TY - THES A1 - Göb [née Klaus], Vanessa Aline Domenica T1 - Pathomechanisms underlying ischemic stroke T1 - Pathomechanismen des ischämischen Schlaganfalles N2 - Every year, stroke affects over 100 million people worldwide and the number of cases continues to grow. Ischemic stroke is the most prevalent form of stroke and rapid restoration of blood flow is the primary therapeutic aim. However, recanalization might fail or reperfusion itself induces detrimental processes leading to infarct progression. Previous studies identified platelets and immune cells as drivers of this so-called ischemia/reperfusion (I/R) injury, establishing the concept of ischemic stroke as thrombo-inflammatory disease. Reduced cerebral blood flow despite recanalization promoted the hypothesis that thrombus formation within the cerebral microcirculation induces further tissue damage. The results presented in this thesis refute this: using complementary methodologies, it was shown that infarct growth precedes the occurrence of thrombi excluding them as I/R injury-underlying cause. Blood brain barrier disruption is one of the hallmarks of ischemic stroke pathology and was confirmed as early event during reperfusion injury in the second part of this study. Abolished platelet α-granule release protects mice from vascular leakage in the early reperfusion phase resulting in smaller infarcts. Using in vitro assays, platelet α-granule-derived PDGF-AB was identified as one factor contributing to blood-brain barrier disruption. In vivo visualization of platelet activation would provide important insights in the spatio-temporal context of platelet activation in stroke pathology. As platelet signaling results in elevated intracellular Ca2+ levels, this is an ideal readout. To overcome the limitations of chemical calcium indicators, a mouse line expressing an endogenous calcium reporter specifically in platelets and megakaryocytes was generated. Presence of the reporter did not interfere with platelet function, consequently these mice were characterized in in vivo and ex vivo models. Upon ischemic stroke, neutrophils are among the first cells that are recruited to the brain. Since for neutrophils both, beneficial and detrimental effects are described, their role was investigated within this thesis. Neither neutrophil depletion nor absence of NADPH-dependent ROS production (Ncf-/- mice) affected stroke outcome. In contrast, abolished NET-formation in Pad4-/- mice resulted in reduced infarct sizes, revealing detrimental effects of NETosis in the context of ischemic stroke, which might become a potential therapeutic target. Cerebral venous (sinus) thrombosis, CV(S)T is a rare type of stroke with mainly idiopathic onset. Whereas for arterial thrombosis a critical contribution of platelets is known and widely accepted, for venous thrombosis this is less clear but considered more and more. In the last part of this thesis, it was shown that fab-fragments of the anti-CLEC-2 antibody INU1 trigger pathological platelet activation in vivo, resulting in foudroyant CVT accompanied by heavy neurological symptoms. Using this novel animal model for CVT, cooperative signaling of the two platelet receptors CLEC-2 and GPIIb/IIIa was revealed as major trigger of CVT and potential target for treatment. N2 - Jährlich sind weltweit über 100 Millionen Menschen von einem Schlaganfall betroffen, wobei die Zahl der Fälle weiter zunimmt. Der ischämische Schlaganfall ist die häufigste Form des Schlaganfalls, und die sofortige Wiederherstellung des Blutflusses ist das oberste Therapie¬ziel. Allerdings kommt es vor, dass die Rekanalisierung des betroffenen Gefäßes fehlschlägt oder die Reperfusion selbst zu schädlichen Prozessen führt, die das Fortschreiten des Infarkts begünstigen. In vorangegangen Studien wurden Thrombozyten und Immunzellen als treibende Kräfte dieser so genannten Ischämie/Reperfusion (I/R)-Schädigung identifiziert und der ischämische Schlaganfall als thrombo-inflammatorische Erkrankung definiert. Eine verminderte zerebrale Durchblutung trotz Rekanalisation führte zu der Hypothese, dass die Bildung von Thromben in der zerebralen Mikrozirkulation zu weiteren Gewebeschäden führt. Die hier vorgestellten Ergebnisse widerlegen dies: Mit Hilfe komplementärer Methoden konnte gezeigt werden, dass das Infarktwachstum dem Auftreten von Thromben vorausgeht, was diese als Ursache für die I/R-Verletzung ausschließt. Die Störung der Blut-Hirn-Schranke ist eines der charakteristischen Kennzeichen der Pathologie des ischämischen Schlaganfalls und wurde im zweiten Teil dieser Studie als frühes Ereignis während des Reperfusionsschadens bestätigt. Mit Hilfe transgener Mäuse konnte gezeigt werden, dass die Ausschüttung von α-Granula aus Thrombozyten in der frühen Reperfusionsphase an Störungen der Blut-Hirn-Schranke beteiligt ist und somit zum Infarktwachstum beiträgt. In in-vitro-Versuchen konnte gezeigt werden, dass PDGF-AB, ein Bestandteil der α-Granula, an Prozessen, die für die Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlich sind, beteiligt ist. Die Sichtbarmachung von aktivierten Thrombozyten in vivo, würde wichtige Erkenntnisse über den räumlichen und zeitlichen Kontext der Aktivierung von Thrombozyten im Verlauf des Schlaganfalls liefern. Da alle aktivierenden Signalwege zum Anstieg des intrazellulären Kalziumspiegels führen, ist Kalzium ein idealer Indikator der Thrombozytenaktivierung. Um die Grenzen chemischer Kalziumindikatoren zu überwinden, wurde eine transgene Mauslinie erzeugt, welche einen endogenen Kalziumreporter speziell in Thrombozyten und Megakaryozyten exprimiert. Die Anwesenheit des Reporters hatte keine Auswirkung auf die Funktionalität der Thrombozyten und die Mäuse wurden in vivo sowie ex vivo in verschiedenen Experimenten charakterisiert. In der Folge eines ischämischen Schlaganfalles gehören Neutrophile zu den am frühesten ins Gehirn einwandernden Zellen. Dabei werden Neutrophilen sowohl günstige als auch schädliche Wirkungen auf den Verlauf des ischämischen Schlaganfalls zugeschrieben. Aus diesem Grund wurde ihre Rolle in dieser Arbeit näher untersucht. Weder die Abwesenheit von Neutrophilen noch das Fehlen der NADPH-abhängigen Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (Ncf1-/- Mäuse) beeinflussen den Ausgang eines Schlaganfalls. Im Gegensatz dazu, führte die Verhinderung der NET-Bildung (NET = neutrophil extracellular traps) in Pad4-/- Mäusen zu verringerten Infarktgrößen, was auf eine schädliche Wirkung der NETose im Zusammenhang des Schlaganfalls hinweist und somit ein therapeutisches Angriffsziel darstellen könnte. Sinusvenenthrombosen sind eine seltene Form des Schlaganfalls, die meist ohne bekannte Ursache auftreten. Während für die arterielle Thrombose ein kritischer Beitrag der Thrombozyten bekannt und weithin akzeptiert ist, ist dies für venöse Thrombosen weniger klar, wird aber immer mehr in Betracht gezogen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Fab-Fragmente des anti-CLEC-2-Antikörpers INU1 in vivo eine pathologische Aktivierung von Thrombozyten auslösen, die zu einer fulminanten Sinusvenenthrombose mit schweren neurologischen Symptomen führt. Mit Hilfe dieses neuartigen Tiermodells wurde die zusammenwirkende Signalübertragung der beiden Thrombozytenrezeptoren CLEC-2 und GPIIb/IIIa als Hauptauslöser der Sinusvenenthrombose und damit potenzielles Ziel für eine Behandlung identifiziert. KW - Schlaganfall KW - Thrombozyt KW - Maus KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Sinusthrombose KW - thrombo-inflammation KW - ischemic stroke KW - blood brain barrier KW - CVT KW - platelets Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-286727 ER - TY - THES A1 - Eckert, Ina-Nathalie T1 - Molecular markers of myeloid-derived suppressor cells and their functional role for homing and in disease models in mice T1 - Molekulare Marker von myeloiden Suppressorzellen und ihre funktionelle Rolle für deren zielgerichtete Migration und bei Krankheitsmodellen in Mäusen N2 - MDSCs are suppressive immune cells with a high relevance in various pathologies including cancer, autoimmunity, and chronic infections. Surface marker expression of MDSCs resembles monocytes and neutrophils which have immunostimulatory functions instead of suppressing T cells. Therefore, finding specific surface markers for MDSCs is important for MDSC research and therapeutic MDSC manipulation. In this study, we analyzed if the integrin VLA-1 has the potential as a novel MDSC marker. VLA-1 was expressed by M-MDSCs but not by G-MDSCs as well as by Teff cells. VLA-1 deficiency did not impact iNOS expression, the distribution of M-MDSC and G-MDSC subsets, and the suppressive capacity of MDSCs towards naïve and Teff cells in vitro. In mice, VLA-1 had no effect on the homing capability of MDSCs to the spleen, which is a major reservoir for MDSCs. Since the splenic red pulp contains collagen IV and VLA-1 binds collagen IV with a high affinity, we found MDSCs and Teff cells in this area as expected. We showed that T cell suppression in the spleen, indicated by reduced T cell recovery and proliferation as well as increased apoptosis and cell death, partially depended on VLA-1 expression by the MDSCs. In a mouse model of multiple sclerosis, MDSC injection prior to disease onset led to a decrease of the disease score, and this effect was significantly reduced when MDSCs were VLA-1 deficient. The expression of Sema7A by Teff cells, a ligand for VLA-1 which is implicated in negative T cell regulation, resulted in a slightly stronger Teff cell suppression by MDSCs compared to Sema7A deficient T cells. Live cell imaging and intravital 2-photon microscopy showed that the interaction time of MDSCs and Teff cells was shorter when MDSCs lacked VLA 1 expression, however VLA-1 expression had no impact on MDSC mobility. Therefore, the VLA-1-dependent interaction of MDSC and Teff cells on collagen IV in the splenic red pulp is implicated MDSC-mediated Teff cell suppression. N2 - MDSCs sind suppressive Immunzellen mit hoher Relevanz bei verschiedenen Krankheiten, einschließlich Krebs, Autoimmunerkrankungen und chronischen Infektionen. Die Expression der Oberflächenmarker von MDSCs ähnelt Monozyten und Neutrophilen, welche im Gegensatz zu MDSCs immunstimulatorische Funktionen haben. Daher es wichtig für die Forschung und die therapeutische Manipulation von MDSCs, spezifische Oberflächenmarker für MDSCs zu identifizieren. In dieser Studie haben wir analysiert, ob das Integrin VLA-1 das ein möglicher neuer MDSC-Marker ist. Effektor-T-Zellen und M-MDSCs, aber nicht G-MDSCs exprimierten VLA-1. VLA-1-Defizienz hatte keinen Einfluss auf die iNOS-Expression, die Verteilung der M-MDSC- und G-MDSC-Subpopulationen und die suppressive Kapazität von MDSCs gegenüber naiven und Effektor-T-Zellen in vitro. In Mäusen hatte VLA-1 keinen Einfluss auf die Fähigkeit zur zielgerichteten Migration von MDSCs zur Milz, welche ein wichtiges Reservoir für MDSCs ist. Da die rote Pulpa der Milz Kollagen IV enthält und VLA-1 Kollagen IV mit hoher Affinität bindet, fanden wir wie erwartet MDSCs und Effektor-T-Zellen in diesem Bereich. Wir konnten zeigen, dass die T Zell-Suppression in der Milz, indiziert durch verringerte T-Zell-Wiederfindung und Proliferation sowie erhöhte Apoptose und Zelltod, teilweise von der VLA 1-Expression von MDSCs abhing. In einem Mausmodell für Multiple Sklerose führte die MDSC-Injektion vor Induktion der Krankheit zu einer Verringerung des Krankheits-Scores, und dieser Effekt war signifikant verringert, wenn MDSCs VLA-1-defizient waren. Die Expression von Sema7A durch Effektor-T-Zellen, ein Ligand für VLA-1, der mit negativer T Zell-Regulierung assoziiert ist, führte zu einer etwas stärkeren Effektor-T-Zell-Suppression durch MDSCs im Vergleich zu Sema7A-defizienten T-Zellen. Live-Cell-Imaging und intravitale 2-Photonen-Mikroskopie zeigten eine kürzere Interaktionszeit von MDSCs und Effektor-T-Zellen bei VLA-1 defizienten MDSCs, jedoch hatte die VLA-1-Expression keinen Einfluss auf die MDSC-Mobilität. Die Verwendung von VLA-1 bei der Identifizierungsstrategie von in vitro generierten MDSCs führte zu einer reineren Trennung von iNOS+ und Arg1+ Zellen von Zellen ohne Expression von Suppressormarkern. In Brusttumor-tragenden Mäusen und BCG-infizierten Mäusen, welche etablierte Modelle für die MDSC-Generierung in vivo sind, wurde VLA-1 nicht von endogenen MDSCs hochreguliert, daher ist VLA-1 möglicherweise kein geeigneter MDSC Marker in vivo. In BCG-infizierten Mäusen fanden wir CD16.2 (FcγRIV), welcher möglicherweise an der MDSC-vermittelten Immunsuppression beteiligt ist, in M-MDSCs und G-MDSCs hochreguliert, daher könnte CD16.2 ein neuer potenzieller MDSC-Marker in vivo sein. Die Analyse veröffentlichter RNA-Sequenzierungs- und Proteomikdaten von MDSCs ergab Markerkandidaten, die von MDSCs hochreguliert wurden, einschließlich VCAN und FCN1. KW - Immunologie KW - Immunsuppression KW - Maus KW - Myeloid-derived suppressor cells KW - Integrin KW - VLA-1 KW - Homing Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-319974 ER - TY - THES A1 - Yuan, Xidi T1 - Aging and inflammation in the peripheral nervous system T1 - Altern und Entzündung im peripheren Nervensystem N2 - Aging is known to be a risk factor for structural abnormalities and functional decline in the nervous system. Characterizing age-related changes is important to identify putative pathways to overcome deleterious effects and improve life quality for the elderly. In this study, the peripheral nervous system of 24-month-old aged C57BL/6 mice has been investigated and compared to 12-month-old adult mice. Aged mice showed pathological alterations in their peripheral nerves similar to nerve biopsies from elderly human individuals, with nerve fibers showing demyelination and axonal damage. Such changes were lacking in nerves of adult 12-month-old mice and adult, non-aged humans. Moreover, neuromuscular junctions of 24-month-old mice showed increased denervation compared to adult mice. These alterations were accompanied by elevated numbers of macrophages in the peripheral nerves of aged mice. The neuroinflammatory conditions were associated with impaired myelin integrity and with a decline of nerve conduction properties and muscle strength in aged mice. To determine the pathological impact of macrophages in the aging mice, macrophage depletion was performed in mice by oral administration of CSF-1R specific kinase (c-FMS) inhibitor PLX5622 (300 mg/kg body weight), which reduced the number of macrophages in the peripheral nerves by 70%. The treated mice showed attenuated demyelination, less muscle denervation and preserved muscle strength. This indicates that macrophage-driven inflammation in the peripheral nerves is partially responsible for the age-related neuropathy in mice. Based on previous observations that systemic inflammation can accelerate disease progression in mouse models of neurodegenerative diseases, it was hypothesized that systemic inflammation can exacerbate the peripheral neuropathy found in aged mice. To investigate this hypothesis, aged C57BL/6 mice were intraperitoneally injected with a single dose of lipopolysaccharide (LPS; 500 μg/kg body weight) to induce systemic inflammation by mimicking bacterial infection, mostly via activation of Toll-like receptors (TLRs). Altered endoneurial macrophage activation, highlighted by Trem2 downregulation, was found in LPS injected aged mice one month after injection. This was accompanied by a so far rarely observed form of axonal perturbation, i.e., the occurrence of “dark axons” characterized by a damaged cytoskeleton and an increased overall electron density of the axoplasm. At the same time, however, LPS injection reduced demyelination and muscle denervation in aged mice. Interestingly, TREM2 deficiency in aged mice led to similar changes to LPS injection. This suggests that LPS injection likely mitigates aging-related demyelination and muscle denervation via Trem2 downregulation. Taken together, this study reveals the role of macrophage-driven inflammation as a pathogenic mediator in age-related peripheral neuropathy, and that targeting macrophages might be an option to mitigate peripheral neuropathies in aging individuals. Furthermore, this study shows that systemic inflammation may be an ambivalent modifier of age-related nerve damage, leading to a distinct type of axonal perturbation, but in addition to functionally counteracting, dampened demyelination and muscle denervation. Translationally, it is plausible to assume that tipping the balance of macrophage polarization to one direction or the other may determine the functional outcome in the aging peripheral nervous system of the elderly. N2 - Es ist bekannt, dass das Altern ein Risikofaktor für strukturelle Veränderungen und Funktionsstörungen des Nervensystems ist. Die Charakterisierung altersbedingter Veränderungen ist wichtig, um mögliche Wege zu identifizieren, um schädliche Auswirkungen zu überwinden und die Lebensqualität älterer Menschen zu verbessern. In dieser Studie wurde das periphere Nervensystem von 24 Monate alten gealterten C57BL/6-Mäusen untersucht und mit 12 Monate alten adulten Mäusen verglichen. Gealterte Mäuse zeigten ähnliche pathologische Veränderungen in ihren peripheren Nerven wie Nervenbiopsien älterer Menschen, wobei die Nervenfasern eine Demyelinisierung und axonale Schädigung zeigten. Bei den Nerven von adulten 12 Monate alten Mäusen und nicht gealterten Menschen fehlten solche Veränderungen. Darüber hinaus wiesen die neuromuskulären Endplatten von 24 Monate alten Mäusen im Vergleich zu adulten Mäusen eine erhöhte Denervation auf. Diese Veränderungen wurden von einer erhöhten Anzahl von Makrophagen in den peripheren Nerven gealterter Mäuse begleitet. Die neuroinflammatorischen Bedingungen waren mit einer Beeinträchtigung der Myelinintegrität, einer Abnahme der Nervenleitungseigenschaften und der Muskelkraft bei gealterten Mäusen verbunden. Um den pathologischen Einfluss von Makrophagen bei alternden Mäusen zu bestimmen, wurde die Makrophagen-Depletion bei Mäusen durch orale Verabreichung des CSF-1R-spezifischen Kinase-Inhibitors (c-FMS) PLX5622 (300 mg/kg Körpergewicht) durchgeführt, welche die Anzahl der Makrophagen in den peripheren Nerven um 70% reduzierte. Die behandelten Mäuse zeigten eine verminderte Demyelinisierung, eine reduzierte Muskeldenervation und einen Erhalt der Muskelkraft. Dies deutet darauf hin, dass die durch Makrophagen verursachte Entzündung in den peripheren Nerven teilweise für die altersbedingte Neuropathie bei Mäusen verantwortlich ist. Auf der Grundlage früherer Beobachtungen, dass systemische Entzündungen das Fortschreiten der Krankheit in Mausmodellen neurodegenerativer Erkrankungen beschleunigen können, wurde die Hypothese aufgestellt, dass systemische Entzündungen die periphere Neuropathie in gealterten Mäusen verschlimmern können. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurde gealterten C57BL/6-Mäusen eine Einzeldosis Lipopolysaccharid (LPS; 500 μg/kg Körpergewicht) intraperitonal injiziert, um eine systemische Entzündung durch Nachahmung einer bakteriellen Infektion, meist über die Aktivierung von Toll-like-Rezeptoren (TLRs), zu induzieren. Eine veränderte endoneuriale Makrophagenaktivierung, die durch eine reduzierte Trem2-Expression hervorgehoben wird, konnte bei LPS-injizierten gealterten Mäusen einen Monat nach der Injektion gefunden werden. Dies ging einher mit einer bisher selten beobachteten Form der axonalen Perturbation, d.h. dem Auftreten von "dunklen Axonen", die sich durch ein geschädigtes Zytoskelett und eine erhöhte Gesamtelektronendichte des Axoplasmas auszeichnen. Gleichzeitig verringerte die LPS-Injektion jedoch die Demyelinisierung und Muskeldenervation bei gealterten Mäusen. Interessanterweise führte die TREM2 Defizienz bei gealterten Mäusen zu vergleichbaren Veränderungen wie die LPS-Injektion. Dies deutet darauf hin, dass die LPS-Injektion die alterungsbedingte Demyelinisierung und Muskeldenervierung über die Trem2 Herunterregulation abschwächt. Zusammenfassend zeigt diese Studie die Rolle der Makrophagen-getriebenen Entzündung als pathogener Mediator bei der altersbedingten peripheren Neuropathie. Zusätzlich deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die gezielte Behandlung von Makrophagen eine Option zur Linderung peripherer Neuropathien bei alternden Menschen sein könnte. Darüber hinaus zeigt diese Studie, dass die systemische Entzündung ein ambivalenter Modifikator der altersbedingten Nervenschädigung sein kann, der zu einer bestimmten Art von axonaler Perturbation führt, aber zusätzlich zu einer funktionell entgegenwirkenden, weniger schweren Demyelinisierung und Muskeldenervation. Translatorisch ist es plausibel anzunehmen, dass eine Veränderung des Gleichgewichts der Makrophagenpolarisation in die eine oder andere Richtung das funktionelle Ergebnis im alternden peripheren Nervensystem der älteren Menschen bestimmen kann. KW - Maus KW - Peripheres Nervensystem KW - Altern KW - Immunsystem KW - macrophages KW - peripheral nervous system KW - aging KW - neuroinflammation KW - Trem2 KW - systemic inflammation Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-237378 ER -