TY  - THES
A1  - Pickel, Simone
T1  - Role of the β subunit of L-type calcium channels in cardiac hypertrophy
T1  - Die Rolle der β Untereinheit von L-Typ Kalziumkänalen in der kardialen Hypertrophie
N2  - L-type calcium channels (LTCCs) control crucial physiological processes in cardiomyocytes such as the duration and amplitude of action potentials, excitation-contraction coupling and gene expression, by regulating the entry of Ca2+ into the cells. Cardiac LTCCs consist of one pore-forming α1 subunit and the accessory subunits Cavβ, Cavα2δ and Cavγ. Of these auxiliary subunits, Cavβ is the most important regulator of the channel activity; however, it can also have LTCC-independent cellular regulatory functions. Therefore, changes in the expression of Cavβ can lead not only to a dysregulation of LTCC activity, but also to changes in other cellular functions. Cardiac hypertrophy is one of the most relevant risk factors for congestive heart failure and depends on the activation of calcium-dependent prohypertrophic signaling pathways. However, the role of LTCCs and especially Cavβ in this pathology is controversial and needs to be further elucidated.
Of the four Cavβ isoforms, Cavβ2 is the predominant one in cardiomyocytes. Moreover, there are five different splice variants of Cavβ2 (Cavβ2a-e), differing only in the N-terminal region. We reported that Cavβ2b is the predominant variant expressed in the heart. We also revealed that a pool of Cavβ2 is targeted to the nucleus in cardiomyocytes. The expression of the nuclear Cavβ2 decreases during in vitro and in vivo induction of cardiomyocyte hypertrophy and overexpression of a nucleus-targeted Cavβ2 completely abolishes the in vitro induced hypertrophy. Additionally, we demonstrated by shRNA-mediated protein knockdown that downregulation of Cavβ2 enhances the hypertrophy induced by the α1-adrenergic agonist phenylephrine (PE) without involvement of LTCC activity. These results suggest that Cavβ2 can regulate cardiac hypertrophy through LTCC-independent pathways. To further validate the role of the nuclear Cavβ2, we performed quantitative proteome analyses of Cavβ2-deficient neonatal rat cardiomyocytes (NRCs). The results show that downregulation of Cavβ2 influences the expression of various proteins, including a decrease of calpastatin, an inhibitor of the calcium-dependent cysteine protease calpain. Moreover, downregulation of Cavβ2 during cardiomyocyte hypertrophy drastically increases calpain activity as compared to controls after treatment with PE. Finally, the inhibition of calpain by calpeptin abolishes the increase in PE-induced hypertrophy in Cavβ2-deficient cells. These results suggest that nuclear Cavβ2 has Ca2+- and LTCC-independent functions during the development of hypertrophy. Overall, our results indicate a new role for Cavβ2 in antihypertrophic signaling in cardiac hypertrophy.
N2  - Durch die Regulation des Calciumeintritts in die Zellen kontrollieren L-Typ-Calciumkanäle (LTCCs) wichtige physiologische Prozesse wie die Dauer und Amplitude von Aktionspotentialen, die elektromechanische Kopplung und die Genexpression in Kardiomyozyten. Kardiale LTCCs bestehen aus einer porenformenden α1 Untereinheit und Hilfsuntereinheiten wie Cavβ, Cavα2δ und Cavγ. Von diesen Hilfsuntereinheiten ist Cavβ der wichtigste Regulator der Kanalfunktion, wobei Cavβ auch LTCC-unabhängige zelluläre und regulatorische Funktionen haben kann. Veränderungen in der Expression dieses Proteins können daher zu einer Fehlregulation der LTCC-Aktivität führen, jedoch auch zu Veränderungen von anderen zellulären Funktionen. Einer der häufigsten Risikofaktoren für kongestive Herzinsuffizienz ist die kardiale Hypertrophie, welche abhängig ist von der Aktivierung von Calcium-abhängigen prohypertrophen Signalwegen. Die Rolle von LTCCs und insbesondere von Cavβ in dieser Erkrankung ist jedoch kontrovers und muss noch weiter erforscht werden.
Von den vier Cavβ Splicevarianten ist Cavβ2 die dominierende Form in Kardiomyozyten. Darüber hinaus existieren fünf verschiedene Splicevarianten von Cavβ2 (Cavβ2a-e), die sich jeweils nur in der N-terminalen Region unterscheiden. Wir konnten demonstrieren, dass von diesen Splicevarianten überwiegend Cavβ2b im Herzen exprimiert wird. Außerdem konnten wir zeigen, dass ein Teil von Cavβ2 im Nukleus von Kardiomyozyten zu finden ist. Die Expression von nuklearem Cavβ2 verringert sich während der in vitro und in vivo induzierten kardialen Hypertrophie und außerdem verhindert die Überexpression von im Kern lokalisiertem Cavβ2 die in vitro induzierte Hypertrophie komplett. Zusätzlich konnten wir demonstrieren, dass die Reduktion von Cavβ2 mittels shRNA zu einer Steigerung der Hypertrophie induziert durch die Stimulation mit dem α1-adrenergen Agonisten Phenylephrin (PE) führt, ohne dass die LTCC-Aktivität beteiligt ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Cavβ2 die Entstehung von Hypertrophie durch LTCC-unabhängige Signalwege beeinflussen kann. Um die Rolle von nuklearem Cavβ2 zu bekräftigen, haben wir quantitative Proteomanalysen von Cavβ2 defizienten neonatalen Rattenkardiomyozyten (NRCs) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Reduktion von Cavβ2 die Expression verschiedener Proteine beeinflusst, zum Beispiel wird Calpastatin, ein Inhibitor der calciumabhängigen Cysteinproteasen Calpain, herunterreguliert. Außerdem wird durch die Cavβ2 Reduktion während der Hypertrophie von Kardiomyozyten die Calpainaktivität verglichen mit den Kontrollen signifikant erhöht. Letztendlich konnten wir zeigen, dass die Inhibierung von Calpain durch Calpeptin die gesteigerte PE-induzierte Hypertrophie in Cavβ2-defizienten Zellen verhindert. Diese Ergebnisse lassen eine Calcium- und LTCC-unabhängige Funktion von nuklearem Cavβ2 während der Entwicklung von Hypertrophie, annehmen. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse auf eine neue Rolle von Cavβ2 in den antihypertrophen Signalwegen in der kardialen Hypertrophie hin.
KW  - Herzhypertrophie
KW  - Calciumkanal
KW  - Herzmuskelzelle
KW  - L-type calcium channels
KW  - Cavβ subunit
KW  - Calpain
KW  - LTCC-independent function of Cavβ
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192829
ER  - 
TY  - THES
A1  - Becher, Jan
T1  - Untersuchung des Calcineurin Signalweges bei der Myokardhypertrophie
T1  - The calcineurin signal-pathway in cardiac hypertrophy
N2  - Die Myokardhypertrophie ist eine Anpassungsreaktion des Herzens auf verschiedene pathologische Stimuli wie der arteriellen Hypertonie, Herzklappen-Vitien, Myokardinfarkt, endokrine Stoffwechselstörungen sowie Mutationen von Genen kontraktiler Proteine. Die Antwort der Herzmuskelzelle auf einen hypertrophen Reiz ist gekennzeichnet durch ein verstärktes Zellwachstum ohne Zellteilung und auf molekularer Ebene durch die Induktion fetaler kardialer Gene kontraktiler Proteine. Auch wenn über den klinischen Aspekt der Myokardhypertrophie bereits ein umfangreiches Wissen vorliegt, wurden Details über die bei der Hypertrophie ablaufenden intrazellulären Signalwege erst in den letzten Jahren entdeckt. Der Calcineurin/NFAT Signalweg ist bei der Entstehung der Herzhypertrophie von großer Bedeutung. Die Aktivierung der Ca²+-Calmodulin-abhängigen Phosphatase Calcineurin führt zur einer Dephosphorylierung des Transkriptionsfaktors NFAT. Dies erlaubt die nukleäre Translokation, was zur einer Induktion von Genen führt, welche an der Entstehung der Myokardhypertrophie beteiligt sind. Nach dem heutigen Verständnis benötigt die Aktivierung des Calcineurin/NFAT-Signalweges die Bindung von Calmodulin sowie dauerhaft erhöhte Ca²+-Spiegel. Die Folge der Calcineurinaktivierung ist eine strukturelle Veränderung mit einem Shift der C-terminalen Autoinhibitorischen Domäne, so dass das aktive Phosphatase-Zentrum freigegeben wird. In dieser Arbeit untersuchen wir einen Mechanismus der gezielten proteolytischen Abspaltung der Autoinhibitorischen Domäne, welcher ebenfalls zu einer Enzymaktivierung führt. Die Stimulation von Ratten-Kardiomyozyten mit Angiotensin II führte zu einer Erhöhung der Calpain-Aktivität, was eine proteolytische Abspaltung der autoinhibitorischen Domäne von Calcineurin bedingte. Durch die Blockierung von Calpain konnte die Proteolyse verhindert werden. Die Calcineurin-Aktivität war nach Angiotensin II-Stimulation erhöht (310±29%) und bleib auch nach Wegnahme des Stimulus auf erhöhtem Niveau (214±17%). Wurde dem Medium während der Stimulation Calpain-Inhibitor hinzu gegeben, kam es nach Wegnahme des Angiotensin II-Stimulus zu einem deutlichen Absinken (110±19%) der Calcineurin-Aktivität. An Hand von immunhistochemischen Färbungen und von Transfektionsversuchen mit einem GFP-fusionierten Calcineurin konnte gezeigt werden, dass die Angiotensin II-Stimulation eine nukleäre Translokation von Calcineurin bewirkt. Die Calpain-Blockierung und somit die Unterdrückung des Calpain vermittelten Verdaus von Calcineurin erlaubt es diesem, den Zellkern wieder zu verlassen. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Angiotensin II-Stimulation der Kardiomyozyten zu einer Erhöhung der Calpain-Aktivität führt. Diese wiederum bedingt eine proteolytische Abspaltung der Autoinhibitorischen Domäne von Calcineurin. Die Folge ist eine erhöhte Calcineurin-Aktivität, was eine nukleäre Translokation von Calcineurin auslöst. Nach dem Verlust der Autoinhibitorischen Domäne ist Calcineurin dauerhaft aktiv und nukleär lokalisiert, sogar nach Wegnahme des Hypertrophie-auslösenden Stimulus.
N2  - Cardiac hypertrophy is an adaptive response of the heart to various pathological conditions, including hypertension, valvular disease, myocardial infarction, endocrine disorders, and mutations of genes for cardiac contractile proteins. The cardiomyocyte response to hypertrophic stimuli is characterized by an increase in cell size without cell division as well as by induction of fetal cardiac genes of contractile proteins. Even though extensive knowledge is available on the clinical aspect of LVH, details of the involved signal transduction pathways are being explored only in the recent years. The calcineurin/NFATc signal cascade is of major importance in the development of cardiac hypertrophy. Activation of the Ca²+-calmodulin-dependent phosphatase CnA leads to dephosphorylation of the nuclear transcription factor NFATc, enabling its nuclear translocation resulting in induction of genes typical of cardiac hypertrophy. According to the current understanding, the activation of the CnA/NFATc pathway required sustained high Ca²+ and the binding of calmodulin. The result is a structural change an subsequent displacement of the C-terminal autoinhibitory domain from the catalytic subunit. In this study we investigated a mechanism of targeted proteolyses of the CnA autoinhibitory domain leading to the activation of CnA. Stimulation of rat cardiomyocytes with angiotensin II increased calpain activity significantly and caused proteolyses of the autoinhibitory domain of CnA. Inhibition of calpain prevented proteolysis. CnA activity was increased after Ang II stimulation (310±29%) and remained high after removal of Ang II (214±17%). Addition of calpain inhibitor to the medium decreased CnA activity (110±19%) after removal of Ang II. Ang II stimulation of cardiomyocytes furthermore leads to a translocation of CnA into the nucleus as demonstrated by immunohistochemical staining and transfection assays with GFP-tagged CnA. Calpain inhibition and therefore suppression of calpain-mediated cleavage of CnA enabled CnA exit from the nucleus. The data presented in this study demonstrated that Ang II stimulation of cardiomyocytes increased calpain activity, leading to proteolysis of the autoinhibitory domain of CnA. This causes an increase in CnA activity and results in nuclear translocation of CnA. Loss of the autoinhibitory domain renders CnA constitutively nuclear and active, even after removal of the hypertrophic stimulus.
KW  - Myokard
KW  - Hypertrophie
KW  - Calcineurin
KW  - Calpain
KW  - Molekulare Kardiologie
KW  - myocardium
KW  - hypertrophy
KW  - calcineurin
KW  - calpain
KW  - molecular cardiology
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21889
ER  -