TY - JOUR A1 - Houben, Roland A1 - Alimova, Pamela A1 - Sarma, Bhavishya A1 - Hesbacher, Sonja A1 - Schulte, Carolin A1 - Sarosi, Eva-Maria A1 - Adam, Christian A1 - Kervarrec, Thibault A1 - Schrama, David T1 - 4-[(5-methyl-1H-pyrazol-3-yl)amino]-2H-phenyl-1-phthalazinone inhibits MCPyV T antigen expression in Merkel cell carcinoma independent of Aurora kinase A JF - Cancers N2 - Merkel cell carcinoma (MCC) is frequently caused by the Merkel cell polyomavirus (MCPyV), and MCPyV-positive tumor cells depend on expression of the virus-encoded T antigens (TA). Here, we identify 4-[(5-methyl-1H-pyrazol-3-yl)amino]-2H-phenyl-1-phthalazinone (PHT) — a reported inhibitor of Aurora kinase A — as a compound inhibiting growth of MCC cells by repressing noncoding control region (NCCR)-controlled TA transcription. Surprisingly, we find that TA repression is not caused by inhibition of Aurora kinase A. However, we demonstrate that β-catenin — a transcription factor repressed by active glycogen synthase kinase 3 (GSK3) — is activated by PHT, suggesting that PHT bears a hitherto unreported inhibitory activity against GSK3, a kinase known to function in promoting TA transcription. Indeed, applying an in vitro kinase assay, we demonstrate that PHT directly targets GSK3. Finally, we demonstrate that PHT exhibits in vivo antitumor activity in an MCC xenograft mouse model, suggesting a potential use in future therapeutic settings for MCC. KW - Merkel cell carcinoma KW - polyomavirus KW - large T antigen KW - phthalazinone pyrazole KW - glycogen synthase kinase 3 KW - GSK3 Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-313547 SN - 2072-6694 VL - 15 IS - 9 ER - TY - THES A1 - Wilhelm, Daniela Elisabeth T1 - Die Rolle von GSK3 im Rahmen der angeborenen Immunabwehr gegen Aspergillus fumigatus T1 - GSK3 in the context of innate immune response to aspergillus fumigatus N2 - Aspergillus fumigatus ist ein ubiquitär vorkommender Schimmelpilz, dessen Sporen vom Menschen täglich zu hunderten mit der Atemluft aufgenommen werden. Aufgrund ihrer geringen Größe gelangen die Konidien leicht bis in die Alveolen der Lunge, wo sie normalerweise sofort vom angeborenen Immunsystem beseitigt werden. Immunsupprimierte Menschen leiden an einer qualitativen oder quantitativen Einschränkung dieses Teiles der Immunabwehr, weshalb die Inokulation der Sporen bei ihnen zur Auslösung der lebensgefährlichen Invasiven Aspergillose führen kann, deren Mortalität in der Hochrisikogruppe der Patienten nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation über 90% beträgt. Bei diesen Patienten gewinnt die adaptive Immunabwehr an Bedeutung. Dendritische Zellen gehören dem angeborenen Immunsystem an und besitzen einzigartige Fähigkeiten zur Aktivierung und Steuerung der erworbenen Immunabwehr. Durch die Aktivierung naiver T-Zelen und die Sekretion bestimmter immunmodulatorischer Zytokine bestimmen sie die Art der konsekutiv asugelösten T-Helferzellantwort. Lediglich eine T-Helfer 1-Zellantwort wird hierbei mit einer erhöhten Resistenz gegenüber der invasiven Aspergillose in Verbindung gebracht. Die Zytokinsekretion der Dendritischen Zellen wird durch intrazelluläre Signalkaskaden reguliert, welche sich an ihre PRRs anschließen. Für die Erkennung des bakteriellen LPS durch den TLR wurde die Regulation der immunmodulatorischen Zytokine durch die Serin-Threonin-Kinase GSK3 festgestellt. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob es bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus durch humane dendritische Zellen ebenfalls einen Zusammenhang mit GSK3 und der Sekretion immunmodulatorischer Zytokine gibt. Dafür wurden aus humanen Monozyten generierte dendritische Zellen mit rekombinanten Antigenen von Aspergillus fumigatus sowie verschiedenen Morphologien stiumuliert und teilweise mit dem GSK3-Inhibitor LiCl gehemmt. Anschließend wurde die Expression bestimmter immunmodulatorischer Zytokine und der GSK3 mittels quantitativer real-time RT-PCR bestimmt. Hierbei konnte für eines der getesteten Antigene, Aspf 1, ein deutlicher Einfluss auf die GSK3-Expression der Zellen festgestellt werden. Ein paralleler Anstieg der Expression proinflammatorischer Zytokine erhärtete die Annahme einer immunregulierenden Rolle der GSK3 bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus. Einen deutlicheren Hinweis auf den Zusammenhang zwischen der Aktivität der GSK3 und der Expression proinflammatorischer Zytokine erbrachte die Inhibierung mittels LiCl. Die mit Aspergillus fumigatus stimulierten Zellen reagierten hierauf im Vergleich zu den nicht-inhibierten Zellen mit einer Reduktion der IL12p35-Expression um 86,1% sowie mit einer Reduktion der IL23-Expression um 49,5%. Der letzte Teil der Experimente sollte ausgehend von der Vorstellung, dass verschiedene Aspergillus-Morphologien von unterschiedlichen Rezeptoren erkannt werden quantitative Unterschiede der GSK3-Beteiligung bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus durch dendritische Zellen zeigen. Obwohl alle Morphologien des Schimmelpilzes einen Einfluss auf die GSK3-Expression der Zellen zeigten, konnten hierbei keine einheitlichen quantitativen Unterschiede festgestellt werden. Zusammengefasst konnte in der vorliegenden Arbeit die Beteiligung von GSK3 bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus durch humane dendritische Zellen gezeigt werden. Außerdem konnten Hinweise auf eine immunregulierende Rolle der GSK3 bei der Abwehr des fakultativ pathogenen Schimmelpilzes erbracht werden, wobei die genaue Einbindung der Serin-Threonin-Kinase in dieser Situation noch unklar ist und weitere Experimente erforderlich macht. N2 - Aspergillus fumigatus is a ubiquitously occurring mould. Human beings inoculate the spores each day by breathing air. Because of their small size, the conidia easily reach the alveoles, where under normal conditions, they are immediately deleted by innate immunity. Immunocompromised humans suffer from a reduction in this part of the immune system, regarding both the quality of its deletion ability and the quantity of immune cells. Therefore, the inoculation of the spores in immunocompromised cases leads to a severe disease called invasive aspergillosis. The mortality in the high-risk group of patients undergoing stem-cell transplantation is more than 90%. Thus, the adaptive immunity of these patients gains importance. Dendritic cells are a part of innate immunity, and they have unique skills to activate and control the adaptive part of the immune system. By activating naive T-cells and secreting certain immunomodulatory cytokines, they affect the consecutive T-cell response. At this time, only a T-helper 1 response is associated with an increased resistance to invasive aspergillosis. Intracellular signaling systems attached to the pathogen recognition receptors (PRRs) of the dendritic cells regulate the secretion of cytokines. The serine-threonine kinase GSK3 (glycogen synthase kinase 3) controls the expression of the immunomodulatory cytokines from the Toll-like receptor (TLR) and the bacterial Lipopolysaccharide (LPS). This research investigated whether a correlation exists between the recognition of aspergillus fumigatus by human dendritic cells and the GSK3-controlled secretion of immunomodulatory cytokines, and thereby, the control of adaptive immunity. Dendritic cells were generated from human monocytes, subsequently stimulated with recombinant antigenes or various morphologies of aspergillus fumigates, and partially inhibited with the GSK3-inhibitor lithium chloride (LiCl). The expression of certain GSK3-controlled immunomodulatory cytokines was determined using quantitative, real-time RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction). For one of the tested antigenes, Aspf 1, we revealed a considerable influence on the cells GSK3-expression. A parallel increase of the proinflammatory cytokine expression confirmed the presumption of a immunoregulatory role of GSK3 in recognizing certain Aspergillus fumigatus antigenes. A further indication of the correlation between the activity of GSK3 and the expression of proinflammatory cytokines was provided by inhibiting the cells using LiCl. Hereby, the inhibited cells reacted according to the non-inhibited cells with a 86,1% diminution of the IL-12p35 expression and a 49,5% diminution of the IL-23 expression. In the last part of this work, we investigated whether there is a difference in the GSK3 involvement during the recognition of different aspergillus morphotypes by dendritic cells, as these are recognized by different PRRs. Although all morphotypes showed an influence on the GSK3-expression, no consistent differences in quantity were discovered. Summarizing our work, we revealed the involvement of GSK3 during the recognition of aspergillus fumigatus by human dendritic cells. Besides, we found some evidence of the immunoregulatory role of GSK3 in this context, however the exact integration of the serine-threonine kinase remains unclear and needs further research. KW - Aspergillus fumigatus KW - GSK3 KW - angeborene Immunabwehr KW - Aspergillus fumigatus KW - GSK3 KW - innate immunity Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71674 ER -