TY - THES A1 - Wiesner, Miriam T1 - Stem Cell-based Adipose Tissue Engineering - Engineering of Prevascularized Adipose Tissue Constructs In Vitro & Investigation on Gap Junctional Intercellular Communication in Adipose-derived Stem Cells T1 - Stammzellbasiertes Tissue Engineering von Fettgewebe - Entwicklung eines prävaskularisierten Fettgewebekonstrukts in vitro & Untersuchung der interzellulären Kommunikation über Gap Junctions in Stammzellen aus dem Fettgewebe N2 - In reconstructive and plastic surgery, there exists a growing demand of adequate tissue implants, since currently available strategies for autologous transplantation are limited by complications including transplant failure and donor site morbidity. By developing in vitro and in vivo autologous substitutes for defective tissue sites, adipose tissue engineering can address these challenges, although there are several obstacles to overcome. One of the major limitations is the sufficient vascularization of in vitro engineered large constructs that remains crucial and demanding for functional tissues. Decellularized jejunal segments may represent a suitable scaffolding system with preexisting capillary structures that can be repopulated with human microvascular endothelial cells (hMVECs), and a luminal matrix applicable for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells (hASCs). Hence, co-culture of these cells in jejunal segments, utilizing a custom-made bioreactor system, was characterized in terms of vascularization and adipose tissue development. Substantial adipogenesis of hASCs was demonstrated within the jejunal lumen in contrast to non-induced controls, and the increase of key adipogenic markers was verified over time upon induction. The development of major extracellular matrix components of mature adipose tissue, such as laminin and collagen IV, was shown within the scaffold in induced samples. Successful reseeding of the vascular network with hMVECs was demonstrated in long-term culture and co-localization of vascular structures and adipogenically differentiated hASCs was observed. Therefore, these results represent a novel approach for in vitro engineering of vascularized adipose tissue constructs that warrants further investigations in preclinical studies. Another still existing obstacle in adipose tissue engineering is the insufficient knowledge about the applied cells, for instance the understanding of how cells can be optimally expanded and differentiated for successful engineering of tissue transplants. Even though hASCs can be easily isolated from liposuction of abdominal fat depots, yielding low donor site morbidity, huge numbers of cells are required to entirely seed complex and large 3D matrices or scaffolds. Thus, cells need to be large-scale expanded in vitro on the premise of not losing their differentiation capacity caused by replicative aging. Accordingly, an improved differentiation of hASCs in adipose tissue engineering approaches remains still desirable since most engineered constructs exhibit an inhomogeneous differentiation pattern. For mesenchymal stem cells (MSCs), it has been shown that growth factor application can lead to a significant improvement of both proliferation and differentiation capacity. Especially basic fibroblast growth factor (bFGF) represents a potent mitogen for MSCs, while maintaining or even promoting their osteogenic, chondrogenic and adipogenic differentiation potential. As there are currently different contradictory information present in literature about the applied bFGF concentration and the explicit effect of bFGF on ASC differentiation, here, the effect of bFGF on hASC proliferation and differentiation capacity was investigated at different concentrations and time points in 2D culture. Preculture of hASCs with bFGF prior to adipogenic induction showed a remarkable effect, whereas administration of bFGF during culture did not improve adipogenic differentiation capacity. Furthermore, the observations indicated as mode of action an impact of this preculture on cell proliferation capacity, resulting in increased cellular density at the time of adipogenic induction. The difference in cell density at this time point appeared to be pivotal for increased adipogenic capacity of the cells, which was confirmed in a further experiment employing different seeding densities. Interestingly, furthermore, the obtained results suggested a cell-cell contact-mediated mechanism positively influencing adipogenic differentiation. As a consequence, subsequently, studies were conducted focusing on intercellular communication of these cells, which has hardly been investigated to date. Despite the multitude of literature on the differentiation capacity of ASCs, little is reported about the physiological properties contributing to and controlling the process of lineage differentiation. Direct intercellular communication between adjacent cells via gap junctions has been shown to modulate differentiation processes in other cell types, with connexin 43 (Cx43) being the most abundant isoform of the gap junction-forming connexins. Thus, in the present study we focused on the expression of Cx43 and gap junctional intercellular communication (GJIC) in hASCs, and its significance for adipogenic differentiation of these cells. Cx43 expression in hASCs was demonstrated histologically and on the gene and protein expression level and was shown to be greatly positively influenced by cell seeding density. Functionality of gap junctions was proven by dye transfer analysis in growth medium. Adipogenic differentiation of hASCs was shown to be also distinctly elevated at higher cell seeding densities. Inhibition of GJIC by 18α-glycyrrhetinic acid significantly compromised adipogenic differentiation, as demonstrated by histology, triglyceride quantification, and adipogenic marker gene expression. Flow cytometry analysis showed a lower proportion of cells undergoing adipogenesis when GJIC was inhibited, further indicating the importance of GJIC in the differentiation process. Altogether, these results demonstrate the impact of direct cell-cell communication via gap junctions on the adipogenic differentiation process of hASCs and may contribute to further integrate direct intercellular crosstalk in rationales for tissue engineering approaches. N2 - In der rekonstruktiven und plastischen Chirurgie besteht ein wachsender Bedarf an adäquaten Gewebetransplantaten, da die derzeit verfügbaren Strategien für autologe Transplantationen von Geweben durch Komplikationen wie beispielsweise Transplantatversagen sowie Morbiditäten an der Entnahmestelle beeinträchtigt werden. Das Tissue Engineering kann dieser Problematik jedoch durch die Entwicklung von in vitro und in vivo gezüchtetem, autologen Gewebeersatz für defekte Gewebestellen begegnen, wobei es dabei noch mehrere Hindernisse zu überwinden gilt. Eine der größten Limitationen ist die ausreichende Vaskularisierung der in vitro hergestellten, großen Konstrukte, welche für die Funktion des Gewebes entscheidend ist. Hierfür können dezellularisierte, jejunale Segmente ein geeignetes Gerüstsystem darstellen, deren bereits vorhandene Kapillarstrukturen mit humanen, mikrovaskulären Endothelzellen (hMVECs) und deren luminale Matrix mit humanen Stammzellen aus dem Fettgewebe (hASCs), mit anschließender adipogen Differenzierung, besiedelt werden können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden diese Konstrukte mit Hilfe eines maßgeschneiderten Bioreaktorsystems kultiviert und die Kokultur der Zellen in der jejunalen Matrix hinsichtlich der Fettgewebeentwicklung untersucht. Im Gegensatz zu nicht-induzierten Kontrollen wurde nach adipogener Induktion innerhalb des jejunalen Lumens eine substanzielle Fettgewebebildung der hASCs, sowie ein Anstieg wichtiger adipogener Marker im zeitlichen Verlauf nachgewiesen. Die Bildung wesentlicher extrazellulärer Matrixkomponenten des reifen Fettgewebes, wie beispielsweise Laminin und Kollagen IV, wurde innerhalb der Matrix bei induzierten Proben ebenso beobachtet. Die erfolgreiche Neubesiedlung des Gefäßnetzes mit hMVECs konnte in der Langzeitkultur gezeigt und eine Kolokalisation von Gefäßstrukturen und differenzierten hASCs beobachtet werden. Somit stellen diese Ergebnisse einen vielversprechenden, neuen Ansatz für die in vitro Entwicklung von vaskularisierten Fettgewebekonstrukten dar, welcher jedoch noch weitere Untersuchungen in präklinischen Studien erfordert. Eine weitere Limitation in der Entwicklung von Fettgewebe ist das unzureichende Wissen über die verwendeten Zellen – so zum Beispiel wie Zellen optimal expandiert und differenziert werden können, um einen Gewebeersatz erfolgreich herzustellen. Auch wenn hASCs leicht aus abdominalen Liposuktionen, welche zu einer relativ geringen Morbidität an der Entnahmestelle führen, isoliert werden können, ist eine sehr große Anzahl an Zellen erforderlich, um komplexe und große 3D-Matrizes vollständig mit Zellen zu besiedeln. So müssen Zellen in vitro im großen Maßstab expandiert werden, wobei auf die Erhaltung ihrer Differenzierungskapazität und die Vermeidung des replikativen Alterns geachtet werden muss. Da viele der entwickelten Konstrukte des Weiteren ein inhomogenes Differenzierungsmuster aufweisen, ist eine Verbesserung der adipogenen Differenzierung von ASCs im Rahmen von Tissue Engineering Ansätzen wünschenswert. Für mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurde bereits gezeigt, dass die Anwendung von Wachstumsfaktoren zu einer deutlichen Verbesserung der Proliferations- und Differenzierungskapazität führen kann. Insbesondere der Wachstumsfaktor bFGF (basic fibroblast growth factor) stellt ein starkes Mitogen für MSCs dar, wobei er das osteogene, chondrogene und adipogene Differenzierungspotenzial der Zellen aufrechterhält und sogar fördert. Da es in der Literatur derzeit unterschiedliche und teilweise widersprüchliche Informationen über die verwendeten bFGF Konzentrationen und den expliziten Effekt von bFGF auf die Differenzierung von ASCs gibt, wurde der Effekt von bFGF auf die Proliferations- und Differenzierungsfähigkeit mit unterschiedlichen Konzentrationen und zu unterschiedlichen Zeitpunkten in der 2D Kultur untersucht. Die Vorkultur der hASCs mit bFGF vor der adipogenen Induktion hatte einen beachtlichen Effekt auf die Differenzierung, während die Verabreichung von bFGF während der Kultur, die adipogene Differenzierungsfähigkeit der Zellen nicht verbesserte. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse einen Einfluss der Vorkultur auf die Zellproliferation, was zu einer erhöhten Zelldichte zum Zeitpunkt der adipogenen Induktion führte. Der Unterschied in der Zelldichte zu diesem Zeitpunkt schien entscheidend für die gesteigerte Differenzierungskapazität der Zellen zu sein, was sich in einem weiteren Experiment mit unterschiedlichen Aussaatdichten bestätigte. Interessanterweise deuteten die Ergebnisse außerdem darauf hin, dass ein Zell-Zell-Kontakt-vermittelter Mechanismus die adipogene Differenzierung positiv beeinflusst. Daher wurden anschließend Untersuchungen zur interzellulären Kommunikation dieser Zellen durchgeführt, welche bisher kaum erforscht wurde. Trotz der Vielzahl an Literatur über die Differenzierungsfähigkeit von ASCs ist wenig über die physiologischen Prozesse bekannt, die zur Differenzierung in verschiedene Zelltypen beitragen und diese kontrollieren. So wurde gezeigt, dass die direkte interzelluläre Kommunikation zwischen benachbarten Zellen über Gap Junctions Differenzierungsprozesse moduliert. Connexin 43 (Cx43) stellt dabei die häufigste Isoform der Gap Junction-bildenden Connexine dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression von Cx43 und die interzelluläre Kommunikation durch Gap Junctions (gap junctional intercellular communication; GJIC) in hASCs, sowie ihre Bedeutung für die adipogene Differenzierung untersucht. Die Cx43 Expression in hASCs wurde histologisch und auf Gen- und Proteinexpressionsebene nachgewiesen und wurde durch die Zellaussaatdichte nachweislich stark beeinflusst. Die Funktionalität der Gap Junctions konnte mit Hilfe eines Assays zur Übertragung von Farbstoffen untersucht werden. Es zeigte sich hierbei eine zelldichteabhängige, adipogene Differenzierungkapazität der hASCs. Die Hemmung der GJIC durch 18α-Glycyrrhetinsäure beeinträchtigte die adipogene Differenzierung deutlich, wie sich durch die Histologie, die Triglyceridquantifizierung und die adipogene Markergenexpression beobachten ließ. Bei Hemmung der GJIC zeigte sich mit Hilfe der Durchflusszytometrie, dass weniger Zellen adipogen differenzieren konnten, was die Bedeutung von GJIC im Differenzierungsprozess hervorhebt. Zusammenfassend veranschaulichen diese Ergebnisse den Einfluss direkter Zell-Zell-Kommunikation über Gap Junctions auf den adipogenen Differenzierungsprozess von hASCs und könnten somit in Zukunft dazu beitragen, direkte interzelluläre Kommunikation in Tissue Engineering Ansätze zu integrieren. KW - Tissue Engineering KW - Fettgewebe KW - Gap Junction KW - Adipose Tissue Engineering Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185005 ER - TY - THES A1 - Weyhmüller Reboredo, Jenny T1 - Tissue Engineering eines Meniskus - Vom Biomaterial zum Implantat T1 - Tissue Engineering of a meniscus - from a biomaterial to the implant N2 - Der Meniskus, ein scheibenförmiger Faserknorpel, spielt im Kniegelenk eine bedeutende Rolle, weil er Kräfte und Druck im Kniegelenk gleichmäßig verteilt, Stöße dämpft sowie der Kraftübertragung und Stabilisierung dient. Durch die Entfernung des Gewebes, der sogenannten Totalmeniskektomie, nach einer Meniskusverletzung oder einem Riss, verändern sich die mechanischen Eigenschaften des Gelenks stark und verursachen durch die erhöhte Belastung der Gelenkflächen Arthrose. Arthrose ist weltweit die Häufigste aller Gelenkerkrankungen. Der Erhalt der körperlichen Leistungsfähigkeit und Mobilität bis ins hohe Alter sowie die Bewahrung der Gesundheit von Herz-Kreislauf- und Stoffwechselorganen zählen aufgrund des demografischen Wandels zu den großen medizinischen Herausforderungen. Die Erkrankung des muskuloskelettalen Systems stellte 2010 im Bundesgebiet die am häufigsten vorkommende Krankheitsart dar. Während Risse in den äußeren Teilen des Meniskus aufgrund des Anschlusses an das Blutgefäßsystem spontan heilen können, können sie dies in tieferen Zonen nicht. Durch die begrenzte Heilungsfähigkeit des Knorpels bleibt langfristig der Einsatz eines Ersatzgewebes die einzige therapeutische Alternative. In der vorliegenden Arbeit wurde als therapeutische Alternative erfolgreich ein vaskularisiertes Meniskusersatzgewebe mit Methoden des Tissue Engineering entwickelt. Es soll in Zukunft als Implantat Verwendung finden. Tissue Engineering ist ein interdisziplinäres Forschungsfeld, in dem Gewebe außerhalb des Körpers generiert werden. Schlüsselkomponenten sind Zellen, die aus einem Organismus isoliert werden, und Trägerstrukturen, die mit Zellen besiedelt werden. Die Biomaterialien geben den Zellen eine geeignete Umgebung, die die Extrazelluläre Matrix (EZM) ersetzen soll, um die Funktion der Zellen beizubehalten, eigene Matrix zu bilden. Zum Erhalt eines funktionelles Gewebes werden oftmals dynamische Kultursysteme, sogenannte Bioreaktoren, verwendet, die natürliche Stimuli wie beispielsweise den Blutfluss oder mechanische Kompressionskräfte während der in vitro Reifungsphase des Gewebes, zur Verfügung stellen. Das Gewebekonstrukt wurde auf Basis natürlicher Biomaterialien aufgebaut, unter Verwendung ausschließlich primärer Zellen, die später direkt vom Patienten gewonnen werden können und damit Abstoßungsreaktionen auszuschließen sind. Da der Meniskus teilvaskularisiert ist und die in vivo Situation des Gewebes bestmöglich nachgebaut werden sollte, wurden Konstrukte mit mehreren Zelltypen, sogenannte Ko-Kulturen aufgebaut. Neben mikrovaskulären Endothelzellen (mvEZ) und Meniskuszellen (MZ) erfolgten Versuche mit mesenchymalen Stammzellen (MSZ). Zur Bereitstellung einer zelltypspezifischen Matrixumgebung, diente den mvEZ ein Stück Schweinedarm mit azellularisierten Gefäßstrukturen (BioVaSc®) und den MZ diente eine geeig- nete Kollagenmatrix (Kollagen Typ I Hydrogel). Die Validierung und Charakterisierung des aufgebauten 3D Meniskuskonstrukts, welches in einem dynamischen Perfusions-Bioreaktorsystem kultiviert wurde, erfolgte mit knorpeltypischen Matrixmarkern wie Aggrekan, Kollagen Typ I, II und X sowie mit den Transkriptionsfaktoren RunX2 und Sox9, die in der Knorpelentstehung von großer Bedeutung sind. Zusätzlich erfolgten Auswertungen mit endothelzellspezifischen Markern wie vWF, CD31 und VEGF, um die Vaskularisierung im Konstrukt nachzuweisen. Analysiert wurden auch die Zellvitalitäten in den Konstrukten. Aufgrund einer nur geringen Verfügbarkeit von MZ wurden Kulturansätze mit alternativen Zellquellen, den MSZ, durchgeführt. Dafür erfolgte zunächst deren Isolation und Charakterisierung und die Auswahl einer geeigneten 3D Kollagenmatrix. Die beste Zellintegration der MSZ konnte auf einer eigens hergestellten elektrogesponnenen Matrix beobachtet werden. Die Matrix besteht aus zwei unterschiedlichen Kollagentypen, die auf insgesamt fünf Schichten verteilt sind. Die Fasern besitzen weiter unterschiedliche Ausrichtungen. Während die Kollagen Typ I Fasern in den äußeren Schichten keiner Ausrichtung zugehören, liegen die Kollagen Typ II Fasern in der mittleren Schicht parallel zueinander. Der native Meniskus war für den Aufbau einer solchen Kollagen-Trägerstruktur das natürliche Vorbild, das imitiert werden sollte. Nach der Besiedelung der Matrix mit MSZ, konnte eine Integration der Zellen bereits nach vier Tagen bis in die Mittelschicht sowie eine spontane chondrogene Differenzierung nach einer insgesamt dreiwöchigen Kultivierung gezeigt werden. Das Biomaterial stellt in Hinblick auf die Differenzierung der Zellen ohne die Zugabe von Wachstumsfaktoren eine relevante Bedeutung für klinische Studien dar. Zur Kultivierung des 3D Meniskuskonstrukts wurde ein Bioreaktor entwickelt. Mit diesem können neben Perfusion der Gefäßsysteme zusätzlich Kompressionskräfte sowie Scherspannungen auf das Ersatzgewebe appliziert und die Differenzierung von MZ bzw. MSZ während der in vitro Kultur über mechanische Reize stimuliert werden. Ein anderes Anwendungsfeld für den neuartigen Bioreaktor ist seine Verwendung als Prüftestsystem für die Optimierung und Qualitätssicherung von Gewebekonstrukten. N2 - The meniscus, a disk-shaped fibrous cartilage, plays an important role in the equal distribution of pressure, shock absorption, power transmission and stability within the knee joint. After a meniscus injury or a meniscus tear, a total meniscectomy is done where the complete tissue is removed. This leads to a change of mechanical properties in the joint and causes arthrosis by an increased strain on the joint surfaces. Wordwide arthrosis is the most frequent of all joint diseases. Due to the demographic change, maintaining physical fitness and mobility up to an old age are the main challenges besides ensuring health of the heart and circulatory system and of the metabolic organs. Musculoskeletal disorders represented the most frequent type of disease in Germany in 2010. While tears in the outer zone of the meniscus heal spontaneously because of its connection to the blood vessel system, tears in the deeper zones do not heal. Due to the limited healing capacity of cartilage the use of a replacement tissue is the only therapeutic alternative in the long run. In the present work a vascularized meniscus construct as therapeutic alternatives has been developed with the Tissue Engineering method for the further use as an implant. Tissue En- gineering is an interdisciplinary research field to generate tissues outside the body. The key components are isolated cells from an organism, and scaffolds, which are seeded with cells. Biomaterials provide a suitable environment that replaces the extracellular matrix (ECM) to maintain cell functionality to let cells build up their own matrix. To maintain a functional tissue during in vitro dynamic culture, bioreactor systems are used to provide natural stimuli such as blood flow or mechanical compression forces. The tissue construct is based on natural biomaterials and solely on primary cells, which later can be isolated directly from the patient and thereby exclude repulsion reactions. Due to its limited vascularity of the meniscus and the aim to build up at its best the in vivo situation more than one cell type is used to generate constructs, so called co-culture systems. Mesen- chymal stem cells (MSZ) besides microvascular endothelial cells (mvEZ) and meniscus cells (MZ) were used in the experiments. To supply a cell type specific matrix environment, a segment of a porcine jejunum with decellularized vascular structures (BioVaSc®) for the mvEZ and a collagen based matrix (collagen type I hydrogel) for the MZ were employed. The validation and characterization of the de- veloped 3D meniscus construct, that was cultured in a dynamic perfusion bioreactor system, was performed by using cartilage matrix specific markers, such as aggrecan, collagen type I, II and X, as well as the transcription factors RunX2 and Sox9 that are of major importance for cartilage development. Further analysis with endothelial cell specific markers, such as vWF, CD31 and VEGF were performed to evaluate the vascularization of the construct. Furthermore, cell vitality tests of the construct were made. Because of the limited availability of primary MZ, culture approaches with MSZ as an alter- native cell source were investigated. Cell isolation and characterization were performed and a suitable 3D collagen matrix was selected. The best cell integration of the MSZ could be observed on a specifically engineered electrospun matrix. The matrix consists of two different collagen types that are arranged in a total of five layers. The fibers are further orientated in different directions. While outer layers consist of randomly-aligned collagen type I fibers, the collagen type II fibers in the middle layer are aligned parallel to each other. The native meniscus tissue serves as natural example and its structure is replicated in such a collagen scaffold. After seeding the scaffold with MSZ, cell integration into the middle layer could be observed after four days, as well as a spontanous chondrogenic differentation after three weeks of culture. The biomaterial developed in this work has to be considered as relevant for clinical studies with regard to cell differentiation without adding growth factors to the culture. For the culture of 3D meniscus construct a bioreactor was successfully developed, that can apply compressive strength and shear stress to the tissue model in addition to perfusing the vascular system. With these measures the differentiation of MZ or MSZ could be induced with mechanical strains during the in vitro culture. Another field of application for the new bioreactor is its use as a test system for the optimization and quality control of the tissue models. KW - Tissue Engineering KW - Meniskustransplantation KW - Bioreaktor KW - Gewebekultur KW - Biomaterial KW - Elektrospinning KW - Implantatentwicklung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108477 ER - TY - THES A1 - Weigel [geb. Schneider], Verena T1 - Entwicklung eines \(in\) \(vitro\) Modells für Verbrennungen ersten Grades zur Testung einer zellbasierten Wundauflage T1 - Development of an \(in\) \(vitro\) model for first degree burn wounds to test a cell based wound dressing N2 - Mit jährlich circa 11 Millionen Fällen weltweit, stellen schwere Brandwunden bis heute einen großen Anteil an Verletzungen dar, die in Kliniken behandelt werden müssen. Während leichte Verbrennungen meist problemlos heilen, bedarf die Behandlung tieferer Verbrennungen medizinischer Intervention. Zellbasierte Therapeutika zeigen hier bereits große Erfolge, aufgrund der eingeschränkten Übertragbarkeit von Ergebnissen aus Tiermodellen ist jedoch sowohl die Testung neuer Produkte, als auch die Erforschung der Wundheilung bei Brandwunden noch immer schwierig. Aufgrund dessen wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt: Die Etablierung von Methoden, um ein zellbasiertes Therapeutikum produzieren zu können und die Entwicklung eines Modells zur Untersuchung von Verbrennungswunden. Zunächst wurden hierfür die Kulturbedingungen und -protokolle zur Isolation und Expansion von Keratinozyten so angepasst, dass sie gängigen Regularien zur Produktion medizinischer Produkte entsprechen. Hier zeigten die Zellen auch in anschließenden Analysen, dass charakteristische Merkmale nicht verloren hatten. Darüber hinaus gelang es, die Zellen mithilfe verschiedener protektiver Substanzen erfolgreich einzufrieren und zu konservieren. Des Weiteren konnte ein Modell etabliert werden, das eine Verbrennung ersten Grades widerspiegelt. Über einen Zeitraum von zwei Wochen wurde seine Regeneration hinsichtlich verschiedener Aspekte, wie der Histomorphologie, dem Metabolismus und der Reepithelialisierungsrate, untersucht. Die Modelle zeigten hier viele Parallelen zur Wundheilung in vivo auf. Um die Eignung der Modelle zur Testung von Wirkstoffen zu ermitteln wurde außerdem eine Behandlung mit 5% Dexpanthenol getestet. Sie resultierte in einer verbesserten Histomorphologie und einer erhöhten Anzahl an proliferativen Zellen in den Modellen, beschleunigte jedoch die Reepithelialisierung nicht. Zusammengefasst konnten in dieser Arbeit zunächst Methoden etabliert werden, um ein medizinisches Produkt aus Keratinozyten herzustellen und zu charakterisieren. Außerdem wurde ein Modell entwickelt, anhand dessen die Wundheilung und Behandlung von Verbrennungen ersten Grades untersucht werden kann und welches als Basis zur Entwicklung von Modellen von tieferen Verbrennungen dienen kann. N2 - With approximately 11 million cases annually worldwide, severe burns still represent a large proportion of injuries requiring hospital treatment. While minor burns usually heal without problems, the treatment of deeper burns requires medical intervention. Cell-based therapeutics have already shown great success in this area, but due to the limited transferability of results from animal models, both the testing of new products and research into wound healing in burn wounds is still difficult. Due to this, two objectives were pursued in this work: The establishment of methods to enable the production of a cell-based therapeutic and the development of a model to study burn wounds. First, the culture conditions and protocols for the isolation and expansion of keratinocytes were adapted to meet common regulations for the production of medical products. The cells showed in subsequent analyses that characteristic features had not been lost. In addition, the cells were successfully frozen and preserved with the use of different protective substances. Furthermore, it was possible to establish a model that reflects a first-degree burn wound. Over a period of two weeks, the regeneration of the models was investigated with regard to various aspects, such as histomorphology, metabolism and the rate of reepithelialization. Here, the models showed many parallels to wound healing in vivo. In addition, to determine the suitability of the models for testing active ingredients, a treatment with 5% dexpanthenol was tested. It resulted in an improved histomorphology and increased numbers of proliferative cells in the models, but did not accelerate overall reepithelialization. In summary, this work initially established methods to produce and characterize a medical product from keratinocytes. In addition, an in vitro model was developed that can be used to study wound healing and treatment of first-degree burns and can serve as a basis for developing models of deeper burns. KW - Tissue Engineering KW - In-vitro-Kultur KW - Wundheilung KW - Hautverbrennung KW - Kryokonservierung KW - skin equivalent KW - in vitro model KW - burn wound KW - wound healing KW - cryokonservation Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-261514 ER - TY - THES A1 - Wallstabe, Julia T1 - Induktion von GvHD-artigen Gewebeschäden an humanen artifiziellen Hautmodellen T1 - Induction of GvHD-like tissue damage in human artificial skin models N2 - Graft-versus-Host Disease (GvHD) stellt einen häufigen, den Gesamterfolg einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation limitierenden Faktor dar. Bei dieser Komplikation attackieren vor allem alloreaktive T-Lymphozyten des Stammzellspenders gesunde Körperzellen des Patienten. Infolgedessen kommt es zu Gewebeschäden in den Zielorganen Haut, Leber und Darm. Die Behandlung der GvHD erfordert eine effektive Immunsuppression, was wiederum Graft-versusTumor-Effekte kompromittiert und den Rückfall der malignen Grunderkrankung bedingen kann. Viele Patienten sprechen aus bisher ungeklärten Gründen nicht auf die klassische immunsuppressive Therapie mit Steroiden oder second-line Therapien an. Neue zelluläre Therapien zur Behandlung der refraktären GvHD sind auf dem Vormarsch, bedürfen aber einer weiterführenden klinischen Testung, auch um die exakten Wirkungsmechanismen zu verstehen. Idealerweise könnten neue Testsysteme das GvHD-Potential von allogenen Stammzellpräparaten oder aber das immunsuppressive Potential von neuen GvHD-Therapien vorhersagen, bevor diese in klinischen Studien eingesetzt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein erstes, in multiplen Replikaten einsetzbares, humanes organotypisches Gewebemodell zur Simulation einer GvHD-Reaktion am Beispiel der Haut zu etablieren. Zu diesem Zweck wurden artifizielle humane Hautmodelle unter statischen (KollagenHautmodelle) und dynamischen Kulturbedingungen (vaskularisierte Hautmodelle) generiert. Die Injektion unstimulierter PBMCs (engl. peripheral blood mononuclear cells) führte zu keinen histomorphologischen Veränderungen in den KollagenHautmodellen. Im Gegensatz dazu hatte die Injektion vorstimulierter allogener PBMCs eine Zerstörung der epidermalen Strukturen der Kollagen-Hautmodelle zur Folge, welche vergleichbar waren mit Gewebeschäden bei einer akuten GvHD der Haut. Dieselben Schädigungen der Epidermis wurden durch die Injektion von Mediumüberständen vorstimulierter PBMCs in die Kollagen-Hautmodelle erreicht. Im Kulturmedium der Kollagen-Hautmodelle wurden hohe Konzentrationen von Interleukin 2 und 17, Interferon gamma sowie Tumornekrosefaktor alpha gemessen, wodurch auf die Beteiligung von Zytokinen an der inflammatorischen Reaktion geschlossen werden konnte. Auch im komplexeren vaskularisierten Hautmodell verursachte die Injektion vorstimulierter PBMCs histomorphologische Veränderungen entsprechend einer akuten Haut-GvHD sowie einen zeitabhängigen Anstieg proinflammatorischer Zytokine. Zusammenfassend zeigen die Resultate dieser Arbeit, dass die Induktion einer starken Inflammations- und Immunreaktion in artifiziellen humanen Hautmodellen, welche histomorphologisch eine GvHD imitiert, möglich ist. Dieses Modell könnte als Grundlage für die Entwicklung eines klinisch relevanten Testsystems zur Bestimmung des GvHD-Restpotentials oder zur Festlegung der immunsuppressiven Kapazität innovativer Zellpräparate dienen. Somit könnten humane artifizielle GvHDModelle in klinischen Studien eingesetzt werden und die Erfahrungen aus Tiermodellen ergänzen sowie erste in vitro Ergebnisse im humanen System liefern, welche dann mit dem tatsächlichen klinischen Resultat verglichen werden könnten. N2 - Graft-versus-Host Disease (GvHD) remains the most important limiting factor for the success of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. This major complication is caused by alloreactive donor T-lymphocytes that attack healthy tissues of the recipient leading to severe tissue damage within the target organs skin, liver and gut. Treatment of GvHD requires effective immunosuppression, which in turn impairs Graft-versus-Tumor activity and enhances the risk for relapse of the malignant disease. However, for still unknown reasons many patients do not respond to standard immunosuppressive therapy with steroids or to second-line therapies. Development of novel cellular therapies that gain more and more clinical relevance due to their high anti-tumor potency lead to a strong demand for advanced test platforms to further investigate their underlying functional mechanisms and exclude off-tumor effects against healthy tissues. Ideally, new test systems could be used for the prediction of the GvHD potential of allogeneic stem cell products or for prediction of an immunosuppressive potential of novel GvHD therapies before entering clinical studies. The aim of this study was to establish a GvHD test system based on human organotypic skin models allowing the simulation of GvHD reactions in the skin in multiple replicates. To this end, artificial human skin models were generated under static (collagen skin model) and dynamic culture conditions (vascularized skin model). Injection of unstimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) did not cause histomorphological changes in collagen skin models. In contrast, injection of prestimulated PBMCs resulted in disruption of the epidermis of collagen skin models mimicking acute skin GvHD. The same disruption of the epidermal layer was observed using cell culture supernatants of prestimulated PBMCs, suggesting the involvement of proinflammatory cytokines. Indeed, measurement of cytokine levels in culture supernatants revealed an increase of interleukin 2 and 17, interferon gamma and tumor necrosis factor alpha. In addition, injection of prestimulated PBMCs into more complex vascularized skin models also caused disruption of the epidermal layer and an increase of proinflammatory cytokine levels in a time dependent manner. Taken together, these findings demonstrate that it is possible to induce a strong immune reaction and inflammatory tissue damage in artificial human skin models mimicking histomorphological patterns of acute skin GvHD. Therefore, this model could contribute to the development of a clinically relevant GvHD test platform for prediction of the GvHD potential or immunosuppressive capacity of innovative cell products. Thus, artificial human GvHD models may be employed in clinical studies in order to gain first in vitro results in a human system and to extend information from animal models, which can then be compared to the actual clinical outcome. KW - Graft-versus-host-disease KW - Tissue Engineering KW - inflammatorische Gewebeschäden KW - artifizielle Hautmodelle Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153966 ER - TY - THES A1 - Schürlein, Sebastian T1 - Entwicklung von Technologien zur Optimierung von Tissue Engineering Prozessen am Beispiel der Herstellung von kardialem Gewebe T1 - Development of technologies to optimize tissue engineering processes, documented on the example of the generation of cardiac tissue N2 - Kardiovaskuläre Erkrankungen, wie beispielsweise der Herzinfarkt, sind die häufigste Todesursache weltweit. Bei einem Herzinfarkt sterben Areale des Herzens aufgrund einer Unterversorgung mit Blut ab. Da das Herzmuskelgewebe ein sogenanntes terminal differenziertes Gewebe ist, kommt es zu keiner Regeneration des Gewebes, mit der Folge einer Herzinsuffizienz beziehungsweise dem Tod des Patienten. Eine alternative Behandlungsmöglichkeit zu einer Herztransplantation stellt das Tissue Engineering dar. Mit Hilfe des Tissue Engineerings können dreidimensionale Gewebe aufgebaut und kultiviert werden, um auf diese Weise ein funktionelles Gewebe zu erhalten, durch welches das abgestorbene Gewebeareal des Herzens zukünftig auch ersetzt werden könnte. In der vorliegenden Arbeit wurden notwendige Technologien für den Aufbau von Geweben entwickelt sowie erste Versuche für die Erzeugung eines funktionellen Herzmuskelgewebes durchgeführt. Beim Aufbau von dreidimensionalen Geweben finden Trägerstrukturen Anwendung, die mit Zellen besiedelt werden. Solche Trägerstrukturen können aus biologischen oder synthetischen Polymeren hergestellt sein oder aus der extrazellulären Matrix eines dezellularisierten Gewebes bestehen. Für eine standardisierte Dezellularisierung von Geweben wurde eine computergesteuerte Pumpeneinheit, für die Herstellung von Nanofaserscaffolds eine Elektrospinninganlage entwickelt. Mit Hilfe der Dezellularisierungseinheit können komplexe Organe, wie ein Herz im Ganzen, reproduzierbar dezellularisiert werden. Untersuchungen der mittels Elektrospinning hergestellten Nanofaserscaffolds, welche als Alternative zu der dezellularisierten, natürlichen Matrix eingesetzt werden können, zeigten bei allen hergestellten Zusammensetzungen eine Orientierung der Zellen entlang der Fasern. Die Kultivierung von Zellmatrixkonstrukten erfolgt im Tissue Engineering häufig unter dynamischen Bedingungen. Hierfür wurde ein mobiler Stand Alone Inkubator mit der erforderlichen Peripherie für eine Kultur unter Perfusion des Gewebes entwickelt. Als Weiterentwicklung des Stand Alone Inkubators ist eine modulare Bioreaktorplattform, bestehend aus Wärmetauscher, Beutelpumpe und Gasaustauscher, aufgebaut worden. In dieses System kann über Standard Anschlüsse jegliche Art von Bioreaktor in das System eingebunden werden. Durch die Kompaktheit des Systems ist es möglich mehrere Ansätze parallel auf engem Raum durchzuführen. Die Funktion der Plattform, wurde in der vorliegenden Arbeit durch die Gewebekultur einer nativen porzinen Karotis nachgewiesen. Für den Aufbau des kardialen Gewebes dient die small intestinal submucosa ohne Serosa (SISser) als Trägerstruktur. Der Aufbau des Gewebekonstrukts erfolgte in verschiedenen Ansätzen unter Einsatz verschiedener Zellarten. Native, aus Herzbiopsien generierte Cardiosphere derived cells (CDCs) verteilten sich gleichmäßige über die Oberfläche der Matrix, jedoch konnten immunhistologisch keine spezifischen kardialen Marker bei den artifiziellen Geweben nachgewiesen werden. Zellmatrixkonstrukte aus einer Mono Kultur von Kardiomyozyten, differenziert aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS Zellen) sowie einer Co Kultur dieser Kardiomyozyten mit mesenchymalen Stammzellen und Zellen aus einer Herzbiopsie zeigten nach wenigen Tagen in Kultur ein kontraktiles Verhalten. Immunhistologische Färbungen der beiden Gewebe bestätigten die Expression der spezifischen kardialen Marker, wie beispielsweise kardiales Troponin T, kardiales Troponin C und alpha Actinin. Die Kardiomyozyten der Mono Kultur sind jedoch nicht über die gesamte Matrixoberfläche verteilt, sondern bilden Aggregate. Bei der Co Kultur kann eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf der Matrix beobachtet werden. Der vielversprechendste Ansatz für den Aufbau eines Herzmuskelgewebes, welches als Implantat oder Testsystem eingesetzt werden kann, bildet nach den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen, ein Konstrukt aus der SISser und der Co Kultur der Zellen. Allerdings muss die Zusammensetzung der Co Kultur sowie das Verhältnis der Zellzahlen optimiert werden. N2 - Cardiovascular diseases as myocardial infarction are the most frequent cause of death worldwide. During a myocardial infarction, areas of the heart are being damaged because of an insufficient nutrient supply. Heart tissue is a terminal differentiated tissue, this means that it can’t be regenerated by itself. The consequence of this characteristic is a heart insufficiency or the death of the patient. An alternative treatment to heart transplantation is promised by tissue engineering. By using the methods of tissue engineering, cells can be cultured on a scaffold to generate a mature tissue, which can be used to replace the damaged areas of the heart. In the present work systems for the generation of tissues have been developed and first experiments to build up a functional cardiac patch were performed. To generate three-dimensional tissues, scaffolds colonized with cells are necessary. These scaffolds can be produced with biological or synthetic polymers or even decellularized tissues can be used. A computer controlled decellularization platform was designed to ensure a standardized, reproducible decellularization of complex organs like hearts. Furthermore, an electrospinning device was developed for the production of nanofiber scaffolds. On such matrices, seeded cells grow along the fibers. Most cell-matrix-constructs are cultured under dynamic conditions in tissue engineering. A stand alone incubator system containing the required periphery to apply different culture conditions was developed. As further development a compact modular bioreactor platform consisting of a heat exchanger, a bag pump and a gas exchanger was established. All kinds of bioreactors can be enclosed to the system via standard Luer Lock Connectors. Due to the compactness of the system, it is possible to parallelize and run experiments easily on narrow space. The functionality of the platform was demonstrated by a tissue culture of a native porcine carotid artery. The small intestinal submucosa without serosa (SISser) was employed as matrix for the development of a functional cardiac patch. In different experiments diverse cell types were used to generate a cardiac construct. Cardiosphere derived cells (CDC) seeded on the SISser showed an equal distribution all over the surface of the matrix, but no expression of specific cardiac markers. Constructs consisting of a mono culture of induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes (CM iPS cells) or a co culture of CM iPS cells, mesenchymal stem cells and cells isolated form a heart biopsy showed a contraction of the whole matrix after a few days in culture. Furthermore, cardiac markers like cardiac troponin T, cardiac troponin C and alpha actinin could be observed by immunohistological staining. Regarding the morphology of the different tissues, the mono culture of the CM iPS cells formed agglomerates on the surface of the matrix whereas the co culture showed a well distribution of the cells all over the surface of the matrix. Consequently, the co culture on the SISser is the most promising approach for the development of a functional cardiac patch. However, the combination of cell types within the co culture and their ratio has to be optimized. KW - Tissue Engineering KW - Herzmuskel KW - Bioreaktorplattform KW - Elektrospinning KW - kardiales Tissue Engineering KW - kardiales Gewebe KW - bioreactor plattform KW - electrospinning KW - cardiac tissue engineering KW - Biomaterial KW - Gewebekultur Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142432 ER - TY - THES A1 - Schweinlin, Matthias Oliver T1 - Development of advanced human intestinal in vitro models T1 - Entwicklung von erweiterten humanen intestinalen in vitro Modellen N2 - The main function of the small intestine is the absorption of essential nutrients, water and vitamins. Moreover, it constitutes a barrier protecting us from toxic xenobiotics and pathogens. For a better understanding of these processes, the development of intestinal in vitro models is of great interest to the study of pharmacological and pathological issues such as transport mechanisms and barrier function. Depending on the scientific questions, models of different complexity can be applied. In vitro Transwell® systems based on a porous PET-membrane enable the standardized study of transport mechanisms across the intestinal barrier as well as the investigation of the influence of target substances on barrier integrity. However, this artificial setup reflects only limited aspects of the physiology of the native small intestine and can pose an additional physical barrier. Hence, the applications of this model for tissue engineering are limited. Previously, tissue models based on a biological decellularized scaffold derived from porcine gut tissue were demonstrated to be a good alternative to the commonly used Transwell® system. This study showed that preserved biological extracellular matrix components like collagen and elastin provide a natural environment for the epithelial cells, promoting cell adhesion and growth. Intestinal epithelial cells such as Caco-2 cultured on such a scaffold showed a confluent, tight monolayer on the apical surface. Additionally, myofibroblasts were able to migrate into the scaffold supporting intestinal barrier formation. In this thesis, dendritic cells were additionally introduced to this model mimicking an important component of the immune system. This co-culture model was then successfully proven to be suitable for the screening of particle formulations developed as delivery system for cancer antigens in peroral vaccination studies. In particular, nanoparticles based on PLGA, PEG-PAGE-PLGA, Mannose-PEG-PAGE-PLGA and Chitosan were tested. Uptake studies revealed only slight differences in the transcellular transport rate among the different particles. Dendritic cells were shown to phagocytose the particles after they have passed the intestinal barrier. The particles demonstrated to be an effective carrier system to transport peptides across the intestinal barrier and therefore present a useful tool for the development of novel drugs. Furthermore, to mimic the complex structure and physiology of the gut including the presence of multiple different cell types, the Caco-2 cell line was replaced by primary intestinal cells to set up a de novo tissue model. To that end, intestinal crypts including undifferentiated stem cells and progenitor cells were isolated from human small intestinal tissue samples (jejunum) and expanded in vitro in organoid cultures. Cells were cultured on the decellularized porcine gut matrix in co-culture with intestinal myofibroblasts. These novel tissue models were maintained under either static or dynamic conditions. Primary intestinal epithelial cells formed a confluent monolayer including the major differentiated cell types positive for mucin (goblet cells), villin (enterocytes), chromogranin A (enteroendocrine cells) and lysozyme (paneth cells). Electron microscopy images depicted essential functional units of an intact epithelium, such as microvilli and tight junctions. FITC-dextran permeability and TEER measurements were used to assess tightness of the cell layer. Models showed characteristic transport activity for several reference substances. Mechanical stimulation of the cells by a dynamic culture system had a great impact on barrier integrity and transporter activity resulting in a tighter barrier and a higher efflux transporter activity. In Summary, the use of primary human intestinal cells combined with a biological decellularized scaffold offers a new and promising way to setup more physiological intestinal in vitro models. Maintenance of primary intestinal stem cells with their proliferation and differentiation potential together with adjusted culture protocols might help further improve the models. In particular, dynamic culture systems and co culture models proofed to be a first crucial steps towards a more physiological model. Such tissue models might be useful to improve the predictive power of in vitro models and in vitro in vivo correlation (IVIVC) studies. Moreover, these tissue models will be useful tools in preclinical studies to test pharmaceutical substances, probiotic active organisms, human pathogenic germs and could even be used to build up patient-specific tissue model for personalized medicine. N2 - Die Hauptfunktion des Dünndarms besteht in der Aufnahme von lebenswichtigen Nährstoffen, Wasser und Vitaminen. Zudem stellt er eine Barriere dar, die uns vor toxischen Fremdstoffen und Pathogenen schützt. Um diese Prozesse besser zu verstehen, ist die Entwicklung neuer in vitro Modellen des Darms von großem Interesse um pharmakologische und pathologische Studien durchzuführen. Abhängig von der wissenschaftlichen Fragestellung können Modelle von unterschiedlicher Komplexität zur Anwendung kommen. In vitro Transwell® Systeme basierend auf einer porösen PET-Membran ermöglichen die Untersuchung von Transportmechanismen über die intestinal Barriere und den Einfluss von Wirkstoffen auf deren Integrität. Dieser künstliche Aufbau ähnelt jedoch nur eingeschränkt der Physiologie des Dünndarms und kann eine zusätzliche physikalische Barriere darstellen. Die Anwendungsmöglichkeiten dieses Modells im Tissue Engineering sind daher begrenzt. Gewebemodelle basierend auf einer dezellularisierten biologischen Matrix hergestellt aus Schweinedarmgewebe haben sich als gute Alternative zum herkömmlichen Transwell® System herausgestellt. Diese Studie zeigt, dass die erhaltenen Komponenten der biologischen Extrazellulärmatrix wie Kollagen und Elastin eine natürliche Umgebung für die Epithelzellen bieten und Zelladhäsion und Wachstum der Zellen fördern. Darmepithelzellen wie Caco-2 Zellen, welche auf einer solchen Matrix kultiviert wurden, bildeten einen konfluenten, dichten Monolayer auf der apikalen Oberfläche aus. Zusätzlich ermöglichte dieser Aufbau die Migration von Myofibroblasten in die Matrix, was die Bildung der intestinalen Barriere unterstützt. In dieser Doktorarbeit wurden zusätzlich dendritische Zellen als wichtige Komponente des adaptiven Immunsystems in das Modell integriert. Dieses Ko-Kultur Modell erwies sich als geeignet um partikuläre Formulierungen zu testen, welche als Transportsysteme für Tumorantigene entwickelt wurden. Es wurden Partikel basierend auf PLGA, PEG-PAGE-PLGA, Mannose-PEG-PAGE-PLGA und Chitosan untersucht. Aufnahmestudien ergaben nur geringfügige Unterschiede in den Transportraten zwischen den verschiedenen Partikeln. Es konnte ausserdem gezeigt werden, dass dendritische Zellen die Partikel phagozytieren, nachdem sie die intestinale Barriere überwunden haben. Die Partikel erwiesen sich als effektives Transportsystem um Peptide über die intestinale Barriere zu schleusen und stellen daher ein nützliches Werkzeug für die Entwicklung neuartiger Medikamente dar. Um die komplexe Struktur und Physiologie des Darms noch besser nachzustellen, wurde für den Aufbau des Modells die Caco-2 Zelllinie durch primäre Darmzellen ersetzt. Die Darmkrypten, welche undifferenzierte Stammzellen und Vorläuferzellen enthalten, wurden aus humanen Dünndarmgewebe, dem Jejunum, isoliert und in vitro expandiert. Die Zellen wurden zusammen mit Myofibroblasten auf der dezellularisierten Schweinedarmmatrix, unter statischen und dynamischen Bedingungen, kultiviert. Die primären Darmepithelzellen bildeten einen konfluenten Monolayer, welcher alle differenzierten intestinalen Zelltypen aufwies, gezeigt durch Zellen positiv für Mucin (Becherzellen), Villin (Enterozyten), Chromogranin A (enteroendokrine Zellen) und Lysozym (Paneth-Zellen). Mit Hilfe von Elektronenmikroskopie ließen sich essentielle funktionelle Einheiten eines intakten Epithels darstellen, wie die Mikrovilli und Tight Junctions. Um die Dichtigkeit des Epithels zu überprüfen wurde mit FITC-Dextran die Permeabilität bestimmt und TEER-Messungen durchgeführt. Die Modelle zeigten einen charakteristischen Transport für mehrere Referenzsubstanzen. Mechanische Stimulation durch ein dynamisches Kultivierungssystem hatte einen starken Einfluss auf die Barriereintegrität und Transporteraktivität der Modelle, was sich in einer dichteren Barriere und erhöhten Efflux-Transporteraktivität widerspiegelte. Alles in allem bietet die Verwendung primärer intestinaler Zellen in Kombination mit einer dezellularisierten biologischen Matrix eine neue, vielversprechende Möglichkeit physiologischere in vitro Modelle des Darms aufzubauen. Der Erhalt intestinaler Stammzellen mit ihrem Proliferations- und Differenzierungspotential zusammen mit angepassten Protokollen könnte dabei helfen die Modelle weiter zu verbessern. Insbesondere die dynamische Kultivierung und die Ko-Kultur-Modelle erwiesen sich als entscheidender Schritt auf dem Weg zu physiologischeren Modellen. Solche Gewebemodelle könnten sich als nützlich erweisen, wenn es darum geht die Vorhersagekraft der in vitro Modelle, sowie die in vitro-in vivo Korrelation zu verbessern. Solche Gewebemodelle können ein nützliches Werkzeuge in der präklinischen Forschung für die Testung von pharmazeutischen Wirkstoffen, probiotisch aktiven Organismen, sowie humaner pathogener Keime sein und sogar zum Aufbau personalisierter Modelle für die regenerative Medizin dienen. KW - Tissue Engineering KW - in vitro KW - Dünndarm KW - intestinal in vitro model KW - intestine Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142571 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Stefanie T1 - Cartilage Tissue Engineering – Comparison of Articular Cartilage Progenitor Cells and Mesenchymal Stromal Cells in Agarose and Hyaluronic Acid-Based Hydrogels T1 - Tissue Engineering von Knorpel – Vergleich von Gelenkknorpel-Vorläuferzellen und mesenchymalen Stromazellen in Agarose- und Hyaluronsäure-basierten Hydrogelen N2 - Articular cartilage damage caused by sports accidents, trauma or gradual wear and tear can lead to degeneration and the development of osteoarthritis because cartilage tissue has only limited capacity for intrinsic healing. Osteoarthritis causes reduction of mobility and chronic pain and is one of the leading causes of disability in the elderly population. Current clinical treatment options can reduce pain and restore mobility for some time, but the formed repair tissue has mostly inferior functionality compared to healthy articular cartilage and does not last long-term. Articular cartilage tissue engineering is a promising approach for the improvement of the quality of cartilage repair tissue and regeneration. In this thesis, a promising new cell type for articular cartilage tissue engineering, the so-called articular cartilage progenitor cell (ACPC), was investigated for the first time in the two different hydrogels agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) in comparison to mesenchymal stromal cells (MSCs). In agarose, ACPCs´ and MSCs´ chondrogenic capacity was investigated under normoxic (21 % oxygen) and hypoxic (2 % oxygen) conditions in monoculture constructs and in zonally layered co-culture constructs with ACPCs in the upper layer and MSCs in the lower layer. In the newly developed hyaluronic acid (HA)-based hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G), chondrogenesis of ACPCs and MSCs was also evaluated in monoculture constructs and in zonally layered co-culture constructs like in agarose hydrogel. Additionally, the contribution of the bioactive molecule hyaluronic acid to chondrogenic gene expression of MSCs was investigated in 2D monolayer, 3D pellet and HA-SH hydrogel culture. It was shown that both ACPCs and MSCs could chondrogenically differentiate in agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels. In agarose hydrogel, ACPCs produced a more articular cartilage-like tissue than MSCs that contained more glycosaminoglycan (GAG), less type I collagen and only little alkaline phosphatase (ALP) activity. Hypoxic conditions did not increase extracellular matrix (ECM) production of ACPCs and MSCs significantly but improved the quality of the neo-cartilage tissue produced by MSCs. The creation of zonal agarose constructs with ACPCs in the upper layer and MSCs in the lower layer led to an ECM production in zonal hydrogels that lay in general in between the ECM production of non-zonal ACPC and MSC hydrogels. Even though zonal co-culture of ACPCs and MSCs did not increase ECM production, the two cell types influenced each other and, for example, modulated the staining intensities of type II and type I collagen in comparison to non-zonal constructs under normoxic and hypoxic conditions. In HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogel, MSCs produced more ECM than ACPCs, but the ECM was limited to the pericellular region for both cell types. Zonal HASH/P(AGE-co-G) hydrogels resulted in a native-like zonal distribution of ECM as MSCs in the lower zone produced more ECM than ACPCs in the upper zone. It appeared that chondrogenesis of ACPCs was supported by hydrogels without biological attachment sites such as agarose, and that chondrogenesis of MSCs benefited from hydrogels with biological cues like HA. As HA is an attractive material for cartilage tissue engineering, and the HA-based hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) appeared to be beneficial for MSC chondrogenic differentiation, the contribution of HA to chondrogenic gene expression of MSCs was investigated. An upregulation of chondrogenic gene expression was found in 2D monolayer and 3D pellet culture of MSCs in response to HA supplementation, while gene expression of osteogenic and adipogenic transcription factors was not upregulated. MSCs, encapsulated in a HA-based hydrogel, showed upregulation of gene expression for chondrogenic, osteogenic and adipogenic differentiation markers as well as for stemness markers. In a 3D bioprinting process, using the HA-based hydrogel, gene expression levels of MSCs mostly did not change. Nevertheless, expression of three tested genes (COL2A1, SOX2, CD168) was downregulated in printed in comparison to cast constructs, underscoring the importance of closely monitoring cellular behaviour during and after the printing process. In summary, it was confirmed that ACPCs are a promising cell source for articular cartilage engineering with advantages over MSCs when they were cultured in a suitable hydrogel like agarose. The performance of the cells was strongly dependent on the hydrogel environment they were cultured in. The different chondrogenic performance of ACPCs and MSCs in agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels highlighted the importance of choosing suitable hydrogels for the different cell types used in articular cartilage tissue engineering. Hydrogels with high polymer content, such as the investigated HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels, can limit ECM distribution to the pericellular area and should be developed further towards less polymer content, leading to more homogenous ECM distribution of the cultured cells. The influence of HA on chondrogenic gene expression and on the balance between differentiation and maintenance of stemness in MSCs was demonstrated. More studies should be performed in the future to further elucidate the signalling functions of HA and the effects of 3D bioprinting in HA-based hydrogels. Taken together, the results of this thesis expand the knowledge in the area of articular cartilage engineering with regard to the rational combination of cell types and hydrogel materials and open up new possible approaches to the regeneration of articular cartilage tissue. N2 - Gelenkknorpeldefekte, die durch Sportverletzungen, Unfälle oder graduelle Abnutzung ent-stehen, können zu Degeneration des Gewebes und zur Entstehung von Arthrose führen, da Knorpelgewebe nur über eine eingeschränkte Fähigkeit zur Selbstheilung verfügt. Arthrose reduziert die Beweglichkeit und verursacht chronische Schmerzen. Sie ist vor allem bei älte-ren Menschen einer der häufigsten Gründe für körperliche Behinderung. Die zurzeit verfüg-baren operativen Behandlungsmöglichkeiten können die Symptome meist für einige Zeit lindern, aber das dabei gebildete Ersatzgewebe zeigt meistens nur eingeschränkte Funktiona-lität im Vergleich zu natürlichem gesunden Knorpelgewebe und bleibt nur für eine begrenzte Zeit stabil. Tissue Engineering von Gelenkknorpelgewebe ist ein vielversprechender Ansatz, um die Qualität des Ersatzgewebes und der Knorpelregeneration zu verbessern. Diese Arbeit untersuchte einen neuen vielversprechenden Zelltyp für das Tissue Engineering von Knorpelgewebe, sogenannte Gelenkknorpel-Vorläuferzellen (ACPCs). Diese Zellen wurden erstmals in zwei verschiedenen Hydrogelen, Agarose und HA-SH/P(AGE-co-G), mit mesenchymalen Stromazellen (MSCs) verglichen. Die chondrogene Kapazität von ACPCs und MSCs in Agarose wurde unter normoxischen (21 % Sauerstoff) und hypoxischen (2 % Sauerstoff) Bedingungen in Monokultur und zonal geschichteter Kokultur untersucht. In den zonalen Kokulturen befanden sich ACPCs in einer oberen Schicht und MSCs in einer unte-ren Schicht. In dem neu entwickelten Hyaluronsäure (HA)-basierten Hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) wurde die chondrogene Differenzierung von ACPCs und MSCs ebenfalls in Monokultur und in zonal geschichteter Kokultur, wie im Agarose-Hydrogel, analysiert. Außerdem wurde der Beitrag des biologisch aktiven Moleküls Hyaluronsäure zur chondro-genen Genexpression von MSCs in 2D-, 3D-Pellet- und HA-SH-Hydrogel-Kulturen unter-sucht. Diese Arbeit zeigte, dass sowohl ACPCs als auch MSCs in Agarose- und HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogelen chondrogen differenzieren konnten. ACPCs produzierten im Agarose-Hydrogel ein Gewebe, das dem Gelenkknorpel ähnlicher war als das von MSCs produzierte Gewebe, da es mehr Glykosaminoglykane (GAG), weniger Typ I Kollagen und nur geringe Aktivität der Alkalinen Phosphatase (ALP) aufwies. Hypoxische Bedingungen konnten die Produktion von extrazellulärer Matrix (ECM) durch ACPCs und MSCs nicht erhöhen, aber sie verbesserten die Qualität des von MSCs produzierten Gewebes. Die Herstellung von zon-alen Agarose-Konstrukten mit ACPCs in der oberen Schicht und MSCs in der unteren Schicht führte zu einer ECM-Produktion in zonalen Hydrogelen, die im Allgemeinen zwi-schen der ECM-Produktion der ACPC-Monokultur und der MSC-Monokultur lag. Zonale Kokultur von ACPCs und MSCs führte zwar nicht zu einer erhöhten ECM-Produktion, al-lerdings beeinflussten die beiden Zelltypen sich gegenseitig und modulierten zum Beispiel die Intensitäten der Typ II und Typ I Kollagen Färbungen im Vergleich zu Monokulturen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen. Im HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogel produzierten die MSCs mehr ECM als die ACPCs, allerdings war die Verteilung der gebilde-ten ECM bei beiden Zelltypen auf den perizellulären Bereich beschränkt. Zonale HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogele führten zu einer zonalen Verteilung von ECM, die der natürli-chen Struktur von Gelenkknorpel ähnlich war, da die MSCs in der unteren Schicht mehr ECM produzierten als die ACPCs in der oberen Schicht. Anscheinend wurde die chondroge-ne Differenzierung von ACPCs von Hydrogelen unterstützt, die, so wie Agarose, keine bio-logischen Bindestellen aufwiesen, und die Chondrogenese von MSCs profitierte von Hydro-gelen mit biologischen Signalen wie HA. Da HA ein attraktives Material für Tissue Engineering von Knorpel darstellt und das HA-basierte Hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) anscheinend die chondrogene Differenzierung von MSCs begünstigte, wurde der Beitrag von HA zur chondrogenen Genexpression in MSCs untersucht. Eine Hochregulation der chondrogenen Genexpression ließ sich in 2D- und 3D-Pellet-Kulturen von MSCs als Reaktion auf HA beobachten, während die Genexpression von osteogenen oder adipogenen Transkriptionsfaktoren nicht hochreguliert wurde. Der Ein-schluss von MSCs in einem HA-basierten Hydrogel führte zu einer Erhöhung der Genex-pression von chondrogenen, osteogenen, adipogenen und Stemness-Markern. Ein 3D-Druck-Prozess mit dem HA-basierten Hydrogel veränderte die Genexpression von MSCs in den meisten Fällen nicht. Dennoch wurde die Expression von drei getesteten Genen (COL2A1, SOX2, CD168) in gedruckten im Vergleich zu gegossenen Konstrukten herunterreguliert. Dies unterstrich die Wichtigkeit einer genauen Kontrolle des Verhaltens der Zellen während und nach dem Druck-Prozess. Zusammenfassend ließen sich ACPCs als vielversprechender neuer Zelltyp für das Tissue Engineering von Gelenkknorpelgewebe bestätigen. ACPCs haben Vorteile gegenüber MSCs, vor allem, wenn sie in einem passenden Hydrogel wie Agarose kultiviert werden. Die Leis-tung der Zellen war stark von den verschiedenen Hydrogelen und der Umgebung beeinflusst, die diese den Zellen darboten. Die unterschiedliche chondrogene Leistung von ACPCs und MSCs in Agarose- und HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogelen zeigte deutlich die übergeordnete Relevanz der Auswahl von passenden Hydrogelen für die verschiedenen Zelltypen, die im Tissue Engineering von Gelenkknorpel Verwendung finden. Hydrogele mit einem hohen Polymergehalt, wie das eingesetzte HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogel, können die Verteilung der gebildeten ECM auf den perizellulären Bereich beschränken und sollten weiterentwickelt werden, um einen niedrigeren Polymergehalt und damit eine homogenere ECM-Verteilung durch die kultivierten Zellen zu erreichen. Der Einfluss von HA auf die chondrogene Gen-expression und auf die Balance zwischen Differenzierung und Erhaltung der Stemness in MSCs ließ sich aufzeigen. In Zukunft sollten weitere Studien die Signalfunktionen von HA und den Einfluss des 3D-Drucks in HA-basierten Hydrogelen genauer zu untersuchen. Zusammengenommen erweitern die Ergebnisse dieser Arbeit das Wissen im Bereich des Tissue Engineerings von Gelenkknorpelgewebe, vor allem in Bezug auf eine rationale Kom-bination von Zelltypen und Hydrogel-Materialien, und eröffnen neue Ansätze zur Knorpel-regeneration. KW - Hyaliner Knorpel KW - Tissue Engineering KW - Hydrogel KW - Hypoxie KW - Mesenchymzelle KW - articular cartilage progenitor cells KW - Cartilage KW - Mesenchymal stem cell KW - Hyaluronsäure KW - Agarose KW - zonal Hydrogels KW - Bioprinting KW - Cartilage Tissue Engineering KW - Oxygen partial pressure KW - chondrogene Differenzierung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251719 ER - TY - THES A1 - Schmidt [geb. Schmid], Freia Florina T1 - Ein dreidimensionales kutanes Melanommodell für den Einsatz in der präklinischen Testung T1 - A three-dimensional cutaneous melanoma model for use in preclinical testing N2 - Das maligne Melanom nimmt als Tumorerkrankung mit hoher Metastasierungsrate und steigenden Inzidenzraten bei höchster Mortalität aller Hauttumoren eine zunehmende Bedeutung in der modernen Onkologie ein. Frühzeitige Diagnosemöglichkeiten und moderne Behandlungen konnten das Überleben der Patienten bereits erheblich verbessern. Jedoch besteht nach wie vor Bedarf an geeigneten Modellen, um die Melanomprogression vollständig zu verstehen und neue wirksame Therapien zu entwickeln. Hierfür werden häufig Tiermodelle verwendet, diese spiegeln jedoch nicht die menschliche Mikroumgebung wider. Zweidimensionalen Zellkulturen fehlen dagegen entscheidende Elemente der Tumormikroumgebung. Daher wurde in dieser Arbeit ein dreidimensionales epidermales Tumormodell des malignen Melanoms, welches aus primären humanen Keratinozyten und verschiedenen Melanomzelllinien besteht, entwickelt. Die eingesetzten Melanomzelllinien variieren in ihren Treibermutationen, wodurch das Modell in der Lage ist, Wirkstoffe zu untersuchen, die spezifisch auf diese Mutationen wirken. Mit Techniken des Tissue Engineerings konnte ein dreidimensionales Hautmodell aufgebaut werden, das alle charakteristischen Schichten der Epidermis aufweist und im Bereich des stratum basale Melanomcluster ausbildet. Diese reichen je nach Größe und Ausdehnung bis in suprabasale Epidermisschichten hinein. Die Tumor-Histopathologie, der Tumorstoffwechsel sowie tumorassoziierte Proteinsekretionen ließen sich im in vitro Modell nachweisen. Darüber hinaus konnte ein Protokoll entwickelt werden, mit dem einzelne Zellen aus den Modellen reisoliert werden können. Dies ermöglichte es, den Proliferationszustand innerhalb des jeweiligen Modells zu charakterisieren und die Wirkung von Antitumortherapien gezielt zu bewerten. Die Anwendbarkeit als Testsystem im Bereich der Tumortherapeutika wurde mit dem in der Klinik häufig verwendeten v-raf-Maus-Sarkom-Virus-Onkogen-Homolog B (BRAF)-Inhibitor Vemurafenib demonstriert. Der selektive BRAF-Inhibitor reduzierte erfolgreich das Tumorwachstum in den Modellen mit BRAF-mutierten Melanomzellen, was durch eine Verringerung der metabolischen Aktivität, der proliferierenden Zellen und des Glukoseverbrauchs gezeigt wurde. Für die Implementierung des Modells in die präklinische Therapieentwicklung wurde B-B-Dimethylacrylshikonin, ein vielversprechender Wirkstoffkandidat, welcher einen Zellzyklusarrest mit anschließender Apoptose bewirkt, im Modell getestet. Bei einer Anwendung der Modelle im Bereich der Testung topischer Behandlungen ist eine Barrierefunktion der Modelle notwendig, die der in vivo Situation nahe kommt. Die Barriereeigenschaften der Hautäquivalente wurden durch die Melanomzellen nachweislich nicht beeinflusst, sind aber im Vergleich zur in vivo Situation noch unzureichend. Eine signifikante Steigerung der Hautbarriere konnte durch die Bereitstellung von Lipiden und die Anregung hauteigener Regenerationsprozesse erreicht werden. Über den Nachweis des transepidermalen Wasserverlusts konnte eine Messmethode zur nicht-invasiven Bestimmung der Hautbarriere etabliert und über den Vergleich zur Impedanzspektroskopie validiert werden. Hierbei gelang es, erstmals die Korrelation der Hautmodelle zur in vivo Situation über ein solches Verfahren zu zeigen. Das entwickelte epidermale Modell konnte durch die Integration eines dermalen Anteils und einer Endothelzellschicht noch weiter an die komplexe Struktur und Physiologie der Haut angepasst werden um Untersuchungen, die mit der Metastierung und Invasion zusammenhängen, zu ermöglichen. Die artifizielle Dermis basiert auf einem Kollagen-Hydrogel mit primären Fibroblasten. Eine dezellularisierte Schweinedarmmatrix ließ sich zur Erweiterung des Modells um eine Endothelzellschicht nutzen. Dabei wanderten die primären Fibroblasten apikal in die natürliche Schweindarmmatrix ein, während die Endothelzellen basolateral eine geschlossene Schicht bildeten. Die in dieser Arbeit entwickelten Gewebemodelle sind in der Lage, die Vorhersagekraft der in vitro Modelle und die in vitro - in vivo Korrelation zu verbessern. Durch die Kombination des Melanommodells mit einer darauf abgestimmten Analytik wurde ein neuartiges Werkzeug für die präklinische Forschung zur Testung von pharmazeutischen Wirkstoffen geschaffen. N2 - Malignant melanoma, as a tumor disease with a high metastasis rate and rising incidence rates with the highest mortality of all skin tumors, is assuming increasing importance in modern oncology. Early diagnosis and modern treatments significantly improved patient survival. There is still an unmet need for appropriate models to fully understand melanoma progression and to develop new effective therapies. Animal models are widely used but do not reflect the human microenvironment, while two-dimensional cell cultures lack crucial elements of this tumor microenvironment. Therefore, a three-dimensional epidermal tumor model of malignant melanoma consisting of primary human keratinocytes and various melanoma cell lines was developed in this work. The melanoma cell lines vary in their driver mutations, enabling the model to investigate compounds specifically designed to target one mutation. Tissue engineering techniques were used to generate a three-dimensional skin model that shows all characteristic layers of the epidermis and forms melanoma clusters in the stratum basale. Depending on size and extension, these extend into suprabasal epidermal layers. Tumor histopathology, tumor metabolism, and tumor-associated protein secretions could be demonstrated in the in vitro model. In addition, a protocol could be developed to reisolate single cells from the models. This made it possible to characterize the proliferation state within the respective model and to specifically evaluate the effect of antitumor therapies. Applicability as a test system in the field of tumor therapeutics was demonstrated with the v-raf mouse sarcoma virus oncogene homolog B (BRAF) inhibitor commonly used in the clinic. This selective BRAF inhibitor successfully reduced tumor growth in models with BRAF-mutated melanoma cells, indicated by a reduction in metabolic activity, proliferating cells, and glucose consumption. For the implementation of the model in preclinical development, B-B-dimethylacrylshikonin, a promising drug candidate, which induces cell cycle arrest followed by apoptosis, was tested in the model. An application of the models in the field of testing topical treatments requires a barrier function of the models close to the in vivo situation. The barrier properties of the skin equivalents were demonstrably not influenced by the melanoma cells, but are still insufficient compared to the in vivo situation. A significant increase in the skin barrier could be achieved by providing lipids and stimulating the skin's own regeneration processes. A measurement method for the non-invasive determination of the skin barrier was established by detection of transepidermal water loss and validated by comparison with impedance spectroscopy. For the first time, the correlation of the skin models to the in vivo situation was demonstrated by such a method. The developed epidermal model could be further adapted to the complex structure and physiology of the skin by integrating a dermal portion and an endothelial cell layer to allow studies related to metastasis and invasion. The artificial dermis is based on a collagen hydrogel with primary fibroblasts. A decellularized porcine intestinal matrix could be used to extend the model with an endothelial cell layer. Here, the primary fibroblasts migrated apically into the natural porcine intestinal matrix, while the endothelial cells formed a closed layer basolaterally. The tissue models developed in this work are able to improve the predictive power of the in vitro models and the in vitro - in vivo correlation. By combining the melanoma model with matched analytics, a novel tool for preclinical research for testing of pharmaceutical agents was established. KW - Tissue Engineering KW - Melanom KW - Hautmodell KW - Alternative zum Tierversuch Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-329255 ER - TY - THES A1 - Schlesinger, Tobias T1 - Autolog zellbesiedelte Matrix zum Verschluss gastraler Inzisionen: Eine Machbarkeitsstudie im Schweinemodell T1 - Autologous seeded matrix for gastrotomy closure: A proof of concept in a porcine model N2 - Einleitung: Strukturelle Defekte der gastrointestinalen Hohlorgane stellen ein allgegen-wärtiges Problem im klinischen Alltag dar. Sie entstehen meist auf dem Boden einer ent-zündlichen oder tumorösen Grunderkrankung und können außerdem traumatisch sowie durch medizinische Eingriffe hervorgerufen werden. In der Folge kommt es zur Kontami-nation des umliegenden Gewebes mit Magen- bzw. Darminhalt, wodurch deletäre Folgen wie eine systemische Infektion, also eine Sepsis mit Multiorganversagen drohen können. Vor diesem Hintergrund sind gastrointestinale Defekte immer als potenziell lebensbedroh-lich für den Patienten zu betrachten. Die adäquate und kausale Behandlung erfolgt je nach Ätiologie und Zustand des Patienten durch eine Operation oder eine endoskopische Inter-vention. Hierzu stehen zahlreiche etablierte, operative und interventionelle Therapieme-thoden zur Verfügung. In manchen Fällen stoßen die etablierten Techniken jedoch an ihre Grenzen. Bei Patienten mit schwerwiegenden Komorbiditäten oder im Rahmen neuer me-dizinischer Verfahren sind Innovationen gefragt. Die Grundidee der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung einer biotechnologischen Therapieoption zur Versorgung gastrointesti-naler Hohlorganperforationen. Methoden: Zur Durchführung einer Machbarkeitsstudie wurden zehn Göttinger Mi-nischweine in zwei Gruppen mit jeweils 5 Tieren aufgeteilt. Den Tieren der Experimental-gruppe wurden Hautbiopsien entnommen und daraus Fibroblasten isoliert, welche vo-rübergehend konserviert wurden. Unter Verwendung von azellularisiertem Schweinedarm erfolgte die Herstellung von Implantaten nach den Prinzipien des Tissue Engineerings. Die Tiere beider Gruppen wurden einer Minilaparotomie und einer ca. 3cm-Inzision der Ma-genvorderwand unterzogen. Die anschließende Versorgung wurde in der Experimental-gruppe durch Implantation der neuartigen Konstrukte erzielt. In der Kontrollgruppe wur-de im Sinne des Goldstandards eine konventionelle Naht durchgeführt. Anschließend wurden die Tiere für vier Wochen beobachtet. Eine bzw. zwei Wochen nach dem pri-mären Eingriff wurde bei allen Tieren beider Gruppen eine Laparoskopie bzw. Gastrosko-pie durchgeführt. Am Ende der klinischen Observationsphase wurden die Versuchstiere getötet und die entsprechenden Magenareale zur histologischen Untersuchung explantiert. Ergebnisse: Die Herstellung der Implantate konnte auf der Basis standardisierter zellbio-logischer Methoden problemlos etabliert werden. Alle Tiere beider Gruppen überlebten den Primäreingriff sowie das vierwöchige Nachbeobachtungsintervall und zeigten dabei keine klinischen Zeichen möglicher Komplikationen. Die durchgeführten Laparoskopien und Gastroskopien ergaben bei keinem der Tiere Hinweise auf Leckagen oder lokale Infek-tionsprozesse. Die histologische Aufarbeitung zeigte im Bereich des ursprünglichen De-fekts eine bindegewebige Überbrückung sowie ein beginnendes Remodeling der Magen-schleimhaut in beiden Gruppen. Schlussfolgerungen: Durch die Verknüpfung von Einzelprozessen der Zellkultur und dem Großtier-OP konnte ein neues Verfahren zum Verschluss gastrointestinaler Defekt erfolgreich demonstriert und etabliert werden. Das Projekt konnte reibungslos durchge-führt werden und lieferte Ergebnisse, die dem Goldstandard nicht unterlegen waren. Auf-grund der kleinen Fallzahl und weiterer methodischer Limitationen sind jedoch nur einge-schränkt Schlussfolgerungen möglich, weshalb die Durchführung größerer und gut geplan-ter Studien notwendig ist. Die Erkenntnisse dieser Pilotstudie liefern eine solide Basis für die Planung weiterführender Untersuchungen. N2 - Introduction: Structural defects of the gastrointestinal hollow organs are a common problem in clinical routine. They mostly arise from inflammatory or malignant patholo-gies as well as trauma or medical procedures. Contamination of adjacent tissue with fae-ces is a consequence of this, which can lead to systemic infection e.g. sepsis with multiple organ failure. Bearing this in mind gastrointestinal defects are always potentially life-threatening for the patient. Considering the aethiology and the patient’s general condition an appropriate therapy namely operation or endoscopic intervention will be performed. Though, these techniques have limitations in certain cases. For example there are patients with severe comorbidities or history of previous operations. And there are also new sur-gical procedures emerging. Therefore, innovations are needed in this field. The main purpose of the present study is the fabrication of a new biotechnological method for therapy of gastrointestinal hollow organ perforation. Methods: A feasibility study with Göttinger Minipigs was perforemd. Ten animals were randomly split up in two groups regarding closure technique . Skin biopsies were ob-tained from the animals of the experimental group (n=5) in order to obtain dermal fibro-blasts. Using acellularised porcine small intestine seeded with the autologous dermal fi-broblasts implants were manufactured following the principles to tissue engineering. All animals underwent laparotomy and a 3cm gastrical incision. Subsequently, animals of the experimental group received a novel implant in order to close the defect. Animals of the control group received a conventional suture as a gold standard technique. All animals were observed for four weeks. One and two weeks after primary surgery all animals un-derwent laparoscopy and gastroscopy respectively. Observation was completed after four weeks and all animals were euthanized. Relevant specimens of the gastric wall were ex-planted for histological examination. Results: Fabrication of the implants was based on well-established cell cultural methods. All animals survived within four weeks after primary surgery and showed no signs for possible complications. Neither laparoscopy nor gastroscopy revealed leakage or local infection in both groups. Histological examinations showed connective tissue in the de-fect-area predominantly but also initial remodeling of gastric mucosa. Conclusions: In this trial, a novel method based on cell culture methods and surgery were combined creating a new technique for closure of gastrointestinal defect. The pro-ject was carried out smoothly and results showed non-inferiority compared with the gold standard. Though, evidence generated from this study is limited due to the small scaled design and methodological issues. Thus, further investigations with larger animal groups and proper planning are required. Nevertheless, this pilot study will contribute to im-provement of trial designs in the future. KW - Magenkrankheit KW - NOTES KW - Tissue Engineering KW - Fibroblast KW - Magenchirurgie KW - Fibroblasts KW - small intestinal submucosa KW - Anastomoseninsuffizienz KW - Gastrointestinaltrakt KW - Magen KW - Perforation Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-305832 ER - TY - THES A1 - Rossi, Angela Francesca T1 - Development of functionalized electrospun fibers as biomimetic artificial basement membranes T1 - Entwicklung funktionalisierter elektrogesponnener Fasern als biomimetische künstliche Basalmembranen N2 - The basement membrane separates the epithelium from the stroma of any given barrier tissue and is essential in regulating cellular behavior, as mechanical barrier and as structural support. It further plays an important role for new tissue formation, homeostasis, and pathological processes, such as diabetes or cancer. Breakdown of the basement membrane is believed to be essential for tumor invasion and metastasization. Since the basement membrane is crucial for many body functions, the development of artificial basement membranes is indispensable for the ultimate formation of engineered functional tissue, however, challenging due to their complex structure. Electrospinning enables the production of fibers in the nano- or microscale range with morphological similarities to the randomly orientated collagen and elastic fibers in the basement membrane. However, electrospun fibers often lack the functional similarity to guide cells and maintain tissue-specific functions. Hence, their possible applications as matrix structure for tissue engineering are limited. Herein, the potential of polyester meshes, modified with six armed star-shaped pre-polymers and cell-adhesion-mediating peptides, was evaluated to act as functional isotropic and bipolar artificial basement membranes. Thereby, the meshes were shown to be biocompatible and stable including under dynamic conditions, and the degradation profile to correlate with the rate of new tissue formation. The different peptide sequences did not influence the morphology and integrity of the fibers. The modified membranes exhibited protein-repellent properties over 12 months, indicating the long-term stability of the cross-linked star-polymer surfaces. Cell culture experiments with primary fibroblasts and a human keratinocyte cell line (HaCaT) revealed that cell adhesion and growth strongly depends on the peptide sequences and their combinations employed. HaCaT cells grew to confluence on membranes modified with a combination of laminin/collagen type IV derived binding sequences and with a combination of fibronectin/laminin/collagen type IV derived peptide sequences. Fibroblasts strongly adhered to the fibronectin derived binding sequence and to membranes containing a combination of fibronectin/laminin/collagen type IV derived peptide sequences. The adhesion and growth of fibroblasts and HaCaT cells were significantly reduced on membranes modified with laminin, as well as collagen IV derived peptide sequences. HaCaT cells and fibroblasts barely adhered onto meshes without peptide sequences. Co-culture experiments at the air-liquid interface with fibroblasts and HaCaT cells confirmed the possibility of creating biocompatible, biofunctional and biomimetic isotropic and bipolar basement membranes, based on the functionalized fibers. HaCaT cells grew in several layers, differentiating towards the surface and expressing cytokeratin 10 in the suprabasal and cytokeratin 14 in the basal layers. Migration of fibroblasts into the electrospun membrane was shown by vimentin staining. Moreover, specific staining against laminin type V, collagen type I, III, IV and fibronectin illustrated that cells started to remodel the electrospun membrane and produced new extracellular matrix proteins following the adhesion to the synthetic surface structures. The culturing of primary human skin keratinocytes proved to be difficult on electrospun fibers. Cells attached to the membrane, but failed to form a multilayered, well-stratified, and keratinized epidermal layer. Changing the fiber composition and fixation methods did not promote tissue development. Further investigations of the membrane demonstrated the tremendous influence of the pore size of the membrane on epithelial formation. Furthermore, primary keratinocytes reacted more sensitive to pH changes in the medium than HaCaT cells did. Since primary keratinocytes did not adequately develop on the functionalized meshes, polycarbonate membranes were used instead of electrospun meshes to establish oral mucosa models. The tissue-engineered models represented important features of native human oral mucosa. They consisted of a multilayered epithelium with stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum, and stratum corneum. The models formed a physical barrier and the expression of characteristic cell markers was comparable with that in native human oral mucosa. The results from the ET-50 assay and the irritation study reflected the reproducibility of the tissue equivalents. Altogether, electrospinning enables the production of fibers with structural similarity to the basement membrane. Incorporating extracellular matrix components to mimic the functional composition offers a safe and promising way to modify the fibers so that they can be used for different tissue engineering applications. The resultant biomimetic membranes that can be functionalized with binding sequences derived from widely varying proteins can be used as a toolbox to study the influence of isotropic and bipolar basement membranes on tissue formation and matrix remodeling systematically, with regards to the biochemical composition and the influence and importance of mono- and co-culture. The oral mucosa models may be useful for toxicity and permeation studies, to monitor the irritation potential of oral health care products and biomaterials or as a disease model. N2 - Die Basalmembran trennt das Epithel vom Stroma eines jeden Wandgewebes und ist entscheidend bei der Regulierung des Zellverhaltens, als mechanische Barriere, und als strukturelle Unterstützung. Darüber hinaus spielt sie eine wichtige Rolle sowohl bei der Neubildung von Gewebe und der Homöostase, als auch bei pathologischen Prozessen, wie Diabetes mellitus oder Krebs. Es wird angenommen, dass die Überquerung der Basalmembran eine entscheidende Rolle bei der Tumorinvasion und Metastasierung spielt. Wegen der großen Bedeutung der Membran für eine Vielzahl an Körperfunktionen, ist die Entwicklung von strukturierten und funktionalen künstlichen Basalmembranen für den Aufbau von im Labor entwickeltem funktionalem Gewebe unerlässlich; nichtsdestotrotz stellt die Herstellung aufgrund der komplexen Struktur eine Herausforderung dar. Das elektrostatische Verspinnen ermöglicht es, Fasern im Nano oder Mikrometer Maßstab mit morphologischen Ähnlichkeiten zu den zufällig orientierten Kollagen und elastischen Fasern in der Basalmembran herzustellen. Allerdings fehlt den elektrogesponnenen Fasern häufig die funktionale Ähnlichkeit um die Zellbewegung innerhalb des Gewebes zu regulieren und gewebespezifische Funktionen aufrecht zu erhalten. Daher sind ihre Anwendungsmöglichkeiten als Membranen für das Tissue Engineering begrenzt. In dieser Arbeit wurde das Potential eines Polyestergerüsts beurteilt, das mit einem sechsarmigen sternförmigen Additiv und Zelladhäsion vermittelnden Peptiden modifiziert worden war, als isotrope und bipolare künstliche Basalmembran. Zunächst wurden die Materialeigenschaften der Faservliese untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Vliese biokompatibel, und auch unter dynamischen Bedingungen stabil sind. Zudem korrelierte der Abbau der Vliese mit dem Aufbau von neuem Gewebe. Die Modifizierung der Faseroberfläche mit Peptidsequenzen beeinflusste nicht die Morphologie und die Integrität der Fasern. Die funktionalisierten Gerüste zeigten proteinabweisende Eigenschaften über 12 Monate, was die langfristige Stabilität der quervernetzten Stern Polymer Oberflächen bestätigte. Zellkulturversuche mit primären Fibroblasten und einer humanen Keratinozyten Zelllinie (HaCaT) ergaben, dass die Zelladhäsion und das Wachstum stark von den Peptidsequenzen und deren Kombinationen abhängig sind. HaCaT Zellen wuchsen zur Konfluenz auf Vliesen, die mit einer Kombination aus Laminin/Kollagen Typ IV stammenden Peptidsequenzen und mit einer Kombination aus Fibronektin/Laminin/Kollagen Typ IV stammenden Peptidsequenzen funktionalisiert worden waren. Fibroblasten dagegen adhärierten und proliferierten stark auf Vliesen, die mit Fibronektin, und einer Kombination aus Fibronektin/Laminin/Kollagen Typ IV stammenden Bindungssequenzen modifiziert worden waren. Die Adhäsion und das Wachstum von Fibroblasten und HaCaT Zellen waren dagegen auf mit Laminin sowie mit Kollagen Typ IV funktionalisierten Membranen deutlich geringer. Fibroblasten und HaCaT Zellen adhärierten kaum auf Vliesen ohne Peptidsequenzen. Ko Kultur Versuche an der Luft Flüssigkeits Grenzfläche mit Fibroblasten und HaCaT Zellen bestätigten, dass es möglich ist, basierend auf funktionalisierten Fasern, biokompatible, biofunktionale und biomimetische isotrope und anisotrope Basalmembranen aufzubauen. HaCaT Zellen wuchsen mehrschichtig, differenzierten und polarisierten, dies wurde belegt durch den Nachweis von Zytokeratin 14 in den basalen und Zytokeratin 10 in den oberen Schichten des Epithels. Die Vimentin Färbung zeigte, dass die Fibroblasten in das Vlies einwandern. Durch spezifische Färbung von Laminin V, Kollagen I, III, IV und Fibronektin konnte gezeigt werden, dass die Zellen beginnen das Vlies umzubauen und extrazelluläre Matrix Proteine zu produzieren. Die Kultivierung von primären Keratinozyten, sowohl aus der humanen Haut als auch aus der humanen Mundschleimhaut, erwies sich als komplex auf elektrogesponnenen Fasern. Die Zellen adhärierten auf der Membran, bildeten aber weder mit noch ohne Fibroblasten ein mehrschichtiges, verhorntes Epithel aus. Die Anpassung der Faserzusammensetzung und der Fixierungsmethoden begünstigte die Entwicklung des Epithels nicht. Weiterführende experimentelle Studien belegten, dass der Porendurchmesser des Vlieses eine wichtige Rolle für die Entwicklung des Epithels spielt und dass primäre Keratinozyten stärker auf pH Veränderungen reagieren als HaCaT Zellen. Da die funktionalisierten Fasern sich nicht als geeignete Struktur für primäre Keratinozyten erwiesen, wurden Polycarbonat Membranen anstelle von elektrogesponnenen Strukturen als Träger für den Aufbau von Mundschleimhautmodellen verwendet. Die Modelle zeigten wichtige Eigenschaften der nativen Mundschleimhaut. Es bildete sich ein mehrschichtiges, polarisiertes Epithel aus basalen Zellen, einer Stachelzellschicht, Körnerzellschicht und Hornschicht. Die Modelle entwickelten eine physikalische Barriere und exprimierten Zellmarker ähnlich der nativen Mundschleimhaut. Die Ergebnisse des ET 50 Assays und der Irritationsstudie legten dar, dass die Modelle reproduzierbar hergestellt werden können. Das elektrostatische Spinnen ermöglicht es, fibrilläre Strukturen, die der Basalmembran sehr ähnlich sind, herzustellen. Die Funktionalisierung der Fasern mit Zelladhäsionssignalen stellt eine vielversprechende Möglichkeit dar, diese Fasern so zu modifizieren, dass sie als Basalmembranen für verschiedene Anwendungen des Tissue Engineerings geeignet sind. Die biomimetischen Membranen können mit Bindungssequenzen von sehr unterschiedlichen Proteinen modifiziert werden. Darüber hinaus können sie genutzt werden, den Einfluss von isotropen und anisotropen Basalmembranen auf die Gewebebildung und den Matrixumbau systematisch in Bezug auf die biochemische Zusammensetzung und den Einfluss sowie die Bedeutung von Mono und Ko Kultur zu untersuchen. Die Mundschleimhautmodelle können für toxikologische Untersuchungen, Permeationsstudien, sowie als Krankheitsmodelle eingesetzt werden. Außerdem können sie verwendet werden, um das Irritationspotenzial von Mundhygieneprodukten und Biomaterialien einzuschätzen. KW - Tissue Engineering KW - Basalmembran KW - Skin KW - Basement membrane KW - Bipolar Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137618 N1 - die Online-Version weicht insofern von der gedruckten Fassung ab als im Appendix die Arbeitsanweisungen aus dem Labor fehlen (diese dürfen nicht im WWW veröffentllicht sein) ER -