-Antikörpern vollzieht. Die Antigene p19, p31/34, p39 und p65 scheinen hierbei vor allem bei der Lyme Arthritis im Vordergrund zu stehen. Weiterhin konnte bei dieser Analyse beobachtet werden, dass teilweise zahlreiche serologische Untersuchungen bei ein und demselbem Patienten statt fanden, was darauf schließen lässt, dass diese Untersuchung zur Verlaufskontrolle benutzt wurde. Grundsätzlich ist die Serologie hierzu jedoch nicht geeignet. Vielmehr sollte sie lediglich zur Diagnosestellung dienen. In dieser Funktion ist sie bei korrekter Interpretation ein hervorragendenes diagnostisches Mittel. Leider werden serologische Untersuchungen jedoch häufig falsch interpretiert und angewendet, was dazu führt, dass Patienten häufiger oder auch länger als nötig antibiotisch behandelt werden. So erhielten auch rund 8 % der Lyme Arthritis Patienten mehr als 2 Zyklen antibiotischer Therapie. Die Nebenwirkungen dieser langwierigen antibiotischen Behandlung sind nicht zu vernachlässigen. Die aktuellen Leitlinien sehen im Gegensatz dazu nämlich nach dem zweiten antibiotischen Zyklus den Beginn einer Therapie mit DMARD ́s vor, selten kommen auch intraartikuläre Steroide zum Einsatz. Diese beobachtete „Überdiagnostik und Übertherapie“ der Borrelioseerkrankung spiegelt vermutlich die Angst vor chronischen Verlaufsformen in der Bevölkerung und teilweise auch unter Ärzten wider. Bereits in anderen Studien konnte die Existenz einer therapieresistenten Verlaufsform der Borreliose - insbesondere der Lyme Arthritis – nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit litten 24 % der Lyme Arthritis Patienten nach einer adäquaten antibiotischen Behandlung laut eigenen Angaben zum Zeitpunkt der Umfrage noch unter Gelenkbeschwerden. Ob es sich hierbei nun um eine schwerwiegendere Verlaufsform in Europa handelt, bleibt zunächst offen. Zur Objektivierung der Beschwerden, zum Ausschluss einer Zweitinfektion oder aber auch einer Fibromyalgie als mögliche Differentialdiagnose sind prospektive Studien mit klinischer Untersuchung der Patienten im Verlauf nötig. Eindeutig ist jedoch, dass durch eine frühzeitige antibiotische Behandlung nach Infektion das Fortschreiten der Erkrankung effektiv verhindert werden kann. Chronische Beschwerden gaben hingegen auch die Patienten mit zurückliegender Neuroborreliose an. Rund 20% der Patienten litten nach eigener Angabe unter Allgemeinsymptomen, die ihre Lebensqualität subjektiv wesentlich einschränkten. Der spezifische Zusammenhang zwischen diesen Beschwerden und einer Neuroborreliose bzw. einer Borrelioseerkrankung im Allgemeinen ließ sich jedoch nicht endgültig klären. Es wäre hierfür der Vergleich mit einer gesunden Kohorte und die Anwendung spezieller neuropsychologischer Untersuchungen nötig. N2 - This paper should compare different manifestations of borreliosis based on various parameters as well as analyze the development of a borreliosis infection. It could be shown that it is a year-round disease reaching different seasonal peaks depending on its manifestation. As an example, neuro borreliosis and early borreliosis occur frequently in spring and summer, whereas lyme arthritis infections occur during the whole year. As borrelia are transmitted to the host only after 12 hours of latency, especially tick bites that go unnoticed cause infections. That is why it does not come as a surprise that only 55% of the patients were able to remember a tick bite in the past. Examining the different laboratory parameters, no substantial differences between the different types of manifestation regarding haemoglobin content, erythrocyte sedimentation rate, thrombocytes and leucocytes in the serum were discovered. In addition, there were no hints as to a contribution of the rheumatic factor or antinuclear antibodies to immunologic processes during a lyme arthritis infection. Using ELISA, IL-17 could neither be detected in serum/plasma nor in synovial liquid in significantly increased concentrations. However, it remains unclear whether this was due to the long storage of the samples or whether IL-17 was actually not significantly increased. According to literature on this topic, IL-17 seems to play a major role during the course of an infection with B. burgdorferi. This could be a starting point for new ways of treating lyme arthritis and makes further research necessary. By analyzing initial serology, the antibody reaction during an infection with B. burgdorferi could be shown. It starts with the creation of IgM antibodies and then shifts to IgG antibodies. The antigenes p19, p31/34, p39 and p65 seem to be especially important when it comes to lyme arthritis. The analysis also made it clear that in some cases a single patient was exposed to numerous serological examinations what makes it probable that this examination was used to control the course of the infection. Basically, serology is not a suitable instrument to do so. It should rather be used to diagnose. Interpreting it correctly, it is in that function an excellent means of diagnosing. Unfortunately, serological examinations are often interpreted and applied in the wrong way, what leads to a more frequent or unnecessarily long antibiotics treatment of patients. Around 8% of lyme arthritis patients received more than two cycles of antibiotics treatment. The side effects of this longsome antibiotics treatment are not to be neglected. In contrast, current guidelines recommend a DMARDs therapy after the second cycle of antibiotics treatment, in rare cases intraarticular steroids are used. This observed “overdiagnostics and overtherapy” of borreliosis infections presumably reflects the fear of chronic infections among the population and partly among doctors. There have already been other studies proving the existence of a form of borreliosis infection resistant to therapy – especially regarding lyme arthritis. According to this paper, 24% of lyme arthritis patients said, when they were interrogated, that they were still suffering from arthralgia after an adequate antibiotics treatment. It remains open whether this is just a more serious progression in Europe. To come to an objective judgement of the pains, to exclude a second infection or a fibromyalgia as a potential differential diagnosis, prospective studies invoving clinical examinations of the patients are necessary. However, it is beyond any doubt that an early antibiotics treatment after the infection can effectively prevent the progress of the infection. Nevertheless, also patients with an overcome neuroborreliosis reported chronic pains. About 20% of the patients reported that they were suffering from general syndromes limiting their quality of life subjectively essentially. The specific connection between these pains and a neuroborreliosis respectively a borreliosis infection in general could, however, not be proven in the end. For this, it would be necessary to make a comparison with a healthy cohort and to apply special neuropsychological studies. KW - Lyme-Krankheit KW - Borreliose KW - Erythema chronicum migrans KW - Borrelia burgdorferi KW - Zeckenbiss KW - Neuroborreliose KW - neuroborreliosis KW - Lyme Arthritis KW - lyme arthritis KW - Borrelienserologie KW - serology of borreliosis Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-95910 ER - TY - THES A1 - Neukirchen, Sebastian T1 - Borrelienneuropathie - eine histologische und immunhistochemische Charakterisierung T1 - Borrelianeuropathy - a histologic and immunhistochemical characterization N2 - Die Pathomechanismen der Neuropathie bei Neuroborreliose sind noch immer unklar. In der vorliegenden Studie untersuchten wir 22 Patienten mit einer Neuropathie bei Neuroborreliose (BN) (3 Patienten in Stadium 2, 19 Patienten in Stadium 3) und verglichen diese mit 9 Patienten einer vaskulitischen Neuropathie (VN) und 14 Patienten einer idiopathisch axonalen Neuropathie (AN). Histologische und immunhistochemische Färbungen wurden mit Antikörpern gegen Leu4, CD68, 27E10 (frühzeitig aktivierte Makrophagen) und 25F9 (späte Makrophagen), Membrane-Attack-Komplex C5b-9, Adhäsionsmolekül ICAM sowie inflammatorische Zytokine Tumor Nekrose-Faktor-alpha (TNF-alpha), Interleukin-1ß (IL-1ß) und Interleukin-6 (IL-6), als auch Metalloproteinase MMP-9 durchgeführt, ferner mit Antikörpern gegen das membranassoziierte Glykoprotein HLA-DR3. Zusätzlich wurden Semi-Dünn-Schnitte angefertigt. Klinisch wiesen die meisten BN Patienten eine distal symmetrische sensomotorische Neuropathie auf, nur 6/22 Patienten waren schmerzfrei. Die Mehrzahl (18/22) der BN Neuropathien waren primär axonal mit perivaskulären (6/22), in 8 Fällen vaskulitischen Infiltraten. Das Perineurium war schwerpunktmäßig im Rahmen einer Borrelien-assoziierten Neuropathie betroffen. Das lies sich aus dem gegenüber den Kontrollgruppen signifikant verdickten Perineurium, der vermehrten Vaskularisation des Perineuriums und der starken IR für das Zytokin TNF-α schliessen, in geringerem Ausmaß für IL-1β, und für die terminale Komplementkomponente C5b9. Perivaskuläre und vaskuläre Infiltrate sowie die betont perineurale Expression bestimmter inflammatorischer Zytokine und Adhäsionsmoleküle erschienen charakteristisch für eine Neuropathie bei Neuroborreliose. Autoimmune Reaktionen mit Angriff am Perineurium können für die Pathogenese der Neuropathie bei Neuroborreliose bedeutsam sein. N2 - The pathologic mechanisms in Lyme Borreliosis are still unknown. In this study we examinated 22 patients with neuropathy in Neuroborreliosis (3 patients in stadium 2, 19 patients in stadium 3) and compared them to 9 patients with vasculitic neuropathy (VN) and to 14 patients with idiopathic axonal neuropathy (AN). Histologic and immunohistochemical stainings on sural nerve biopsies with antibodies against Leu4, CD68, 27E10 (early macrophages) and 25F9 (late macrophages), membrane-attack-complex C5b9, adhesionmolecule ICAM and inflammatoric cytokines tumor-necrosis-factor-alpha (TNF-alpha), interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6), metalloproteinases-9 (MMP-9) and membrane-associated glykoprotein HLA-DR3 were obtained. Additional semi thin sections were performed. Clinically, most of the patients had distal, symmetric, sensomotoric neuropathy, only 6 (of 22) did not feel any pain. Most of the BN-patients showed a primary axonal neuropathy, in 6 cases (of 22) with pervasculitic and in 8 cases with vasculitic infiltrates. Perineurial tissues play an extraodinary important role for the pathogenesis of neuroborreliosis. This can be claimed because of the significant thickened perineurium, the increased perineurial vascularisation and the intense IR for cytokine TNF alpha. Perivascular and vascular infiltrates as well as the definite perineurial expression of certain inflammatory cytokines and adhesion molecules seemed to be distinguishing for neuropathy in context of Neuroborreliosis. Autoimmune reactions followed by affection of the perineurium may play a role in the pathogenesis of a neuroborreliosis. KW - Borrelien KW - Neuropathie KW - Suralisbiopsien KW - Lyme-Krankheit KW - ECM KW - Borreliosis KW - neuropathy KW - sural nerve KW - Lyme-disease KW - ECM Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16147 ER - TY - THES A1 - Glenz, Karin T1 - Entwicklung eines Lipoprotein-Impfstoffes aus Pflanzen : Produktion des rekombinanten 'outer surface protein A' (OspA) von Borrelia burgdorferi in Tabakchloroplasten T1 - Production of vaccines in transgenic plants: Expression of the recombinant outer surface protein A (OspA) of Borrelia burgdorferi in tobacco chloroplasts N2 - Transgene Pflanzen nehmen einen wachsenden Stellenwert bei der Produktion therapeutischer Proteine, besonders von Impfstoffen, ein. Einige dieser Proteine benötigen für ihre Funktionalität verschiedenste post-translationale Modifikation und es ist nicht bekannt, ob Pflanzen zu diesen Stoffwechselleistungen befähigt sind. In der vorliegenden Arbeit sollte anhand eines bakteriellen Antigens geprüft werden, ob in Chloroplasten von Nicotiana tabacum an einem rekombinanten Protein eine besondere Form der post-translationalen Modifikation, die Lipidierung, durchgeführt wird und ob somit ein alternatives Produktionssystem für einen Lipoprotein-Impfstoff entwickelt werden kann. Basis für diese Untersuchungen war das bakterielle Lipoprotein OspA (outer surface protein A) aus Borrelia burgdorferi. Dieses Protein wird zur Prävention von Lyme-Borreliose eingesetzt und frühere Untersuchungen zeigten, dass OspA sowohl in B. burgdorferi als auch nach heterologer Expression in E. coli einer post-translationalen Lipidierung am N-Terminus unterliegt. Dabei wird das Protein unter Mitwirkung dreier Enzyme (Lgt, Lsp und Lnt) am N-Terminus mit einer Pam3Cys-Struktur versehen und die N-terminale Signalsequenz abgespalten. In dieser Arbeit konnten nach der Etablierung eines Expressionssystems mehrere unabhängige transplastome OspA-Tabakpflanzen generiert werden. Der Anteil an rekombinantem, plastidärem OspA (rpOspA) am löslichen Gesamtprotein wurde mit ca. 1% bestimmt. Dabei lag rpOspA sowohl in einer lipidierten, membrangebundenen als auch in einer nicht-modifizierten, löslichen Form vor. Strukturelle Untersuchungen an rpOspA ergaben, dass in Chloroplasten eine Bakterien-ähnliche Lipidierung an dem Protein durchgeführt wurde. Dabei wurde am N-Terminus ein Diacylglycerin über eine Thioetherbindung an das einzige in der Sequenz vorkommende Cystein gebunden. Anders als in Bakterien wurde die Signalsequenz in Chloroplasten jedoch nicht abgespalten und infolgedessen keine dritte Fettsäure an das Cystein gebunden. Die plastidäre Modifikation an rekombinantem OspA resultierte daher in einer Pam2Cys-Struktur mit Signalsequenz. Untersuchungen zur Immunogenität des rpOspA in Mäusen zeigten eindeutig, dass das rekombinante Protein aus Tabak die Bildung spezifischer Antikörper induziert und damit in seiner Wirkung vergleichbar dem bakteriellen Protein ist. Um die Lipidierungsrate des akkumulierten OspA in Chloroplasten zu erhöhen, wurden weitere transplastome Tabakpflanzen generiert. Diese wiesen neben dem ospA-Gen auch die Gene (lgt, lsp und lnt) der drei modifizierenden Enzyme aus E. coli auf. Durch die simultane Bildung von OspA und den drei modifizierenden Enzyme konnte eine quantitative Lipidierung von rpOspA mit einer Pam2Cys-Struktur erlangt werden. Als Grundlage für vergleichende Untersuchungen zwischen plastidärer und cytoplasmatischer Lipidmodifikation in Tabak wurden ebenfalls Transformationen des Zellkerns mit ospA durchgeführt, wobei jedoch keine heterologe ospA-Expression erreicht werden konnte. Erst durch die Anwendung eines transienten, viralen Expressionssystems war es möglich, ospA im Zellkern zu exprimieren. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass in Chloroplasten Höherer Pflanzen eine Bakterien-ähnliche Modifikation an rekombinantem OspA durchgeführt wird und das resultierende Protein eine spezifische Immunantwort in Mäusen induzieren kann. Das Potential von transgenen Pflanzen als alternatives Produktionssystem für Lipoprotein-Impfstoffe wird diskutiert. N2 - Transgenic plants play an increasing role in the production of therapeutical proteins, especially vaccines. Some of those proteins need a posttranslational modification for their activity of immunogenicity and it is still ambiguous if plants are capable of performing these modifications. In the present study it was investigated by the use of a bacterial antigen if a particular form of posttranslational modification, the lipidation of proteins, is performed in chloroplasts of Nicotiana tabacum and if the resulting plants could be further developed into an alternative production system for lipoprotein-vaccines. For this investigation, the bacterial lipoprotein OspA (outer surface protein A) of Borrelia burgdorferi was chosen, a protein used as a vaccine against Lyme disease. Previous studies have been shown that OspA is lipidated on its N-terminus both in B. burgdorferi and when expressed in Escherichia coli. This modification is performed by three different enzymes (Lgt, Lsp and Lnt) which build up a Pam3Cys-structure at the N-terminus of the protein while the N-terminal signal sequence is cleaved. In the present study several independent transgenic plant lines could be generated by the use of a suitable expression system. Analysis showed that the fraction of recombinant plastidal OspA (rpOspA) in transplastomic plants reached approx. 1% of the total soluble protein. Moreover, a lipid modification could be detected in a fraction of the rpOspA which resulted in the membrane association of a portion of the recombinant protein. The structural analysis of rpOspA revealed that in chloroplasts, rpOspA is lipidated in a bacteria-like manner, including the attachment of a diacylglycerol moiety to the sole cysteine via a thioether linkage. Other than in bacteria, the signal peptide is not cleaved in chloroplasts; thus, no additional fatty acid is attached to the cysteine. The plastidal modification on recombinant OspA therefore resulted in a Pam2Cys-structure including the signal sequence. Furthermore, the rpOspA from tobacco showed similar immunogenic properties as the recombinant protein from bacteria when tested in mice, showing the potential of plants as a production system for lipoprotein-vaccines. To further increase and modify the lipidation rate and pattern of tobacco-derived OspA, a new set of transplastomic tobacco plants were generated. These plants not only carried the ospA gene, but also the genes encoding for the three modifying enzymes (lgt, lsp and lnt). This simultaneous expression shifted the ratio between lipidated and non-lipidated rpOspA almost quantitatively to the lipidated form. For further comparisons of the OspA-lipidation either in plastids or in the cytosol transgenic tobacco plants were established. However, after stable integration of ospA into the nuclear genome, no detectable heterologeous expression could be achieved. Only by using a transient viral expression system the nuclear ospA expression was feasible. In this study it has been shown, that in chloroplasts of higher plants a bacteria-like modification on recombinant OspA was performed and that the resulting protein induced a specific immune response in mice. The potential of transgenetic plants as an alternative production system for lipoprotein-vaccines is discussed. KW - Lyme-Krankheit KW - Impfstoff KW - Tabak KW - Chloroplast KW - Lipoprotein KW - pflanzliche Vaccine KW - Lyme-Borreliose KW - lipoproteins KW - plant-derived vaccines Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15884 ER -