TY - THES A1 - Fischer, Regina Maria T1 - Einfluß verschiedener extrakorporaler Dialyseverfahren auf endotheliale Vorläuferzellen T1 - Endothelial progenitor cells in patients on extracorporeal maintenance dialysis therapy N2 - Zirkulierende endotheliale Vorläuferzellen, kurz EPCs, werden als Biomarker für kardiovaskuläre Erkrankungen genutzt. In einer prospektiven, randomisierten Cross-over-Studie wurden 18 chronische Dialysepatienten während jeweils vier Wochen mit Low-Flux-HD, High-Flux-HD sowie Hämodiafilatration behandelt. EPCs wurden zu Beginn sowie am Ende jedes Intervalls bestimmt. Trotz deutlicher Unterschiede bezüglich der Toxinentfernung im mittelmolekularen Bereich zeigte sich kein Einfluss auf Qualität und Quantität der EPCs N2 - The number and function of endothelial progenitor cells (EPCs) are associated with the cardiovascular risk. In a prospective, randomized, cross-over trial, 18 maintenance dialysis patients were subjected to four weeks of each low-flux HD (LF-HD), high-flux HD (HF-HD), and online predilution hemodiafiltration (HDF). EPCs were determined at baseline and at the end of each four-week period. Despite a clear separation in middle molecular uremic toxin removal, there was no difference found in the effects of LF-HD, HF-HD, and HDF on EPCs KW - endotheliale Vorläuferzellen KW - Dialyse KW - Urämietoxine KW - endotheliale Vorläuferzellen KW - Dialyse KW - Urämietoxine KW - endothelial progenitor cells KW - hemodialysis KW - uremic toxins Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71353 ER - TY - THES A1 - Hofmann, Anke Katrin T1 - Ex vivo Expansion von endothelialen Vorläuferzellen T1 - Ex vivo expansion of endothelial progenitor cells N2 - EINFÜHRUNG: Endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) können in vivo aus dem Knochenmark in die periphere Blutzirkulation mobilisiert und gezielt zu ischämischem Gewebe oder Gefäßläsionen rekrutiert werden. Im Zielgewebe differenzieren EPCs in situ zu reifen Endothelzellen und tragen auf diese Weise zur Neovaskularisation und Endothelregeneration bei. Der therapeutische Einsatz von EPCs ist durch die geringe Zellzahl limitiert, die aus dem Blut eines Patienten gewonnen werden kann. Folglich ist ein Verfahren zur ex vivo Expansion von EPCs erforderlich. Das Cystein-reiche Protein 61 (CYR61) ist ein matrizelluläres Signalprotein der CCN-Familie, das in vitro in der Lage ist die Proliferation, Migration und Adhäsion von Endothelzellen zu steigern. In vivo ist CYR61 im Rahmen von Geweberegeneration und Neovaskularisation verstärkt exprimiert. Die Beteiligung von EPCs und CYR61 an der Blutgefäßbildung legt eine mögliche Interaktion dieser beiden angiogenetischen Faktoren nahe. In dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob CYR61 ein potenter Stimulator der ex vivo Expansion von EPCs ist, ohne dabei den Phänotyp der Zellen zu verändern. MATERIAL UND METHODEN: Das rekombinante CYR61-Protein wurde in Insektenzellen als Fusionsprotein mit der Fc-Domäne des humanen IgG exprimiert und affinitätschromatographisch aufgereinigt. Mononukleäre Zellen des peripheren venösen Blutes von adulten humanen Spendern wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert und anschließend mit einem für die Selektion von EPCs geeigneten Grundmedium in vitro kultiviert. Vom 2. Kulturtag an wurde das Grundmedium mit CYR61 supplementiert. Die Kontrollzellen wurden in reinem oder mit Fc-tag supplementiertem Grundmedium kultiviert. Das Wachstum und die Entwicklung der Zellen wurden über die gesamte Kulturdauer hinweg beobachtet und fotografiert. Die Zellproliferation wurde mittels Zellzählung quantifiziert. Zudem wurden die Zellen mittels FACS-Analyse und immunhistochemischer Färbung bezüglich der Expression charakteristischer Oberflächenmarker phänotypisch analysiert. ERGEBNISSE: Die in vitro Kultur von aus dem Blut isolierten EPCs unter CYR61-Supplementierung führte zu einer konzentrationsabhängigen Steigerung der Zellproliferation, im Konzentrationsbereich von 0,05 bis 1,5µg/ml CYR61. Die Behandlung von EPCs mit 0,5µg/ml CYR61 führte zu einer durchschnittlich 4,1-fachen Zellzahlzunahme im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen. Die FACS-Analysen und immunhistochemischen Färbungen ergaben ein für EPCs charakteritisches Oberflächenmarkerexpressionsprofil der Zellen. Sowohl die mit CYR61 behandelten als auch die unbehandelten Kontrollzellen zeigten eine identische EPC-typische Markerexpression, wodurch gezeigt werden konnte, dass der Phänotyp der EPCs von der Behandlung mit CYR61 unbeeinflusst bleibt. SCHLUSSFOLGERUNG: Folglich ist CYR61 ein potenter Stimulator der ex vivo Expansion von aus dem peripheren humanen Blut isolierten EPCs. Dieses Ergebnis legt eine mögliche Verwendung von ex vivo unter CYR61 Behandlung expanierten EPCs zur Stimulation von Neovaskularisation und Endothelregeneration nahe. Derartige neue Zell-basierte therapeutische Strategien könnten dazu beitragen beispielsweise die Behandlung der ischämischen Herzkrankheit, die Knochenregeneration oder die Vaskularisierung von mittels Tissue Engineering hergestellten Gewebekonstrukten zu verbessern. N2 - BACKGROUND: Endothelial progenitor cells (EPCs) can in vivo be mobilized from the bone marrow into the peripheral blood, home to sites of ischemia or vascular injury and differentiate into endothelial cells in situ, resulting in an enhanced neovascularisation and reendothelialisation. The use of EPCs as a potential therapeutic agent is limited by the small number of EPCs that can be isolated from peripheral blood. Consequently an ex vivo expansion technique for EPCs is required. The cystein-rich protein 61 (CYR61) is a matricellular signal protein of the CCN family, that promotes endothelial cell proliferation, migration and adhesion in vitro and is shown to be over expressed in the context of tissue regeneration and neovascularisation in vivo. The involvement of EPCs and CYR61 in neovascularisation suggests possible interaction between these two angiogenic factors. This study explores the question whether CYR61 is a potent stimulator of ex vivo expansion of EPCs, without altering the cell phenotype. MATERIALS AND METHODS: The recombinant CYR61 protein was expressed in insect cells as a fusion protein with the IgG Fc-domain and purified via protein G sepharose. Mononuclear cells were isolated from peripheral venous blood of adult healthy human volunteers using density gradient centrifugation, followed by in vitro cultivation with a basic medium for selection of EPCs. From day 2 of cultivation onwards the basic medium was supplemented with CYR61. Control cells were cultured in basic medium alone or were treated with Fc-tag. Cell growth and development was monitored and photographed during the time of culture. Cell proliferation was quantified by cell counting. Phenotypic analysis of EPC based on cell surface marker expression was performed using FACS-analysis and immunhistochemical staining. To evaluate the influence of the treatment with CYR61 on the phenotype of EPCs, the marker expression of the treated an untreated cells was compared. RESULTS: Medium supplementation with CYR61 during in vitro culture of EPCs isolated from peripheral blood resulted in a dose-depend increase of cell proliferation in the concentration range between 0.05 and 1.5µg/ml CYR61. Treatment of EPCs with 0.5µg/ml CYR61 resulted in a 4.1-fold average EPC number increase compared to untreated control cells. FACS analysis and immunhistochemical staining revealed a characteristic EPC surface marker expression profile. Both CYR61 treated and untreated cells showed the same EPC marker expression, demonstrating that CYR61 treatment has no influence on EPC phenotype. CONCLUSION: In conclusion, CYR61 represents a potent stimulator of ex vivo expansion of EPCs isolated from peripheral human blood. This finding suggests a possible application of EPCs expanded ex vivo under CYR61 treatment to stimulate neovascularisation and endothelial regeneration. Such novel cell-based therapeutic strategies may help improve for instance treatment for ischemic heart disease, bone regeneration or vascularisation of tissue engineered constructs. KW - Vaskularisation KW - Angiogenese KW - Endothel KW - endotheliale Vorläuferzellen KW - CYR61 KW - Vaskulogenese KW - endothelial progenitor cells KW - CYR61 KW - vasculogenesis Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64878 ER - TY - THES A1 - Stein, Sylvia T1 - Hemmung der Mobilisation und Funktion humaner endothelialer Vorläuferzellen durch den endogenen NO-Synthase-Inhibitor asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) bei koronarer Herzkrankheit T1 - Suppression of endothelial progenitor cells in human coronary artery disease by the endogenous nitric oxide synthase inhibitor asymmetric dimethylarginine N2 - Intaktes Endothel und die ausreichende Funktion der endothelialen NO-Synthase (eNOS) sind Voraussetzungen für gesunde Gefäße. Eine endotheliale Dysfunktion besteht bei Patienten mit kardiovaskulären Risikofaktoren bzw. manifester koronarer Herzerkrankung (KHK). Endotheliale Vorläuferzellen (EPC) sind ein wichtiger Faktor für die Aufrechterhaltung der Homöostase des Endothels. Im klinischen Teil der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese Vorläuferzellen mit zunehmender Schwere der KHK in geringerem Maß im Blut zirkulieren. Die Anzahl der EPC war bei Patienten mit einer koronaren 3-Gefäßerkrankung um 77 % geringer, die Anzahl der kolonie-bildenden Einheiten (CFUs) um 50,3%, jeweils verglichen mit Patienten ohne KHK. Bei diesen Patienten konnte ebenfalls gezeigt werden, dass sich die Konzentration des endogenen eNOS-Inhibitors asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) im Plasma mit zunehmender Schwere der KHK erhöhte (0,47 ± 0,02 μmol/l bei fehlender KHK gegenüber 0,58 ± 0,02 μmol/l bei koronarer 3-Gefäßerkrankung). ADMA ist über eine Hemmung der eNOS an der Entstehung und Aufrechterhaltung einer endothelialen Dysfunktion beteiligt. Über diesen Weg wird vermutlich auch die Funktion der EPC erheblich eingeschränkt. Dies konnten wir anhand der In­vitro­Versuche mit EPC gesunder Spender zeigen. Dabei reduzierte sich unter ADMA-Einfluß die Anzahl der EPC in Kultur, die Anzahl und Größe der CFUs und ihre Funktion bzw. ihre Fähigkeit, sich in gefäßähnliche Strukturen zu integrieren. Eine gleichzeitige Gabe des HMG-CoA-Reduktase-Inhibitors Rosuvastatin wirkte in all diesen In-vitro-Versuchen der hemmenden Wirkung von ADMA entgegen. Die vorliegende Arbeit zeigt erstmals eine inverse Korrelation zwischen ADMA-Spiegeln und der Anzahl und Funktion der EPC. Der negative Einfluss auf EPCs ist vermutlich ein wichtiger Mechanismus, über den ADMA der Entstehung und dem Fortschreiten kardiovaskulärer Erkrankungen Vorschub leistet. N2 - Endothelial progenitor cells play a pivotal role in regeneration of injured endothelium, thereby limiting the formation of atherosclerotic lesions. Reduced numbers of EPCs may affect progression of coronary artery disease. Regulation of EPC mobilization and function is mediated in part by nitric oxide (NO). Endogenous inhibitors of NO synthases, such as ADMA, contribute to endothelial dysfunction and injury. We tested the hypothesis that asymmetric dimethylarginine (ADMA) may be an endogenous inhibitor of endothelial progenitor cells (EPCs). We used flow cytometry and in vitro assays to investigate the relationship between EPC number and function with ADMA plasma levels in patients with stable angina. The plasma concentration of ADMA was related to the severity of coronary artery disease and correlated inversely with the number of circulating CD34+/CD133+ progenitor cells (r = -0.69; p < 0.0001) and endothelial colony forming units (CFUs) (r = -0.75; p < 0.0001). Adjusting for all patient characteristics, we confirmed these findings in multivariate regression analyses. In vitro differentiation of EPCs was repressed by ADMA in a concentration-dependent manner. Compared with untreated cells, ADMA reduced EPC incorporation into endothelial tube-like structures to 27 +/- 11% (p < 0.001). Asymmetric dimethylarginine repressed the formation of CFUs from cultured peripheral blood mononuclear cells to 35 +/- 7% (p < 0.001). Asymmetric dimethylarginine decreased endothelial nitric oxide synthase activity in EPCs to 64 +/- 6% (p < 0.05) when compared with controls. Co-incubation with the hydroxymethyl glutaryl coenzyme A reductase inhibitor rosuvastatin abolished the detrimental effects of ADMA. CONCLUSIONS: Asymmetric dimethylarginine is an endogenous inhibitor of mobilization, differentiation, and function of EPCs. This contributes to the cardiovascular risk in patients with high ADMA levels and may explain low numbers and function of EPCs in patients with coronary artery disease. KW - endotheliale Vorläuferzellen KW - ADMA KW - NO-Synthase KW - asymmetrisches Dimethylarginin KW - koronare Herzkrankheit KW - asymmetric dimethylarginine KW - coronary artery disease KW - endothelial progenitor cells KW - nitric oxide synthase Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57317 ER -