TY  - THES
A1  - Schmalzl, Jonas Georg
T1  - Genetische Modifikation humaner mesenchymaler Stammzellen zur Stimulation der Knochenheilung
T1  - Synergistic effect of Indian hedgehog and BMP-2 gene transfer to increase the osteogenic potential of human mesenchymal stem cells
N2  - Fragestellung:
Die Therapie von Knochendefekten kritischer Größe mit kompromittiertem Regenerationspotential, stellt ein schwerwiegendes Problem dar. Die Forschung auf dem Gebiet der Knochenheilung hat sich in jüngster Vergangenheit daher auf die Anwendung mesenchymaler Vorläuferzellen (MSZ) zur Stimulierung des Knochenwachstums konzentriert. In der vorliegenden Studie wurde in humanen MSZ eine Überexpression spezifischer Wachstumsfaktoren induziert mit dem Ziel, deren osteogenes Potential zu steigern.
Methodik:
MSZ wurden nach etablierten Protokollen expandiert. Durch adenovirale Transfektion wurde eine überexpression von grün fluoreszierendem Protein (GFP, Kontrolle), indian hedgehog (IHH), bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) und IHH in Kombination mit BMP-2 induziert. Die MSZ wurden für 28 Tage mit osteogenem Differenzierungs- und Kontrollmedium kultiviert. Als weitere Kontrolle dienten native MSZ. Es wurden die Auswirkungen der jeweiligen genetischen Veränderungen auf die metabolische Aktivität (Alamar Blau), die Proliferation (Qubit dsDNA BR), die Aktivität des Enzyms alkalische Phosphatase (ALP)(p-Nitrophenylphosphat), die Mineralisierung (Alizarinrot S, Calcium O-Cresolphthalein) sowie auf die Expression charakteristischer Markergene untersucht (qRT-PCR).
Ergebnis:
In den ersten 72h nach Transfektion konnte eine leichte, im Vergleich zu nativen Zellen nicht signifikante Abnahme der metabolischen Aktivität in allen Gruppen beobachtet werden. Das Proliferationsverhalten transfizierter und nativer MSZ unterschied sich während des Untersuchungszeitraums nicht signifikant. Bei der Analyse der ALP-Aktivität zeigte sich ein typisches Rise-and-Fall Muster. Alle ost Gruppen wiesen sowohl im Assay als auch in der PCR eine signifikant höhere ALP-Aktivität auf. Die Überexpression von BMP-2 und IHH+BMP-2 bewirkte eine signifikant stärkere Mineralisierung an Tag 28. In der PCR zeigte sich für BMP-2 ost und IHH+BMP2 ost ein signifikanter Anstieg der Osteopontin und BMP-2 Expression über die Zeit. Zudem stieg bei allen ost Gruppen die Runx2 Expression bis Tag 21 an.
Schlussfolgerung:
Die virale Transfektion hatte keinen negativen Einfluss auf die metabolische Aktivität der Zellen oder deren Proliferationsverhalten. Die Überexpression von BMP-2 ohne oder in Kombination mit IHH führte zu einer vermehrten Produktion extrazellulärer Matrix und zu einer gesteigerten Genexpression osteogener Marker. Die virale Transfektion stellt daher eine vielversprechende Möglichkeit dar, das osteogene Potential von MSZ zu steigern.
N2  - Introduction: 
To stimulate healing of large bone defects research has concentrated on the application of mesenchymal stem cells (MSCs).
Methods: 
In the present study, we induced the overexpression of the growth factors bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) and/or indian hedgehog (IHH) in human MSCs by adenoviral transduction to increase their osteogenic potential. GFP and non-transduced MSCc served as controls. The influence of the respective genetic modification on cell metabolic activity, proliferation, alkaline phosphatase activity (ALP), mineralization in cell culture, and osteogenic marker gene expression was investigated.
Results: 
Transduction had no negative influence on cell metabolic activity or proliferation. ALP activity showed a typical rise-and-fall pattern with a maximal activity at day 14 and 21 after osteogenic induction. Enzyme activity was significantly higher in groups cultured with osteogenic media. The
overexpression of BMP-2 and especially IHH+BMP-2 resulted in a significantly higher mineralization after 28 days. This was in line with obtained qRT-PCR analyses, which showed a significant increase in osteopontin and osteocalcin expression for osteogenicly induced BMP-2 and IHH+BMP-2 transduced cells when compared to the other groups. Moreover, an increase in runx2 expression was observed in all osteogenic groups toward day 21. It was again more pronounced for BMP-2 and IHH+BMP-2 transduced cells cultured in osteogenic media.
Conclusion: 
In summary, viral transduction did not negatively influence cell metabolic activity and proliferation. The overexpression of BMP-2 in combination with or without IHH resulted in an increased deposition of mineralized extracellular matrix, and expression of osteogenic marker genes. Viral transduction therefore represents a promising means to increase the osteogenic potential of MSCs and the combination of different transgenes may result in synergistic effects.
KW  - Stammzellen
KW  - Osteogenese
KW  - Adenoviren
KW  - Wachstumsfaktoren
KW  - Knochenheilung
KW  - mesenchymale Stammzellen
KW  - bone morphogenic protein 2
KW  - indian hedgehoc
KW  - gene transfer
KW  - osteogenic potential
KW  - mesenchymal stem cells
KW  - osteogenes Potential
KW  - growth factors
KW  - adenovirale Transduktion
KW  - Gen Transfer
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142391
ER  - 
TY  - THES
A1  - Krätzig, Theresa
T1  - Pilotstudie zum Vergleich der Knorpelrekonstruktion durch Autologe Chondrozytentransplantation und Autologe Stammzelltransplantation in Kollagen I Hydrogelen am Göttinger Mini-Pig
T1  - Repair of full-thickness cartilage defects with autologous chondrocytes and autologous mesenchymal stem cells in a collagen-I-hydrogel - a pilot study in mini-pigs
N2  - Traumatische und/oder degenerative, umschriebene Knorpeldefekte sind aufgrund der schlechten intrinsischen Regenerationseigenschaften des Knorpelgewebes immer noch eine chirurgische Herausforderung. Therapiemöglichkeiten mittels Knorpelrekonstruktion durch autologes Knorpelgewebe hat den Nachteil der „donor-site-morbidity“ und auch die mit guten klinischen und bildmorphologischen Ergebnissen bereits in der Klinik angewandte matrixgekoppelte autologe Chondrozytentransplantation kommt nicht ohne eine zusätzliche Operation und Entnahme von Knorpelgewebe aus.
Autologe mesenchymale Stammzellen sind einfach mittels Beckenkammpunktion zu gewinnen und stellen aufgrund ihres Proliferations- und chondrogenen Differenzierungsvermögens eine vielversprechende Alternative dar. Die Tissue Engineering Division des orthopädischen König-Ludwig-Hauses in Würzburg befasst sich nun seit mehreren Jahren in verschiedenen Versuchsreihen unter anderem mit dieser Alternative der Knorpelrekonstruktion. Vor allem die Optimierung der Nutzung von Stammzellen, die Vordifferenzierungsmöglichkeiten in vitro und das Verhalten in verschiedenen Trägermatrizes wird erforscht.
Die vorliegende Arbeit stellt eine Pilotstudie zur Anwendung von Stammzellen analog zu der in klinischer Anwendung befindlichen MACT in vivo in Göttinger Minipigs vor. Wir haben zeigen können, wenn auch nur mit einer geringen Fallzahl und fehlenden signifikanten Aussagen, dass Stammzellen eine vielversprechende Alternative zu Chondrozyten in der Versorgung von Gelenkknorpeldefekten darstellen. Eine Verarbeitung in Kollagen I Hydrogelen ist in gleicher Weise wie mit den Chondrozyten möglich und auch die mechanische Stabilität differiert nicht. Die histologischen und immunhistochemischen Auswertungen haben in den Stammzelltransplantaten gleich gute, in einigen Aspekten sogar gering bessere Ergebnisse erzielt als die bewährten Chondrozytentransplantate.
In der Nachbehandlung schien die sofortige volle Belastung der frisch operierten Kniegelenke bei den Minipigs möglicherweise problematisch in Bezug auf die Fixierung und den Verbleib der Gel-Transplantate im Defekt. In der Klinik ist eine zeitweise Teilbelastung und anfangs lediglich passive Bewegung des Gelenks natürlich problemlos möglich. In der Zukunft werden durch Vordifferenzierung und Markierung der Stammzellen sowie durch Vorauswahl von Zellen mit einem hohen chondrogenen Differenzierungspotential die Ergebnisse von ähnlichen Versuchsreihen sicher noch optimiert werden können.
N2  - Repair of full-thickness cartilage defects with autologous chondrocytes and autologous mesenchymal stem cells in a collagen-I-hydrogel - a pilot study in mini-pigs
KW  - Mesenchymale Stammzelle
KW  - Knorpelzelle
KW  - Tissue Engineering
KW  - Knorpelrekonstruktion
KW  - Chondrozytentransplantation
KW  - Stammzelltransplantation
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-138822
ER  -