TY - THES A1 - Sarma, Bhavishya T1 - Merkel Cell Carcinoma: Investigations on its carcinogenesis and new therapeutic approaches T1 - Merkelzellkarzinom: Untersuchungen zur Karzinogenese und neue Therapieansätze N2 - Merkel cell carcinoma (MCC) is a rare and aggressive skin cancer with an increasing incidence. The majority of MCC cases (approximately 80%) are associated with the Merkel cell polyomavirus (MCPyV). This virus encodes for the MCPyV T antigens (small T (sT) and large T (LT)), which are oncoproteins that drive MCC carcinogenesis. However, the precise cells of the skin that are transformed by the T antigens are not known i.e., the cells of origin of MCC are yet to be discovered. Therefore, the first part of this study involved the generation and evaluation of a vector system that could be used to study MCC oncogenesis. To this end, a set of lentiviral vectors was cloned that allows independent, inducible expression of potential key factors in MCC oncogenesis. In addition, a CRISPR/Cas9 knock in was established that allows the coding sequence for a fluorescent protein to be placed under the control of the promoter of KRT20, one of the most crucial markers of MCC. The functionality of this KRT20 reporter was proven in the MCPyV-positive MCC cell line, WaGa. The different inducible vector systems (doxycycline-inducible MCPyV T antigens or MCPyV sT, RheoSwitch-inducible ATOH1 and IPTG-inducible dnMAML1 and GLI1) were found to have different efficacies in various cellular systems and in particular, a considerable reduction in efficiency was observed at times upon the interaction of several vectors in one cell. In the second and more important part of this study, the role of the well-established anti-malarial drug, artesunate, which possesses additional anti-tumor and anti-viral activity, in the treatment of MCPyV-positive MCC was analyzed. In our study, artesunate was found to be cytotoxic towards MCPyV-positive MCC cell lines in vitro and repressed tumor growth in vivo in a mouse model. Artesunate was also found to downregulate T antigen expression, which is critical for the proliferation of MCPyV-positive MCC cells. The repression of T antigen expression, however, was not the sole mechanism of artesunate’s cytotoxic action; instead, the MCPyV-positive MCC cell line, WaGa, was found to be even less sensitive to artesunate after shRNA knockdown of the T antigens. Since loss of membrane integrity occurred more rapidly than degradation/loss of genomic DNA under the influence of artesunate in four of five MCPyV-positive MCC cell lines examined, apoptosis, although widely described as a modus operandi for artesunate, did not appear to be a determinant of the cytotoxicity of artesunate against MCPyV-positive MCC cells. Instead, we were able to demonstrate that artesunate induced the recently described iron-dependent and lipid peroxide-associated form of cell death known as "ferroptosis". This was achieved primarily through the use of inhibitors that can suppress specific individual steps of the ferroptotic process. Thus, artesunate-induced cell death of MCPyV-positive MCC cells could be suppressed by iron chelators and by the inhibition of lipid peroxidation and lysosomal transport. Surprising results were obtained from the analysis of two proteins associated with the ferroptotic process, namely, ferroptosis suppressor protein 1 (FSP1) and tumor suppressor protein p53. Here, we showed that ectopically- 2 expressed FSP1 cannot suppress artesunate-induced ferroptosis in MCPyV-positive MCC cells and that p53 does not play a pro-ferroptotic role in artesunate-induced cell death of MCPyV-positive MCCs. Since artesunate did not suppress the interferon-γ-induced expression of immune-related molecules such as HLA and PD-L1 on the surface of MCPyV-positive MCCs, our study also provided the first positive evidence for its use in combinatorial immunotherapy. Overall, this study showed that artesunate appears to be an effective drug for the treatment of MCPyV-positive MCC and might also be considered for its use in combinatorial MCC immunotherapy in the future. N2 - Das Merkelzellkarzinom (MCC) ist ein seltener und aggressiver Hautkrebs mit einer steigenden Inzidenz. Die Mehrzahl der MCC-Fälle (ca. 80%) sind mit dem Merkelzell-Polyomavirus (MCPyV) assoziiert. Dieses Virus kodiert für die MCPyV T Antigene (small T (sT) und Large T (LT)), die als Onkoproteine die MCC Karzinogenese vorantreiben. Unbekannt ist jedoch welche Zellen der Haut durch die T Antigene transformiert werden, was also die Ursprungszellen des MCC sind. Der erste Teil dieser Arbeit befasste sich daher mit der Generierung und Evaluierung eines Vektorsystems, das zur Untersuchung der MCC-Onkogenese genutzt werden könnte. Dazu wurde ein Set von lentiviralen Vektoren kloniert, das die voneinander unabhängige, induzierbare Expression von potentiellen Schlüsselfaktoren der MCC-Onkogenese erlaubt. Außerdem wurde ein CRISPR/Cas9 knock in etabliert, der es erlaubt die kodierende Sequenz für ein fluoreszierendes Protein unter die Kontrolle des Promoters von KRT20, dessen Expression eines der wichtigsten MCC Marker ist, zu bringen. Die Funktionalität dieses KRT20 Reporters konnte in einer MCPyV-positive MCC Linie, WaGa, nachgewiesen werden. Die verschiedenen induzierbaren Vektorsysteme (Doxycyclin-induzierbare MCPyV T Antigene bzw. MCPyV sT, RheoSwitch-induzierbare ATOH1, IPTG-induzierbares dnMAML1 und GLI1) zeigten sich unterschiedlich effektiv in unterschiedlichen Zellsystemen und insbesondere im Zusammenspiel mehrerer Vektoren in einer Zelle war die Induzierbarkeit teilweise erheblich reduziert. Im zweiten, und wichtigeren Teil dieser Arbeit, habe ich mich mit der Frage auseinandergesetzt, ob ein etabliertes Anti-Malaria-Medikament, dem zusätzlich anti-tumorale und anti-virale Aktivität zugeschrieben werden, sich für die Behandlung des MCPyV-positiven MCC anbieten könnte. In unserer Studie wurde festgestellt, dass Artesunat in vitro zytotoxisch auf MCPyV-positive MCC Zelllinien wirkt und in vivo im Mausmodell das Tumorwachstum verlangsamen kann. Es wurde zudem beobachtet, dass Artesunat die T Antigen Expression unterdrückt, das für die Proliferation von MCPyV-positiven MCC-Zellen entscheidend ist. Allerdings spielt die Repression der T Antigen Expression keine Rolle für den zytotoxischen Effekt von Artesunat, sondern es zeigte sich, dass die MCC-Zelllinie WaGa nach shRNA knockdown der T Antigene sogar weniger sensitiv gegenüber Artesunat war. Da unter dem Einfluss von Artesunat in vier von fünf untersuchten MCC Zelllinien der Verlust der Membranintegrität schneller eintrat als eine Degradation/Verlust der genomischen DNA scheint Apoptose, obwohl vielfach als Modus Operandi für Artesunat beschrieben, nicht bestimmend für die Zytotoxität von Artesunat gegenüber MCPyV-positiven MCC Zellen zu sein. Stattdessen konnten wir die kürzlich beschriebene eisenabhängige und Lipidperoxid-assoziierte Form des Zelltods, die sogenannte "Ferroptose", nachweisen. Dies gelang vor allem durch den Einsatz von Inhibitoren, die spezifische Einzelschritte des ferroptotischen Prozesses unterdrücken können. So ließ sich der durch Artesunat induzierte Zelltod von MCPyV-positiven Zellen durch Eisenchelatbildner und Inhibition der Lipidperoxidation und des lysosomalen Transports unterdrücken. Überraschende Ergebnisse lieferte die Analyze von zwei Proteinen, die mit dem ferroptotischen Prozess in Verbindung gebracht werden, nämlich dem Ferroptose-Suppressor-Protein 1 (FSP1) und dem Tumorsuppressor-Protein p53. Hier zeigte sich, dass ektopisch-exprimiertes FSP1 die Artesunat-induzierte Ferroptose in MCC Zellen nicht unterdrücken kann und dass p53 keine pro-ferroptotische Rolle beim Artesunat-induzierten Zelltod von MCPyV-positiven MCCs spielt. Da Artesunat die Interferon-γ induzierte Expression von immunrelevanten Molekülen wie HLA und PD-L1 auf der Oberfläche von MCPyV-positiven MCCs nicht unterdrückte, ergaben sich auch erste positive Hinweise auf seinen Einsatz in der kombinatorischen Immuntherapie. Insgesamt zeigte diese Studie, dass Artesunat ein wirksames Medikament für die Behandlung von MCPyV-positivem MCC zu sein scheint und in Zukunft auch für den Einsatz in der kombinatorischen MCC-Immuntherapie in Frage kommen könnte. KW - Merkel cell carcinoma KW - Merkel cell polyomavirus KW - Ferroptosis KW - Artesunate Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-247402 ER - TY - THES A1 - Kleffel, Sonja Beate T1 - The role of cancer cell-expressed PD-1 in tumorigenesis and tumor immune evasion T1 - Funktionelle Charakterisierung von Tumorzell-exprimiertem PD-1 in der Karzinogenese und antitumoralen Immunabwehr N2 - Melanoma and Merkel cell carcinoma (MCC) are highly aggressive cancers of the skin that frequently escape immune recognition and acquire resistance to chemotherapeutic agents, which poses a major obstacle to successful cancer treatment. Recently, a new class of therapeutics targeting the programmed cell death-1 (PD-1) immune checkpoint receptor has shown remarkable efficacy in the treatment of both cancers. Blockade of PD-1 on T cells activates cancer-specific immune responses that can mediate tumor regression. The data presented in this Ph.D. thesis demonstrates that PD-1 is also expressed by subsets of cancer cells in melanoma and MCC. Moreover, this work identifies PD-1 as a novel tumor cell-intrinsic growth receptor, even in the absence of T cell immunity. PD-1 is expressed by tumorigenic cell subsets in melanoma patient samples and established human and murine cell lines that also co-express ABCB5, a marker of immunoregulatory tumor- initiating cells in melanoma. Consistently, melanoma-expressed PD-1 downmodulates T effector cell functions and increases the intratumoral frequency of tolerogenic myeloid- derived suppressor cells. PD-1 inhibition on melanoma cells by RNA interference, blocking antibodies, or mutagenesis of melanoma-PD-1 signaling motifs suppresses tumor growth in immunocompetent, immunocompromised, and PD-1-deficient tumor graft recipient mice. Conversely, melanoma-specific PD-1 overexpression enhances tumorigenicity, including in mice lacking adaptive immunity. Engagement of melanoma- PD-1 by its ligand PD-L1 promotes tumor growth, whereas melanoma-PD-L1 inhibition or knockout of host-PD-L1 attenuates growth of PD-1-positive melanomas. Mechanistically, the melanoma-PD-1 receptor activates mTOR signaling mediators, including ribosomal protein S6. In a proof-of-concept study, tumoral expression of phospho-S6 in pretreatment tumor biopsies correlated with clinical responses to anti-PD-1 therapy in melanoma patients. In MCC, PD-1 is similarly co-expressed by ABCB5+ cancer cell subsets in clinical tumor specimens and established human cell lines. ABCB5 renders MCC cells resistant to the standard-of-care chemotherapeutic agents, carboplatin and etoposide. Antibody-mediated ABCB5 blockade reverses chemotherapy resistance and inhibits tumor xenograft growth by enhancing chemotherapy-induced tumor cell killing. Furthermore, engagement of MCC-expressed PD-1 by its ligands, PD-L1 and PD-L2, promotes proliferation and activates MCC-intrinsic mTOR signaling. Consistently, antibody- mediated PD-1 blockade inhibits MCC tumor xenograft growth and phosphorylation of mTOR effectors in immunocompromised mice. In summary, these findings identify cancer cell-intrinsic functions of the PD-1 pathway in tumorigenesis and suggest that blocking melanoma- and MCC-expressed PD-1 might contribute to the striking clinical efficacy of anti-PD-1 therapy. Additionally, these results establish ABCB5 as a previously unrecognized chemoresistance mechanism in MCC. N2 - Das Melanom und das Merkelzellkarzinom (MZK) sind auttumoren neuroendokrinen Ursprungs, die sich durch ein besonders aggressives Wachstum auszeichnen. Melanome und MZK entgehen häufig der antitumoralen Immunabwehr und erwerben Resistenzen gegen Chemotherapeutika, was eine erfolgreiche Behandlung der betroffenen Patienten erschwert. In klinischen Studien hat eine neue Klasse von therapeutischen Antikörpern, die den Immun-Checkpoint Rezeptor PD-1 (Programmed Cell Death-1) inhibieren, hohe Ansprechraten und dauerhafte Remissionen bei Melanom- und MZK-Patienten erzielt. Die Blockade des PD-1 Rezeptors auf T-Zellen reaktiviert autologe Immunreaktionen gegen Tumorzellen, die zur Reduktion des Tumors führen können. Die vorgelegte Dissertation zeigt, dass Subpopulationen von Melanom- und MZK-Zellen PD-1 exprimieren, und dass die Aktivierung von Tumorzell-intrinsischem PD-1 einen pro-tumorigenen Mechanismus darstellt, einschliesslich in T-Zell-defizienten Mäusen. In Biopsien von Melanom-Patienten, sowie in humanen und murinen Melanom-Zelllinien wird PD-1 präferentiell von tumorigenen, immunregulatorischen, ABCB5+ Melanom-Stammzellen exprimiert. PD-1+ Melanomzellen hemmen die Aktivität von Effektor-T-Zellen und erhöhen die Anzahl der tolerogenen myeloiden Suppressorzellen im Tumor. Die Inhibierung des PD-1 Rezeptors auf Melanomzellen durch RNA-Interferenz, blockierende Antikörper oder Mutagenese der intrazellulären Signalmotive des PD-1 Proteins unterdrückt das Melanom-Wachstum in immunkompetenten, immunsupprimierten und PD-1-defizienten Mäusen. Umgekehrt führt die Melanom-spezifische Überexpression von PD-1 zu einem signifikant erhöhtem Tumorwachstum, sogar in immunsupprimierten Mäusen. Die Aktivierung des PD-1 Rezeptors auf Melanomzellen durch die Bindung seines Liganden, PD-L1, fördert das Tumorwachstum, während das protumorigene Potential von PD-1-positiven Melanomzellen durch die Inhibierung von PD-L1 auf Melanomzellen, sowie in PD-L1-defizienten Mäusen, gehemmt wird. In Melanomzellen aktiviert der PD-1 Rezeptor den mTOR Signaltransduktionsweg, einschließlich des Effektormoleküls ribosomales Protein S6. In einer Teststudie korrelierte die Expression des Phospho-S6 Proteins in Melanomzellen aus Biopsien, die vor Gabe der Immuntherapie entnommen wurden, mit den Ansprechraten der Melanom Patienten auf die Behandlung mit PD-1-Antikörpern. Auch in Biopsien von MZK-Patienten und in etablierten humanen MZK-Zelllinien wird PD-1 präferentiell von ABCB5+ Subpopulationen exprimiert. Im MZK vermittelt der ABCB5-Membrantransporter Resistenzen gegenüber den Zytostatika Carboplatin und Etoposid. Die Antikörper-vermittelte Blockade des ABCB5-Transporters sensibilisiert MZK-Zellen für die Carboplatin- und Etoposid-vermittelte Apoptose, was zu einer signifikanten Reduktion des experimentellen Tumorwachstums führt. Ähnlich wie im Melanom fördert die Bindung des PD-1 Rezeptors auf MZK Zellen durch seine Liganden, PD-L1 und PD-L2, deren Proliferation und die intrazelluläre Aktivierung der mTORSignalkaskade. Entsprechend führt die antikörper-vermittelte Blockade von PD-1 zur Inhibierung des MZK-Tumorwachstums in immunsupprimierten Mäusen und zu einer reduzierten Phosphorylierung von mTOR Effektormolekülen. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Dissertation gezeigt werden, dass Subpopulationen von Melanom- und MZK-Zellen PD-1 exprimieren, und dass Tumorzell-intrinsische PD-1-Funktionen das Krebswachstum fördern. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Blockade des PD-1-Rezeptors auf Tumorzellen zu der klinischen Wirksamkeit der anti-PD-1 Therapie beitragen könnte. Darüber hinaus konnte ABCB5 als neuer Chemoresistenz-Mechanismus in MZK identifiziert werden. KW - Melanom KW - Merkelzellkarzinom KW - Cancer KW - Melanoma KW - Merkel cell carcinoma KW - Cancer immunotherapy KW - Chemotherapeutic resistance Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151205 ER -