TY  - THES
A1  - Beck, Katherina
T1  - Einfluss von RSK auf die Aktivität von ERK, den axonalen Transport und die synaptische Funktion in Motoneuronen von \(Drosophila\) \(melanogaster\)
T1  - RSK2 alters ERK activity, axonal transport and synaptic function in motoneurons of \(Drosophila\) \(melanogaster\)
N2  - In dieser Arbeit sollte die Funktion von RSK in Motoneuronen von Drosophila untersucht
werden. Mutationen im RSK2-Gen verursachen das Coffin-Lowry-Syndrom (CLS), das durch
mentale Retardierung charakterisiert ist. RSK2 ist hauptsächlich in Regionen des Gehirns
exprimiert, in denen Lernen und Gedächtnisbildung stattfinden. In Mäusen und Drosophila, die
als Modellorganismen für CLS dienen, konnten auf makroskopischer Ebene keine
Veränderungen in den Hirnstrukturen gefunden werden, dennoch wurden in verschiedenen
Verhaltensstudien Defekte im Lernen und der Gedächtnisbildung beobachtet.
Die synaptische Plastizität und die einhergehenden Veränderungen in den Eigenschaften der
Synapse sind fundamental für adaptives Verhalten. Zur Analyse der synaptischen Plastizität
eignet sich das neuromuskuläre System von Drosophila als Modell wegen des stereotypen
Innervierungsmusters und der Verwendung ionotroper Glutamatrezeptoren, deren
Untereinheiten homolog sind zu den Untereinheiten der Glutamatrezeptoren des AMPA-Typs
aus Säugern, die wesentlich für die Bildung von LTP im Hippocampus sind.
Zunächst konnte gezeigt werden, dass RSK in den Motoneuronen von Drosophila an der
präsynaptischen Seite lokalisiert ist, wodurch RSK eine Synapsen-spezifische Funktion
ausüben könnte. Morphologische Untersuchungen der Struktur der neuromuskulären Synapsen
konnten aufzeigen, dass durch den Verlust von RSK die Größe der neuromuskulären Synapse,
der Boutons sowie der Aktiven Zonen und Glutamatrezeptorfelder reduziert ist. Obwohl mehr
Boutons gebildet werden, sind weniger Aktive Zonen und Glutamatrezeptorfelder in der
neuromuskulären Synapse enthalten. RSK reguliert die synaptische Transmission, indem es die
postsynaptische Sensitivität, nicht aber die Freisetzung der Neurotransmitter an der
präsynaptischen Seite beeinflusst, obwohl in immunhistochemischen Analysen eine
postsynaptische Lokalisierung von RSK nicht nachgewiesen werden konnte. RSK ist demnach
an der Regulation der synaptischen Plastizität glutamaterger Synapsen beteiligt.
Durch immunhistochemische Untersuchungen konnte erstmals gezeigt werden, dass aktiviertes
ERK an der präsynaptischen Seite lokalisiert ist und diese synaptische Lokalisierung von RSK
reguliert wird. Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass durch den
Verlust von RSK hyperaktiviertes ERK in den Zellkörpern der Motoneurone vorliegt. RSK
wird durch den ERK/MAPK-Signalweg aktiviert und übernimmt eine Funktion sowohl als
Effektorkinase als auch in der Negativregulation des Signalwegs. Demnach dient RSK in den
Zellkörpern der Motoneurone als Negativregulator des ERK/MAPK-Signalwegs. Darüber
hinaus könnte RSK die Verteilung von aktivem ERK in den Subkompartimenten der
Motoneurone regulieren.
Da in vorangegangenen Studien gezeigt werden konnte, dass ERK an der Regulation der
synaptischen Plastizität beteiligt ist, indem es die Insertion der AMPA-Rezeptoren zur Bildung
der LTP reguliert, sollte in dieser Arbeit aufgeklärt werden, ob der Einfluss von RSK auf die
synaptische Plastizität durch seine Funktion als Negativregulator von ERK zustande kommt.
Untersuchungen der genetischen Interaktion von rsk und rolled, dem Homolog von ERK in
Drosophila, zeigten, dass die durch den Verlust von RSK beobachtete reduzierte Gesamtzahl
der Aktiven Zonen und Glutamatrezeptorfelder der neuromuskulären Synapse auf die Funktion
von RSK als Negativregulator von ERK zurückzuführen ist. Die Größe der neuromuskulären
Synapse sowie die Größe der Aktiven Zonen und Glutamatrezeptorfelder beeinflusst RSK
allerdings durch seine Funktion als Effektorkinase des ERK/MAPK-Signalwegs.
Studien des axonalen Transports von Mitochondrien zeigten, dass dieser in vielen
neuropathologischen Erkrankungen beeinträchtigt ist. Die durchgeführten Untersuchungen des
axonalen Transports in Motoneuronen konnten eine neue Funktion von RSK in der Regulation
des axonalen Transports aufdecken. In den Axonen der Motoneurone von RSK-Nullmutanten
wurden BRP- und CSP-Agglomerate nachgewiesen. RSK könnte an der Regulation des
axonalen Transports von präsynaptischem Material beteiligt sein. Durch den Verlust von RSK
wurden weniger Mitochondrien in anterograder Richtung entlang dem Axon transportiert, dafür verweilten mehr Mitochondrien in stationären Phasen. Diese Ergebnisse zeigen, dass
auch der anterograde Transport von Mitochondrien durch den Verlust von RSK beeinträchtigt
ist.
N2  - In this thesis the function RSK in motoneurons of Drosophila has been analyzed. Mutations in
the RSK2-gene cause the Coffin-Lowry-Syndrome (CLS) which is characterized by mental
retardation. RSK2 is predominantly expressed in regions of the brain where learning and
formation of the memory take place. Even no obvious changes in brain structures could be
observed at macroscopic level in mouse and Drosophila which serve as an animal model for
CLS. However deficits in various learning tasks could be observed due to the loss of the RSK function.
Synaptic plasticity and the following changes in synaptic properties are fundamental for
adaptive behaviors. The neuromuscular system of Drosophila suits as a model for studies of the
synaptic plasticity because of the stereotypic innervation pattern and the use of ionotropic
glutamate receptors which subunits are homologous to the subunits of the mammalian AMPA-type
of glutamate receptors which are essential for the formation of LTP in the hippocampus.
This study shows that RSK is located at the presynaptic site of the motoneurons of Drosophila
which indicates a synapse-specific function of RSK. The structural analysis of the
neuromuscular junction (NMJ) show that the loss of RSK causes a reduction in size of the NMJ,
boutons, active zones and glutamate receptor fields. More boutons were found at the NMJ, but
less active zones and glutamate receptor fields were established. The localization of RSK at the
postsynaptic side could not be detected in this study although RSK regulates the synaptic
transmission by affecting the postsynaptic sensitivity but not the presynaptic neurotransmitter
release. Hence RSK could take part in the regulation of synaptic plasticity.
Immunohistochemical analysis could depict a novel function of RSK in the synapse-specific
localization of ERK. Further this study show that due to the loss of RSK more activated ERK
is located in den cell bodies of the motoneurons. RSK functions as a negative regulator of the
ERK/MAPK signaling in the somata of motoneurons. Additionally, RSK could regulate the
distribution of ERK in the different subcompartments of the motoneurons.
Previous studies show ERK as a regulator of synaptic plasticity by influencing the insertion of
AMPA receptors into the postsynaptic membrane during LTP. RSK is activated by the
ERK/MAPK signaling and functions not only as an effector kinase but also as a negative
regulator of this pathway. If the effect of RSK on synaptic plasticity is due to its function as a negative regulator of ERK should be clarified in this work.
Analysis of the genetic interactions of rsk and rolled, the Drosophila homologue of mammalian
ERK, show that the reduced number of active zones and glutamate receptor fields found at the
NMJ of RSK null mutants is caused by the function of RSK as a negative regulator of ERK. In
turn RSK affects the size of the NMJ, also the size of the active zones and glutamate receptor
fields by its function as an effector kinase of the ERK/MAPK signaling.
Several studies have shown that the axonal transport of mitochondria is affected in many
neuropathological diseases. This work could uncover a novel function of RSK in the regulation
of the axonal transport in motoneurons. The loss of RSK causes the formation of agglomerates
of the presynaptic proteins BRP and CSP. Therefore RSK takes part in the regulation of the
transport of presynaptic material. In absence of RSK less mitochondria are transported in
anterograde direction and more mitochondria are pausing. This results implicate a function of
RSK in regulating the anterograde transport of mitochondria.
KW  - Taufliege
KW  - RSK
KW  - axonaler Transport
KW  - synaptische Funktion
KW  - ERK
KW  - Motoneuron
KW  - Motoneuron
KW  - Genmutation
KW  - Drosophila
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-130717
ER  - 
TY  - THES
A1  - Sivadasan, Rajeeve
T1  - The role of RNA binding proteins in motoneuron diseases
T1  - Die Rolle von RNA-bindenden Proteinen in Motoneuronerkrankungen
N2  - Motoneuron diseases form a heterogeneous group of pathologies characterized by the progressive degeneration of motoneurons. More and more genetic factors associated with motoneuron diseases encode proteins that have a function in RNA metabolism, suggesting that disturbed RNA metabolism could be a common underlying problem in several, perhaps all, forms of motoneuron diseases. Recent results suggest that SMN interacts with hnRNP R and TDP-43 in neuronal processes, which are not part of the classical SMN complex. This point to an additional function of SMN, which could contribute to the high vulnerability of spinal motoneurons in spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The current study elucidates functional links between SMN, the causative factor of SMA (spinal muscular atrophy), hnRNP R, and TDP-43, a genetic factor in ALS (amyotrophic lateral sclerosis). In order to characterize the functional interaction of SMN with hnRNP R and TDP-43, we produced recombinant proteins and investigated their interaction by co-immunoprecipitation. These proteins bind directly to each other, indicating that no other co-factors are needed for this interaction. SMN potentiates the ability of hnRNP R and TDP-43 to bind to ß-actin mRNA. Depletion of SMN alters the subcellular distribution of hnRNP R in motoneurons both in SMN-knockdown motoneurons and SMA mutant mouse (delta7 SMA). These data point to functions of SMN beyond snRNP assembly which could be crucial for recruitment and transport of RNA particles into axons and axon terminals, a mechanism which may contribute to SMA pathogenesis and ALS.
	ALS and FTLD (frontotemporal lobar degeneration) are linked by several lines of evidence with respect to clinical and pathological characteristics. Both sporadic and familial forms are a feature of the ALS-FTLD spectrum, with numerous genes having been associated with these pathological conditions. Both diseases are characterized by the pathological cellular aggregation of proteins. Interestingly, some of these proteins such as TDP-43 and FUS have also common relations not only with ALS-FTLD but also with SMA. Intronic hexanucleotide expansions in C9ORF72 are common in ALS and FTLD but it is unknown whether loss of function, toxicity by the expanded RNA or dipeptides from non ATG-initiated translation is responsible for the pathophysiology. This study tries to characterize the cellular function of C9ORF72 protein. To address this, lentiviral based knockdown and overexpression of C9ORF72 was used in isolated mouse motoneurons. The results clearly show that survival of these motoneurons was not affected by altered C9ORF72 levels, whereas adverse effects on axon growth and growth cone size became apparent after C9ORF72 suppression. Determining the protein interactome revealed several proteins in complexes with C9ORF72. Interestingly, C9ORF72 is present in a complex with cofilin and other actin binding proteins that modulate actin dynamics. These interactions were confirmed both by co-precipitation analyses and in particular by functional studies showing altered actin dynamics in motoneurons with reduced levels of C9ORF72. Importantly, the phosphorylation of cofilin is enhanced in C9ORF72 depleted motoneurons and patient derived lymphoblastoid cells with reduced C9ORF72 levels. These findings indicate that C9ORF72 regulates axonal actin dynamics and the loss of this function could contribute to disease pathomechanisms in ALS and FTLD.
N2  - Motoneuronerkrankungen bilden eine heterogene Gruppe von Pathologien, die durch die progressive Degeneration von Motoneuronen charakterisiert sind.  Zunehmend werden genetische Faktoren in Assoziation mit Motoneuronerkrankungen identifiziert, die eine Funktion im RNA Metabolismus besitzen, was dafür spricht, dass ein gestörter RNA Metabolismus ein gemeinsames zugrunde liegendes Problem in mehreren, vielleicht allen, Formen von Motoneuronerkrankungen sein könnte. Neuere Ergebnisse legen nahe, dass SMN mit hnRNP R und TDP-43 in neuronalen Prozessen interagiert, die nicht Teil der klassischen Rolle des SMN Komplexes sind. Dies deutet auf eine zusätzliche Funktion von SMN hin, die zur hohen Störanfälligkeit von spinalen Motoneuronen in spinaler Muskelatrophie (SMA) und amyotropher Lateralsklerose (ALS) beitragen könnte. Die vorliegende Arbeit beleuchtet funktionelle Beziehungen zwischen SMN, dem auslösenden Faktor der SMA, und hnRNP R, sowie TDP-43, einem weiteren genetischen Faktor bei ALS. Um die funktionelle Interaktion von SMN mit hnRNP R und TDP-43 zu charakterisieren, wurden rekombinante Proteine hergestellt und ihre Interaktion durch co-Immunpräzipitation untersucht. Diese Proteine binden direkt an einander, was darauf hindeutet, dass für diese Interaktion keine weiteren co-Faktoren erforderlich sind. SMN potenziert die Fähigkeit von hnRNP R und TDP-43, β-Aktin mRNA zu binden. Depletion von SMN verändert die subzelluläre Verteilung von hnRNP R in Motoneuronen sowohl in SMN-knock-down Motoneuronen, als auch in der SMA Mausmutante (delta7 SMA). Diese Daten deuten auf Funktionen von SMN jenseits der snRNP Assemblierung hin, die entscheidend für die Rekrutierung und den Transport von RNA Partikel in Axonen und Axon Terminalen sein könnten, einem Mechanismus, der zur Pathogenese von SMA und ALS beitragen könnte.
	ALS und FTLD (fronto-temporale Lobus Degeneration) sind aufgrund mehrerer Nachweislinien bezüglich klinischer und pathologischer Charakteristika vernetzt. Sowohl sporadische als auch familiäre Formen sind Merkmal des ALS-FTLD Spektrums, wobei zahlreiche Gene mit diesen pathologischen Erscheinungen assoziiert wurden. Beide Krankheiten sind durch pathologische zelluläre Proteinaggregation charakterisiert. Interessanterweise haben einige dieser Proteine, wie TDP-43 und FUS, einen gemeinsamen Bezug nicht nur mit ALS-FTLD, sondern auch mit SMA. Intronische Hexanukleotid-Expansionen in C9ORF72 sind häufig in ALS und FTLD, es ist jedoch unbekannt, ob Funktionsverlust, Toxizität aufgrund der verlängerten RNA, oder Dipeptide von non-ATG initiierter Translation für die Pathophysiologie verantwortlich sind. Die vorliegende Arbeit versucht die zelluläre Funktion von C9ORF72 Protein zu charakterisieren. Hierfür wurde lentiviraler knock-down und Überexpression von C9ORF72 in isolierten Motoneuronen eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass das Überleben dieser Motoneurone durch veränderte C9ORF72 Konzentrationen nicht beeinflusst wurde, wohingegen negative Auswirkungen auf Axonwachstum und Wachstumskegelgröße nach C9ORF72 Suppression deutlich wurden. Die Bestimmung des Protein Interaktoms identifizierte mehrere Proteinkomplexe mit C9ORF72. Interessanterweise liegt C9ORF72 in einem Komplex mit Cofilin und anderen Aktin-bindenden Protein vor, welche die Aktin Dynamik modulieren. Diese Interaktionen wurden sowohl durch Analyse von co-Präzipitationen als auch besonders durch funktionelle Studien bestätigt, die eine veränderte Aktin Dynamik in Motoneuronen mit reduzierter C9ORF72 Konzentration zeigten. Wichtig ist die Beobachtung, dass die Phosphorylierung von Cofilin in C9ORF72 depletierten Motoneuronen und in Lymphoblastoid-Zellen mit reduzierter C9ORF72 Konzentration verstärkt ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass C9ORF72 die axonale Aktin Dynamik reguliert und dass der Verlust dieser Funktion zu Krankheits-Pathomechanismen in ALS und FTLD beitragen könnte.
KW  - Motoneuron
KW  - RNA binding proteins
KW  - Krankheit
KW  - RNS-Bindungsproteine
KW  - Motoneuron diseases
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141907
ER  -